MXPA06011568A - Metodo para purificar adn plasmidico. - Google Patents

Abstract

Esta invencion provee un proceso para la lisis alcalina continua de una suspension bacteriana con el objeto de cosechar el ADNp; ademas provee pasos opcionales para purificacion adicional, incluyendo filtracion del lisado, cromatografia por intercambio de aniones, cromatografia de triple afinidad, y cromatografia por interaccion de hidrofoba; estos pasos opcionales de purificaciones se pueden combinar con la lisis continua con el objeto de producir un producto de ADNp altamente purificado sustancialmente libre de ADNg, ARN, proteina, endotoxina, y otros contaminantes.

Description

ARNids, ribozimas, por ejemplo en el tratamiento de infecciones virales, cáncer o enfermedades relacionadas con la angiogénesis. Una vez administrado dentro de la célula de humano, el ADNp empieza a replicarse y a producir copias de la secuencia de ADN insertada. Por lo tanto, los investigadores consideran al ADN plasmídico como un vehículo prometedor para la administración de secuencias de ADN de interés dentro de células de humano con el objeto de tratar una variedad de estados de enfermedad. Se necesitan enormes cantidades de ADN plasmídico para el desarrollo de la investigación para implementar la tecnología basada en plásmido en un contexto terapéutico. Puesto que el ADN plasmídico utilizado en la terapia génica y en otras aplicaciones clínicas usualmente se produce por bacterias tales como Escherichia coli (E. coll), se necesitan métodos para separar efectivamente el ADN plasmídico a partir del ADN genómico (ADNg) de la célula bacteriana, así como a partir de la endotoxina y de las proteínas en la célula bacteriana. Por lo tanto, existe una creciente necesidad por procedimientos de purificación simples, fuertes, y que se pueden escalar que pueden ser utilizados para aislar grandes cantidades de ADN plasmídico a partir de células bacterianas. Un paso importante en cualquier procedimiento de purificación de plásmido implica la lisis de células bacterianas con el objeto de liberar los contenidos celulares a partir de los cuales el ADNp se puede aislar posteriormente. De hecho, es necesario inicialmente lograr los tres pasos de resuspensión celular, lisis celular y neutralización y precipitación de los contaminantes del hospedero. Normalmente la resuspensión celular utiliza agitación manual o un agitador magnético, y un homogeneizado o mezclador por propulsor para resuspender las células en el regulador de pH para resuspensión. La lisis celular se puede llevar a cabo mediante agitación manual o un agitación magnética con el objeto de mezclar las células resuspendidas con la solución para lisis (que consiste de álcali diluido (base) y detergentes); posteriormente manteniendo la mezcla a temperatura ambiente (20-25 grados Celsius) o sobre hielo por un periodo de tiempo, tal como 5 minutos, para completar la lisis. Como se mencionó anteriormente, la agitación manual y la agitación magnética no son escalables. La tercera etapa es la neutralización y la precipitación de los contaminantes del hospedero. El lisado a partir de la segunda etapa normalmente se mezcla con una solución para neutralización en frío mediante agitación suave o agitación magnética para acidificar el lisado antes de dejar reposar en hielo por 10-30 minutos para facilitar la desnaturalización y precipitación de ADN cromosomal de alto peso molecular, proteínas del hospedero, y otras moléculas del hospedero. Tanto la agitación manual como la agitación magnética no son escalables. Generalmente, la pared celular se digiere mediante tratamiento con lisozima por un corto período de tiempo o vía tratamiento alcalino o tratamiento con acetato de potasio (KOAc). La ARNasa también se añade generalmente para degradar a los ARNs de la suspensión bacteriana. Estos pasos químicos se pueden realizar de manera eficiente en el lisado de células a una escala pequeña. No obstante, el incremento en la viscosidad hace que el procesamiento a gran escala sea muy difícil. Un método alternativo simple y rápido para la preparación de plásmidos comprende el tratamiento de la bacteria con lisozima, posteriormente ebullición a aproximadamente 100°C en un regulador de pH apropiado por 20 a 40 segundos formando un coágulo insoluble de ADN genómico, proteína y desechos celulares dejando el plásmido en solución con el ARN como el contaminante principal. A continuación, se añadió una solución mezclada de NaOH y dodecilsulfato de sodio (SDS) para el propósito de disolución de la membrana citoplásmica. El NaOH desnaturaliza parcialmente a los ADNs y degrada parcialmente a los ARNs y el SDS actúa para la disolución de la membrana y la desnaturalización de las proteínas. Sucesivamente, ei compiejo de SDS-proteína y los desechos celulares se precipitan mediante la adición de acetato de potasio 5N (pH 4.8). En este momento, el pH es importante tanto para la neutralización del NaOH utilizado en dicha manipulación como para la renaturalización del plásmido. Posteriormente, se aplica la centrifugación para remover los precipitados, obteniendo así los plásmidos propuestos en el sobrenadante. No obstante, esta técnica no es adecuada para escalación a un alto volumen de fermentaciones bacterianas y se pretende para fermentaciones de menos de cinco litros. También, estas series de manipulaciones requieren mezclar lentamente y firmemente, de manera que se evita que el ADN cromosomal bacteriano se corte en fragmentos pequeños y se agregue, ocasionando que contaminen el plásmido, y dificulten la implementación de un procesamiento a gran escala. Un método alternativo común para la lisis de células, conocido como lisis alcalina, consiste en la mezcla de una suspensión de células bacterianas (solución 1 ) con una solución para lisis alcalina (solución 2). La solución 2 consiste de un detergente, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS), para lisar las células bacterianas y liberar el material intracelular, y un álcali, por ejemplo, hidróxido de sodio, para desnaturalizar las proteínas y ácidos nucleicos de las células (particularmente ADNg y ARN). Conforme las células se lisan y el ADN se desnaturaliza, la viscosidad de la solución se eleva dramáticamente. Después de la desnaturalización, se añade una solución ácida, por ejemplo, acetato de potasio (solución 3), para neutralizar el hidróxido de sodio, induciendo la rehaturalización en los ácidos nucleicos. Los fragmentos grandes de ADNg se reasocian al azar y forman redes que se precipitan como masas flocosas, atrapando a las proteínas, lípidos, y otros ácidos nucleicos. La sal potásica del dodecilsulfato también se precipita, alejando a las proteínas con los cuales se asocia. Las dos cadenas de ADNp (ADN plasmídico), entrelazadas entre sí, se reasocian normalmente para reformar el plásmido inicial, el cual permanece en solución. Esta técnica de lisis se lleva a cabo en modo de lote, por ejemplo, en donde las diferentes soluciones se mezclan mediante la adición secuencialmente de las soluciones a los recipientes o tanques. Debido a que el lisado alcalino es un fluido viscoelástico que es muy difícil de manipular, una dificultad con este método se presenta durante la mezcla con las diferentes soluciones. Puesto que el esfuerzo cortante ocasiona la fragmentación del ADNg, el cual se vuelve entonces extremadamente difícil de separar a partir del ADNp, los métodos son necesarios para evitar la aplicación de esfuerzo cortante al fluido. Además, el ADNp grande (por ejemplo mayor de aproximadamente 10 kilo pares de bases) también es susceptible al daño por esfuerzo cortante durante el proceso de mezclado. Después de que la solución que contiene la suspensión celular ha sido mezclada con la solución para lisis, el lisado alcalino viscoelástico se mezcla con la solución para neutralización. De nuevo, este proceso de mezclado es problemático debido a las propiedades viscoelásticas de la solución. Además, otra dificultad en el escalamiento del proceso de lisis en lote implica la eficiencia de mezclado de los diferentes fluidos a la vez que se intenta limitar el esfuerzo cortante para evitar así la fragmentación del ADNg. Como se mencionó previamente, la conducta cromatográfica del ADN genómico fragmentado es muy similar a aquella del ADNp, de manera que se vuelve virtualmente imposible deshacerse del ADNg mediante procedimientos de purificación estándares. Por lo tanto, son evidentes diversas limitaciones para el uso de los procedimientos en lote para la lisis de células bacterianas, tales como escalamiento, baja calidad del ADNp recuperado debido a la contaminación por ADNg fragmentado, y la cuantificación relativamente baja del ADNp obtenido.

