ES2227557T3

ES2227557T3 - Procedimiento para la purificacion a gran escala de plasmidos.

Info

Publication number: ES2227557T3
Application number: ES95927143T
Authority: ES
Inventors: Ann L. Lee; Sangeetha Sagar
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-07-11
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2015-07-11
Also published as: AU3126295A; ATE277175T1; DE69533552D1; EP0771355A4; JPH10503086A; DE69533552T2; EP0771355A1; EP0771355B1; CA2192342A1; AU708798B2; WO1996002658A1

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO Y PURIFICACION A GRAN ESCALA DE ADN DE PLASMIDO A PARTIR DE FERMENTACIONES MICROBICAS A GRAN ESCALA. TODAS ESTAS FORMAS DE ADN DE PLASMIDO: CIRCULO SUPERESPIRAL (FORMA I), CORTADO O RELAJADO (FORMA II), Y LINEALIZADO (FORMA III), SE PUEDEN AISLAR INDIVIDUALMENTE UTILIZANDO EL PROCEDIMIENTO DESCRITO. MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO DESCRITO SE DISPONE ADN ALTAMENTE PURIFICADO ADECUADO PARA INCLUSION EN UNA COMPOSICION FARMACEUTICA.

Description

Procedimiento para la purificación a gran escala de plásmidos.

Antecedentes de la invención

Las técnicas clásicas para aislar ADN plasmídico de fermentaciones microbianas son adecuadas para las preparaciones plasmídicas a pequeña escala o a escala de laboratorio. Uno de tales procedimientos implica la lisis alcalina de las células huésped microbianas que contienen el plásmido, seguida por la neutralización con acetato que causa la precipitación del ADN genómico y las proteínas de las células huésped, que después se retiran, por ejemplo, mediante centrifugación. La fase líquida contiene el ADN plasmídico que se precipita con alcohol y después se somete a centrifugación isopícnica con CsCl en presencia de bromuro de etidio. El bromuro de etidio se requiere para separar el ADN plasmídico total en las tres formas diferentes, superenrollado (forma I), círculo cortado (forma II) y lineal (forma III), y se recoge la forma plasmídica deseada. Para eliminar el bromuro de etidio residual se requiere la posterior extracción con butanol, seguida por precipitación de ADN usando alcohol. Después se llevan a cabo varias etapas de purificación para eliminar las proteínas de la célula huésped. La eliminación de las proteínas del huésped se produce mediante extracciones repetidas con fenol o una mezcla de fenol y cloroformo. El ADN plasmídico se precipita con alcohol y el fenol residual se elimina mediante extracciones repetidas con isoamilo/cloroformo. El ADN plasmídico final precipitado en alcohol se disuelve en agua o en una solución tampón adecuada.

Existen varios inconvenientes y limitaciones de este procedimiento, entre los que se incluyen:

a): este procedimiento requiere el uso de productos químicos caros y peligrosos (CsCl y EtBr, que se usan en la centrifugación por gradiente de densidad; EtBr es un conocido mutágeno y debe eliminarse de los productos; asimismo, es un agente intercalante que puede cortar el plásmido);

b): la etapa de centrifugación por densidad no se puede escalar con facilidad;

c): existe una necesidad de eliminar el EtBr residual en la extracción del disolvente orgánico;

d): la extracción con fenol se usa para eliminar las proteínas residuales y la ADNasa, un procedimiento que requeriría una centrífuga para romper la emulsión fenol/agua;

e): etapas altamente repetitivas, lo que lo hace laborioso y requiere tiempo (el aislamiento requiere varios días);

f): la escalabilidad de la etapa de lisis química es un obstáculo, es decir, la etapa de tratamiento con lisozima/alcalino/KOAc es eficaz en la lisis de células a pequeña escala, sin embargo, el incremento de la viscosidad dificulta el procedimiento a gran escala; y

g): el uso de grandes cantidades de lisozima para debilitar enzimáticamente la pared de la células microbiana antes de la lisis.

A continuación la mezcla se neutraliza mediante la adición de ácido, que tiene como resultado la precipitación del ADN cromosómico de alto peso molecular. El ARN de alto peso molecular y los complejos proteína-SDS precipitan con la adición de concentraciones elevadas de sal KOAc. El producto plasmídico permanece en el sobrenadante aclarado después de la centrifugación. Las limitaciones aquí incluyen la necesidad de procesar con rapidez y en hielo para retrasar la actividad de las nucleasas que no se eliminan hasta la extracción con fenol. El principal contaminante que queda en el sobrenadante con el producto es ARN.

Otro procedimiento de uso habitual para aislar y purificar el ADN plasmídico de las bacterias proporciona un procedimiento rápido adecuado sólo para las preparaciones a pequeña escala.

