ES2328008T3 - Procedimientos de purificacion de adn. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para purificar ADN plásmido a partir de una mezcla del mismo que contiene al menos una impureza de la célula huésped que comprende las siguientes etapas: (a) formar una solución mediante la adición de suficiente sal a dicha mezcla en donde dicha solución tiene una concentración de sal en el rango de aproximadamente 2M a 4M para permitir la unión selectiva de dicha al menos una impureza de célula huésped a un medio de interacción hidrofóbica; (b) contactar dicha solución que contiene ADN plásmido con dicho medio de interacción hidrofóbica bajo condiciones en que dicha al menos una impureza se une al medio de interacción hidrofóbica para formar un complejo; y (c) recoger ADN plásmido no unido a partir de dicho complejo; en donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles, cobalto hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona.
Description
Procedimientos de purificación de ADN.
La presente invención proporciona procedimientos
para la purificación de ADN plásmido que incluye la extracción de
impurezas de la célula huésped, tales como endotoxinas, ARN,
proteínas y ADN de la célula huésped, a partir de una solución
acuosa que contiene ADN plásmido y procedimientos para la separación
y purificación de ADN plasmídico superenrollado de una solución
acuosa que contiene una mezcla de ADN plásmido superenrollado y
nicked o relajado utilizando medio de interacción hidrofóbica.
También se proporcionan procedimientos mejorados para pequeña
escala, tales como laboratorio o escala de unidad de banco,
purificación de ADN y equipamiento utilizado en tales
procedimientos. La presente invención proporciona ADN purificado y/o
separado, tal como plásmido, preferentemente superenrollado,
ADN.
La terapia génica ofrece un paradigma de nuevo
tratamiento para curar enfermedades humanas. El uso de ADN para el
tratamiento de enfermedades genéticamente causadas, incluyendo
fibrosis quística, varios tipos de cáncer, etc., e inmunización
contra enfermedades, es un prometedor modo de terapia que en la
actualidad es ampliamente perseguido. Más que alterar el fenotipo de
la enfermedad mediante el uso de agentes que interactúan con
productos génicos, o son en sí mismos productos génicos, la terapia
génica puede teóricamente modificar genes específicos resultando en
la cura o tratamiento de la enfermedad. La terapia génica también
puede utilizarse como un sistema de suministro de fármacos. Para
lograr esto, un gen que produce un producto útil (ARN, péptido,
proteína, etc.) o es en sí mismo un producto útil (tales como en el
uso de ADN antisentido) sería insertado en el ADN o célula de una
célula homóloga, heteróloga o autóloga de un individuo o célula
huésped para ser administrada luego a un individuo, ya sea in
vivo, ex vivo o in vitro. Por ejemplo, durante la
cirugía de vasos sanguíneos, un gen que produce un factor anti
coagulación sería insertado en el ADN de células que revisten los
vasos sanguíneos para ayudar a prevenir la formación de coágulos de
sangre peligrosos. Muchas otras condiciones también pueden conducir
al tratamiento utilizando esta aproximación general.
La terapia génica espera que sea una herramienta
poderosa para tratar muchos de los más de 4.000 desórdenes
genéticos conocidos, incluyendo fibrosis quística, enfermedad
coronaria, cáncer, artritis, y otras enfermedades. La terapia
génica generalmente requiere la transferencia de material genético
(ADN) en un individuo. La entrega genética o la entrega de material
genético can puede lograrse tanto mediante administración directa
del 100 que contiene el virus o ADN plásmido a la sangre tejidos,
indirectamente a través de la introducción de células manipuladas
en el laboratorio para abrigar ADN extraño o a través de diferentes
técnicas de encapsulado o de portador conocidas en la técnica.
Informes recientes sugieren que la entrega directa de ADN también
puede ser posible. Varios sistemas distintos están en uso o bajo
consideración para la transferencia somática de genes. Estas
incluyen, por ejemplo, ADN (tanto desnudo o acomplejado), virus ARN
(retrovirus), y virus ADN (adenovirus, virus adenoasociado [AAV],
virus del herpes, y virus de la viruela).
Las ventajas claves del modo de terapia génica
no viral, tales como el uso de ADN plásmido, es la facilidad de
preparación en grandes cantidades, un alto grado de seguridad, una
falta general de integración del ADN heterólogo en el ADN del astro
la huésped, y la posibilidad de utilizar gen(es) o fragmentos
de gen (es) virtualmente de tamaño y número ilimitado. Además, el
uso de ADN plásmido en la terapia génica generalmente no implican
el uso de gen(es) o proteínas extraños que pueden inducir una
respuesta inmune no deseada en el receptor. Además, las
alternativas al uso del ADN plásmido, tales como vectores virales,
son relativamente más caras de producir.
Los procedimientos actualmente utilizados para
producir ADN plásmido generalmente proporcionan una mezcla de ADN
plásmido superenrollado y un artefacto ADN nicked (o relajado), que
generalmente no es útil en la aplicación final del ADN plásmido.
Los procedimientos de la presente invención proporcionan una
separación no destructiva de ADN plásmido superenrollado y nicked de
forma tal que mientas los presentes procedimientos se ejemplifican
mediante la recuperación y uso del ADN plásmido superenrollado, una
persona de habilidad ordinaria apreciará que cualquier forma
separada del ADN plásmido puede ser considerada un producto útil de
los procedimientos aquí divulgados. Además, mientras la presente
divulgación enfatiza la necesidad de una mayor pureza del ADN
plásmido superenrollado en el contexto de la terapia génica, una
persona de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que el ADN
plásmido es ampliamente utilizado en biología recombinante molecular
más allá del uso en preparaciones de terapia génica y la invención
aquí divulgada encuentra una amplia aplicabilidad como un
procedimiento preparatorio para ADN plásmido superenrollado aislado
y purificado.
Los procedimientos actualmente disponibles para
la separación de las dos formas de ADN plásmido utilizan
cromatografía de intercambio de iones (A novel, rapid process for
purification of plasmids for gene therapy (Bhikhabhai R. Ollivier M.
and Blanche F., Amersham Pharmacia Biotech R & D, 75184
Uppsala, Sweeden and RPR Gencell, Rhone-Poulenc
Roer, Center de Recherche de Vitry-Alfortville, 13
quai Jules Guesde, 94400 Vitry sur Siene, France. Publication
number: 18-1129-51; Preparative
purification of supercoiled plasmid DNA utilizando anion exchange
chromatography, Duarte Miguel Prazeres, Thomas Schleup, Charles
Cooney, Journal of Chromatography A, 606 (1998),
31-45) o cromatografía de exclusión (Prazeres,
D.M., A comparison of Gel Filtration Chromatographic Supports for
Plasmid Purification, Biotechnology Techniques Vol. 11, No. 6, June
1997, p 417-420), acopladas con el uso de aditivos
tales como polietilen glicol (PEG), detergentes, y otros componentes
tales como cobalto hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona
(PVP). Recientemente se concedió una patente (Horn, et al
(Patente U.S. No. 5.707.812)) para la purificación de ADN plásmido
superenrollado usando PEG como un aditivo. Sin embargo,
procedimientos actualmente conocidos son incapaces de proporcionar
una separación eficiente y de coste efectivo de ADN superenrollado
y nicked (o relajado). Además, muchos de los procedimientos
conocidos sufren de la desventaja de utilizar PEG u otros aditivos,
que pueden no ser deseados en la fabricación de ADN plásmido, al
requerir procedimientos de separación, eliminación y control de
calidad adicionales, que pueden ser difíciles, consumir más tiempo
y más caros.
Formas alternativas de procedimientos conocidos
para la separación de formas superenrolladas y relajadas de ADN
plásmido utilizan resinas muy caras, propietarias, que también
utilizan solventes, tales como acetonitrilo, etanol y otros
componentes, como trietilamina y tetrabutil fosfato de amonio,
durante el proceso. Estos procedimientos generalmente no son
adecuados para producción en gran escala debido al uso de
solventes. Además, no pueden aplicarse a materiales iniciales que
tienen cantidad significativas de ADN plásmido relajado ya que la
cantidad abundante de ADN plásmido relajado contaminante en los
materiales iniciales tiende a reducir las capacidades de resolución
de estas resinas. (Green, A. P. et al. Bio. Pharm. Vol. 10,
No. 5, páginas 52-62, Mayo 1997).
Procedimientos adicionales de separación de ADN
superenrollado y relajado se basan en la cromatografía de
exclusión, que implica la separación de las dos formas de ADN
plásmido basada en la pequeña diferencia de tamaño. Estas columnas
tienden a ser relativamente largas, presentando significativos
problemas de escala, haciendo no factible implementar en la
producción en gran escala. Además los procedimientos de exclusión
necesitan muestras concentradas de soluciones, que no es factible
obtener con soluciones de ADN plásmido, debido a la naturaleza
altamente viscosa del ADN. Ver, A comparison of gel
filtration chromatographic supports for plasmid purification G.N.M.
Ferreira, J.M.S. Cabral and D.M.F. Prazeres, Biotechnology
Techniques, Volume 11, No. 6, June 1997, pp
417-420.
Las preparaciones de ADN plásmido, que son
producidas a partir de preparaciones bacterianas y con frecuencia
contienen una mezcla de ADN plásmido relajado y superenrollado, con
frecuencia requieren la extracción de endotoxina, tal como requiere
la FDA, ya que las endotoxinas producidas en muchos huéspedes
bacterianos son conocidos por causar reacciones inflamatorias, tales
como fiebre o sepsis en el huésped que recibe el ADN plásmido.
Estas endotoxinas son generalmente lipopolisacáridos, o fragmentos
de los mismos, que son componentes de la membrana exterior de una
bacteria Gram-negativa, y están presentes en la
preparación de ADN como artefactos de las células huésped o como una
parte de artefactos mayores, tales como membranas de células
huésped o macromoléculas, utilizadas en la expresión y fabricación
del ADN plásmido para la terapia génica, por ejemplo. Por lo tanto
la extracción de endotoxinas es una etapa crucial y necesaria en la
purificación del ADN plásmido para uso terapéutico o
profiláctico.
La extracción de endotoxina a partir de
soluciones de ADN plásmido primariamente ha utilizado la estructura
negativamente cargada de las endotoxinas; sin embargo el ADN
plásmido también está cargado negativamente y por lo tanto la
separación usualmente se logra con resinas de intercambio de iones
que unen ambas de estas moléculas y, bajo ciertas condiciones,
preferencialmente eluyen el ADN plásmido mientras enlazan las
endotoxinas. Dicha separación resulta en sólo la extracción parcial
como cantidades significativas de endotoxinas eluídas con el ADN
plásmido y/o se logra una recuperación muy pobre de ADN plásmido.
Otros procedimientos patentados usan detergentes, que pueden
presentar problemas. (Process for the depletion or removal of
endotoxins. Coplan, Metin, Moritz, Peter, Schorr, Joachim, U.S.
Patent Number: 5,747,663). Además, la capacidad de enlace de estas
resinas está sólo en el orden de 10^{3} a 10^{4} EU (unidades
endotoxina)/ml de resina ya que la resina está ocupada tanto por
endotoxina y ADN plásmido, por ejemplo, requiriendo típicamente de
3 a 80 litros de resina, basado en capacidades informadas de 50.000
EU/ml a 2000 EU/ml (Green, A. P. et al. Bio. Pharm. Vol. 10,
No. 5, pages 52-62, May 1997. Sterogene technical
profile DNA Etox, Sterogene, 5922 Famsworth Cr., Carlsbad, CA
92008).