En contraste con el método en lote, también se han propuesto diversos métodos para el mezclado continuo de diversas soluciones para lisis celular utilizando una serie de mezcladores estáticos. De conformidad con estos métodos, una solución para suspensión celular y una solución para lisado celular se añaden simultáneamente a un mezclador estático. La solución de célula lisada que sale del primer mezclador estático y una solución para precipitación se añaden entonces simultáneamente a un segundo mezclador estático. La solución que sale de este segundo mezclador contiene el lisado precipitado y los plásmidos. Otros métodos continuos para lisado de células incluyen el uso de un intercambiador de calor de flujo a través en donde las células suspendidas se calientan a 70-100°C. Después de la lisis celular en el intercambiador de calor, la corriente saliente se somete ya sea a un flujo continuo o a centrifugación lote a lote durante la cual los desechos celulares y el ADN genómico se precipitan, dejando el ADN plasmídico en el sobrenadante. Por lo tanto, el aislamiento y purificación a gran escala del ADN plasmídico a partir de fermentaciones microbianas de volúmen grande requiere el desarrollo de un proceso mejorado de preparación del plásmido. A pesar de los numerosos métodos que actualmente se utilizan para lisar las células bacterianas, ninguno de éstos resuelve los problemas ocasionados por las propiedades viscoelásticas de los fluidos y los esfuerzos cortantes que se incluyen durante los pasos de mezclado. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método novedoso para la lisis alcalina continua de la suspensión de célula bacteriana a una escala grande y provee de una ventaja principal en la limitación de los esfuerzos cortantes. Otro paso importante para cualquier aplicación en la cual se introducen ácidos nucleicos dentro de un humano o animal en un contexto terapéutico, es necesario producir ácido nucleico altamente purificado, grado farmacáutico. Dicho ácido nucleico purificado debe alcanzar estándares de calidad del fármaco de seguridad, potencia y eficiencia. Además, es deseable tener un proceso escalable que se puede utilizar para producir múltiples gramos de cantidades de ADN. Por lo tanto, es deseable tener un proceso para la producción de ácido nucleico altamente purificado que no requiere químicos tóxicos, mutágenos, solventes orgánicos, u otros reactivos que podrían comprometer la seguridad o eficiencia del ácido nucleico resultante, o hacer difícil o poco práctico el escalamiento. También se desea preparar ácidos nucleicos libres de endotoxinas contaminantes, las cuales si se administran a un paciente podrían inducir una respuesta tóxica. La remoción de las endotoxinas contaminantes es particularmente importante en donde el ADN plasmídlco se purifica a partir de fuentes bacterianas gram negativas que tienen altos niveles de endotoxinas como un componente integral de la membrana externa de la célula. Las técnicas clásicas para aislamiento y purificación de ADN plasmídico a partir de fermentaciones bacterianas son adecuadas para preparaciones de plásmido a escala pequeña o preparaciones de plásmido a escala de laboratorio. Después de la fragmentación de las células hospederas bacterianas que contienen el plásmido, seguido por neutralización con acetato que ocasiona la precipitación del ADN genómico y proteínas de la célula hospedera y generalmente se remueven mediante, por ejemplo, centrifugación. La fase líquida contiene el ADN plasmídico el cual se precipita en alcohol y luego se somete a centrifugación isopícnica utilizando CsCI en la presencia de bromuro de etidio para separar las diversas formas de ADN plasmídico, por ejemplo, superenrollado, circular cortado, y linearizado. La extracción adicional con butanol se requiere para remover el bromuro de etidio residual seguido por precipitación del ADN utilizando alcohol. Los pasos de puridicción adicional siguen a la remoción de las proteínas de la célula hospedera. Estos métodos actuales para el aislamiento del ADN plasmídico tienen varias limitaciones. Por ejemplo, los métodos de purificación que incluyen el uso de grandes cantidades de solventes orgánicos flamables (por ejemplo, etanol e isopropanol) y químicos tóxicos, por ejemplo, bromuro de etidio, fenol, y cloroformo, generalmente no son deseables para aislamiento a gran escala y purificación del ADN plasmídico. Los métodos alternativos a la centrifugación con cloruro de cesio se pueden utilizar para la purificación del ADN plasmídico, tales como la cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía sobre hidroxiapatita, y diversos métodos cromatográficos basados en intercambio en fase reversa o intercambio aniónico. Estas alternativas pueden ser adecuadas para la producción de pequeñas cantidades del material para investigación en una escala de laboratorio, pero generalmente no son tan fácilmente escalables y no son capaces de producir las cantidades de ADN plasmídico. También, con el método de separación química, el proceso de separación y purificación es complicado y se debe utilizar una gran cantidad de solvente orgánico, por lo tanto éste posee muchos problemas de tratamiento de solventes de desecho y otros. Además del método de separación y purificación química, existe un método para separación de plásmidos mediante electroforesis. El método electroforético incluye electroforesis en papel y electroforesis en gel, y comúnmente se utiliza la electroforesis en gel. No obstante, el método electroforético tiene muchos problemas de tiempo de separación largo, recolección difícil, baja carga de muestra, etc. Los métodos actualmente disponibles para la separación de las dos formas de ADN plasmídico utilizan cromatografía de intercambio iónico (Duarte et al., Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) o la cromatografía por exclusión de tamaño (Prazeres, D. M., Biotechnology Techniques Vol. 1 , No. 6, Junio 1997, p 417-420), acoplada con el uso de aditivos tales como polietilenglicol (PEG), detergentes, y otros componentes tales como hexamina cobalto, espermidina, y polivinilpirrolidona (PVP). No obstante, los métodos actualmente conocidos no son capaces de proveer una separación eficiente y con bajo costo del ADN superenrollado y cortado (o relajado). Además, muchos de los métodos conocidos padecen de la desventaja del uso de PEG u otros aditivos, los cuales pueden no ser deseables en la elaboración del ADN plasmídico, puesto que requieren métodos de separación adicional, de desecho y de control de la calidad, los cuales pueden ser difíciles, pueden llevar más consumo de tiempo y ser más costosos. Las formas alternativas de los métodos conocidos para separación de formas superenrolladas y relajadas de ADN plasmídico utilizan resinas muy costosas, las cuales también utilizan solventes, tales como acetonitrilo, etanol y otros componentes, como la trietilamina y fosfato de tetrabutil amonio, durante el procesamiento. Los métodos adicionales para la separación de ADN superenrollado y relajado se basan en la cromatografía por exclusión de tamaño, la cual implica la separación de las dos formas de ADN plasmídico basándose en la pequeña diferencia en el tamaño. Estas columnas tienden a ser relativamente largas, presentando problemas significativos de escalamiento, haciéndolas impracticables para la implementación en la producción a gran escala. Además los métodos por exclusión de tamaño necesitan soluciones de muestras concentradas que son impracticables para obtener con las soluciones de ADN plasmídico, debido a la naturaleza altamente viscosa del ADN. También, las preparaciones de ADN plasmídico, las cuales se producen a partir de preparaciones bacterianas y frecuentemente contienen una mezcla de ADN plasmídico relajado y superenrollado, frecuentemente requieren la remoción de endotoxina, como se refiere por la FDA, puesto que se sabe que las endotoxinas producidas por muchos hospederos bacterianos ocasionan reacciones inflamatorias, tales como fiebre o sepsis en el hospedero que recibe el ADN plasmídico. Generalmente estas endotoxinas son lipopolisacáridos, o fragmentos de los mismos, que son componentes de la membrana externa de la bacteria Gram-negativa, y se encuentran presentes en la preparación de ADN de las células hospederas y membranas celulares del hospedero o macromoléculas. Por lo tanto la remoción de endotoxinas es un paso crucial y necesario en la purificación del ADN plasmídico para uso terapéutico o profiláctico. La remoción de endotoxina a partir de soluciones de ADN plasmídico primcipalmente utilizó la estructura negativamente cargada de las endotoxinas. No obstante el ADN plasmídico también está negativamente cargado y por lo tanto la separación usualmente se logra con resinas para intercambio aniónico las cuales se unen tanto a estas moléculas como a, bajo ciertas condiciones, ADN plasmídico preferiblemente eluido a la vez que se unen a las endotoxinas. Dicha separación resulta en la remoción solamente parcial de cantidades significativas de endotoxinas que eluyen con el ADN plasmídico y/o se logra una recuperación muy pobre del ADN plasmídico. Por lo tanto, el aislamiento y purificación del ADN plasmídico a gran escala a partir de un gran volumen de fermentaciones microbianas requiere el desarrollo de un proceso mejorado para preparación de plásmido. También se requiere un proceso para la separación y purificación de una gran cantidad de ADN plasmídico de manera más simple y en un tiempo más corto. También es deseable para investigación basada en plásmido y terapia, que los ácidos nucleicos se puedan separar y purificar manteniendo la misma estructura de manera reproducible, y con el objeto de evitar los efectos adversos de impurezas sobre el cuerpo humano, los ácidos nucleicos se requieren para que sean separadas y purificados hasta una alta pureza. No obstante, con dicho método convencional, existe un problema de que los ácidos nucleicos, en particular, los ADN plasmídicos no se puedan obtener con pureza suficientemente elevada y en grandes cantidades. Por lo tanto, la presente invención se dirige a la provisión de un método de separación que utiliza al menos dos pasos cromatográficos, los cuales permiten la separación de una gran cantidad de ADNs plasmídicos en un tiempo más corto y con un mayor grado de pureza.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se basa en el descubrimiento de un método para la producción y aislamiento de ADN plasmídico altamente purificado. El ADN plasmídico producido y aislado mediante el método de la invención contiene muy bajos niveles de ADN cromosomal contaminante, ARN, proteínas, y endotoxinas. El ADN plasmídico producido de conformidad con la invención es de pureza suficiente para terapia basada en plásmido. Por lo tanto, la invención abarca un proceso para la producción y aislamiento de ADN plasmídico altamente purificado que incluye el paso de lisis celular en la cual existe (a) un medio para el flujo turbulento para mezclar rápidamente una suspensión celular con una solución que lisa a las células; y (b) un medio para el flujo laminar para permitir la incubación de una mezcla formada en (a) sin agitación sustancial, en donde la mezcla formada en (a) fluye a partir de los medios para flujo turbulento hacia los medios para flujo laminar. Una modalidad adicional de la invención, el mecanismo puede comprender adicionalmente un medio para la adición de una segunda solución que neutraliza a la solución de lisado, en donde la mezcla incubada en (b) fluye a partir de los medios para flujo laminar hacia los medios para la adición de una segunda solución. En incluso otra modalidad, el mecanismo se puede utilizar en un método para aislar el ADN plasmídico a partir de las células que comprende: (a) mezclar las células con una solución de lisis alcalina en los medios para flujo turbulento; y (b) neutralizar la solución de lisis alcalina mediante la adición de una solución ácida. La presente invención también se refiere a un dispositivo para lisis alcalina continua de la célula que comprende un primer mezclador o inyector capaz de inyectar un fluido alcalino en la dirección opuesta de la suspensión celular, un primer tubo de diámetro pequeño de manera que se genera un flujo turbulento dentro de la mezcla, un segundo tubo de un diámetro grande de medida que se genera un flujo laminar dentro de la mezcla, un segundo mezclador o inyector para inyecter la solución neutralizante en un extremo y cosechar el lisado. La invención abarca adicionalmente un método para la producción y aislamiento de ADN plasmídico altamente purificado que está esencialmente libre de contaminantes y por lo tanto es ADN grado farmacéutico. Otro objetivo de la presente invención se refiere a un método para la separación y purificación de ácidos nucleicos y ADN plasmídico. Con mayor detalle, se refiere a un método para la separación de ácidos nucleicos y ADN plasmídico de grado farmacéutico que son útiles para investigación y para terapia basada en plásmido. Una preparación de ADN plasmídico aislada de conformidad con los métodos de la invención se puede someter a pasos de purificación incluyendo al menos cromatografía de triple hélice, y adicionalmente puede incluir cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía por interacción hidrófoba. Por lo tanto estos métodos incluyen el paso de lisis alcalina continua descrita en la presente invención en combinación con cromatografía de intercambio aniónico subsecuente y/o cromatografía de triple hélice, y/o adicionalmente cromatografía por interacción hidrófoba. Por lo tanto estos métodos también incluyen el paso de lisis alcalina continua descrita en la presente invención en combinación con los pasos subsecuentes de cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de triple hélice, y cromatografía por interacción hidrófoba en combinación. Un lisado por filtración u otra remoción de las pequeñas masas floculentas puede preceder al primer paso de cromatografía. Un objetivo de la invención es maximizar la producción de ADN plasmídico a partir de una combinación de célula hospedera/ADN plasmídico.