Holmes y Quigley (1981, Analytical Biochem., 114, páginas 193-197) describieron un procedimiento sencillo y rápido para preparar plásmidos, en el que las bacterias se tratan con lisozima, después se lleva a ebullición a aproximadamente 100ºC en un tampón adecuado (STET) durante 20-40 segundos, formando un coágulo insoluble de ADN genómico, proteína y residuos, lo que deja el plásmido en solución con ARN como contaminante principal. Aparentemente, la lisozima es un requerimiento para que esta técnica funcione, y como tal, añade una etapa de tratamiento que es menos deseable para la fabricación a gran escala de ADN para uso veterinario o humano. Sin embargo, la adición de lisozima puede potenciar la liberación de plásmido durante la lisis. Una ventaja es que el tratamiento térmico de las células también desnaturaliza la ADNasa. Sin embargo, esta técnica no es adecuada para subir hasta un volumen elevado de fermentaciones microbianas y está concebida para las fermentaciones menores de cinco litros.

Se han publicado alternativas a la centrifugación isopícnica usando CsCl para la purificación plasmídica. Estas alternativas son adecuadas sólo para el aislamiento de plásmidos a escala de laboratorio e incluyen:

a): cromatografía por exclusión de tamaño, que está limitada de forma inherente por su rendimiento;

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b): cromatografía con hidroxiapatita, que posee la desventaja de requerir concentraciones elevadas de urea para su eficacia;

c): cromatografía de fase inversa;

d): cromatografía de intercambio iónico.

Por tanto, el aislamiento y purificación a gran escala de ADN plasmídico de fermentaciones microbianas de gran volumen requiere el desarrollo de un procedimiento mejorado de preparación de plásmidos. Para los recientes desarrollos en muchas áreas de biología molecular es necesario un procedimiento de aislamiento y purificación para la producción a gran escala de ADN plasmídico. En particular, los recientes avances en el campo de las vacunas con base polinucleotídica para uso humano, y potencialmente terapia genética humana, requiere la capacidad para producir cantidades grandes de la vacuna polinucleotídica en una forma altamente purificada.

Para desarrollar/aplicar un procedimiento de fermentación, aislamiento, purificación y caracterización de ADN como producto biofarmacéutico a gran escala comercialmente viable es necesaria una tecnología sin precedentes.

Resumen de la invención

El procedimiento de laboratorio actual usado para aislar y purificar ADN plasmídico consiste en una serie de técnicas de laboratorio clásicas que no son adecuadas para un procedimiento de fabricación. Por ejemplo, las centrifugaciones en gradiente de densidad no es escalable; el procedimiento de purificación necesita el uso de disolventes/productos químicos caros y peligrosos tales como bromuro de etidio, un mutágeno conocido que requiere tiempo. Por tanto se ha desarrollado un procedimiento alternativo escalable, que se describe en la presente memoria descriptiva. Además, se estableció un análisis de HPLC para seguir el producto plasmídico a través de las etapas del procedimiento y para distinguir entre las formas plasmídicas. Las células microbianas que alojan el plásmido se suspenden y opcionalmente se incuban con lisozima en un tampón que contiene detergente, se calientan usando un intercambiador de calor por flujo para lisar las células, seguido por centrifugación. Tras la centrifugación, el lisado aclarado, que contiene sobre todo ARN y el producto plasmídico, se filtra a través de un filtro de 0,45 micrómetros y después se somete a diafiltración, antes de cargar en la columna de intercambio aniónico. Opcionalmente, el producto plasmídico puede tratarse con ARNasa antes o después de la filtración, o en una etapa anterior o posterior. La fracción del producto del intercambio aniónico que contiene el plásmido se carga en la columna de fase inversa y se eluye con un tampón adecuado, lo que proporciona ADN plasmídico muy puro adecuado para uso humano.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Se muestra un esquema de un aparato adecuado de intercambio por calor.

Figura 2. Se muestra un gráfico de la relación entre la temperatura en la salida y el caudal.

Figura 3. Se muestran los cromatogramas comparativos de plásmido total en sobrenadante aclarado con EDTA 50 mM y EDATA 100 mM.

Figura 4. Se muestra el rendimiento de plásmido superenrollado como función de la temperatura de salida.

Figura 5. Se muestran los perfiles de elución de columnas de intercambio aniónico con lisados aclarados tratados con ARNasa (línea en negrita) y sin tratar (línea fina).

Figura 6. Se muestran los perfiles de elución de cromatografía de intercambio aniónico con losado aclarado que se sometió a diafiltración antes de introducirse en la columna y que no se diafiltraron antes de introducirse en la columna.

Figura 7. Se muestra un perfil de elución de ADN plasmídico procedente del lisado celular.

Figura 8. Se muestra un análisis de electroforesis en gel de agarosa del producto ADN obtenido en varias etapas intermedias de purificación.