Prazeres et al., Trends in Biotech.
17(4):169-174 (1999) discute los problemas
asociados con la producción a gran escala de ADN plásmido de grado
farmacéutico para terapia génica y observa que la baja capacidad de
absorbentes cromatográficos de intercambio de aniones es un
problema pertinente en la purificación del plásmido.
McLaughlin et al., J. Chromatog.
418:51-72 (1987) describe procedimientos para la
resolución de ARN utilizando HPLC. En particular cromatografía de
intercambio de aniones y de fase reversa.
El documento WO 99/29832 describe un
procedimiento cromatográfico HPLC para purificar ADN plásmido a
partir de una mezcla que contiene tanto ADN plásmido como genómico.
Se utiliza etanol como un solvente para eluir ADN plásmido.
Colote et al., Analytical Biochem.
154:15-20 (1986) describe un procedimiento para el
análisis y purificación de ADN plásmido mediante la cromatografía
líquida de fase reversa de alto rendimiento. El proceso descrito se
lleva a cabo en presencia de solventes orgánicos tales como
acetonitrilo y DMSO.
La presente invención proporciona procedimientos
de separación, aislamiento y/o purificación de ADN plásmido que
pueden ser utilizados en combinación o independendientemente.
Específicamente, la presente invención proporciona procedimientos
de separación, purificación y/o aislamiento de ADN plásmido
superenrollado y relajado así como un procedimiento de separación,
purificación y/o aislamiento de plásmido.
Impurezas del ADN de la célula huésped, tales
como componentes o fragmentos que contienen endotoxina.
Composiciones de ADN plásmido purificado, separado y/o aislado,
específicamente ADN plásmido superenrollado, también son provistas
por la presente invención. La presente invención también
proporciona procedimientos y aparatos para separación, aislamiento
y/o purificación de ADN plásmido a escala de laboratorio o de
banco.
La presente invención proporciona procedimientos
para aislar tipos deseados de polinucleótidos a partir de otros
componentes presentes en mezclas que contienen estos
polinucleótidos, produciendo composiciones enriquecidas en el tipo
deseado de polinucleótidos. Los procedimientos incluyen la
separación de los polinucleótidos de los componentes no deseados
contactando mezclas que contienen los polinucleótidos con medio
interactivo hidrofóbico. La separación de los polinucleótidos de
otros componentes, así como la separación de tipos de
polinucleótidos resulta de las diferentes afinidades de los
polinucleótidos y otros componentes no deseados por el medio
interactivo hidrofóbico bajo diferentes condiciones iónicas. Así,
en los procedimientos de la invención se utiliza un medio
interactivo hidrofóbico que tiene un enlace altamente preferencial
para los lipopolisacáridos y lipoproteínas relativas a
polinucleótidos; este enlace preferencial se produce en el rango de
condiciones iónicas utilizado en el proceso de separación. También
en la invención hay incluidos procedimientos que separan ADN
superenrollado y ADN relajado. Los procedimientos utilizan
condiciones iónicas donde el ADN superenrollado se enlaza
preferencialmente al medio interactivo hidrofóbico relativo al ADN
relajado.
Se entiende que, cuando se describe una
concentración de sal utilizada en los procedimientos de esta
invención, puede utilizarse una fuerza iónica equivalente de una sal
diferente. También se entiende que, especialmente respecto a
procedimientos que agotan y/o eliminan la endotoxina, estos
procedimientos se aplican al plásmido así como al ADN no
plásmido.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar procedimientos de separación, aislamiento y/o
purificación ADN plásmido de impurezas contaminantes de la célula
huésped.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar procedimientos de separación, purificación y/o
aislamiento de ADN plásmido y componentes o fragmentos que contienen
endotoxina.
Es aún otro objeto de la presente invención
proporcionar procedimientos de separación, purificación y/o
aislamiento de ADN plásmido superenrollado y relajado.
ADN plásmido purificado, separado y/o aislado,
específicamente composiciones ADN plásmido superenrollado, también
son proporcionadas por la presente invención.
En una realización, la presente invención
proporciona un procedimiento de separación de endotoxina y otras
impurezas de la célula huésped (por ejemplo, ARN, ADN cromosómico,
proteína) del ADN plásmido implicando contactar un lisado celular
con un medio de interacción hidrofóbica bajo condiciones donde la
endotoxina y otras substancias contaminantes se unen al medio de
interacción hidrofóbica para formar un complejo y separar el ADN
plásmido y el complejo. La endotoxina separada en el procedimiento
de esta realización incluye endotoxina de microorganismos
Gram-negativos así como fragmentos y componentes
celulares y subcelulares unidos a las endotoxinas y fragmentos de
endotoxina. El medio de interacción hidrofóbica enlaza ARN,
incluyendo t-ARN, r-ARN y
m-ARN, proteínas de la célula huésped y ADN
cromosómico. El medio de interacción hidrofóbica útil en la
presente invención puede estar en forma de resinas, membranas u otro
medio de soporte.
Una forma preferida de esta realización incluye
cargar la mezcla de ADN plásmido, con otros componentes opcionales
contaminantes de la célula huésped, incluyendo endotoxinas, estando
presentes, en una matriz de columna o lecho que contiene el medio
de interacción hidrofóbica, en una forma donde la endotoxina y las
impurezas de la célula huésped preferencialmente se unen o son
retenidas por el medio de interacción hidrofóbica, y el ADN
plásmido se recoge como un efluente (flujo continuo) desde el
proceso de carga o en lavado(s) opcionales subsiguientes del
medio de Interacción Hidrofóbica que no disturben o interrumpan la
retención de las impurezas y endotoxinas de la célula huésped sobre
y/o en el medio de interacción hidrofóbica. Después de la
recolección del ADN plásmido, la columna o matriz de lecho puede
ser regenerada mediante la elución de las impurezas de la célula
huésped y endotoxinas unidas o retenidas mediante la alteración,
cambio o modificación de las condiciones hidrofóbicas de
interacción de la columna o lecho mediante, por ejemplo, la
alteración de la concentración de sal que rodea la matriz de
columna o
lecho.
lecho.
Realizaciones alternativas de la presente
invención proporcionan procedimientos de separación en ausencia de
una o ambas cromatografía de intercambio de iones o cromatografía
de exclusión.
En una forma preferida de esta realización, el
volumen de la columna o lecho es inicialmente equilibrado con una
solución de reacción de sulfato de amonio a una concentración que
permite la unión selectiva de las impurezas contaminantes a la
columna de interacción hidrofóbica, preferentemente, una
concentración de aproximadamente 2M. Las sales que pueden ser
utilizadas en el procedimiento de la presente invención incluyen
mezclas de aniones y cationes seleccionadas del grupo consistente
en, pero no limitado a, acetato, fosfato, carbonato,
SO_{4}^{2-}, Cl^{-}, Br^{-}, NO_{3}^{-}, Mg^{2+},
Li^{+}, Na^{+}, K^{+}, NH_{4}^{+}. Pueden emplearse
mezclas de sales. Además, la mezcla de ADN plásmido y otras
impurezas contaminantes, tales como endotoxinas, son preferentemente
dializadas con un tampón de diálisis antes de contactar con la
matriz de columna o lecho para extraer las sales y otros
contaminantes que pueden alterar la hidrofobicidad de la endotoxina
y del ADN plásmido y otras impurezas contaminantes, tales como
endotoxina, en la solución de reacción de sulfato de amonio. La
solución de reacción es preferentemente tamponada con, por ejemplo,
Tris-HCl a un pH en el rango de, pero no limitado a,
6,8 a 8,5, preferentemente 7,4. Pueden utilizarse otros tampones,
que son conocidos para aquellos entendidos en la técnica, tales
como, pero no limitados a, Tris, TES (ácido
N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetano-sulfónico),
Tricina (N-tris(hidroximetil) metilglicina),
fosfato, PIPES
(Piperazina-N,N'-bis(ácido
2-etano sulfónico), MOPS (ácido
3-(N-morfolino)-propanosulfónico),
MES (ácido
2-(N-morfolino)-etanesulfónico),
MEPES (ácido
3-N(N-Morfolino)etilpiperazina-N'-2-etanesulfónico),
y Bicina
(N,N-bis(2-hiroxietil)
glicina).
Los procedimientos de la presente invención
proporcionan ADN plásmido aislado y/o purificado, y una composición
que contiene el ADN plásmido, que tiene un contenido de endotoxina
sustancialmente reducido, o está libre de endotoxina, de forma tal
que la carga de endotoxina del ADN plásmido se ha reducido en tanto
como más del 95%, preferentemente, más del 98%, más preferentemente
más del 99%, alternativamente más del 99,9% y más preferentemente
más del 99,99% al 99,999%. El procedimiento de la presente
invención puede utilizarse para separar grandes cargas iniciales de
endotoxina, tales como al menos 200.000 a 400.000 unidades
endotoxina (EU)/mililitro de solución, proporcionando una capacidad
de al menos 600.000 a 3 millones EU/ml matriz hidrofóbica. Además,
el proceso de la presente invención proporciona un producto de
composición ADN plásmido que contiene un rango de menos de 10 a
menos de 2500 EU o un rango de menos de 1 a menos de 300 EU/mg
ADN. Alternativamente, el proceso de la presente invención
proporciona un producto de composición ADN plásmido que contiene un
rango de menos de 50 a menos de 1000 unidades endotoxina (EU) o un
rango de menos de 10 a menos de 50 EU/mg ADN. El procedimiento de
la presente invención también reduce el contenido de proteína a
menos de 0,1% (w/w) ARN a menos de 1% (w/w) y de ADN cromosómico de
menos de 1% (w/w).
En otra realización, la presente invención
proporciona un procedimiento de separación de ADN plásmido
superenrollado de ADN plásmido relajado que incluye las etapas de
contactar una mezcla de ADN plásmido superenrollado y ADN plásmido
relajado con un medio de Interacción Hidrofóbica bajo una primera
condición donde tanto el ADN plásmido superenrollado como el ADN
plásmido relajado se unen al medio de interacción hidrofóbica para
formar una primera mezcla de unión, alterando las primeras
condiciones que rodean la primera mezcla de unión a una segunda
condición para extraer el ADN plásmido relajado de la primera mezcla
de unión para formar componentes separados que contienen una
segunda mezcla de unión y el ADN plásmido relajado, y modificar las
segundas condiciones que rodean la segunda mezcla de unión a una
tercera condición para extraer el ADN plásmido superenrollado de la
segunda mezcla de unión para formar componentes separados que
contienen el medio de Interacción Hidrofóbica y el ADN plásmido
superenrollado.
En otra forma de esta realización, la alteración
y modificación pueden realizarse mediante el cambio de las
condiciones de pH del tampón de elución o solución, en una forma
tal que las formas relajada y superenrollada pueden ser eluídas a
diferentes condiciones de pH, con o sin cambios en las condiciones
de la sal.
En otra forma de esta realización, la
alteración y modificación pueden realizarse a través de elución
isocrática, donde una solución de la misma composición,
preferentemente a una concentración de sal que pueda eluir ambas
formas del ADN plásmido, cuando pasan a través de la columna que
contiene el plásmido ligado, eluirían secuencialmente las dos formas
distintamente, en fracciones separadas.