Otro objetivo de la invención es proveer una preparación de ADN plasmídico la cual está sustancialmente libre de ARN del hospedero bacteriano. Otro objetivo de la invención es proveer una preparación de ADN plasmídico la cual está sustancialmente libre de proteína del hospedero bacteriano. Incluso, otro objetivo de la invención es proveer una preparación de ADN plasmídico la cual está sustancialmente libre de ADN cromosomal del hospedero bacteriano. Otro objetivo de la invención es proveer una preparación de ADN plasmídico la cual está sustancialmente libre de endotoxinas del hospedero bacteriano. Otro objetivo de la presente invención es proveer un método para la preparación de ADN plasmídico grado farmacéutico que está altamente puro para uso en investigación y terapia basada en plásmido, y se puede tratar para escalamiento hasta elaboración a gran escala. Por lo tanto la invención abarca ADN plasmídico grado farmacéutico que está esencialmente libre de contaminantes, dicho ADN altamente puro e intacto incluye una estructura base del vector, un gen terapéutico y secuencias reguladoras asociadas. La presente invención también se refiere a una formulación líquida de ADN plasmídico que es estable y que permanece no degradada a temperatura ambiente por un largo período de tiempo, y por lo tanto son útiles para almacenamiento de ADN plasmídico que se utiliza para investigación y para terapia relacionada con el humano. Los objetivos y ventajas adicionales de la invención se establecerán en parte en la descripción a continuación, y en parte serán evidentes a partir de la descripción, o se puede aprender mediante la práctica de la invención. Los objetivos y ventajas de la invención se llevarán a cabo y se logra por medio de los elementos y combinaciones particularmente señaladas en las reivindicaciones anexas. Se debe entender que tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativos solamente y no son restrictivos de la invención, como se reclama. Los dibujos anexos, los cuales se incorporan y constituyen una parte de esta especificación, ilustran varias modalidades de la invención y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es un esquema del aparato que se puede utilizar para una lisis celular de modo continuo de la invención. La figura 2 es un esquema del mezclador M1 en el aparato para lisis celular continua.

Las figuras 3A y 3B son gráficas que muestran depuración y velocidades de corte (formación de la forma plasmídica circular abierta) del ADN plasmídico almacenado a +25°C y +5°C por hasta 90 días.

Definiciones Acido significa que se relaciona con o que contiene un ácido; que tiene un pH de menos de 7. Alcalino significa que se relaciona con o que contiene un álcali o base; que tiene un pH mayor de 7. Continuo significa que no está interrumpido, que no tiene interrupción. ADN genómico significa un ADN que se deriva a partir de o existe en un cromosoma. Flujo laminar significa el tipo de flujo en una corriente de solución de agua en la cual cada partícula se mueve en una dirección paralela a cada partícula. Lisado significa el material producido mediante el proceso de lisis celular. El término lisar se refiere a la acción de ruptura de la pared celular y/o membrana celular de una célula la cual se encuentra en una solución con pH regulado (por ejemplo, suspensión celular) a través de tratamiento químico utilizando una solución que contiene un agente para lisado. Los agentes para lisado incluyen por ejemplo, álcali, detergentes, solventes orgánicos, y enzimas. En una modalidad preferida, la lisis de las células se realiza para liberar los plásmidos intactos a partir de células hospederas. Se neutraliza para hacer neutra (una solución) o para ocasionar (un ácido o base/álcali) para llevar a cabo neutralización. Mediante este término los inventores pretenden que un elemento que neutraliza una solución lleva el pH de la solución a un pH entre 5 y 7, y preferiblemente alrededor de 7 o más preferiblemente cercano a 7 que como se encontraba previamente. El fluido Newtoniano es un fluido en cual el esfuerzo cortante es proporcional al gradiente de velocidad y es perpendicular al plano del esfuerzo cortante. La constante de proporcionalidad se conoce como la viscosidad. Los ejemplos de fluidos Newtonianos incluyen líquidos y gases. El fluido no Newtoniano es un fluido en el cual el esfuerzo cortante no es proporcional solamente al gradiente de velocidad y perpendicular al piano de esfuerzo cortante. Los fluidos no Newtonianos pueden no tener una viscosidad bien definida. Los fluidos no Newtonianos incluyen sólidos plásticos, fluidos que siguen la ley de fuerza, fluidos viscoelásticos (que tienen tanto propiedades viscosas como elásticas), y fluidos con viscosidad dependiente del tiempo. ADN plasmídico significa una inclusión celular pequeña que consiste de un anillo de ADN que no es un cromosoma, la cual puede tener la capacidad de tener un fragmento de ADN no endógeno insertado dentro de ésta. Como se utiliza en la presente invención, el ADN plasmídico también puede tener cualquier forma de ADN plasmídico, tales como cortada, procesada, u otra forma manipulada de un ADN no cromosomal, incluyendo, por ejemplo, cualquiera que, o cualquier combinación de, ADN plasmídico en círculo fragmentado, ADN plasmídico en círculo relajado, ADN plasmídico superenrollado, ADN plasmídico cortado, ADN plasmídico linearizado o lineal, y ADN plasmídico de cadena sencilla.. Los procedimientos para la construcción de plásmidos incluyen aquellos descritos en Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a, Coid Spring Harbor Laboratory Press (1989). Un protocolo de mini-prep de ADN plasmídico, de conocido en la técnica (Bimboim and Doly, Nucleic Acids Research 7: 1513 (1979)), se puede utilizar para aislar inicialmente el ADN plasmídico para un procesamiento posterior a través de algunos aspectos de la invención y se puede contrastar con las muestras altamente purificadas producidas a partir de los métodos de la invención. Preferiblemente, la forma del ADN plasmídico es, o al menos es después de la preparación mediante el método de purificación de la invención, un ADN plasmídico en forma circular substancialmente cerrado, o aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, o más de aproximadamente 99% de ADN plasmídico en forma circular cerrada. Alternativamente, una forma de ADNp cerrada covalentemente superenrollada (ccc) se puede preferir en algunos métodos terapéuticos, en donde ésta puede ser más efectiva que las formas circulares abiertas, lineales, o multiméricas. Por lo tanto, el ADN plasmídico grado farmacéutico se puede aislar a partir de o separar de una o más formas de plásmidos y sustancialmente comprender una o más formas deseadas.

Para propósitos de la presente invención el término flujo se refiere al paso de un líquido a una velocidad de flujo particular (por ejemplo, litros por minuto) a través del mezclador, usualmente mediante la acción de una bomba. Se debe mencionar que se cree que la velocidad de flujo a través del mezclador afecta la eficiencia de la lisis, precipitación y mezclado. Los términos ADN "cortado" y "relajado" significan un ADN que no está superenrollado. ADN "superenrollado" es un término bien conocido en la técnica para la descripción de una forma aislada, particular de ADN plasmídico. Otras formas de ADN plasmídico también se conocen en la técnica. Una "impureza contaminante" es cualquier sustancia a partir de la cual se desea separar, o aislar, ADN. Las impurezas contaminantes incluyen, pero no se limitan a, proteínas de las célula hospedera, endotoxina, ADN de la célula hospedera, tal como ADN cromosomal o ADN genómico, y/o ARN de la célula hospedera. Se entiende que, lo que se considera o puede ser una impureza contaminante puede depender del contexto en el cual se practican los métodos de la invención. Una "impureza contaminante" puede derivarse o no a partir de una célula hospedera, por ejemplo, puede ser o no una impureza de una célula hospedera. El "aislamiento" o "purificación" de un primer componente (tal como ADN) significa el enriquecimiento del primer componente a partir de otros componentes con los cuales se encuentra inicialmente el primer componente. En la presente invención se proveen los grados de purificación deseada y/u obtenida. Los términos esencialmente libre, y altamente purificado se definen como aproximadamente 95% y preferiblemente mayor de 98.99% puro o libre de contaminantes, o que posee menos de 5%, y preferiblemente menos de 1-2% de contaminantes. El ADN grado farmacéutico se define en la presente invención como una preparación de ADN que contiene no más de aproximadamente 5%, y preferiblemente no más de aproximadamente 1-2% de componentes celulares, tales como membranas celulares. La invención comprende adicionalmente un me'todo para la producción y aislamiento de ADN plasmídico altamente purificado que esencialmente está libre de contaminantes y por lo tanto es ADN grado farmacéutico. El ADN producido y aislado por el método de la invención contiene niveles muy bajos, por ejemplo, partes por millón (ppm) de contaminantes de ADN cromosómico, ARN, proteína, y endotoxinas, y contiene principalmente el ADN plasmídico en forma principalmente cerrada. El ADN plasmídico producido de conformidad con la invención es de pureza suficiente para uso en investigación y terapia basada en plásmido, y opcidnaimente para material para ensayo clínico en humano y experimentos de terapia génica en humano y ensayos clínicos. Una "composición de ADN plasmídico grado farmacéutico" de la invención es una que se produce por un método de la invención y/o es una 3 composición que tiene al menos uno de los niveles de pureza definidos a continuación como un "ADN plasmídico grado farmacéutico". Preferiblemente, "una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico" de la invención es de un nivel de pureza definido por al menos dos de aquellos identificados a continuación como un "ADN plasmídico grado farmacéutico", por ejemplo menos de aproximadamente 0.00008% de ADN cromosomal o ADN genómico y menos de aproximadamente 0.00005% de contaminante de proteína, o por ejemplo menos de aproximadamente 0.00008% de ADN cromosomal o ADN genómico y menos de aproximadamente 0.1 UE/mg de endotoxinas. Otras combinaciones de niveles de pureza se incluyen bajo la definición. Por supuesto, la composición de ADN plasmídico grado farmacéutico puede comprender adicionalmente o contener componentes añadidos deseados para cualquier uso particular, incluyendo el uso en los tratamientos, composiciones y terapias de combinación. Los niveles de ADN cromosomal o genómico, ARN, endotoxinas o proteínas referidas como contaminantes a partir de la producción basada en célula del plásmido u otro contaminante(s) a partir del proceso de purificación. Como se mencionó, el "ADN plasmídico grado farmacéutico" se define en presente invención una preparación de ADN que contiene en el nivel de partes por millón o ppm (<0.0001 %, por ejemplo <0.0001 mg de 100 mg de ADN plamídico) o menos de ADN genómico, ARN, y/o contaminantes de proteína.