Figura 9. Se muestra un seguimiento del análisis de HPLC de intercambio aniónico del producto ADN que demuestra la pureza del producto.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han identificado un nuevo procedimiento escalable y alternativo de eliminación de residuos/lisis para el aislamiento y purificación de plásmidos a gran escala que explota un procedimiento de calentamiento rápido para inducir la lisis celular y precipitar el ADN genómico, las proteínas y otros restos mientras se mantiene el plásmido en la solución. La utilidad de este procedimiento es el aislamiento y purificación de ADN plasmídico a gran escala. Los inventores han encontrado que la suspensión de células microbianas en tampón STET modificado (descrito más adelante) y el calentamiento de la suspensión hasta aproximadamente 70-100ºC en un intercambiador de calor de flujo continuo tiene como resultado una lisis excelente. La centrifugación de flujo continuo o discontinuo del lisado da un sedimento que contiene restos celulares, proteínas y la mayoría del ADN genómico mientras que el plásmido permanece en el sobrenadante. Esta invención ofrece un número de ventajas, entre las que se incluye una recuperación más elevada de producto que mediante lisis química, inactivación de ADNasas, simplicidad y escalabilidad.

La presente invención lleva a un procedimiento para el aislamiento y purificación a gran escala de ADN plasmídico de fermentaciones microbianas. Las fermentaciones de células microbianas a gran escala como se usan en la presente memoria descriptiva se considera que son volúmenes totales de fermentación celular mayores de aproximadamente 5 litros o las células recogidas de un volumen de fermentación superior a aproximadamente 5 litros.

ADN para uso humano incluye, pero no se limita a ellos, vacunas polinucleotídicas y ADN para terapia génica humana. Las vacunas polinucleotídicas están pensadas para inyecciones directas en seres humanos [Montogomery, D. L., y col., 1993, Cell Biol., 169, páginas 244-247; Ulmer, J. B. y col., 1993, Science, 259, páginas 1745-1749].

La presente invención también lleva a un procedimiento de monitorización en línea para el seguimiento de varias formas de ADN plasmídico mediante etapas de aislamiento y purificación. Las diversas formas de ADN plasmídico a las que se ha hecho referencia anteriormente se pueden aislar individualmente mediante el procedimiento de la presente invención son la forma I (plásmido superenrollado), la forma II (plásmido cortado o relajado) y la forma III (plásmido linealizado).

El procedimiento de la presente invención es adecuado para usar con las fermentaciones microbianas en general. Para los expertos en la técnica se hace fácilmente evidente que una amplia variedad de células microbianas son adecuadas para usar en el procedimiento de la presente invención, incluidas pero no limitadas a ellas, células fúngicas incluyendo levaduras, y células bacterianas. Una fermentación microbiana preferida es una fermentación bacteriana de células que contienen el plásmido que se va a aislar y purificar. Una fermentación bacteriana preferida es una fermentación de E. coli que contiene el plásmido que se va a aislar y purificar. Para los expertos en la técnica es fácilmente evidente que las fermentaciones bacterianas distintas a la fermentaciones de E. coli son adecuadas para usar en la presente invención. La fermentación microbiana puede crecer en cualquier medio líquido que sea adecuado para el crecimiento de las bacterias que se están usando.

El plásmido que se va a aislar y purificar mediante el procedimiento de la presente invención puede ser cualquier molécula de ADN extracromosómico. Los plásmidos pueden ser un número elevado de copias por células o un número bajo de copias por célula. Los plásmidos también pueden ser de virtualmente cualquier tamaño. Para los expertos en la técnica es fácilmente evidente que mediante el procedimiento de la presente invención se puede aislar virtualmente cualquier plásmido en las células microbianas.

Las células microbianas que contienen el plásmido se recogen del medio de fermentación para proporcionar una pasta celular, o una suspensión. Es adecuado cualquier medio convencional para recoger células de un medio líquido incluidos, pero no limitados a ellos, la centrifugación o la microfiltración.

El aislamiento del ADN plasmídico de células microbianas recogidas usando los procedimientos actuales a escala de laboratorio consiste principalmente en tratamiento enzimático de células microbianas para debilitar la pared celular, seguido por lisis celular. Las etapas de purificación incluyen centrifugaciones repetidas en CsCl/BrEt, seguidas por extracciones en disolvente orgánico y precipitación para eliminar el ARNt, las proteínas residuales, el EtBr y otros contaminantes del huésped. Estas etapas no se pueden escalar y, por tanto, no son adecuadas para usar en procesamientos a escala de laboratorio. En contraste con esto, la cromatografía preparativa a escala es una potente herramienta de purificación que proporciona una resolución elevada, facilidad de funcionamiento y una productividad incrementada para purificar productos plasmídicos de ADN. Se ha mostrado que dos modos diferentes de cromatografía, de fase inversa y de intercambio aniónico, son adecuados para purificar ADN plasmídico a los estrictos niveles requeridos para uso humano. Las separaciones según la fase inversa están dirigidas por interacciones hidrófobas, mientras que las de intercambio aniónico se basan en interacciones electrostáticas. Con estas dos etapas de cromatografía ortogonal se consiguen separaciones entre varias formas de plásmido (superenrollado, relajado abierto, lineal y concatémeros) y se eliminan los contaminantes como LPS (endotoxina), ARN, ADN y proteínas residuales.