En otra realización, las condiciones de la sal
y/u otras condiciones pueden ser modificadas en una forma tal que la
forma relajada del plásmido puede ser recogida como la fracción no
unida, mientras que la forma superenrollada se une a la resina. La
forma superenrollada puede ser subsiguientemente eluída utilizando
condiciones indicadas anteriormente.
En otra forma de esta realización, la
alteración y modificación pueden realizarse mediante el uso de
moléculas o una mezcla de moléculas que se unen a los ligandos
competitivamente ("desplazadores") y extraer las formas ligadas
de ADN plásmido de la matriz como componentes separados.
En otra forma de esta realización, moléculas o
mezcla de moléculas que pueden unirse a través de interacción
hidrofóbica o por el contrario, pueden mezclarse con soluciones de
ADN plásmido, que, al cargarse en la columna pueden ser
secuencialmente desplazadas, resultando en la separación de las
diferentes formas de ADN.
En las dos formas alternativas anteriores de la
realización, comúnmente referidas como modos de cromatografía de
"desplazamiento" y "frontal", la molécula añadida puede
co-eluir con el producto que, en la mayoría de los
casos puede ser efectivamente separado utilizando procedimientos
conocidos para aquellos en la técnica.
La cromatografía de desplazamiento es un modo de
cromatografía en el cual dos o más moléculas unidas a una resina
son desplazadas utilizando una molécula desplazadora que tiene una
afinidad más alta por la resina resultando en un desplazamiento
secuencial y por lo tanto elución de las dos o más moléculas
unidas. Recientemente, se han identificado desplazadores para
resinas hidrofóbicas de interacción, que consisten en copolímeros
tribloque incluyendo polimetil metacrilato, ácido acrílico, y
polidimetilaminoetil metacrilato (ver Ruaan et al
"Hydrophobic displacement chromatography of proteins using
triblock copolymers as displacers", 1998 AIChE meeting). Otros
desplazadores han sido exitosamente desarrollados para la
cromatografía de desplazamiento con resinas hidrofóbicas de
interacción (ver Shukla et. al. Hydrophobic displacement
chromatography of proteins in 1998 Annual AIChE meeting).
Desplazadores tales como 2-(2-butoxietoxi) etanol
se han utilizado como desplazadores en cromatografía de fase
reversa, que podrían ser útiles.
Después de unir las dos formas del plásmido,
puede utilizarse un desplazador, tales como los listados
anteriormente para desplazar ADN superenrollado y relajado
secuencialmente de las resinas HIC (columna de interacción
hidrofóbica) aquí descritas.
En cromatografía de modo "frontal", la
columna se carga con una mezcla binaria, que difiere en su
afinidad por la resina, y al sobrecargar continuamente la columna,
un componente desplaza al otro y resulta en elución secuencial de
los dos componentes. En la aplicación de este procedimiento de la
presente invención, las dos formas de ADN, por ejemplo, pueden
cargarse sobre una columna HIC y la sobrecarga de la muestra puede
resultar en un efecto de desplazamiento que lleve al desplazamiento
de la forma relajada, que puede ser recogida separadamente de la
forma superenrollada.
En una forma de esta realización, la alteración
y modificación son combinadas en un proceso continuo de un gradiente
de elución del ADN plásmido relajado y ADN plásmido superenrollado
mezclando primera mezcla de unión son una solución de sal, tales
como solución de sulfato de amonio, con una concentración
continuamente variable de sal, tales como sulfato de amonio, la
concentración preferentemente variando de 3M a 1M de sal, tales
como sulfato de amonio. El ADN plásmido relajado se recoge en esta
forma de esta realización de la invención en un primer volumen
eluído y el ADN plásmido superenrollado se recoge en un segundo
volumen eluído.
En otra forma preferida de esta realización, las
formas superenrollada y relajada del ADN plásmido son separadas
uniendo primero las dos formas del ADN a un medio de interacción
hidrofóbica en un lecho o columna a altas concentraciones de sal, o
fuerzas iónicas equivalentes, tales como 2,5 M a 4 M,
preferentemente 3 M, sulfato de amonio, y luego eluyendo, tanto en
forma de gradiente por etapas o gradiente continuo, las dos formas
separadas del ADN plásmido de la columna, cambiando la
concentración de sal, o fuerzas iónicas equivalentes, a un primer
rango de 2,45M a 2,35M sulfato de amonio y luego a un segundo rango
de 0M (posiblemente 1M) a 2,3M sulfato de amonio (en la etapa de
realización de la elución) o cambiando continuamente la
concentración de sulfato de amonio del rango de 2,5 M a 4M a un
segundo rango de 0M (posiblemente 1M) a 2,3M sobre un volumen de 1 a
30 volúmenes de columna o lecho, preferentemente al menos 6
volúmenes columna o lecho (en la realización de gradiente continuo).
En cada una de estas formas, el ADN plásmido relajado eluye desde
el medio de la columna o lecho a la concentración de sal (sulfato
de amonio) en el rango de 2,35M a 2,45M mientras que el ADN
plásmido superenrollado eluye desde el medio de la columna o lecho
a la concentración de sal (sulfato de amonio) en el rango de 0M a
2,3M.
En otra realización, la invención proporciona
procedimientos de aislamiento de ADN plásmido superenrollado que
incluyen:
aplicar una muestra que contiene plásmido
superenrollado a un medio de interacción hidrofóbica bajo
condiciones iónicas donde el plásmido superenrollado
preferencialmente se une al medio respecto al
no-plásmido superenrollado; y
ajustar las condiciones iónicas de forma tal que
el plásmido superenrollado unido se extrae del medio.
En otra realización preferida, la presente
invención proporciona un procedimiento para enriquecer la cantidad
de ADN superenrollado relativa al ADN relajado en una mezcla de los
mismos, incluyendo el procedimiento (1) interactuar la mezcla que
contiene ADN superenrollado y ADN relajado con un medio interactivo
hidrofóbico que contiene una mitad alquil bajo condiciones iónicas
donde el ADN superenrollado preferencialmente se une al medio
interactivo hidrofóbico; (2) tratar el medio interactivo hidrofóbico
que contiene el ADN relajado y superenrollado bajo condiciones
iónicas que permitan la extracción preferencial del ADN relajado; y
(3) eluir el ADN superenrollado del medio interactivo
hidrofóbico.
En una realización preferida adicional, la
presente invención proporciona un procedimiento para extraer
lipopolisacárido (LPS) de una composición que contiene ADN,
incluyendo el procedimiento las etapas de (1) interactuar la mezcla
que contiene el ADN y LPS con un medio interactivo hidrofóbico que
contiene una mitad alquil, donde la interacción es bajo condiciones
iónicas donde el LPS preferencialmente se une al medio interactivo
hidrofóbico relativo al ADN; y (2) tratar el medio interactivo
hidrofóbico que contiene el ADN y LPS con condiciones iónicas que
permiten la extracción selectiva del ADN.
Los procedimientos de la presente invención
proporciona ADN plásmido superenrollado aislado y/o purificado, y
una composición que contiene el ADN plásmido superenrollado, que
preferentemente está libre de endotoxina free, de forma tal que la
cantidad de ADN plásmido superenrollado presente en la composición
producida mediante los procedimientos aquí descritos es al menos 50%
en peso de la cantidad total de plásmido a al menos 99% en peso,
preferentemente al menos 60% en peso a al menos 95% en peso, más
preferentemente al menos 70% en peso a al menos 90% en peso, más
preferentemente al menos 75% en peso a al menos 85% en peso, ADN
plásmido
superenrollado.
superenrollado.
El porcentaje en peso puede medirse, como aquí
se ejemplifica, mediante resolución HPLC sobre una columna
ADN-NPR HPLC, a través de un gradiente, resultando
en picos con áreas correspondientes a la cantidad de cada
componente. El porcentaje de forma superenrollada se calculó como
la fracción del área del pico correspondiente al ADN superenrollado
al área total de los picos de ADN plásmido superenrollado y
relajado.
El medio de interacción hidrofóbica preferido
que puede ser utilizado en los procedimientos de la presente
invención incluye resinas de cromatografía hidrofóbicas de
interacción que, por ejemplo, contienen polímero metacrilato o
esqueleto copolímero, tales como copolímeros metacrilato/etilen
glicol y/o metacrilato/propilen glicol (TosoHaas, Montgomeryville.
PA), y/o una agarosa o sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech.
Piscataway, NJ), tales como reticulada o
no-reticulada, agarosa, sefarosa, dextrano, silica
que contiene polímero, polímeros orgánicos (naturales o sintéticos),
una cerámica que contenga, o una matriz de gel, esqueleto, o una
combinación de cualquiera de éstos, con C_{3} a C_{10} alquil,
ramificado o recto, ligandos pendientes de cadenas laterales. Los
grupos pendientes hidrofóbicos preferidos incluyen ligandos
propil, butil, hexil y/o octil. Estos ligandos proporcionan la
interacción preferencial de enlace que se aprovecha en los
procedimientos de separación, purificación y/o aislamiento de la
presente invención. Una persona de habilidad ordinaria en la
técnica apreciará que las resinas hidrofóbicas de interacción pueden
incluir ligandos además a o en lugar de esos ligandos alquil, que
también serán útiles en el procedimiento de la presente invención.
Ejemplos de tales ligandos incluyen, pero no están limitados a,
fenil, octil, butil, propil, neopentil, hidroxipropil, benzil,
octadecil, difenil, y metil así como derivados sustituidos y no
sustituidos del mismo, y combinaciones de los mismos. Resina o
materiales de medio adecuados útiles en la presente invención
incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente EP No.
964057, Solicitud EP No. 99109441, JP 2000035423, JP 99127700 y JP
98127665 (Kitamura et al.).
El medio de interacción hidrofóbica puede estar
en forma de granos, que pueden ser empaquetados o cargados en una
columna o lecho reactor, o un medio reticulado poroso. El tamaño de
grano del medio puede oscilar de 2,5 \mum a más o igual a 100
\mum. El tamaño de grano del medio está preferentemente en el
rango de 30 a 110 \mum de diámetro, tales como 35 a 100 \mum de
diámetro, o, alternativamente en el rango de 35 a 90 \mum de
diámetro. El medio de interacción hidrofóbica puede estar presente
en forma de membranas, tales como esqueletos de celulosa o de
derivados de celulosa, poliéter sulfonas, polisulfonas, y derivados
de la misma y/u otros materiales conocidos en las técnicas de
filtración y separación, incluyendo plásticos, tales como e
incluyendo placas de microtítulo y de Petri o placas y contenedores
de cultivo de células.
Los granos utilizados en columnas
"Streamline" (Amersham Pharmacia biotech) típicamente son de
mayor tamaño con diferentes densidades, y son hechos por varios
fabricantes, incluyendo (Amersham Pharmacia Biotech, Biosepra Inc,
pero no limitado a éstos, donde el lisado clarificado puede fluir a
través de estas columnas de "lecho expandido", resultando en la
extracción de contaminantes a través de la unión a los granos que
contienen los ligandos interactivos hidrofóbicos.