También o más precisamente, el "ADN plasmídico grado farmacéutico" en la presente invención puede significar una preparación de ADN que contiene menos de aproximadamente 0.01 %, o menos de 0.001 %, y preferiblemente menos de 0.0001 %, o preferiblemente menos de 0.00008% (< 0.00008%, por ejemplo < 0.00008 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de ADN cromosomal o ADN genómico. El "ADN plasmídico grado farmacéutico" también puede significar una preparación de ADN que contiene menos de aproximadamente 0.01 %, o menos de 0.001%, y preferiblemente menos de 0.0001%, o preferiblemente meos de 0.00002% (<0.00002%, por ejemplo O.00002 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de contaminantes de ARN. El "ADN plasmídico grado farmacéutico" también puede significar una preparación de ADN que contiene menos de aproximadamente 0.0001 %, y más preferiblemente menos de 0.00005% (<0.00005%, por ejemplo <0.00005 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de contaminantes de proteína. El "ADN plasmídico grado farmacéutico" también puede significar una preparación de ADN que contiene menos de 0.1 EU/mg de endotoxinas. El ADN plasmídico grado farmacéutico significa en la presente invención una preparación de ADN que preferiblemente se encuentra en forma circular predominante, y más precisamente ADN que contiene más de 80%, 85%, 90%, 95%, o más de 99% de ADN plasmídico de forma circular cerrada.

El tubo T se refiere a una configuración en forma de T del tubo, en donde una forma T se forma mediante una pieza particular del tubo creado en esa configuración o más de una pieza del tubo combinada para crear esa configuración. El tubo T tiene tres brazos y un área central en donde los brazos se unen. Un tubo T se puede utilizar para mezclar ingredientes como dos fluidos que pueden fluir cada uno hacia uno de los brazos de la T, uniéndose en el área central, y fuera del tercer brazo. El mezclado se presenta conforme los fluidos se mezclan. El flujo turbulento significa movimiento al azar irregular de las partículas de fluido en direcciones transversales a la dirección del flujo principal, en el cual la velocidad en un punto dado varía erráticamente en magnitud y en dirección. Viscoelástico se refiere a los fluidos que tienen tanto propiedades viscosas como elásticas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención se basa en el descubrimiento de un método escalable para la producción de un alto rendimiento de ADN plasmídico grado farmacéutico. En particular, la invención se basa en el descubrimiento de un método para la producción y aislamiento de ADN plasmídico altamente purificado utilizando una lisis alcalina continua de las células hospederas.

Como un primer paso las células hospederas son inoculadas, por ejemplo se transforman con un ADN plasmídico en una fase de crecimiento exponencial de las células y se siembran sobre placas que contienen un medio LB que contiene un antibiótico tal como tetraciclina. Las colonias particulares a partir de la placa se inoculan entonces a partir de la placa y luego se inoculan cada una en 20 mi de medio LB suplementado con el antibiótico apropiado tetraciclina en matraces de Erlenmeyer de plástico estériles separados y se crecen por 12-16 horas a 37 grados en una incubadora con agitación. Posteriormente uno de estos cultivos se utilizó para inocular 200 mi de medio LB estéril suplementado en un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Este se creció a 37°C y 200 rpm en una incubadora con agitación y se utilizó para inocular dos matraces de Erlenmeyer de 5 L, y se creció a 30°C y 200 rpm en una incubadora con agitación y se utilizó para inocular el recipiente del fermentador cuando se encontraba en fase exponencial media, después de 5 horas y a una DO600 nm de 2 unidades. Los cultivos de célula hospedera y la inoculación se conocen bien en la técnica. Generalmente, las células hospederas se crecen hasta que alcanzan una biomasa alta y las células se encuentran en crecimiento exponencial, con el objeto de tener una gran cantidad de ADN plasmídico. Se pueden emplear dos métodos distintos, por ejemplo, fermentación en lote y fermentación con alimentación por lote. La fermentación en lote permite controlar la velocidad de crecimiento a través de la manipulación de la temperatura de crecimiento y la fuente de carbono utilizada. Como se utiliza en la presente invención, el término "fermentación en lote" es un proceso de cultivo celular mediante el cual todos los nutrientes requeridos para crecimiento celular y para producción de plásmido contenidos en las células cultivadas se encuentran en el recipiente en gran exceso (por ejemplo, exceso de 10 veces mayor con relación a las concentraciones de los nutrientes en la técnica previa) en el momento de la inoculación, obviando así la necesidad de la realización de adiciones al recipiente estéril después de las adiciones post-esterilización, y la necesidad de modelos y estrategias para la alimentación del complejo. Otro tipo de fermentación útil de conformidad con la invención es la fermentación de alimentación por lote, en la cual la velocidad de crecimiento celular se controla mediante la adición de nutrientes al cultivo durante el crecimiento celular. Como se utiliza en la presente invención, "fermentación con alimentación en lote" se refiere a un proceso de cultivo celular en el cual la velocidad de crecimiento se controla mediante las adiciones cuidadosamente monitoreadas de metabolitos al cultivo durante la fermentación. La fermentación con alimentación por lote de conformidad con la invención permite que el cultivo celular alcance una biomasa mayor que la fermentación en lote. Los ejemplos de procesos de fermentación y velocidades ejemplares de alimentación por adición se describen a continuación para una preparación de 50 L. No obstante, también se pueden procesar otros volúmenes, por ejemplo 10 L, 50 L, o mayores de 500 L, utilizando las velocidades de alimentación ejemplares descritas a continuación, dependiendo de la escala del equipo. Las fermentaciones con medio de lote altamente enriquecido y las fermentaciones con medio para alimentación por lote son apropiadas para la producción de cultivo con una elevada densidad celular para maximizar la producción de plásmido específico y permitir la cosecha de una alta biomasa a la vez que aún se encuentra en crecimiento exponencial. La fermentación de alimentación por lote utiliza glucosa o glicerol como una fuente de carbono. La fermentación se lleva a cabo en modo de lote hasta que se acaba el sustrato inicial de carbono (glucosa). Este punto es evidente por una elevación repentina en la DO y se confirma por el análisis de glucosa de una muestra tomada inmediatamente después de este evento. Posteriormente se inicia el trabajo de la bomba de medio para alimentación previamente cebada. La velocidad de la bomba se determina mediante un modelo derivado a partir de Curless et al. (Bioeng. 38: 1082-1090, 1991), el total del cual se incorpora como referencia en la presente invención. El modelo se diseñó para facilitar el control de la fase de alimentación de un proceso de alimentación en lote. En el proceso inicial de lote, se consume una concentración no inhibidora de sustrato por las células en crecimiento a su velocidad de crecimiento específico máximo, produciendo una elevación rápida en los niveles de biomasa después de la inoculación. El cultivo no puede crecer a esta velocidad de manera indefinida debido a la acumulación de metabolitos tóxicos (Fieschio et al., "Fermentation Technology Using Recombinant Microorganisms". En Biotechnology, eds. H. J. Rhem and G. Reed. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b: 117-140, 1989). Para permitir el crecimiento logarítmico continuo, el modelo calcula la velocidad de alimentación basada en el tiempo del sustrato de carbono con crecimiento limitado, sin la necesidad de retroalimentacion control, para producir una fase de crecimiento para alimentación en lote en una fijación dada por el operador. Esto se elige a un nivel el cual no ocasiona la producción de catabolitos inhibidores y es adecuado para la producción de una alta cantidad de biomasa. Generalmente, la fermentación en lote utiliza altos niveles (por ejemplo, 4 veces más elevados que las concentraciones de la técnica previa) de precursores que están presentes en el medio enriquecido del lote. En particular las cantidades de extracto de levadura en el medio de lote enriquecido forma 5 g/l (como en el medio LB) a 20 g/litro proveyendo así grandes cantidades de factores de crecimiento y precursores de ácido nucleico. El medio también se suplementa con sulfato de amonio (5 g/l) el cual actúa como una fuente de nitrógeno orgánico. Las adiciones de precursores (nitrógeno orgánico en la forma de sulfato de amonio) durante el proceso de alimentación en la fermentación con alimentación en lote se diseñan para prevenir efectos deletéreos sobre la calidad del plásmido. Un aspecto importante del método de conformidad con la presente invención es la lisis celular. Por lo tanto, la presente invención abarca un proceso para la producción y aislamiento del ADN plasmídico altamente purificado que incluye el paso de lisis celular en la cual existe (a) un medio para el flujo turbulento para mezclar rápidamente una suspensión celular (solución 1 en la figura 1) con una solución que lisa a las células (solución 2 en la figura 1 ); y (b) un medio para el flujo laminar para permitir la incubación de una mezcla formada en (a) sin agitación sustancial, en donde la mezcla formada en (a) fluye a partir de los medios para flujo turbulento hacia los medios para flujo laminar. De conformidad con una modalidad de la invención, el mecanismo puede comprender adicionalmente un medio para la adición de una segunda solución que neutraliza a la solución de lisado (solución 3 en la figura 1 ), en donde la mezcla incubada en (b) fluye a partir de los medios para flujo laminar hacia los medios para la adición de una segunda solución. En incluso otra modalidad, el mecanismo se puede utilizar en un método para aislar el ADN plasmídico a partir de las células que comprende: (a) mezclar las células con una solución de lisis alcalina en los medios para flujo turbulento; y (b) neutralizar la solución de lisis alcalina mediante la adición de una solución ácida. A pesar de los numerosos métodos actualmente utilizados para lisar a las células bacterianas, ninguno de estos resuelve los problemas ocasionados por las propiedades viscoelásticas de los fluidos y las fuerzas de esfuerzo cortante implicadas durante los pasos de mezclado. Un objetivo de la presente invención es un método para la utilización de tubos T para mezclar la suspensión celular (solución 1 ) y la solución alcalina (solución 2) de manera uniforme y muy rápidamente antes de que aparezca el fluido viscoelástico. Por lo tanto la lisis continua de conformidad con la presente invención provee una ventaja principal en la limitación de las fuerzas de esfuerzo cortante. Los tubos T generalmente tienen un diámetro pequeño del tubo, usualmente con un diámetro inferior a 1 cm, preferiblemente de alrededor de 2 y 8 mm, y más preferiblemente de alrededor de 6 mm, con el objeto de incrementar el tiempo de contacto de los fluidos mezclados, pero ese método no hace uso del mezclado inducido por el paso a través del tubo. El cuadro 1 en la presente invención a continuación muestra la variación de los parámetros B1 a, B1 b, B2 de los medios para flujo turbulento, flujo laminar, y flujo turbulento, respectivamente, y sus velocidades de flujo correspondientes S1 , S2, y S3 como se exhibe en la figura 1.