En el procedimiento de la presente invención, las células microbianas recogidas se resuspenden en tampón STET modificado, que está compuesto por TRIS aproximadamente 50 mM, EDTA aproximadamente 50-100 mM, aproximadamente 8% de sacarosa, aproximadamente 2% de TRITON X-100 y, opcionalmente, concentraciones de lisozima de un orden de magnitud por debajo de microgramos, a un pH en el intervalo de 6,0-10,0. La concentración de lisozima opcionalmente usada en el procedimiento de la presente invención es sustancialmente menor que la concentración de lisozima usada en los procedimientos conocidos en la técnica. Para los expertos en la técnica se hace fácilmente evidente que se pueden hacer modificaciones a esta fórmula de tampón básica y son adecuadas para usar en la presente invención. Se pretende que las modificaciones de esta fórmula de tampón básica que no afectan o alteran sustancialmente al resultado del presente procedimiento se encuentren dentro del alcance del procedimiento de la presente invención. El intervalo de pH puede ajustarse según los mejores resultados proporcionados para la cepa bacteriana concreta de bacterias que se está usando. El intervalo de pH preferido es de aproximadamente 8,0-8,5. A continuación, la suspensión se calienta hasta aproximadamente 70-100ºC, prefiriéndose aproximadamente 70-77ºC, en un intercambiador térmico de flujo continuo. El lisado se centrifuga para precipitar gran cantidad de restos celulares, proteínas y la mayoría del ADN genómico.

Se construyó un intercambiador térmico prototipo para demostrar la viabilidad de la lisis térmica de flujo continuo de las células microbianas que contienen el plásmido. El intercambiador térmico concreto estaba compuesto de un tubo de acero inoxidable D.O de 3,05 m x 0,63 cm con forma de muelle. El muelle se sumergió por completo en un baño de agua a temperatura elevada constante. El Volumen de retención del muelle fue de aproximadamente 50 ml. Se usaron termopares y un termómetro para medir las temperaturas de entrada y de salida y la temperatura del baño de agua, respectivamente. Se bombeó la corriente de producto en el COIL en calentamiento usando una bomba peristáltica Masterflex con tubos de silicona. El lisado celular salió del muelle y después se centrifugó en una centrífuga discontinua Beckman J-21 para su aclaramiento. La figura 1 proporciona un esquema de este aparato determinado, sin embargo son adecuados otros tipos de construcción de intercambiador térmico para usar en la presente invención, incluidos pero no limitados a ellos, una construcción de tubos y cubierta, que es preferible.

Después de la centrifugación, el lisado aclarado se puede tratar opcionalmente con ARNasa y el producto plasmídico se puede filtrar para eliminar posteriormente residuos pequeños. Una amplia variedad de medios de filtración es adecuada para usar en este procedimiento, incluidos pero no limitados a ellos, filtración a través de una membrana con un tamaño de poro pequeño. Un procedimiento de filtración preferido es la filtración a través de un filtro de 0,45 micrómetros.

Para eliminar más contaminantes del producto ADN, el material se puede someter a diafiltración. Los materiales estándar de diafiltración comercialmente disponibles son adecuados para usar en este procedimiento, según las técnicas estándar conocidas en la técnica. Un procedimiento de diafiltración preferido es la diafiltración que usa una membrana con ultrafiltro con un corte en el peso molecular en el intervalo de 30.000 a 500.000, en función del tamaño del plásmido. La preparación del ADN descrito anteriormente se diafiltra usando una membrana de ultrafiltración (corte del peso molecular de aproximadamente 100.000) contra un tampón de columna antes de cargar en la columna de intercambio aniónico.