Tamaños de granos menores, son típicamente
utilizados en separaciones de alto rendimiento, incluyendo HPLC,
donde esta invención puede utilizarse para proporcionar un
procedimiento analítico cuantitativo para ADN plásmido y/o
diferentes formas de ADN.
Los granos para los propósitos de uso en esta
invención, particularmente la separación de dos formas de ADN
plásmido no necesitan ser porosos ya que el ADN plásmido es
generalmente demasiado grande para ser capaz de ocupar los poros, y
por lo tanto proporcionar cualquier capacidad adicional. Sin
embargo, para los propósitos de enlace de contaminantes, los poros
pueden incrementar efectivamente la capacidad ya que las moléculas
contaminantes tales como ARN, proteínas, endotoxinas y fragmentos de
ADN son entonces comparables o menores que el tamaño de los poros.
En este caso la porosidad jugará un papel y por lo tanto las
resinas porosas pueden ser útiles.
En los siguientes procedimientos de la presente
invención:
- (i)
- purificar ADN plásmido a partir de una mezcla del mismo que contiene al menos una impureza de célula huésped;
- (ii)
- separar ADN plásmido superenrollado de ADN plásmido relajado; y
- (iii)
- enriquecer la cantidad de ADN superenrollado relativa al ADN relajado en una mezcla de los mismos;
el procedimiento se realiza en
ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles, cobalto
hexamina, espermidina y polivinilpirrolidona. Otros procedimientos
de la invención preferentemente no requieren solventes orgánicos o
aditivos o detergentes, tales como glicoles, polietilenglicol,
cobalto hexamina, espermidina o polivinil pirrolidona, que más
tarde requerirán separación del producto ADN plásmido
superenrollado antes de utilizarlo en, por ejemplo, terapia
génica.
La figura 1 muestra un diagrama de flujo de las
distintas etapas implicadas en realizar el procedimiento
ejemplificado de separar ADN plásmido superenrollado y
relajado.
La figura 2 muestra una representación
conceptual de los distintos soportes hidrofóbicos de interacción con
las químicas del ligando unidas a las mismas que fueron utilizados
en el procedimiento ejemplificado.
La figura 3 muestra un diagrama de flujo de las
distintas etapas implicadas en la realización del procedimiento
ejemplificado de separar la endotoxina del ADN plásmido.
La figura 4 (inserción) muestra una imagen
escaneada de un gel de agarosa del Ejemplo 5 (butil HIC) teñido con
SYBR GOLD donde el carril 1 contiene un ADN superenrollado Ladder;
los carriles 2 y 3, contienen muestras del pico 1 (relajado) y los
carriles 3-5 contienen muestras del pico 2
(superenrollado). (Estando los carriles numerados de izquierda a
derecha). El cromatograma del Ejemplo 5 de absorbancia versus
volumen muestra la separación del ADN relajado (pico 1) y
superenrollado (pico 2).
La figura 5 (inserción) muestra una imagen
escaneada de un gel de agarosa del Ejemplo 6 (butil HIC) teñida con
SYBR GOLD donde el carril 1 contiene un marcador; los carriles 2 y 3
contienen muestras del pico 1 (relajado) y los carriles
4-6 contienen fracciones del pico 2 (forma
superenrollada). (Estando los carriles numerados de izquierda a
derecha). El cromatograma del Ejemplo 6 muestra la separación de
formas de ADN relajado (pico 1) y superenrollado (pico 2).
La figura 6 (inserción) muestra una imagen
escaneada de un gel de agarosa del Ejemplo 7 donde el carril 1
contiene un marcador, los carriles 2 y 3 contienen material cargado
sobre la columna; el carril 4 contiene material del pico del
artefacto; el carril 5 contiene material de la Elución 2,4M AS; y el
carril 6 contiene material de la Elución 1M AS. (Estando los
carriles numerados de izquierda a derecha). El cromatograma muestra
la separación de formas de ADN plásmido relajado y superenrollado
donde el pico del artefacto es un pico iniciador ancho (izquierda),
seguido hacia la derecha por picos relajado y superenrollado,
respectivamente.
La figura 7 (inserción) muestra una imagen
escaneada de un gel de agarosa del Ejemplo 8 (hexyl HIC) donde el
carril 1 contiene un marcador; los carriles 2-4
contienen material del pico 1 (forma relajada); y los carriles 5 y
6 contienen fracciones del pico 2 (forma superenrollada). (Carriles
y picos numerados de izquierda a derecha). El cromatograma
demuestra la separación de las formas relajada de la
superenrollada.
La figura 8 muestra una imagen escaneada de una
electroforesis de un gel de agarosa de muestras teñidas SYBR GOLD,
del Ejemplo 9, donde el carril 1 es un marcador; el carril 2
contiene el material cargado sobre la columna; los carriles 3, 4 y
5 contienen los lavados 1, 2 y 3, respectivamente; el carril 6
contiene la elución 1M; y el carril 7 contiene la elución de
agua.
Los procedimientos de la presente invención
aprovechan las diferencias en las hidrofobicidades del ADN
plásmido superenrollado, ADN plásmido relajado y contaminantes
celulares, tales como endotoxina.
Los procedimientos aquí descritos son útiles
para purificar y aislar ADN plásmido superenrollado, cósmidos, y
vectores fagomideos. Estos vectores y el ADN plásmido pueden ser
purificados a partir de cualquier fuente. Además, el ADN plásmido y
cósmidos presentes en levadura y células de mamífero también pueden
ser purificados, ya que mezclas similares de contaminantes,
incluyendo endotoxinas, ARN, proteínas y ADN cromosómico, pueden
estar presentes en estas preparaciones. También existe la necesidad
de obtener la forma superenrollada del ADN plásmido y cósmido a
partir de estas fuentes y por lo tanto, los procedimientos aquí
descritos pueden ser utilizados para purificar ADN en muchas de
estas aplicaciones.
"Medio de interacción hidrofóbica" es un
material que comprende (a) una mitad soporte y (b) una mitad
hidrofóbica unida ya sea directa o indirectamente a la mitad
soporte, ejemplos de los cuales son aquí descritos y son conocidos
en la técnica. La mitad hidrofóbica proporciona las bases para la
unión preferencial utilizada en los procedimientos de separación
aquí descritos. Varios ejemplos de "medio de interacción
hidrofóbica" son conocidos en la técnica y están aquí descritos.
Otros términos aquí utilizados también indican un medio de
interacción hidrofóbica y ejemplos del mismo, tales como
"resina", "matriz", "columna", "medio",
"granos" y "ligando de interacción
hidrofóbica".
"ADN" significa cualquier forma de ácido
desoxiribonucleico, incluido, pero no limitado a, plásmido (tanto
superenrollado y/o relajado o nicked), cósmido, o cromosoma
artificial.
ADN "nicked" o "relajado" significa
ADN que no está superenrollado. ADN "superenrollado" es un
término bien entendido en la técnica.
Una "impureza contaminante" es cualquier
sustancia de la cual se desea separar, o aislar, ADN. Las impurezas
contaminantes incluyen, pero no están limitadas a, proteínas de la
célula huésped, endotoxina, ADN y/o ARN de la célula huésped. Se
entiende que, lo que es considerado una impureza contaminante puede
depender del contexto en el cual se practican los procedimientos de
la invención. Una "impureza contaminante" puede ser o no una
célula huésped derivada, por ejemplo, puede ser o no una impureza
de la célula huésped.
"Aislar " o "purificar" un primer
componente (tales como ADN) significa el enriquecimiento del primer
componente a partir de otros componentes con los cuales el primer
componente se halla inicialmente. Se proporcionan aquí grados de
purificación deseable y/o obtenible. Preferentemente, los
procedimientos de la invención resultan en un enriquecimiento
aproximado de cinco veces, preferentemente en un enriquecimiento
aproximado de diez veces, preferentemente en un enriquecimiento
aproximado de 20 veces, preferentemente en un enriquecimiento
aproximado de 50 veces, preferentemente en un enriquecimiento
aproximado de 100 veces, preferentemente en un enriquecimiento
aproximado de 200 veces, preferentemente en un enriquecimiento
aproximado de 500 veces, preferentemente en un enriquecimiento
aproximado de 1000 veces. Alternativamente, el grado de purificación
puede expresarse como un porcentaje del primer componente respecto
a otro componente, o respecto a la preparación resultante. Ejemplos
de dichos porcentajes se proporcionan aquí.
Unión o extracción "preferencial" o
"selectiva" de un componente significa que, para una condición
dada, el primer componente se une o se extrae en un mayor grado
respecto a otro componente.
Como será entendido por aquellos entendidos en
la técnica, "extracción" o "unión" no necesariamente, o
aún de forma deseada, significa completa, o 100%, extracción o
unión.
Una solución "acuosa" generalmente indica
una solución de base agua (por ejemplo, el solvente principal es
agua), que puede o no ser 100% de agua como solvente.
El aislamiento del ADN plásmido producido en
células bacterianas recombinantes implica la lisis de las células y
la extracción de restos celulares, que puede lograrse a través de
varios procedimientos. La solución final contiene ADN plásmido,
que contiene típicamente cantidades extremadamente altas de
endotoxinas entre otros contaminantes. Los procedimientos de la
presente invención prevén la extracción de cantidades
significativas de los contaminantes claves, tales como ARN, ADN
genómico, proteína y endotoxina utilizando cromatografía de
interacción hidrofóbica como una primera etapa, donde el ADN
plásmido fluye sin unir. Un procedimiento de la presente invención
implica, opcionalmente dializar la solución mezclada obtenida a
partir de la lisis bacteriana en un tampón en el rango de pH de 6,8
a 8,5, preferentemente un pH de 6,8 a 7,4, que contiene,
preferentemente, 2M sulfato de amonio, con o sin 10 mM ácido
etilenodiaminotetraacético (EDTA), y fluir opcionalmente la
solución dializada a través de una columna de cromatografía
empaquetada que contiene un soporte cromatográfico con un
ligando(s) de interacción hidrofóbica, tales como cualquiera
de, o una mezcla de, un ligando propil, butil, octil o hexyl, que
preferentemente había sido, previamente equilibrado con un tampón
en el rango de pH de 6,8 a 8,5 (preferentemente 6,8 a 7,4), que
también contiene 2M sulfato de amonio, con o sin 10 mM EDTA. La
solución de flujo continuo está típicamente a una concentración de
sales aproximadamente de 2M, tales como sulfato de amonio, y
predominantemente contiene ADN plásmido (mezcla de superenrollado y
relajado) con menos de 2% de contaminantes. Dependiendo de las
variaciones en las etapas anteriores, el porcentaje de ADN
superenrollado puede oscilar en cualquier parte entre 50 y 95% en
peso, típicamente aproximadamente 75 a 85%, alternativamente, 80 a
85%, requiriendo purificación adicional, implicando la extracción
de la forma relajada de ADN plásmido de la mezcla.
Procedimientos de la presente invención también
hacen posible producir ADN plásmido purificado que tiene niveles de
endotoxina por debajo de niveles especificados, por ejemplo,
típicamente <10 EU/mg ADN plásmido. Los procedimientos de
extracción de endotoxina de la presente invención son adaptables
tanto a producción a gran escala como a pequeña escala, permitiendo
la producción económica de material de grado terapéutico y de
laboratorio. Estos procedimientos aprovechan la unión selectiva de
la endotoxina a las resinas hidrofóbicas aquí descrito que, para
producción a gran escala, puede contener capacidades que excedan un
millón de unidades por mililitro de resina utilizada.