CUADRO 1 Otro objetivo de la presente invención es un mezclador o inyector con tubos en lugar de una T, lo cual permite la dispersión de las células en la solución para lisis. Por consiguiente, el esfuerzo mecánico sobre los fluidos que pasan a través de los tubos se reduce en gran medida en comparación con cuando los fluidos son agitados, por ejemplo, mediante paletas en tanques. La eficiencia inicial de la mezcla resulta en una eficiencia incluso mayor en los segundos que siguen, puesto que este fluido aún no tiene propiedades viscoelásticas y el mezclado que se realiza por el pequeño diámetro del tubo es muy eficiente. En contraste, cuando se utiliza un tubo T para la mezcla, la mezcla inicial solamente es moderada mientras que el fluido se vuelve rápidamente viscoelástico, lo que resulta en problemas considerables mientras fluye en el tubo. Este mezclado parcial resulta en la lisis de solamente una porción de las células y por lo tanto solamente puede liberar una porción de los plásmidos antes de la neutralización. De conformidad con la presente invención, los inventores han identificado dos fases durante la lisis, denominadas Fase I y Fase II. Estas dos fases corresponden a I) lisis de las células y II) desnaturalización de ácidos nucleicos, ocasionando un cambio principal en la conducta reológica que resulta en un fluido viscoelástico. El ajuste sobre los diámetros de los tubos hace posible alcanzar las necesidades de estas dos fases. Con un diámetro de tubo pequeño (B1a), se incrementa el mezclado. Esta es la configuración utilizada para la Fase I. Con un diámetro de tubo grande (B1 b), se reduce la mezcla (y por lo tanto el esfuerzo cortante). Esta es la configuración empleada para la Fase II. Por consiguiente, los inventores utilizan un mezclador denominado M1 que se ilustra en la figura 2. Cualquier dispositivo con forma de T también se puede utilizar para proveer dispersión de la suspensión celular de conformidad con la presente invención. Con este mezclador, la 3 solución 1 se inyecta con fluidez en un solo movimiento dentro de la solución para lisis alcalina a través de una o más orificios con diámetro pequeño con el objeto de obtener una dispersión eficiente. Los diámetros de estos orificios son de alrededor de 0.5 mm a 2 mm, y preferiblemente de aproximadamente 1 mm en la configuración ilustrada. La mezcla sale del mezclador M1 para pasar a través de un tubo de diámetro pequeño (figura 1 ) por un corto período de tiempo (de aproximadamente 2.5 segundos). La combinación del diámetro y el tiempo de flujo se pueden calcular fácilmente para mantener un flujo turbulento. Los ejemplos de variaciones de estos parámetros se proveen en el cuadro 1. Todas las referencias con respecto al diámetro del tubo proveen el diámetro interno del tubo, no el diámetro externo, el cual incluye el grosor de las paredes del tubo. Este tiempo de residencia breve en el tubo permite una homogeneización muy rápida de las soluciones 1 y 2. Asumiendo que la solución 1 y la solución 2 aún son fluidos Newtonianos durante la Fase l, el modo de flujo es turbulento durante la fase de homogeneización. En la salida a partir de este tubo, las soluciones 1 y 2 se homogeneizan, e inicia la lisis de las células en suspensión. La mezcla de homogeneización pasa entonces a través de un segundo tubo (B1 b) de diámetro mucho más grande (figura 1), en el cual se presenta la lisis de las células y la formación del fluido viscoelástico. Durante esta fase, el mezclado se puede minimizar y la solución se puede dejar "descansar" para limitar la turbulencia tanto como sea posible con el objeto de minimizar cualesquiera esfuerzos cortantes que podrían fragmentar de otra manera el ADNg. En una modalidad de la presente invención, un tiempo de contacto de aproximadamente 1 a 3 minutos, alrededor de 2 minutos, y preferiblemente de 1 minuto 20 segundos es adecuado para completar la lisis celular y para desnaturalizar los ácidos nucleicos. Durante la fase de desnaturalización, el modo de flujo del fluido es laminar, promoviendo una difusión lenta del SDS y del hidróxido de sodio hacia los componentes celulares. El lisado así obtenido y la solución de neutralización 3 se mezclan entonces con un mezclador Y denominado M2. En una modalidad de la presente invención, el diámetro interno del mezclador Y es de alrededor de 4 a 15 mm, o de alrededor de 6 a 10 mm, y puede ser de alrededor de 6 mm o de alrededor de 10 mm. El tubo de diámetro pequeño (por ejemplo, aproximadamente 6 mm del tubo) se ubica en una salida del mezclador Y para permitir un mezclado rápido (<1 segundo) y efectivo del lisado con la solución 3. Posteriormente se recolecta la solución neutralizada en un tanque para cosecha. Durante la neutralización, la disminución rápida del pH induce la formación de las pequeñas masas floculentas (por ejemplo, formación de grumos o masas). Por otra parte, el plásmido parcialmente desnaturalizado se renaturaliza muy rápidamente y permanece en solución. Las masas flocosas se asientan gradualmente en el tanque para cosecha, eliminando la masa de los contaminantes.