Una amplia variedad de matrices de intercambio aniónico comercialmente disponibles es adecuada para usar en la presente invención, incluidas pero no limitadas a ellas, las disponibles de POROS Anion Exchange Resins, Qiagen, Toso Haas, Sterogene, Spherodex, Nucleopac y Pharmacia. La columna (Poros II PI/M, 4,5 mm x 100) se equilibra inicialmente con Bis/TRIS propano 20 mM a pH 7,5 y NaCl 0,7 M. La muestra se carga y se lava con el mismo tampón inicial. A continuación se aplica un gradiente de elución de NaCl 0,5 M a 0,85 M en aproximadamente 25 volúmenes de columna y se recogen las fracciones. La cromatografía de intercambio aniónico es una primera etapa de pulido ideal, porque proporciona un aclaramiento excelente de ARN, ADN genómico y proteínas. La figura 5 (negrita) muestra un perfil de elución de muestra de lisado celular filtrado aclarado de la columna de intercambio aniónico. El análisis en gel de agarosa reveló que el segundo pico que aparece después del flujo continuo está compuesto por producto plasmídico. El pico grande anterior se debe a ARN. Esto se confirma mediante la incubación del lisado celular aclarado con ribonucleasa antes de la carga en la columna, que mostró que el pico grande desaparece y se sustituye por picos más pequeños y de elución más rápida, debido a los productos de degradación de la digestión con ribonucleasa.

La fracción del producto del intercambio aniónico se carga en una columna de fase inversa. Una amplia variedad de matrices disponibles comercialmente es adecuada para usar en la presente invención, incluidas pero no limitadas a ellas, las disponibles en POROS, Polymer Labs, Toso Haas, Pharmacia, PQ Corp., Zorbax y Amicon. Las matrices también pueden tener base polimérica o de sílice. La columna de fase inversa (Poros R/H) se equilibra con bicarbonato amónico aproximadamente 100 mM a pH 8,5. A continuación se usa un gradiente de 0-11% de isopropanol para eluir el material unido. Las tres formas de plásmidos, formas I, II y II descritas antes, se pueden separar mediante este procedimiento.

Después, el ADN plasmídico eluido se puede concentrar y/o diafiltrar para reducir el volumen o cambiar el tampón. Para el ADN pensado para uso humano puede ser útil diafiltrar el producto de ADN en un vehículo o solución tampón farmacéuticamente aceptable.

En la técnica se conocen vehículos o soluciones tampón farmacéuticamente aceptables e incluyen las descritas en una serie de textos tales como el Remington´s Pharmaceutical Sciences. Cualquier procedimiento adecuado para concentrar una muestra de ADN es adecuado para usar en la presente invención. Tales procedimientos incluyen diafiltración, precipitación en alcohol, liofilización y similares, prefiriéndose la diafiltración. Tras la diafiltración, el producto de ADN plasmídico final se puede esterilizar. Es adecuado cualquier procedimiento de esterilización que no afecte a la utilidad del producto de ADN, tales como la esterilización mediante el paso a través de una membrana con un tamaño de poro lo bastante pequeño, por ejemplo de 0,2 micrómetros y menor.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar el procedimiento de la presente invención.

Ejemplo 1 Crecimiento de células microbianas, lisis celular y aclaración

Se usó un litro de pasta de células E. coli congelada para preparar 8 litros de suspensión celular en tampón STET (8% de sacarosa, 0,5% de TRITON, tampón TRIS 50 mM, pH 8,5 y EDTA 50 mM). La absorbancia de la suspensión celular a 600 nm fue de aproximadamente D. O. 30. La suspensión se agitó de forma continua para garantizar la homogeneidad. Se midió una viscosidad de la suspensión celular de aproximadamente 1,94 cp a temperatura ambiente (24ºC). La suspensión celular se bombeó a través del intercambiador térmico a 81 ml/min, que correspondía a un tiempo de residencia de la solución celular en el intercambiador térmico de aproximadamente 35 segundos. La temperatura del baño se mantuvo a 92ºC. Se midieron unas temperaturas de entrada y salida de la solución celular de aproximadamente 24ºC y aproximadamente 89ºC (media), respectivamente.

Aproximadamente 1 litro de muestra se introdujo en el intercambiador térmico. No se observó obstrucción visible del tubo, aunque el lisado era algo más espeso del material de partida. El lisado se enfrió hasta la temperatura ambiente y se midió que su viscosidad era de aproximadamente 40 cp. El lisado celular se aclaró mediante centrifugación discontinua a 9000 rpm durante 50 minutos usando el Beckman J-21. El análisis del sobrenadante confirmó la lisis celular efectiva y la recuperación de producto. El rendimiento de producto producido mediante lisis térmica en flujo continuo fue al menos comparable al proporcionado mediante el método de ebullición Quigley & Holmes. Sin embargo, este último procedimiento debe llevarse a cabo a escala de laboratorio en modo discontinuo y, por tanto, es inadecuado para el procesamiento a gran escala (5 litros o más). Dado que el procedimiento del intercambiador térmico es de flujo continuo, no hay un límite máximo al volumen de la suspensión celular que se puede procesar. Por tanto, este procedimiento puede acomodar fermentaciones bacterianas a gran escala para producir grandes cantidades de ADN plasmídico altamente purificado.

A continuación, el lisado aclarado se filtró a través de una membrana con un tamaño de poro de 0,45 micrómetros para eliminar el residuo más pequeño. Después, el filtrado se diafiltró usando una membrana con un corte de peso molecular de aproximadamente 100.000.