Los procedimientos convencionalmente disponibles
de extracción de endotoxina tienen bajas capacidades (1.000 a
50.000 EU/mililitro de resina) y/o resultan en bajas recuperaciones
de ADN plásmido y/o implican el uso de componentes químicos y/o
procedimientos que no pueden ser fácilmente utilizados en la
preparación de material de grado terapéutico. (Patente U.S. No.
5.747.663). El procedimiento de extracción de endotoxina de la
presente invención implica suspender la solución que contiene
endotoxina y ADN plásmido en una sal, tales como sulfato de amonio
o cloruro de sodio a una concentración de 2M que hace a la
endotoxina significativamente más hidrofóbica que el ADN plásmido y
asegura la unión o interacción preferencial y separación de la
endotoxina sobre la resina que contiene ligandos hidrofóbicos de
interacción, tales como grupos butil, octil, y/o hexil, en
comparación con el ADN plásmido. La concentración de sal utilizada
puede preferentemente ser optimizada para unir ARN, proteína y
endotoxina. Una baja concentración de sal puede ser suficiente para
proporcionar la unión de la endotoxina sola ya que la endotoxina
tiene una mayor afinidad para los ligandos hidrofóbicos de
interacción aquí
descritos.
descritos.
Una característica atractiva de este
procedimiento de extracción de endotoxina es la inmensa capacidad
de la resina por la endotoxina, de aproximadamente 1.000.000 EU/ml
de resina, además de la simplicidad y >95% de recuperación de
ADN plásmido. Por ejemplo, una solución de ADN plásmido que
contiene 500 mg de plásmido y 10 millones EU de endotoxina puede ser
purificada utilizando 10 ml de resina, mientras que, se requerirían
al menos 1.000 a 4.000 ml de una resina de intercambio de aniones
para unir el ADN plásmido y la endotoxina, con la desventaja
añadida de recuperaciones pobres de resina de intercambio de
aniones. El procedimiento de la presente invención por lo tanto
resulta en ahorros de 100 a 400 veces en el coste de la resina, y
ahorros adicionales de coste de columna y recuperación incrementada
de producto. La resina comercialmente disponible ADN Etox es
actualmente al menos 8 veces más cara que las resinas utilizadas en
el procedimiento de la presente invención. Otra resina comercial
(PolyFlo - PureSyn Inc., 87 Great Valley Pkwy Malvem, PA 19355) con
propiedad química que es útil en la extracción de endotoxina es 5 a
10 veces más cara y requiere el uso de solventes y químicos de
apareamiento de
iones.
iones.
Los procedimientos de la presente invención
proporciona ADN plásmido de alta calidad que comprenden más de 90%
de ADN plásmido superenrollado a partir del material inicial de
menor calidad (por ejemplo, un material inicial compuesto de una
mezcla de ADN relajado y superenrollado). Adicionalmente, los
procedimientos de la presente invención son aplicables para
procesos a gran escala típicamente usados para la producción de ADN
plásmido para terapia génica. Los procedimientos de la presente
invención permiten una producción confiable de ADN plásmido de alta
calidad, independiente de variaciones que típicamente conducen a la
reducción en calidad por ejemplo generación de forma de ADN
plásmido relajado/nicked. Estas variaciones pueden producirse
durante el crecimiento de las bacterias que producen el ADN
plásmido y las subsiguientes etapas de aislamiento y
purifica-
ción.
ción.
Los procedimientos de separación de ADN plásmido
superenrollado y relajado, y procedimientos de separación de ADN
plásmido y endotoxina, de la presente invención se basan en un
descubrimiento de que las formas de ADN plásmido y endotoxina
exhiben diferentes especificidades de unión sobre resinas de
cromatografía hidrofóbicas de interacción que, por ejemplo,
contienen C_{4} a C_{10} alquil, ramificados o rectos, ligandos,
y preferentemente contienen tanto un ligando butil o un hexil.
Estos ligandos proporcionan la interacción preferencial de unión
que es aprovechada en los procedimientos de separación, purificación
y/o aislamiento de la presente invención. Una persona de habilidad
ordinaria en la técnica apreciará que las resinas hidrofóbicas
pueden incluir ligandos además de o en lugar de estos ligandos
alquil, que también serán útiles en el procedimiento de la presente
invención. Ejemplos de dichos ligandos también se describen con
anterioridad. Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran los
procedimientos de la presente invención descrita. Los siguientes
procedimientos generales fueron o pueden ser
utilizados.
utilizados.
Se extrajeron plásmidos para aplicaciones de
terapia génica a partir de una bacteria huésped adecuada, por
ejemplo Escherchia coli, a continuación de una fermentación.
En la siguiente ejemplificación de la invención descrita, se
utilizó E. coli STBL-2, que contiene
plásmido pEIA-K2. El plásmido
pEI-A-K2 es un derivado plásmido pUC
que contiene un gen supresor de adenovirus Tipo 5, y contiene un
gen kanamicina como un marcador seleccionable. La fermentación se
llevó a cabo anaeróbicamente en un medio adecuado de extracto de
levadura/glucosa que contiene sales inorgánicas, tales como fosfato
de potasio mono básico, fosfato de sodio dibásico, sulfato de
amonio y sulfato de magnesio a un pH de entre 6,5 a 7,8,
preferentemente 7,0, y a una temperatura de 37ºC. La aireación se
ajustó a un volumen de aire por volumen de medio y la agitación se
ajustó a 800 rpm. Las células se cultivaron en esta forma hasta que
se agotó la glucosa del medio, luego se controló la DO del caldo de
fermentación mediante la alimentación de glucosa y agitación. La
alimentación contenía una solución concentrada de glucosa (160 g/L)
y extracto de levadura (80 g/L) y sales (1,5 g/L sulfato de amonio,
MgSO_{4}, 1,5 g/L en tampón fosfato). Después de completar la
fermentación, las células fueron recogidas mediante centrifugación
o mediante filtración a través de membranas de ultra o
microfiltración, y lavadas con TE tampón (ver a continuación), pH
7,4. Las células fueron lisadas contactando la suspensión con un
volumen igual de una solución de 0,15N a 0,2N NaOH y 1% sulfato de
sodio dodecil (pH 11,5 a 13) con mezclado suave. La solución
alcalina fue neutralizada con una solución de acetato de potasio.
El material fue luego clarificado tanto mediante centrifugación como
mediante el pasaje de la suspensión a través de una serie de
filtros intensos. Las soluciones de plásmido son concentradas
mediante membranas de ultrafiltración y diafiltración contra TE
tampón, pH 7. El concentrado diafilter puede aplicarse directamente
al medio aquí
descrito.
descrito.
El contenido de ADN plásmido del lisado es
generalmente menos del 2% del ácido nucléico total siendo la mayor
parte de los contenidos ARN o ADN cromosómico. Además, el lisado
está contaminado con endotoxina y proteínas celulares.
La presente invención también proporciona
procedimientos de producción a escala pequeña, de laboratorio o de
banco de ADN aislado o purificado, y equipos de columnas y
separadores útiles aquí. Una persona de habilidad ordinaria en la
técnica apreciará que la producción a pequeña escala de ADN
plásmido introduce desafíos diferentes, en comparación con la
producción gran escala. Específicamente, la separación a pequeña
escala comporta la separación de una mayor proporción de ARN
contaminante en el material inicial, de forma tal que mientras la
relación de plásmido respecto al ARN en un material inicial a gran
escala puede ser aproximadamente 2% (wt/wt), como se indicó
anteriormente, la relación de pequeña escala es aproximadamente
0,1% (wt/wt). Además, el volumen de cultivo de las muestras a
pequeña escala es generalmente de aproximadamente 2 mL hasta
aproximadamente 2 L, en oposición a los de aproximadamente 5 L hasta
aproximadamente 1000L en la separación a gran escala. Las
separaciones a pequeña escala de la presente invención implican
aproximadamente 100 \mug hasta aproximadamente 1mg de plásmido con
un volumen reactor o columna lecho de aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 20 ml; usualmente en el rango de aproximadamente 10
ml hasta aproximadamente 15 ml. La presente invención proporciona
por lo tanto, producción eficiente a pequeña escala de ADN aislado
y/o purificado, preferentemente ADN superenrollado, a partir de
impurezas, tales como endotoxina, ARN y ADN relajado.
Mientras que distintos procedimientos son
utilizados en la presente ejemplificación, una persona de habilidad
ordinaria apreciará que otros procedimientos preparatorios y
materiales iniciales pueden ser utilizados en la invención aquí
descrita.
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Ejemplo
1
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de filtración. Todos los tampones utilizados fueron
filtrados a través de un filtro de 0.2 \mum, y se almacenaron
muestras para endotoxina en tubos de muestra de poliestireno.
Un concentrado de diafiltración (\sim 400 ml)
se dializó en TE pH 7,4 (50 ml Tris, 10 mM EDTA ajustado a pH 7,4
con HCI) se utilizó para el experimento. Se añadió sulfato de amonio
(AS) según se requirió para llevar la muestra 2M a 100 ml de TE más
2M AS, tampón pH 7,4 y parcialmente disuelta. Esta solución se
añadió a la muestra dializada para hacer un volumen final de 575
ml, del cual 475 ml se utilizaron para el experimento.
Una columna Butil 650S (resina Butil 650S de
TosoHaas Inc., 156 Keystone Drive, Montgomeryville, PA 18936) de
2,6 cm de diámetro y 15 cm de altura de lecho, de aproximadamente 75
ml volumen de lecho se empaquetó y se equilibró con TE tampón, pH
7,4, que contiene 2M AS. La muestra se cargó a una tasa de flujo de
5 ml/min. El flujo continuo se recolectó, y se tomaron muestras
para análisis (concentración ADN, gel de agarosa, y ensayo de
endotoxina. El ensayo de endotoxina se realizó con jeringuillas y
las muestras fueron diluidas apropiadamente para obtener
recuperaciones PPC (Positive Product Control) en el rango
considerado aceptable. Las concentraciones de endotoxina se
determinaron utilizando el ensayo BioWhittaker
Kinetic-QCL Chromogenic LAL como se describió en la
BW publicación No. P50-650U-5,
Kinetic-QCL Test Kit Manual. A continuación de la
carga de la muestra, se hizo fluir TE que contiene 2M sulfato de
amonio a través de la columna, y se recogió y se muestreó. La
columna fue subsiguientemente lavada con TE tampón - pH 7,4, USP
agua purificada, y limpiada con 0,5N hidróxido de sodio, y
enjuagada con >15 volúmenes de USP agua purificada. La endotoxina
estuvo presente en cada uno de estos lavados como se muestra a
continuación en la Tabla 1. Además para esta excepcional eficiencia
de extracción de endotoxina, se extrajeron cantidades
significativas de ARN, proteína, y fragmentos de ADN, dejando la
muestra significativamente purificada.
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Ejemplo
2
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de filtración.
La diafiltración del concentrado (- 650 ml) se
dializó en TE pH 7,4 (50 mM Tris, 10 mM EDTA ajustado a pH 7,4 con
HCl) y el sulfato de amonio requerido para volver la muestra 2M se
añadió a 1200 ml de TE que contiene 2M AS, pH 7,4 tampón y se
disolvió. El volumen de esta solución se llevó hasta 1300 ml. Esta
solución se añadió a la muestra dializada para hacer un volumen
final de 1950 ml, y el pH se ajustó a 7,4 utilizando HCI.