El dibujo esquemático en la figura 1 muestra una modalidad del sistema de lisis continua (CL). La lisis continua se puede utilizar de esta manera o con procesamiento adicional. El método de la presente invención se puede utilizar para lisar cualquier tipo de célula (por ejemplo, procarionte o eucarionte) para cualquier propósito relacionado con la lisis, tal como la liberación de ADN plasmídico deseado a partir de las células blanco que se puede purificar subsecuentemente. En una modalidad preferida, el método de la presente invención se utiliza para lisar células hospederas que contienen plásmidos para liberar los plásmidos. El proceso del paso de lisis alcalina continua de conformidad con la presente invención se puede llevar a cabo sobre células cosechadas a partir de una fermentación las cuales se han crecido hasta una biomasa de células que aún no ha alcanzado la fase estacionaria, y por lo tanto se encuentran en crecimiento exponencial (2-10 g de peso seco/litro). El paso de lisis alcalina continua también se puede llevar a cabo sobre células cosechadas a partir de una fermentación las cuales se han crecido hasta alcanzar una alta cantidad de biomasa de las células y ya no se encuentran en crecimiento exponencial, sino que han alcanzado una fase estacionaria, con una concentración celular de aproximadamente 10-200 g en peso seco por litro, y preferiblemente 2-60 g en peso seco por litro. Otro aspecto importante de la invención son las composiciones de ADN plasmídico altamente purificado y las composiciones de ADN plasmídico grado farmacéutico producidas a través de una combinación de pasos de cromatografía, los cuales pueden o no estar combinados con el aspecto de lisis celular anteriormente mencionado. Por lo tanto, la invención comprende adicionalmente, o comprende además, un método para la producción y aislamiento de ADN plasmídico altamente purificado que está esencialmente libre de contaminantes y por lo tanto es ADN grado farmacéutico. El ADN plasmídico producido y aislado mediante el método de la invención contiene niveles muy bajos, por ejemplo, partes por millón (ppm) de ADN cromosomal contaminante, ARN, proteína, y endotoxinas, y principalmente contiene ADN plasmídico en forma circular cerrada. El ADN plasmídico producido de conformidad con la invención es de pureza adecuada para uso en investigación y terapia basada en plásmido. Como se mencionó anteriormente, se puede definir, en un aspecto, una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico de la invención por un nivel de pureza con respecto a uno más contaminantes típicos, tales como los contaminantes de la célula hospedera. Por consiguiente, una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico de la invención puede ser una composición que contiene en el nivel de una parte por millón o ppm (< 0.0001 %, por ejemplo < 0.0001 mg por 100 mg de ADN plasmídico) o menos de contaminantes de ADN genómico, ARN, y/o proteína. Más precisamente, la composición de ADN plasmídico grado farmacéutico puede comprender una preparación de ADN plasmídico que contiene menos de aproximadamente 0.01 %, o menos de 0.001 %, y preferiblemente menos de 0.0001 %, o preferiblemente menos de 0.00008% (< 0.00008%, por ejemplo < 0.00008 mg por 100 mg de ADN plasmídico) del ADN cromosomal de la célula hospedera o ADN genómico. Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico también puede comprender una preparación de ADN plasmídico que contiene menos de aproximadamente 0.01 %, o menos de 0.001 %, y preferiblemente menos de 0.0001 %, o preferiblemente menos de 0.00002% (< 0.00002%, por ejemplo < 0.00002 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de contaminantes de ARN de la célula hospedera. Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico puede comprender una preparación de ADN plasmídico que contiene menos de aproximadamente 0.0001 %, y más preferiblemente menos de 0.00005% (< 0.00005%, por ejemplo < 0.00005 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de contaminantes de proteína de la célula hospedera. Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico también puede comprender una preparación de ADN plasmídico que contiene menos de 0.1 UE/mg de endotoxinas. En particular, cualquier combinación de al menos dos, o al menos tres, o cuatro de estos niveles de pureza también se incluye en la invención. Por lo tanto, una composición que tiene un nivel detectable de ADN genómico de la célula hospedera o menos de aproximadamente 0.01% y menos de aproximadamente 0.001% de ARN de la célula hospedera se puede incluir en la invención. Más preferiblemente, la composición de ADN plasmídico grado farmacéutico puede tener menos de aproximadamente 0.00008% de ADN genómico de la célula hospedera y menos de aproximadamente 0.00002% de ARN de la célula hospedera y menos de aproximadamente 0.00005% de proteína de la célula hospedera. De hecho, se puede emplear cualquier combinación de los niveles de pureza anteriormente mencionados para cualquier composición particular de ADN plasmídico grado farmacéutico según la invención. Las composiciones también pueden comprender otros componentes farmacéuticamente aceptables, reguladores de pH, estabilizantes, o compuestos para la mejoría de la transferencia de gen y particularmente transferencia de ADN plasmídico dentro de una célula u organismo. En otro aspecto, los métodos de la invención comprenden el uso de una cromatografía por afinidad de triple hélice, la cual es precedida por o seguida por al menos una técnica cromatográfica adicional, opcionalmente o típicamente como los pasos de purificación finales o al menos al término o cerca del término del esquema de purificación del plásmido. En combinación con una cromatografía por afinidad de triple hélice es preferible una o más de cromatografía por intercambio iónico, cromatografía por interacción hidrófoba, y permeacion en gel o cromatografía por exclusión de tamaño. Otras técnicas incluyen cromatografía en hidroxiapatita (tipo I y II), fase reversa, y cromatografía por afinidad. Se puede adaptar para uso cualquier protocolo disponible de cromatografía por afinidad que incluye la separación de ácido nucleico. La cromatografía por intercambio de aniones o cualquier uno más de diferentes pasos de cromatografía o técnicas utilizadas puede emplear frases estacionarías, métodos cromatográficos para desplazamiento, tecnología simulada en cama con movimiento, y/o columnas o sistemas de cama continua. Además, cualquier uno o más de los pasos o técnicas puede emplear técnicas o sistemas de cromatografía de alta resolución. Por lo tanto, el método de la invención comprende los pasos de purificación incluyendo la cromatografía por afinidad en triple hélice con un paso adicional de cromatografía de intercambio iónico y adicionalmente puede incluir la cromatografía por interacción hidrófoba o cromatografía por permeación en gel. El paso de cromatografía de intercambio iónico se puede realizar tanto en cromatografía de intercambio iónico en cama fluida como en cromatografía de intercambio aniónico axial y/o radial de alta resolución, Por lo tanto el método incluye el paso de lisis alcalina descrito en la presente invención en combinación con los pasos de la cromatografía de intercambio iónico subsecuente, cromatografía por afinidad de triple hélice y cromatografía por interacción hidrófoba, que se presentan en ese orden. Una filtración del lisado o la remoción de otras pequeñas masas floculentas pueden preceder al primer paso de cromatografía. Los métodos de la invención descritos en la presente invención para la purificación del ADN plasmídico son escalables y por lo tanto pueden ser escalables en la elaboración a gran escala. En algunas modalidades de la invención, la lisis continua se puede combinar con pasos adicionales de purificación para resultar en un producto que contiene ADNp con una alta pureza. Este puede, por ejemplo, combinarse con al menos una remoción de las pequeñas masas floculentas (tal como filtración del lisado, sedimentación, o centrifugación), cromatografía de intercambio iónico (tal como intercambio catiónico o intercambio aniónico), cromatografía por afinidad triple, y cromatografía por interacción hidrófoba. En una modalidad, la lisis continua se sigue por la cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía por afinidad triple, y cromatografía por interacción hidrófoba, en ese orden. En otra modalidad, la lisis continua se sigue por filtración del lisado, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía por afinidad triple, y cromatografía por interacción hidrófoba, en ese orden. Estos pasos se realizan para un procedimiento de elaboración de plásmido verdaderamente escalable, el cual puede producir grandes cantidades de ADNp con pureza sin precedente. Los ADN y ARN del hospedero así como las proteínas se encuentran en el intervalo de sub-ppm. El método de la presente invención también puede utilizar pasos adicionales de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), cromatografía en fase reversa, cromatografía en hidroxiapatita, y/o otras técnicas, métodos, o sistemas cromatográficos disponibles en combinación con los pasos descritos en la presente invención de conformidad con la presente solicitud. Se puede emplear la remoción de las pequeñas masas floculentas para proveer una pureza mayor a la del producto de ADNp resultante. Este paso se puede utilizar para remover la masa de material precipitado (pequeñas masas floculentas). Un mecanismo para la realización de la remoción de las pequeñas masas floculentas es a través de un paso de filtración del lisado, tal como a través de un filtro con malla de 1 a 5 mm, y preferiblemente un filtro con malla de 3.5 mm, seguido por una filtración profunda como un paso de filtración profunda. Otros métodos para llevar a cabo la remoción de las pequeñas masas floculentas son a través de la centrifugación o de sedimentación. La cromatografía de intercambio iónico se puede emplear para proveer una mayor pureza al producto de ADNp resultante. El intercambio aniónico se puede seleccionar dependiendo de las propiedades de los contaminantes y el pH de la solución. La cromatografía de intercambio aniónico se puede emplear para proveer una mayor pureza al producto de ADNp resultante. La cromatografía de intercambio aniónico funciona mediante la unión de moléculas negativamente cargadas (o ácidas) a un soporte el cual está positivamente cargado. Posteriormente, el uso de la cromatografía por intercambio iónico, permite que las moléculas se separen basándose en su carga. Las familias de moléculas (ácidas, básicas y neutras) se pueden separar fácilmente mediante esta técnica. Los esquemas de elución paso a paso se pueden utilizar, con muchos contaminantes eluyendo en las fracciones tempranas y el ADNp eluyendo en las fracciones posteriores. El intercambio aniónico es muy eficiente para la remoción de proteínas y endotoxinas a partir de la preparación de ADNp. Para la cromatografía de intercambio iónico, el material para empaquetamiento y el método para la preparación de dicho material así como un procedimiento para la preparación, polimerización y funcionalización de la cromatografía de intercambio aniónico y elución y separación del ADN plasmídico a través de éstos se conocen bien en la técnica. El compuesto a ser utilizado para la síntesis de los materiales base que se utilizan para el material para empaquetamiento para la cromatografía de intercambio aniónico pueden ser cualesquiera compuestos, si se pueden introducir diversos grupos funcionales que exhiben hidrofobicidad o diversos grupos de intercambio iónico mediante una post-reacción después de que los materiales base son sintetizados. Los ejemplos de monómeros monofuncionales incluyen estireno, o-halometilestireno, m~ halometilestireno, p-halometilestireno, o-haloalquilestireno, m-haloalquilestireno, p-haloalquilestireno, a-metilestireno, -metil-o-halometilestireno, -metil-m-halometilestireno, a-metil-p-halometilestireno, ct-metil-o-haloalquilestireno, a-metil-m-haloalquilestireno, a-metil-p-haloalquilestireno, o-hidroximetilestireno, m-hidroximetilestireno, p-hidroximetilestireno, o-hidroxialquilestireno, m-hidroxialquilestireno, p-hidroxilalquilestireno, a-metil-o-hidroximetilestireno, a-metil-m-hidroximetilestireno, a-metil-p-hidroximetilestireno, a-metil-o-hidroxialquilestireno, a-metil-m-hidroxialquilestireno, c -metil-p-hidroxialquilestireno, glicidil metacrilato, glicidil acrilato, hidroxietil acrilato, hidroximetacrilato, y vinil acetato. Los compuestos más preferidos son grupos haloalquilo sustituidos en anillos aromáticos, halógenos tales como Cl, Br, l y F de hidrocarburos saturados de cadena recta y/o de cadena ramificada con de 2 a 15 átomos de carbono. Los ejemplos de monómeros polifuncionaies incluyen divinilbenceno, trivinilbenceno, diviniltolueno, triviniltolueno, divinilnaftaleno, trivinilnaftaleno, etilenglicol dimetacrilato, etilenglicol diacrilato, dietilenglicol dimetacrilato, dietilenglicol diacrilato, metilenbismetacrilamida, y metilenbisacrilamida. Se pueden introducir diversos grupos para intercambio mediante la post-reacción. La preparación del material base incluye un primer paso en donde el monómero monofuncional y el monómero polifuncional se pesaron a una relación apropiada y se añadieron precisamente el diluyente o solvente se pesaron los cuales se utilizan para el propósito de ajuste de los poros en forma de partículas y se pesa similarmente de manera precisa un iniciador de polimerización, seguido por agitación. Posteriormente la mezcla se somete a una polimerización de suspensión tipo aceite-en-agua en donde la mezcla se añade dentro de un estabilizante en suspensión disuelto en solución acuosa pesado de manera precisa de antemano, y gotitas de aceite con un tamaño propuesto se forman mediante mezclado con agitación, y la polimerización se lleva a cabo mediante solución mezclada gradualmente calentada. La relación de monómero monofuncional con respecto al monómero polifuncional generalmente es de alrededor de 1 mol de monómeros monofuncionales, y alrededor de 0.01 a 0.2 moles de monómero polifuncional de manera que se obtienen partículas suaves de material base. Tampoco se restringe particularmente un iniciador de la polimerización, y comúnmente se utilizan los de tipo azobis y/o de tipo peróxido.