Ejemplo 2 Control y reproducibilidad de la lisis celular con el intercambiador térmico

El ajuste del caudal (es decir, el tiempo de residencia) al que la pasta celular se bombea a través del intercambiador térmico permite el control estrecho de la temperatura de lisis, es decir, la temperatura de salida. Se preparó una solución de pasta celular como se describe en el Ejemplo 1 y se bombea a través del intercambiador térmico a caudales variables de 160 a 850 ml/min. Las correspondientes temperaturas de salida variaban entre 93ºC y 65ºC, respectivamente. La figura 2 ilustra la relación entre el caudal y la temperatura. La temperatura inicial de la pasta celular fue de 24ºC y la temperatura del baño se mantuvo constante a 96ºC. Además, se llevaron a cabo una serie de ciclos con una temperatura de salida diana de 80ºC. De forma constante se obtuvieron rendimientos de 24 mg de ADN circular por litro de sobrenadante aclarado, lo que demuestra la reproducibilidad del procedimiento.

Ejemplo 3 Purificación del ADN plasmídico

Las células microbianas y los lisados se prepararon como se describe en los Ejemplos 1 y 2 y se realizaron los siguientes análisis.

Para ilustrar que la adición de EDTA 100 mM frente a EDTA 50 mM aumentó el porcentaje de ADN superenrollado y para determinar un intervalo aceptable de temperaturas de salida (es decir, la temperatura de lisis) en relación con la recuperación del ADN superenrollado, se llevaron a cabo los siguientes análisis. La forma superenrollada de ADN plasmídico es deseable, ya que es más estable que la forma circular relajada. Una de las formas mediante las que el ADN superenrollado se puede convertir en un círculo abierto es mediante rotura con ADNasa. Los inventores han encontrado que la adición de EDTA 100 mM frente a 50 mM en el tampón STET minimizaba la formación de plásmido en forma de círculo abierto. La figura 3 muestra los cromatogramas comparativos del plásmido total en el sobrenadante aclarado con EDTA 50 mM frente a EDTA 100 mM. La suspensión celular se preparó como se describe en el Ejemplo 1. El caudal de funcionamiento para estos ciclos fue de aproximadamente 186 ml/min. Las temperaturas de entrada, salida y del baño fueron 24ºC, 92ºC y 96ºC, respectivamente.

Se determinó un intervalo aceptable de temperaturas de lisis mediante la medición del porcentaje de plásmido superenrollado generado para cada ciclo. La figura 4 ilustra la concentración de plásmido superenrollado como una función de la temperatura de salida. Un intervalo aceptable de temperaturas de lisis es entre 75ºC y 92ºC. A temperaturas por debajo de 75ºC se generó plásmido circular más relajado, muy probablemente a causa de un incremento de la actividad ADNasa. Por encima de 93ºC, parece que los niveles de plásmido superenrollado disminuyen, posiblemente debido a la desnaturalización térmica.

Tras la lisis y la centrifugación térmica continua, 1 ml de lisado aclarado se incubó con 5 \mug de ARNasa durante 2 horas o se usó sin tratar. A continuación, las muestras tratadas con ARNasa o sin tratar se cargaron en una columna de intercambio aniónico (Poros Q/M 4,6 x 100) que se había equilibrado previamente con una mezcla 50-50 de disolventes A y B [HPLC disolvente A: Tris/Bis propano 20 mM, pH 8,0; y disolvente B: NaCl 1 M en Tris/Bis propano 20 mM, pH 8,0]. La columna se eluyó usando un gradiente de 50%-85% de B en 100 volúmenes de columna. El plásmido circular abierto eluye a aproximadamente el 68% de B y el superenrollado eluye al 72% de B.

En la figura 5 se muestra una comparación del eluido de la columna de intercambio aniónico del lisado aclarado tratado con ARNasa (línea fina) y sin tratar (línea gruesa). El pico que aparece a aproximadamente 10 minutos es ADN plasmídico y se sigue de un pico grande en la muestra sin tratar que es ARN. En la muestra tratada con ARNasa, el pico grande de ARN se ha eliminado y se produce una mayor separación entre el pico del plásmido y los picos contaminantes.