Una columna Butil 650S de 5 cm diámetro y 15 cm
de altura de lecho, de aproximadamente 275 ml de volumen de lecho se
empaquetó y equilibró con TE tampón, pH 7,4, que contiene 2M AS. La
muestra se cargó a una tasa de flujo de 20 ml/min. El flujo
continuo se recogió, y se tomaron muestras para análisis
(concentración ADN, gel de agarosa, y ensayo de endotoxina, como se
describió anteriormente). A continuación de la carga de la muestra,
TE que contenía 2M sulfato de amonio se hizo fluir a través de la
columna, y se recogió y se muestreó. La columna fue
subsiguientemente lavada con TE tampón - pH 7,4, USP agua
purificada, y limpiada con 0,5N hidróxido de sodio, y enjuagada con
>15 volúmenes de USP agua purificada. La endotoxina estaba
presente en cada uno de estos lavados como se muestra a
continuación en la Tabla 2. Además de esta extremadamente
excepcional eficiencia de extracción de endotoxina, se extrajeron
cantidades significativas de ARN, proteína, y fragmentos de ADN,
dejando la muestra significativamente purificada.
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Ejemplo
3
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de centrifugación. El sobrenadante se dializó en un
tampón 20 mM fosfato de potasio (solución 20 mM fosfato de potasio
monobásico combinada con 20 mM fosfato de potasio dibásico en una
proporción para obtener un pH de 6,8), pH 6,8 y el sulfato de amonio
requerido para hacer la muestra 2M se añadió a 20 ml de KPB (20 mM
fosfato de potasio tampón) que contiene 2M AS, pH 6,8 tampón y se
disolvió. Esta solución se añadió a 5 ml de muestra dializada para
hacer un volumen final de 25 ml y el pH se ajustó a
6,8.
6,8.
Una columna Hexyl 650C (TosoHaas) de 1,6 cm
diámetro y 4 cm de altura de lecho, de aproximadamente 8 ml de
volumen de lecho se empaquetó y equilibró con KPB, pH 6,8, que
contiene 2M AS. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2
ml/min. El flujo continuo se recogió, y se tomaron muestras para
análisis (concentración ADN, gel de agarosa, y ensayo endotoxina,
ver anterior). A continuación de la carga de la muestra, se
permitió el flujo continuo de KPB que contiene 2M sulfato de amonio
en la columna, se recogió y se muestreó. La columna fue
subsiguientemente lavada con KPB pH 6,8, USP agua purificada, y
limpiada con 0,5N hidróxido de sodio, y enjuagada con >15
volúmenes de USP agua purificada. La endotoxina estaba presente en
cada uno de estos lavados como se muestra a continuación en la Tabla
3. Además de esta eficiencia extremadamente excepcional de
extracción de endotoxina, se extrajeron cantidades significativas
de ARN, proteína, y fragmentos de ADN, dejando la muestra
significativamente
purificada.
purificada.
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Ejemplo
4
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2, y lisado utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de centrifugación como se describió anteriormente.
El sobrenadante se utilizó para el experimento. Se añadió sulfato de
amonio requerido para hacer la muestra 2M a 20 ml de TE más 2M AS,
pH 7,4 tampón y se disolvió. Esta solución se añadió a 10 ml de
muestra dializada para hacer un volumen final de 25 ml y el pH se
ajustó a 7,4.
Una columna Octil Sefarosa 4 de Flujo Rápido
(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) de 1,0 cm diámetro y 10
cm de altura de lecho, de aproximadamente 8 ml de volumen de lecho
se empaquetó y equilibró con TE, pH 7,4, que contiene 2M AS. La
muestra se cargó a una tasa de flujo de 2 ml/min. El flujo
continuo se recogió, y se tomaron muestras para análisis
(concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayo de endotoxina). A
continuación de la carga de la muestra, TE que contiene 2M sulfato
de amonio se hizo fluir a través de la columna, se recogió y se
muestreó. La columna fue subsiguientemente lavada con TE pH 7,4,
USP agua purificada, y limpiada con 0,5N hidróxido de sodio, y
enjuagada con >15 volúmenes de USP agua purificada. La
endotoxina estaba presente en cada uno de estos lavados como se
muestra a continuación en la Tabla 4.
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Ejemplo
5
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de filtración, como se describió anteriormente. La
purificación gruesa del ADN plásmido para eliminar los contaminantes
principales tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosómico,
etc. se realizó utilizando cromatografía butil de interacción
hidrofóbica, donde, a una concentración de 2M Sulfato de amonio, el
ADN plásmido fluye a través de la columna mientras los contaminantes
se unen a la columna (ver anterior).
El flujo continuo que contiene el ADN plásmido
se dializó y procesó sobre una columna de intercambio de iones (Bio
Sepra) que no proporcionaba ninguna purificación adicional. El
procesado a través de la columna Q de intercambio de iones y
diafiltraciones no son necesarias para lograr la separación sobre
la columna butil. La elución de la columna Q de intercambio de iones
fue diafiltrada utilizando una membrana 30 kD regenerada de
celulosa (0,1 m^{2}, Millipore Corporation). El material dializado
se ajustó a 3M sulfato de amonio utilizando sulfato de
amonio
sólido.
sólido.
Una columna Butil (Toyopearl Butil 650S -
TosoHaas) de 2,6 cm diámetro y aproximadamente 15 cm de altura se
empaquetó a una tasa de flujo de 15-20 mUmin. La
columna fue equilibrada con 3M sulfato de amonio en Tris - EDTA
tampón pH 7,4. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 5 ml/min.
El plásmido se unió a la columna a 3M sulfato de amonio. La columna
fue entonces lavada con 2-3 volúmenes de columna de
una solución 3M de sulfato de amonio en tampón. La columna se eluyó
entonces con un gradiente de sulfato de amonio de concentración
desde 3M a 1M sobre 6 volúmenes de lecho. Durante el gradiente de
elución, resultaron dos picos, el primer pico que contiene la forma
relajada del ADN plásmido, y el segundo pico que contiene la forma
superenrollada de ADN plásmido como se evidencia en fracciones del
gel de agarosa (la figura 4A). El cromatograma se muestra en la
figura 4B. Los resultados fueron confirmados adicionalmente
mediante un ensayo HPLC utilizado para determinar el porcentaje de
las dos formas (Tabla 5).
Dentro de los limites de sensibilidad del
ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía un 85% de forma
superenrollada, mientras que el material inicial sólo contenía un
50-60% de forma superenrollada. Al menos un 90% del
ADN plásmido superenrollado inicial fue recuperado. La resolución de
los picos fue adecuada para realizar la separación, aún con una
altura de columna de 15 cm. Esto demuestra la separación efectiva
de formas superenrollada y relajada del plásmido utilizando
cromatografía Butil de interacción hidrofóbica. Además de esta
excelente separación, la cantidad residual de ARN, proteína, y
endotoxina pueden ser extraídas resultando en un producto que reúne
las especificaciones para la terapia génica.
Ejemplo
6
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de filtración, como descrito anteriormente. Se
realizó una purificación gruesa del ADN plásmido para eliminar los
principales contaminantes tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN
cromosómico, etc. utilizando cromatografía butil de interacción
hidrofóbica, donde, a una concentración de 2M Sulfato de amonio,
el ADN plásmido fluye a través de la columna mientras los
contaminantes se unen a la columna (ver anterior). El flujo
continuo que contiene el ADN plásmido se dializó y procesó sobre
una columna de intercambio de iones que no proporciona ninguna
purificación adicional. La elución de la columna Q fue diafiltrada
utilizando una membrana de celulosa 30 kD regenerada. El material
dializado se ajustó a 3M sulfato de amonio utilizando sulfato de
amonio solido, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo
5.
Una columna Butil (Toyopearl Butil 650S -
TosoHaas) de 2,6 cm diámetro y aproximadamente 30 cm de altura se
empaquetó a una tasa de flujo de 15-20 ml/min. La
columna fue equilibrada con 3M sulfato de amonio en Tris - EDTA
tampón pH 7,4. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 5 ml/min.
El plásmido se unió a la columna a 3M sulfato de amonio. La columna
se lavó entonces lavada con 2-3 volúmenes de lecho
con una solución tampón 3M sulfato de amonio. La columna se eluyó
con un gradiente de concentración de sulfato de amonio de 3M a 1M
sobre 6 volúmenes de lecho. Durante el gradiente de elución,
resultan dos picos, el primer pico que contiene la forma relajada
del ADN plásmido, y el segundo pico que contiene la forma
superenrollada de ADN plásmido como se evidenció en el gel de
agarosa de fracciones (la figura 5A). El cromatograma se muestra en
La figura 5B. Los resultados fueron adicionalmente confirmados
mediante un ensayo HPLC utilizado para determinar el porcentaje de
las dos formas (Tabla 6).
Dentro de los límites de sensibilidad del
ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía un 90% de forma
superenrollada, mientras que el material inicial sólo contenía 50%
de forma superenrollada. La resolución de punto de partida de los
picos se obtuvo con la columna más larga. Este ejemplo demuestra
claramente la separación efectiva de las formas superenrollada y
relajada del plásmido utilizando cromatografía butil de interacción
hidrofóbica. Además de esta excelente separación, cantidades
residuales de ARN, proteína, y endotoxina pueden extraerse
resultando en un producto que reúne las especificaciones para
terapia génica.
Ejemplo
7
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de filtración, como se ha descrito anteriormente. Se
realizó una purificación gruesa del ADN plásmido para eliminar los
principales contaminantes tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN
cromosómico, etc. utilizando cromatografía butil de interacción
hidrofóbica, donde, a una concentración de 2M Sulfato de amonio,
el ADN plásmido fluye a través de la columna mientras que los
contaminantes se unen a la columna (ver Ejemplo 1 anterior). El
flujo continuo y el lavado se reunieron y concentraron utilizando
una membrana 30 kD de ultrafiltración utilizando filtración de flujo
tangencial. El ADN plásmido concentrado se ajustó a 3M sulfato de
amonio utilizando sulfato de amonio sólido.
Una columna Butil (Toyopearl Butil 650S -
TosoHaas) de 1 cm diámetro y aproximadamente 30 cm de altura se
empaquetó a una tasa de flujo de 6 ml/min. La columna fue
equilibrada con 3M de sulfato de amonio en Tris - EDTA tampón pH
7,4. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2 ml/min. El
plásmido se unió a la columna a 3M sulfato de amonio. La columna se
lavó entonces con 2-3 volúmenes de lecho con una
solución tampón 3M de sulfato de amonio. La columna se eluyó
entonces con varias concentraciones de sulfato de amonio - 2,8M,
2,7M, 2,6M, 2,55M, 2,5M, 2,4M, 1M - utilizando 2-3
volúmenes de columna. Se observaron picos en las eluciones 2,4M y
1M. La electroforesis de gel de agarosa de los picos se muestra en
la figura 6A. El gel indica separación clara de las formas
superenrollada y relajada. La elución 2,4M contiene la forma
relajada, mientras que la elución 1M contiene el ADN superenrollado.