Los estabilizantes de la suspensión tales como agentes tensioactivos iónicos, agentes tensioactivos no iónicos y polímeros con propiedades amfipáticas o mezclas de los mismos también se pueden utilizar para prevenir la agregación entre las gotitas de aceite. El material para empaquetamiento a ser utilizado para cromatografía de intercambio iónico para la purificación de los ADN plasmídicos es preferible que tenga un diámetro de poro relativamente grande, particularmente dentro de un intervalo de 1500 a 4000 angstroms. Se conocen bien en la técnica la modificación de la superficie para introducir grupos de intercambio iónico a los materiales base. Se pueden utilizar dos tipos de eluyentes para la cromatografía de intercambio iónico. Se puede utilizar un primer eluyente que contiene una concentración baja de sal y un segundo eluyente que contiene una alta concentración de sal. El método de elución consiste en un cambio paso a paso a partir de primer eluyente hacia el segundo eluyente y el método para elución en gradiente que cambia continuamente la composición del primer eluyente hacia el segundo eluyente. Se pueden utilizar los reguladores de pH y las sales que generalmente se utilizan en estos eluyentes para cromatografía de intercambio iónico. Para el primer eluyente que contiene una baja concentración de sal, es particularmente preferible una solución acuosa con una concentración de regulador de pH de 10 a 50 m y un valor de pH de 6 a 9. Para el segundo eluyente que contiene una alta concentración de sal, es particularmente preferible una solución acuosa con 0.1 a 2 M de sal de sodio añadida al eluyente C. Para las sales de sodio, se puede utilizar cloruro de sodio y sulfato de sodio. Además, se puede utilizar un agente quelante para ion metálico bivalente tal como por ejemplo, ácido etilendiamina-tetraacético, para la inhibición de la degradación de los plásmidos debido a las enzimas degradantes del ADN en el lisado de Escherichia coli. La concentración del agente quelante para ion metálico bivalente preferiblemente es de 0.1 a 100 mM. Una amplia variedad de matices para intercambio aniónico comercialmente disponibles son adecuadas para uso en la presente invención, incluyendo pero no limitadas a aquellas disponibles a partir de POROS Anión Exchange Resins, Qiagen, Toso Haas, Sterogene, Spherodex, Nucleopac, y Pharmacia. Por ejemplo, la columna (Poros II PL/M, 4.5 mm x 100) se equilibra inicialmente con 20 mM de Bis/TRIS Propano a pH 7.5 y 0.7 M de NaCI. La muestra se carga y se lava con el mismo regulador de pH inicial. Posteriormente se aplica un gradiente de elución de 0.5 M a 0.85 M de NaCI en aproximadamente 25 volúmenes de la columna y las fracciones se recolectan. La cromatografía de intercambio aniónico preferida incluye Fractogel TMAE HiCap. De conformidad con una modalidad preferida del procedimiento de separación y purificación del ADN plasmídico, la presente invención se refiere a un método de separación y purificación de ácidos nucleicos y/o ADN plasmídico mediante cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de triple hélice en combinación para la obtención eficiente de ácidos nucleicos con una alta pureza en una gran cantidad. La cromatografía por afinidad de triple hélice se describe entre otras en las patentes US 6,319,672, 6,287,762 así como en la Solicitud de Patente Internacional publicada bajo WO 02/77274 del solicitante. La cromatografía por afinidad de triple hélice se basa en la hibridación específica de oligonucleótidos y una secuencia blanco dentro del ADN de cadena doble. Estos oligonucleótidos pueden contener las siguientes bases: - timidina (T), la cual es capaz de formar tripletes con los dobletes A.T de ADN de cadena doble (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859); - adenina (A), la cual es capaz de formar tripletes con los dobletes A.T de ADN de cadena doble; - guanina (G), la cual, es capaz de formar tripletes con los dobletes G.C de ADN de cadena doble; - citosina protonada (C+), la cual es capaz de formar tripletes con los dobletes G.C de ADN de cadena doble (Rajagopal et al., loe. cit.); - uracilo (U), la cual es capaz de formar tripletes con los pares de bases A.U o A.T. Preferiblemente, el oligonucleótido utilizado comprende una secuencia de homopirimidina rica en citosina y la secuencia específica presente en el ADN es una secuencia de homopurina-homopirimidina. La presencia de citosinas hace posible tener una triple hélice la cual es estable a un pH ácido en donde las citosinas están protonadas, y se encuentra desestabilizada a un pH alcalino en donde las citosinas están neutralizadas. El oligonucleotido y la secuencia específica presente en el ADN preferiblemente son complementarias para permitir la formación de una triple hélice. Las mejores producciones y la mejor selectividad se pueden obtener mediante el uso de un oligonucleotido y una secuencia específica las cuales son completamente complementarias. Por ejemplo, un oligonucleotido poli(CTT) y una secuencia específica poli(GAA). Los oligonucleótidos preferidos tienen una secuencia 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTT CTTCTT-3' (GAGG(CTT)7 (SEQ ID NO: 1 ), en la cual las bases GAGG no forman una triple hélice pero permiten que el oligonucleotido se encuentre separado del brazo para acoplamiento; la secuencia (CTT)7. Estos oligonucleótidos son capaces de formar una triple hélice con una secuencia específica que contiene unidades complementarias (GAA). La secuencia en cuestión puede ser, en particular, una región que contiene 7, 14 o 17 unidades GAA, como se describe en los ejemplos. Otra secuencia de interés específico es la secuencia 5'-AAGGGAGGGAGGA GAGGAA-3' (SEQ ID NO: 2). Esta secuencia forma una triple hélice con los oligonucleótidos 5 -AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID NO: 3) o 5'-TTG GTGTG GTG G GTG G GTT-3' (SEQ ID NO: 4). En este caso, el oligonucleotido se une en una orientación antiparalela a la cadena de polipurina. Estás triples hélices son estables solamente en la presencia de Mg2+ (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251 ; Beal and Dervan, Science, 991 , 251 , 1360-1363). Como se estableció anteriormente, la secuencia específica puede ser una secuencia que está presente de manera natural en el ADN de cadena doble, o una secuencia sintética introducida de manera artificial en el último. Es especialmente ventajoso el uso de un oligonucleótido capaz de formar una triple hélice con una secuencia que está presente de manera natural en el ADN de cadena doble, por ejemplo en el origen de replicación de un plásmido o en un gen marcador. A este respecto, se sabe a través de los análisis de secuencia que algunas regiones de estos ADNs, en particular el origen de replicación, podrían poseer regiones de homopurina-homopirimidina. La síntesis de oligonucleótidos capaces de formar triples hélices con estas regiones naturales de homopurina-homopirimidina permite que se aplique el método de la invención a plásmidos no modificados, en particular plásmidos comerciales del tipo pUC, pBR322, pSV, y los similares. Entre las secuencias de homopurina-homopirimidina naturalmente presentes en un ADN de cadena doble, se puede mencionar una secuencia que comprende toda o una parte de la secuencia 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID NO: 5) presente en el origen de replicación del plásmido de E. coli ColE1. En este caso, el oligonucleótido que forma la triple hélice posee la secuencia: S'-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-S' (SEQ ID NO: 6), y se une alternativamente a las dos cadenas de la doble hélice, como se describe por Beal y Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) y Jayasena y Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). También se puede mencionar la secuencia 5 -GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 7) del plásmido pBR322 gen ß-lactamasa (Duval-Valentin et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA, 1992, 89, 504-508). Las secuencias blanco apropiadas las cuales pueden formar estructuras triples con oligonucleotidos particulares han sido identificadas en los orígenes de replicación de los plásmidos ColE1 así como los plásmidos pCOR. Los plásmidos pCOR son plásmidos con un origen de replicación condicional y se describen entre otros en los documentos US 2004/142452 y US 2003/161844. Los plásmidos derivados de ColE1 contienen una secuencia de 12 elementos de homopurina (5 -AGAAAAAAAGGA-3') (SEQ ID NO: 8) situada hacia el extremo 5' del transcrito de ARN-II implicado en la replicación del plásmido (Lacatena et al., 1981 , Nature, 294, 623). Esta secuencia forma una estructura triple estable con el oligonucleótido complementario de 12 elementos d'-????????????^· (SEQ ID NO: 9). La estructura base de pCOR contiene una extensión de homopurina de 14 bases no repetitivas (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID NO: 10) localizadas en el segmento rico en A+T del origen de replicación ? de pCOR (Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). Esta secuencia forma una estructura triple estable con el oligonucleótido complementario de 14 elementos 5'-TTC I I I I I I I I CTT-3' (SEQ ID NO: 11). Los oligonucleotidos correspondientes 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 8) y 5 -TTC I I I I I TTTCTT-3' (SEQ ID NO: 11 ) se dirigen eficientemente y específicamente a sus secuencias complementarias respectivas localizadas en el origen de replicación ya sea de ColE1 ori o de pCOR (oriy). De hecho, una tríada no canónica particular (T*GC o C*AT) puede resultar en la desestabilización completa de la estructura triple. El uso de un oligonucleótido capaz de formar una triple hélice con una secuencia presente en un origen de replicación o un gene marcador es especialmente ventajoso, puesto que hace posible purificar, con el mismo oligonucleótido, cualquier ADN que contiene dicho origen de replicación o dicho gen marcador. Por lo tanto no es necesario modificar el plásmido o el ADN de cadena doble con el objeto de incorporar una secuencia específica artificial en éste. Aunque se prefieren las secuencias completamente complementarias, no obstante, se entiende que se pueden tolerar ciertas inconsistencias entre la secuencia del oligonucleótido y la secuencia presente en el ADN, con la condición de que no lleven a una pérdida de afinidad demasiado grande. Se puede mencionar la secuencia 5'-AAAAAAG G GAATA AG G G-3' (SEQ ID NO: 12) presente en el gen de ß-lactamasa de E. coli. En este caso, la timina que interrumpe la secuencia de polipurina se puede reconocer por una guanina de la tercera cadena, formando por lo tanto un triplete de G*TA el cual es estable cuando está flanqueado por dos tripletes T*AT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31 , 2829-2834). De conformidad con una modalidad particular, los oligonucleótidos de la invención comprenden la secuencia (CCT)n, la secuencia (CT)n o la secuencia (CTT)n, en la cual n es un entero entre 1 y 15 inclusivo. Es especialmente ventajoso utilizar secuencias del tipo (CT)n o (CTT)n. El solicitante mostró, en efecto, que la purificación producida fue influenciada por la cantidad de C en el oligonucleótido. En particular, como se muestra en el ejemplo 7, la producción de la purificación se incrementa cuando el oligonucleótido contiene menos citosinas. Se entiende que los oligonucleótidos de la invención también pueden combinar las unidades (CCT), (CT) o (CTT). El oligonucleótido utilizado puede ser natural (compuesto de bases naturales no modificadas) o puede estar químicamente modificado. En particular, el oligonucleótido puede poseer ventajosamente ciertas modificaciones químicas que permiten que se incremente su resistencia a o su protección en contra de las nucleasas, o su afinidad para la secuencia específica. También se entiende que oligonucleótido se refiere a cualquier sucesión lineal de nucleótidos la cual ha sido sometida a modificación del esqueleto con el objetivo de hacerlo más resistente a las nucleasas. Entre las modificaciones posibles, se pueden mencionar los oligonucleótido fosforotioatos, los cuales son capaces de formar triples hélices con el ADN (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), así como los oligonucleótidos que poseen esqueletos con forma del acetal o del metilfosfonato (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc, 1991 , 113, 7767-7768). También es posible utilizar oligonucleótidos sintetizados con a anómeros de nucleótidos, los cuales también forman triples hélices con el ADN (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Otra modificación del esqueleto es el enlace de fosfora midato. Por ejemplo, se puede mencionar el enlace de fosforarnidato N3'-P5 intemucleótido descrito por Gr aznov y Chen, el cual proporciona oligonucleótidos que forman triples hélices especialmente estables con el ADN (J. Am. Chem. Soc, 1994, 16, 3143-3144). Entre otras modificaciones del esqueleto, también se puede mencionar el uso de ribonucleótidos, de 2'-O-metilribosa! fosfodiéster, etc. (Sun y Héléne, Curr. Opinión Struct. Biol., 116, 3143-3144). Finalmente, el esqueleto basado en fósforo se puede reemplazar mediante un esqueleto de poliamida como en los PNAs (péptido ácido nucleicos), los cuales también se pueden formar a partir de triples hélices (Nielsen et al., Science, 1991 , 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc, 1993, 115, 6477-6481 ), o mediante un esqueleto basado en guanina, como en DNGs (deoxyribonucleic guanidine, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), o mediante análogos policatiónicos de ADN, los cuales también forman triples hélices. La timina de la tercera cadena también se puede reemplazar por un 5-bromouracilo, el cual incrementa la afinidad del oligonucleótido por el ADN (Povsic y Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1989, 111 , 3059-3061 ). La tercera cadena también puede contener bases no naturales, entre las cuales se pueden mencionar la 7-deaza-2'-deoxixantosina (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21 , 327-333), 1-(2-deoxi-p-D-ribofuranosil)-3-metil-5-amino-1 H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona (Koh y Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenina, 2-aminopurina, 2'-O-metilpseudoisocitidina, o cualquier otra modificación conocida por una persona experta en la técnica (para una revisión véase Sun y Héléne, Curr. Opinión Struct. Biol., 1993, 3, 345-356). Otro tipo de modificación del oligonucleótido tiene el objetivo, más específicamente, de mejorar la interacción y/o afinidad entre el oligonucleótido y la secuencia específica. En particular, una modificación más ventajosa de conformidad con la invención consiste en la metilación de las citosinas del oligonucleótido. El oligonucleótido así metilado exhibe la notable propiedad de formación de una triple hélice estable con la secuencia específica en los intervalos de pH cercanos a la neutralidad (> 5). Por lo tanto hace posible el trabajo a mayores valores de pH que los oligonucleótidos de la técnica precedente, es decir a valores de pH en donde los riesgos de degradación del ADN plasmídico son mucho más pequeños. La longitud del oligonucleótido utilizado en el método de la invención se encuentra entre 5 y 30. Un oligonucleótido de longitud mayor de 10 bases se utiliza de manera ventajosa. La longitud se puede adaptar por una persona experta en la técnica para cada caso individual para ajusfar la selectividad deseada y la estabilidad de la interacción. Los oligonucleótidos de conformidad con la invención se pueden sintetizar mediante cualquier técnica conocida. En particular, éstos se pueden preparar mediante medios de sintetizadores de ácido nucleico. Se puede utilizar de manera bastante obvia cualquier otro método conocido por una persona experta en la técnica.