Como se ha descrito antes, la diafiltración previa a la cromatografía de intercambio aniónico incrementa mucho la cantidad de lisado que se puede cargar en la columna. Esto se demuestra en la figura 6, que muestra una comparación de lisado aclarado que se había diafiltrado y lisado aclarado que no se había diafiltrado antes de la cromatografía de intercambio aniónico. Las muestras se prepararon como se ha descrito anteriormente, a excepción de que una muestra se diafiltró antes de cargar en la columna de intercambio aniónico y la otra muestra no se diafiltró. Se puso en funcionamiento la columna y se eluyó como se ha descrito antes. La figura 6 muestra que la cantidad de material contaminante eluido de la columna es mucho mayor en la muestra que no se había diafiltrado. La gran cantidad de material contaminante que se une a la matriz de la columna de intercambio aniónico puede superar la capacidad máxima de la columna, lo que causa la pérdida de producto de ADN a causa de la no disponibilidad de la matriz para que se una a más material. Por tanto, la diafiltración elimina los contaminantes y permite que más producto ADN se una a la matriz de intercambio aniónico y, a su vez, permite que se cargue en la columna un mayor volumen de lisado aclarado.

El ADN plasmídico eluido de la columna de intercambio aniónico se separó en las formas individuales mediante análisis HPLC de fase inversa. La separación de plásmido superenrollado (forma I) del círculo cortado (forma 2) se muestra en la figura 7. Las dos formas se separaron con facilidad y se permitió el aislamiento de formas individuales del plásmido.

Ejemplo 4 ADN plasmídico altamente purificado de un procedimiento basado en cromatografía

Una pasta celular de fermentación se resuspendió en tampón STET modificado y después se lisó térmicamente de forma discontinua.

Como alternativa, una pasta celular de fermentación se resuspende en tampón STET modificado y después se lisa térmicamente en el procedimiento de flujo continuo descrito antes. El lisado se centrifugó como se ha descrito anteriormente. Veinte ml del sobrenadante se filtraron como se ha descrito antes y se cargaron en una columna de intercambio aniónico (Poros Q/M 4,6 x 100) que se había equilibrado previamente con una mezcla 50-50 de tampones A y B descritos anteriormente. Se procesa un gradiente de 50% a 85% de B en 50 volúmenes de columna con un caudal de 10 ml/minuto. De la columna se recogieron fracciones de 2,5 ml cada una. El ADN plasmídico superenrollado eluyó de la columna a 72% de B.

A continuación, el producto del intercambio aniónico se cargó en una columna de cromatografía de fase inversa (Poros R/H) que se había equilibrado previamente con bicarbonato amónico 100 mM a pH 8,0 y para eluir el material unido se usó un gradiente de 0% al 80% de metanol. El ADN plasmídico superenrollado altamente purificado eluyó a 22% de metanol.

En la figura 8 se muestra un gel de agarosa de las fracciones de producto de cada una de las etapas principales del procedimiento de purificación. Según los geles de agarosa y los análisis colorimétricos y de HPLC descritos en el Ejemplo 3, el producto final, mostrado en la figura 9, es altamente puro. El producto está compuesto por más del 90% de plásmido superenrollado y menos del 10% circular abierto. El ARN estaba por debajo de los límites de detección del ensayo usado. Los niveles de ADN genómico y de proteína contaminantes también estaban por debajo de los límites de detección de los análisis usados. El rendimiento global de plásmido superenrollado al final del procedimiento fue de aproximadamente del 60% del plásmido superenrollado en el lisado aclarado.