El cromatograma se muestra en la figura 6B. Los resultados fueron
adicionalmente confirmados mediante un ensayo HPLC usado para
determinar el porcentaje de las dos formas (Tabla 7).
Dentro de los límites de sensibilidad del
ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía un 93% de forma
superenrollada, mientras que el material inicial sólo contenía 62%
de forma superenrollada. Estos resultados fueron confirmados
mediante subsiguientes experimentos donde las eluciones 2,3M y 2,2M
no proporcionan la resolución, y la elución 2,4M repetidamente
proporcionó una significativa extracción de la forma relajada,
enriqueciendo así la forma superenrollada en la elución 1M. La
separación lograda utilizando la elución por etapas es significativa
en separaciones a gran escala, que son realizadas de forma más
confiable utilizando eluciones en etapas. Este ejemplo demuestra
claramente la efectiva separación de las formas superenrollada y
relajada del plásmido utilizando elución por etapas de
cromatografía butil de interacción hidrofóbica. Además de esta
excelente separación, la cantidad residual de ARN, proteína, y
endotoxina puede ser extraída resultando en un producto que reúne
las especificaciones para terapia génica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2 y se lisaron utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de filtración, como se ha descrito anteriormente. Se
realizó una purificación gruesa del ADN plásmido para eliminar los
principales contaminantes tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN
cromosómico, etc. utilizando cromatografía butil de interacción
hidrofóbica, donde, a una concentración de 2M Sulfato de amonio, el
ADN plásmido fluye a través de la columna mientras que los
contaminantes se unen a la columna (ver, por ejemplo, Ejemplo 1
anterior). El flujo continuo que contiene el ADN plásmido se
dializó y procesó en una columna de intercambio de iones que no
proporciona ninguna purificación adicional. La elución de la
columna Q fue diafiltrada utilizando una membrana de celulosa 30 kD
regenerada. El material dializado se ajustó a 3M sulfato de amonio
utilizando sulfato de amonio sólido (ver anterior).
Una columna Hexyl (Toyopearl Hexyl 650C -
TosoHaas) de 1 cm diámetro y aproximadamente 30 cm de altura se
empaquetó a una tasa de flujo de 5 ml/min. La columna fue
equilibrada con 3M sulfato de amonio en Tris-EDTA
tampón pH 7,4. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2 ml/min.
El plásmido se unió a la columna a 3M sulfato de amonio. La
columna se lavó entonces con 2-3 volúmenes de lecho
con una solución 3M sulfato de amonio tampón. La columna se eluyó
entonces con un gradiente de sulfato de amonio de concentración de
3M a 1M durante 6 volúmenes de lecho. Durante el gradiente de
elución, resultaron dos picos, el primer pico que contiene
predominantemente la forma relajada del ADN plásmido, y el segundo
pico que contiene predominantemente la forma superenrollada de ADN
plásmido cono se evidencia en el gel de agarosas de fracciones (La
figura 7A).
El cromatograma se muestra en la figura 7B.
Cualitativamente, el segundo pico contenía significativamente una
mayor proporción de plásmido superenrollado que el material inicial
basado en la electroforesis de gel de agarosa. Se obtuvo una
excelente resolución de los picos, considerando el hecho de que el
tamaño de grano fue de 100 :m para el Hexyl, comparado con 35 :m
para el Butil.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se cultivaron células de E. coli que
abrigan el plásmido pEIA-K2 y se lisaron utilizando
procedimientos químicos, y se clarificaron a través de
procedimientos de centrifugación. El sobrenadante se utilizó para
el experimento. La muestra fue purificada a través de una columna de
intercambio de iones (Q Hyper D - BIOSEPRA Inc.). Una elución 2M de
cloruro de sodio de la columna se utilizó para este experimento. La
muestra estuvo presente en 50 mM Tris 10 mM EDTA pH 7,4 tampón con
2M NaCl. Una columna Butil HIC (utilizando Butil 650S resina -
TosoHaas) de 1 cm de diámetro y de altura 20 cm de aproximadamente
10 ml de volumen se empaquetó y equilibró con TE que contiene 2M
cloruro de sodio. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2
ml/min. El flujo continuo se recogió, y se tomaron muestras para
análisis (concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayo de
endotoxina). A continuación de la carga de la muestra, TE que
contiene 2M sulfato de amonio se hizo fluir a través de la
columna, se recogió y se muestreó. La columna fue subsiguientemente
lavada con TE pH 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
La purificación de ADN plásmido a pequeña escala
se realiza utilizando equipos comercialmente disponibles, el más
comúnmente conocidos de los cuales es el equipo Qiagen's Miniprep.
Los procedimientos aquí descritos pueden utilizarse para la
purificación de ADN plásmido proporcionan varias ventajas sobre los
equipos comerciales. El siguiente ejemplo demuestra el uso de la
cromatografía de interacción hidrofóbica en un procedimiento de la
presente invención para purificación de ADN plásmido en una pequeña
escala.
El material inicial para la purificación se
obtuvo a través de procedimientos estándar. Específicamente, células
de E. coli que abrigan plásmido de aproximadamente 4,65 Kb
de tamaño se cultivaron en Caldo de Luria que contiene 100 \mug/ml
de ampicilina a 37ºC. Las células se recogieron a un OD de 2,7.
Las células se extrajeron del medio a través de centrifugación.
Subsiguientemente, el gránulo de células se resuspendió en 50 mM
Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8,0. Se añadió un volumen
igual de 200 mM NaOH, 1% SDS solución, se mezcló bien y se incubó a
temperatura ambiente durante 5 minutos. Esta etapa resulta en la
lisis de las células, liberando los contenidos de la célula,
incluyendo el ADN plásmido. Se añadió solución de neutralización
consistente en 3,1M de acetato de potasio (pH 5,5) en volumen igual
(original) y se mezcló bien. El lisado neutralizado se filtró
entonces a través de tela para queso y filtros para extraer el
precipitado. El lisado clarificado se precipitó con 70% isopropanol
(añadiendo 2,1 ml isopropanol por 3 ml de lisado clarificado). El
precipitado se separó a través de centrifugación y el gránulo fue
lavado con 70% etanol, secado y disuelto en 10 mM
Tris-HCl, 0,1 mm EDTA tampón, pH 8,0. Esta
preparación se congeló a -20ºC hasta su uso y fue el material
inicial para los experimentos de purificación.
Una columna Butil 650S con un volumen de lecho
de 20 ml y altura de lecho de 10 cm se empaquetó en una columna de
1,6 cm de diámetro (Pharmacia XK16/20) y se equilibró con 2,2M
sulfato de amonio (AS) en 50 mM Tris-HCl, 10 mM
EDTA (TE) tampón, pH 7,4. La muestra para cargar se preparó mediante
el añadido de sulfato de amonio solido a la concentración final de
2,2M. La muestra se diluyó con 2,2M AS en Tris - EDTA, pH 7,4 a 10
ml.
Las condiciones de purificación se diseñaron
para permitir que el ADN plásmido sea recogido en el flujo continuo
y que los contaminantes se unieran a la resina.
La muestra se cargó a 2 ml/min y se recogió el
flujo continuo. La columna fue lavada con 35 ml de 2,2M AS en TE
tampón y se recogió como fracciones Lavado 1(10 ml), Lavado
2 (14,5 ml), y Lavado 3 (10 ml). Un pico resultó durante el lavado.
La columna se eluyó con 55 ml de 1M AS en TE tampón, pH 7,4 y se
recogió como 1M Lavado 1 (10 ml) y 1M Lavado 2 (45 ml). Un pico
resultó durante la elución 1M AS. La columna se eluyó con 50 ml de
USP - Agua purificada. Resultó un pico. La tabla siguiente muestra
el ácido nucléico total presente en cada una de las fracciones
anteriores. Las concentraciones fueron calculadas en base a la
absorbancia a 260 nm (Conc. (\mug/ml) = A260 * 50).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la electroforesis de un gel de
agarosa de la muestras. La figura 8 muestra una fotocopia del gel.
La fotografía del gel muestra el ADN plásmido en las fracciones de
Lavado (carriles 3, 4, 5). En comparación con la muestra de carga
(carril 2) se ve ARN no visible en las fracciones de Lavado. Las
fracciones de elución contienen ARN como se ve en los Carriles 6 y
7. La endotoxina en el Lavado reunido se midió utilizando un ensayo
Kinetic QCL de endotoxina. No se detectó endotoxina en la muestra en
el nivel de sensibilidad del ensayo, que fue de 0.005 EU/ml. El
rendimiento de plásmido fue 733 \mug a partir de 100 ml de cultivo
que es similar al obtenible con equipos comerciales.
Producción de ADN plásmido de grado
farmacéutico, Magda Marquet, Nancy Horn, Jennifer Meek, Gregg
Budahazi, Patente U.S. Número. 5.561.064.
Concentración y fraccionamiento por tamaño de
ácidos nucléicos y virus en medio poroso, Cole, Kenneth D., Patente
U.S. Número: 5.707.850.
Purificación de ADN plásmido durante
cromatografía de columna, Nancy Horn, Greg Budahazi, Magda Marquet,
Patente U.S. Número: 5.707.812.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
\bullet FR 18112951 [0006]
\bullet US 5707812 A, Horn [0006]
[0104]
\bullet US 5747663 A, Coplan,
Metin, Moritz, Peter, Schorr,
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\bullet WO 9929832 A [0013]
\bullet EP 964057 A [0045]
\bullet EP 99109441 A [0045]
\bullet JP 2000035423 B [0045]
\bullet JP 99127700 B [0045]
\bullet JP 98127665 B, Kitamura
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\bullet Duarte Miguel Prazeres; Thomas
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\bulletGreen, A. P. et al.
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\bulletFerreira, J. M. S.
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\bulletColote et al.
Analytical Biochem., 1986, vol. 154,
15-20 [0014]
Claims (46)
1. Procedimiento para purificar ADN plásmido a
partir de una mezcla del mismo que contiene al menos una impureza
de la célula huésped que comprende las siguientes etapas:
- (a)
- formar una solución mediante la adición de suficiente sal a dicha mezcla en donde dicha solución tiene una concentración de sal en el rango de aproximadamente 2M a 4M para permitir la unión selectiva de dicha al menos una impureza de célula huésped a un medio de interacción hidrofóbica;
- (b)
- contactar dicha solución que contiene ADN plásmido con dicho medio de interacción hidrofóbica bajo condiciones en que dicha al menos una impureza se une al medio de interacción hidrofóbica para formar un complejo; y
- (c)
- recoger ADN plásmido no unido a partir de dicho complejo;
en donde dicho procedimiento se
realiza en ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles,
cobalto hexamina, espermidina, y
polivinilpirolidona.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en
donde la al menos una impureza es seleccionada del grupo consistente
en ARN, endotoxina, ADN cromosómico y proteína.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 en
donde la al menos una impureza es una endotoxina.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 en
donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo
consistente en acetato, fosfato, carbonato, SO_{4}^{2-},
Cl^{-}, Br^{-}, NO_{3}^{-}, Mg^{2+}, Li^{+}, Na^{+},
K^{+} y NH_{4}^{+}.
5. Procedimiento según la reivindicación 4 en
donde la sal es sulfato de amonio en un rango de concentración de
2M a 4M.
6. Procedimiento según la reivindicación 5 en
donde el sulfato de amonio está presente en una concentración de
2M.
7. Procedimiento según la reivindicación 1 en
donde la solución comprende sales de sodio en un rango de
concentración de 2M a 4M.
8. Procedimiento según la reivindicación 7 en
donde la sal de sodio es cloruro de sodio.
9. Procedimiento según la reivindicación 8 en
donde la sal de sodio es cloruro de sodio en una concentración de
2M.
10. Procedimiento según la reivindicación 1 en
donde la solución tiene un pH en el rango de 6,8 a 7,4.
11. Procedimiento según la reivindicación 1 en
donde la solución tiene un pH de 7,4.
12. Procedimiento de separación de ADN plásmido
superenrollado de una mezcla de ADN plásmido superenrollado y ADN
plásmido relajado y, opcionalmente, al menos una impureza de célula
huésped que comprende las siguientes etapas:
- (a)
- formar a solución mediante el añadido de una sal a la mezcla de ADN plásmido superenrollado y ADN plásmido relajado y, cuando esté presente, dicha al menos una impureza de célula huésped;
- (b)
- contactar la solución con un medio de interacción hidrofóbica bajo una primera condición donde tanto el ADN plásmido superenrollado y el ADN plásmido relajado se unen al medio de interacción hidrofóbica para formar una primera mezcla de unión;
- (c)
- alterar la primera condición que rodea la primera mezcla de unión a una segunda condición para extraer ADN plásmido relajado de la primera mezcla de unión para formar componentes separados que contienen una segunda mezcla de unión y ADN plásmido relajado; y
- (d)
- modificar la segunda condición que rodea dicha segunda mezcla de unión a una tercera condición para extraer ADN superenrollado plásmido de dicha segunda mezcla de unión para formar componentes separados que contienen medio de interacción hidrofóbica y ADN plásmido superenrollado.
13. Procedimiento según la reivindicación 12 en
donde la al menos una impureza de célula huésped es seleccionada
del grupo consistente en ARN, endotoxina, ADN cromosómico y
proteína.
\newpage
14. Procedimiento según la reivindicación 12 en
donde la al menos una impureza de célula huésped es una
endotoxina.
15. Procedimiento según la reivindicación 12 en
donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo
consistente en acetato, fosfato, carbonato, SO_{4}^{2-},
Cl^{-}, Br^{-}, NO_{3}^{-}, Mg^{2+}, Li^{+}, Na^{+},
K^{+} y NH_{4}^{+}.
16. Procedimiento según la reivindicación 15 en
donde la sal es sulfato de amonio en un rango de concentración de
2,5M a 4M.
17. Procedimiento según la reivindicación 12 en
donde la primera condición comprende equilibrar dicho medio con una
solución de sal que contiene sulfato de amonio que está presente en
un rango de concentración de 2,5M a 4M.
18. Procedimiento según la reivindicación 12 en
donde la segunda condición comprende lavar el medio con una solución
de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 2,35M
a 2,45M.
19. Procedimiento según la reivindicación 12 en
donde dicha tercera condición comprende lavar dicha segunda mezcla
de unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en
una concentración de 1 M a 2,3M.
20. Procedimiento de separación de endotoxina de
ADN plásmido que comprende contactar una mezcla de endotoxina y ADN
plásmido con un medio de interacción hidrofóbica bajo condiciones
donde dicha endotoxina se une a dicho medio de interacción
hidrofóbica para formar un complejo y separar dicho ADN plásmido y
dicho complejo.
21. Procedimiento según la reivindicación 20 en
donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo
consistente en acetato, fosfato, carbonato, SO_{4}^{2-},
Cl^{-}, Br^{-}, NO_{3}^{-}, Mg_{2}^{+}, Li^{+},
Na^{+}, K^{+} y NH_{4}^{+}.
22. Procedimiento según la reivindicación 20 en
donde dicha mezcla comprende además una sal de amonio en un rango
de concentración de 1,5 a 4M.
23. Procedimiento según la reivindicación 22 en
donde dicha sal de amonio es sulfato de amonio que está presente en
una concentración de 2M.
24. Procedimiento según la reivindicación 20 en
donde dicha mezcla tiene un pH en el rango de 6,8 a 7,4.
25. Procedimiento según la reivindicación 24 en
donde el pH es 7,4.
26. Procedimiento de separación de ADN
superenrollado plásmido del ADN plásmido relajado que comprende
contactar una mezcla de ADN plásmido superenrollado y ADN plásmido
relajado con un medio de interacción hidrofóbica bajo una primera
condición donde tanto el ADN plásmido superenrollado como el ADN
plásmido relajado se unen a dicho medio de interacción hidrofóbica
para formar una primera mezcla de unión, alterar dicha primera
condición que rodea la primera mezcla de unión a una segunda
condición para extraer dicho ADN plásmido relajado de dicha primera
mezcla de unión para formar componentes separados que contienen una
segunda mezcla de unión y dicho ADN plásmido relajado, y modificar
la segunda condición que rodea dicha segunda mezcla de unión hasta
una tercera condición para extraer dicho ADN superenrollado
plásmido de dicha segunda mezcla de unión para formar componentes
separados que contiene dicho medio de interacción hidrofóbica y
dicho ADN superenrollado
plásmido;
plásmido;
en donde dicho procedimiento se realiza en
ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles, cobalto
hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona.
27. Procedimiento según la reivindicación 26 en
donde dicha primera condición comprende equilibrar dicho medio con
una solución de sal que contiene sulfato de amonio en un rango de
concentración de 2,5 M a 4 M.
28. Procedimiento según la reivindicación 27 en
donde dicha segunda condición comprende lavar dicha primera mezcla
de unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en
una concentración de 2,35 M a 2,45 M.
29. Procedimiento según la reivindicación 28 en
donde dicha tercera condición comprende lavar dicha segunda mezcla
de unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en
una concentración de 1 M a 2,3M.
30. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 y 26 en donde dicha alteración y dicha
modificación son combinados en un proceso continuo que comprende un
gradiente elución de dicho ADN plásmido relajado y ADN plásmido
superenrollado mediante la mezcla de dicha primera mezcla de unión
con una solución de sulfato de amonio que contiene sal con una
concentración continuamente variable de sulfato de amonio, dicha
concentración variando de 3M a 1 M de sulfato de amonio, y dicho ADN
plásmido relajado se recoge en un primer volumen eluído y dicho ADN
superenrollado plásmido se recoge en un segundo volumen eluído.
31. Procedimiento según la reivindicación 26 en
donde dicho componente de ADN plásmido relajado separado y dicho
ADN plásmido superenrollado separado se recogen y se aíslan.
32. Procedimiento para el enriquecimiento de la
cantidad de ADN superenrollado relativa al ADN relajado en una
mezcla de los mismos, procedimiento que comprende:
- (1)
- interactuar la mezcla que contiene ADN superenrollado y ADN relajado con un medio interactivo hidrofóbico que comprende una mitad alquil bajo condiciones iónicas en donde el ADN superenrollado preferencialmente se une al medio interactivo hidrofóbico;
- (2)
- tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN relajado y superenrollado bajo condiciones iónicas que permiten la extracción preferencial del ADN relajado; y
- (3)
- eluir el ADN superenrollado del medio interactivo hidrofóbico;
en donde dicho procedimiento se
realiza en ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles,
cobalto hexamina, espermidina, y
polivinilpirolidona.
33. Procedimiento para extraer lipopolisacárido
(LPS) de una composición que contiene ADN, procedimiento que
comprende:
- (1)
- interactuar la mezcla que comprende el ADN y LPS con un medio de interacción hidrofóbica que comprende una mitad alquil, en donde la interacción es bajo condiciones iónicas donde el LPS preferencialmente se une al medio interactivo hidrofóbico relativo al ADN; y
- (2)
- tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN y LPS con condiciones iónicas que permiten la extracción selectiva del ADN.
34. Procedimiento de enriquecimiento del ADN
superenrollado relativo al ADN relajado en una mezcla de los
mismos, el procedimiento que comprende:
- (a)
- formar una solución mediante la adición de una sal a la mezcla de ADN superenrollado y ADN relajado;
- (b)
- contactar la solución con un medio de interacción hidrofóbica bajo una primera condición donde tanto el ADN superenrollado y el ADN relajado se unen al medio de interacción hidrofóbica para formar una primera mezcla de unión;
- (c)
- alterar la primera condición que rodea la primera mezcla de unión a una segunda condición para extraer ADN relajado de la primera mezcla de unión para formar componentes separados que contiene una segunda mezcla de unión y ADN relajado; y
- (d)
- modificar la segunda condición que rodea dicha segunda mezcla de unión a una tercera condición para extraer ADN superenrollado de dicha segunda mezcla de unión para formar componentes separados que contiene medio de interacción hidrofóbica y ADN superenrollado.
35. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 12, 20, 26 ó 34 en donde el medio de interacción
hidrofóbica comprende un soporte de cromatografía con grupos
hidrofóbicos pendientes.
36. Procedimiento según la reivindicación 35 en
donde dichos grupos pendientes son seleccionados del grupo
consistente en C_{3} a C_{10} grupos alquil.
37. Procedimiento según la reivindicación 35
respecto a las reivindicaciones 12, 20 ó 34 en donde el medio de
interacción hidrofóbica es seleccionado del grupo consistente en un
polímero metacrilato o esqueleto copolímero unido a al menos uno de
un propil, butil, hexil, octil, nonil o una mezcla de éstos como
grupo hidrofóbico pendien-
te.
te.
38. Procedimiento según la reivindicación 35
respecto de la reivindicación 1 en donde el medio de interacción
hidrofóbica es seleccionado del grupo consistente en un polímero
metacrilato o esqueleto copolímero unido a al menos uno de un grupo
hidrofóbico propil, butil, hexil, octil, nonil o decil.
39. Procedimiento según la reivindicación 35
respecto de la reivindicación 26 en donde el medio de interacción
hidrofóbica es un polímero metacrilato o esqueleto copolímero unido
a al menos un ligando propil, butil, pentil, hexil, heptil, octil,
nonil o decil.
40. Procedimiento según la reivindicación 35 en
donde el medio es al menos uno de esqueleto copolímero metilacrilato
etilenglicol o una agarosa reticulada.
41. Procedimiento según la reivindicación 35 en
donde el medio es una resina en la forma de granos en el rango de
tamaño de 15 a 100 \mum.
42. Procedimiento según la reivindicación 34 en
donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo
consistente en acetato, fosfato, carbonato, SO_{4}^{2-},
Cl^{-}, Br^{-}, NO_{3}^{-}, Mg^{2+}, Li^{+} Na^{+},
K^{+} y NH_{4}^{+}.
43. Procedimiento según la reivindicación 40 en
donde la sal es sulfato de amonio en un rango de concentración de
2,5M a 4M.
44. Procedimiento según la reivindicación 34 en
donde la primera condición comprende equilibrar dicho medio con una
solución de sal que contiene sulfato de amonio que está presente en
un rango de concentración de 2,5M a 4M.
45. Procedimiento según la reivindicación 34 en
donde la segunda condición comprende lavar el medio con una
solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración
de 2,35M a 2,45M.
46. Procedimiento de la reivindicación 34 en
donde la dicha tercera condición comprende lavar dicha segunda
mezcla de unión con una solución de sal que contiene sulfato de
amonio en una concentración de 1M a 2,3M.
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