Ejemplo 5 Purificación multi-gram a escala de ADN plasmídico

Se usaron 4,5 l de pasta de células E. coli congelada para preparar 33,7 l de suspensión celular en tampón STET (8% de sacarosa, 2% de Triton, tampón Tris 50 mM, EDTA 50 mM, pH 8,5) con 2500 unidades/ml de lisozima. La absorbancia de la suspensión a 600 nm fue de aproximadamente D.O. 30. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos para garantizar la mezcla adecuada y después se incubó durante 45 minutos con agitación continua a 37ºC. Tras la incubación, la mezcla se continuó a temperatura ambiente y la suspensión celular se bombeó a través del intercambiador térmico a un caudal de 500 ml/min. La temperatura del baño se mantuvo a 100ºC y se midieron unas temperaturas de entrada y salida de la suspensión celular de aproximadamente 24ºC y de entre 70-77ºC, respectivamente. El lisado celular que sale del intercambiador térmico se recogió en tubos de centrífuga Beckman (500 ml cada uno) y el material se centrifugó inmediatamente en centrífugas Beckman J-21 durante 50 minutos a 9000 rpm. Tras la centrifugación, se encontró que el sobrenadante contenía 4-5 veces más producto plasmídico que en el caso en el que no se produjo incubación con lisozima. El producto sobrenadante de la centrifugación se diafiltró inmediatamente frente a 3 volúmenes de tampón TE (Tris-EDTA 25 mM a pH 8,0) y después se incubó con 20 x 10^{5} unidades de ARNasa de E. coli durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Después de completada la incubación, la solución con el producto se diafiltró frente a 6 volúmenes más con tampón TE usando una membrana con corte de peso molecular de 100 kD y después se filtró a través de un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar los restos residuales. El lisado filtrado se diluyó hasta NaCl 0,7 M con tampón Bis/Tris propano 20 mM-NaCla pH 7,5, que prepara el filtrado diluido para cargar en la columna de intercambio aniónico. La columna de intercambio aniónico (3,6 l de POROS PI/M) se equilibró previamente con Bis/Tris propano 20 mM y NaCl 0,7 M. El lisado filtrado se cargó hasta la capacidad de la columna. En este caso, se cargaron 5 gramos de plásmido superenrollado en la columna de intercambio aniónico. Después de cargar, la columna se lavó con 2-4 volúmenes de columna de Bis/Tris propano 20 mM y NaCl 0,7 M. Se llevó a cabo un gradiente de 10 volúmenes de la columna de NaCl 0,7 M a NaCl 2,0 M en Bis/Tris propano 20 mM, para aclarar la mayoría de la proteína de E. coli, ARN y algo de endotoxina. La fracción de plásmido superenrollado eluyó entre NaCl 1,4 M y 2,0 M. La fracción superenrollada de la columna de intercambio aniónico, que contenía 4 gramos de plásmido superenrollado, se diluyó 2-3 veces con agua sin pirógenos, se ajustó a IPA 1,2% y el pH se ajustó a 8,5 con NaOH 1N. A continuación, la fracción superenrollada diluida del intercambio aniónico se cargó en una columna de fase inversa de 7 l (POROS R2/M), que se había equilibrado previamente con bicarbonato amónico 100 mM con 1,2% de IPA. En este caso, se cargaron 3,2 gramos de plásmido superenrollado en la columna de fase inversa y después la columna se lavó con 6-10 volúmenes de columna de IPA 1,2% en bicarbonato amónico 100 mM. Este extenso lavado se llevó a cabo para aclarar impurezas. A continuación, se llevó a cabo un gradiente de IPA 1,2% a IPA 11,2% en 5 volúmenes de columna. La fracción de plásmido superenrollado eluye a aproximadamente IPA 4%. La fracción de producto superenrollado de la columna de fase inversa se concentró y se diafiltró en suero salino normal usando una membrana de corte de peso molecular de 30 kD. La masa de producto final se filtró a través de un filtro de 0,22 micrómetros. La tabla 1 proporciona una tabla de purificación que describe el aclaramiento de las impurezas y el rendimiento en cada una de las principales etapas del procedimiento. El rendimiento final de producto del procedimiento fue más del 50% del plásmido superenrollado en el lisado celular aclarado, como se indica mediante el ensayo HPLC de intercambio aniónico descrito en el EJEMPLO 3. La pureza del producto fue muy elevada, con menos del 1% de ARN y proteína de E. coli y menos del 2,9% de ADN genómico de E. coli.

TABLA 1 Resumen de la purificación y recuperación multigram

1

Claims

1. Un procedimiento para preparar un lisado bruto que es favorable a la purificación y el aislamiento del ADN plasmídico que contiene, que comprende las etapas de recoger las células microbianas procedentes de una fermentación de células microbianas a gran escala con un volumen superior a aproximadamente 5 litros, la resuspensión de dichas células en un tampón que contiene detergente y el paso de las células microbianas a través de un aparato de intercambio térmico de flujo continuo en el que el caudal de células que pasan a través del aparato de intercambio térmico se ajusta de forma tal que la temperatura de las células a la salida del aparato de intercambio térmico es de aproximadamente 65ºC a aproximadamente 93ºC.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tampón además contiene lisozima.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la temperatura de las células a la salida del intercambiador térmico es de aproximadamente 70ºC a aproximadamente 77ºC.

4. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el tampón es un tampón STET modificado que comprende TRIS aproximadamente 50 mM, EDTA aproximadamente 50-100 mM, aproximadamente 8% (p/v) de sacarosa y aproximadamente 2% de Triton X-100.

5. Un procedimiento para el aislamiento y la purificación de ADN plasmídico de una fermentación de células microbianas a gran escala con un volumen mayor de aproximadamente 5 litros, que comprende:

a): proporcionar un lisado bruto mediante un procedimiento según cualquier reivindicación precedente;

b): centrifugar el lisado bruto para dar un sedimento y un sobrenadante;

c): filtrar y diafiltrar el sobrenadante de la etapa b) para proporcionar un filtrado que contenga el ADN plasmídico;

d): poner en contacto el filtrado de la etapa c) con una matriz de intercambio aniónico;

e): eluir y recoger el ADN plasmídico de la matriz de intercambio aniónico;

f): poner en contacto el ADN plasmídico de la etapa e) con una matriz de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa;

g): eluir y recoger el ADN plasmídico de la matriz de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa de la etapa f);

h): opcionalmente concentrar y/o diafiltrar el producto de la etapa g) en un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

i): opcionalmente esterilizar el producto de ADN.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, que incluye la adición de ARNasa a cualquier etapa posterior a la recogida de las células.