Para permitir su acoplamiento covalente al soporte, el oligonucleótido generalmente se funcionaüza. Por lo tanto, éste se puede modificar mediante un grupo tiol, amina o carboxílo terminal en la posición 5' o 3'. En particular, la adición de un grupo tiol, amina o carboxilo hace posible, por ejemplo, acoplar el oligonucleótido a un soporte que contiene funciones de disulfuro, maleimida, amina, carboxilo, áster, epóxido, bromuro de cianógeno o aldehido. Estos acoplamientos se forman mediante el establecimiento de enlaces disulfuro, tioéter, éster, amida o amina entre el oligonucleótido y el soporte. Se puede utilizar cualquier otro método conocido por una persona experta en la técnica, tales como por ejemplo, reactivos de acoplamiento bifuncional. Además, para mejorar la hibridación con el oligonucleótido acoplado, puede ser ventajoso para el oligonucleótido que contenga un "brazo" y una secuencia de bases "espadadora". El uso de un brazo hace posible, en efecto, unir el oligonucleótido a una distancia elegida a partir del soporte, permitiendo que se mejoren las condiciones de interacción con el ADN. El brazo consiste de manera ventajosa de una cadena de carbono lineal, que comprende de 1 a 18 y preferiblemente 6 o 12 grupos (CH2), y una amina la cual permite la unión a la columna. El brazo se asocia a un fosfato del oligonucleótido o de un "espaciador" compuesto de bases el cual no interfiere con la hibridación. Por lo tanto, el "espaciador" puede comprender bases de purina. Como un ejemplo, el "espaciador" puede comprender la secuencia GAGG. El brazo está compuesto de manera ventajosa de una cadena de carbono lineal que comprende 6 o 12 átomos de carbono. La cromatografía por afinidad triple es muy eficiente para la remoción del ARN y del ADN genómico. Estos pueden ser soportes cromatográficos funcionalizados, en masa o pre-empaquetados en una columna, las superficies plásticas funcionalizadas o glóbulos de látex funcionalizados, magnéticos o de otra manera. Preferiblemente se utilizan soportes cromatográficos. Como un ejemplo, los soportes cromatográficos capaces de ser utilizados son agarosa, acrilamida o dextrán así como sus derivados (tales como Sephadex, Sepharose, Superóse, etc.), polímeros tales como poli(estireno/divinilbenceno), o sílice injertado o no injertado, por ejemplo. Las columnas cromatográficas pueden operar en el modo de difusión o de perfusión. Para obtener mejores rendimientos de purificación, es especialmente ventajoso utilizar, en el plásmido, una secuencia que contiene diversas posiciones de hibridación con el oligonucleótido. La presencia de diversos promotores de posiciones de hibridación, en efecto, las interacciones entre dicha secuencia y el oligonucleótido, la cual lleva a una mejoría en los rendimientos de purificación. Por lo tanto, para un oligonucleótido que contiene n repetidos de los motivos (CCT), (CT) o (CTT), es preferible utilizar una secuencia de ADN que contiene al menos n motivos complementarios, y preferiblemente n+ 1 motivo complementario. Una secuencia que porta n+ 1 motivo complementario permite así dos posiciones de hibridación con el nucleótido. De manera ventajosa, la secuencia de ADN contiene hasta 11 posiciones de hibridación, es decir n+ 0 motivos complementarios. El método de conformidad con la presente invención se puede utilizar para purificar cualquier tipo de ADN de cadena doble. Un ejemplo del último es un ADN circular, tal como un plásmido, que generalmente porta uno o más genes de importancia terapéutica. Este plásmido también puede portar un origen de replicación, un gen marcador, y los similares. El método de la invención se puede aplicar directamente a un lisado celular. En esta modalidad, el plásmido, amplificado mediante transformación seguido por cultivo celular, se purifica directamente después de la lisis de las células. El método de la invención también se puede aplicar a un lisado claro, es decir al sobrenadante obtenido después de la neutralización y centrifugación del lisado celular. Esto también se puede aplicar de manera bastante obvia a una solución prepurificada mediante métodos conocidos. Este método también permite que el ADN lineal o circular porte una secuencia de importancia a ser purificada a partir una mezcla que comprende ADNs de diferentes secuencias. El método de conformidad con la invención también se puede utilizar para la purificación del ADN de cadena doble. El lisado celular puede ser un lisado de células procariontes o eucariontes. Con respecto a las células procariontes, las bacterias E. cgjj, B. subtilis, S. typhimurium o Strepomvces se pueden mencionar como ejemplos. Con respecto a las células eucariontes, se pueden mencionar las células animales, levaduras, hongos, y los similares, y más especialmente levaduras Kluvveromvces o Saccharomyces o células COS, CHO, C127, NIH3T3, y las similares. El método de la presente invención el cual incluye al menos un paso de cromatografía por afinidad triple se puede emplear para proveer mayor pureza al producto de ADNp resultante. En la cromatografía por afinidad triple, un oligonucleótido se une a un soporte, tal como una resina para cromatografía u otra matriz. Posteriormente la muestra a ser purificada se mezcla con el oligonucleótido unido, tal como mediante la aplicación de la muestra a una columna para cromatografía que contiene el oligonucleótido unido a una resina para cromatografía. El plásmido deseado en la muestra se unirá al oligonucleótido, formando un triple. Los enlaces entre el oligonucleótido y el plásmido pueden ser enlaces de Hoogsteen. Este paso se puede presentar a un pH < 5, en una alta concentración de sal por un tiempo de contacto de 20 minutos o más. Se puede emplear un paso del lavado. Finalmente, la desprotonación de la citosina se presenta en un regulador de pH neutro, eluyendo el plásmido a partir de la resina unida al oligonucleótido. De conformidad con la modalidad más preferida, el proceso de separación y purificación de ácidos nucleicos y/o ADNs plasmídicos comprende los pasos de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad de triple hélice, y la cromatografía por interacción hidrófoba en combinación.

La cromatografía por interacción hidrófoba utiliza porciones hidrófobas en un sustrato para atraer a las regiones hidrófobas en moléculas en la muestra para purificación. Se debe mencionar que estos soportes de HIC trabajan mediante un efecto de "agrupamiento"; los enlaces no covalentes o iónicos se forman o se comparten cuando estas moléculas se asocian. La cromatografía por interacción hidrófoba es benéfica puesto que remueve de manera muy eficiente las formas de plásmidos circulares abiertos y otros contaminantes, tales como ADNg, ARN, y endotoxina. La síntesis de los materiales base para la cromatografía por interacción hidrófoba, así como los procesos para preparación, polimerización y funcionalización de la cromatografía por interacción hidrófoba y elución y separación del ADN plasmídico a través de éstas se conocen bien en la técnica, y se describen entre otras en la Patente de E.U.A. No: 6,441 ,160 la cual se incorpora en la presente invención como referencia. El compuesto a ser utilizado para la síntesis de materiales base que son utilizados para el material para empaquetamiento para la cromatografía por interacción hidrófoba puede ser cualquier compuesto, si diversos grupos funcionales que exhiben hidrofobícidad o diversos grupos de intercambio iónico se pueden introducir mediante una post-reacción después de que se sintetizan los materiales base. Los ejemplos de monómeros monofuncionales incluyen estireno, o-halometilestireno, m-halometilestireno, p-halornetilestireno, o-haloalquilestireno, m-haloalquilestireno, p-haloalquilestireno, a-metilestireno, a-metil-o-halometilestireno, a-metil-m- halometilestireno, a-metil-p-halometilestireno, a-metil-o-haloalquilestireno, a-metil-m-haloalquilestireno, a-metil-p-haloalquilestireno, o-hidroximetilestireno, m-hidroximetilestireno, p-hidroximetilestireno, o-hidroxialquilestireno, m-hidroxialquilestireno, p-hidroxilalquilestireno, a-metil-o-hidroximetilestireno, a-metil-m-hidroximetilestireno, a-metfl-p-hidroximetilestireno, a-metil-o-hidroxialquilestireno, a-metil-m-hidroxialquilestireno, a-metil-p-hidroxialquilestireno, glicidil metacrilato, glicidil acrilato, hidroxietil acrilato, hidroximetacrilato, y vinil acetato. Los compuestos más preferidos son grupos haloalquilo sustituidos en anillos aromáticos, halógenos tales como Cl, Br, I y F e hidrocarburos saturados de cadena recta y/o de cadena ramificada con de 2 a 15 átomos de carbono. Los ejemplos de monómeros polifuncionales incluyen divinilbenceno, trivinilbenceno, diviniltolueno, triviniltolueno, divinilnaftaleno, trivinilnaftaleno, etilenglicol dimetacrilato, etilenglicol diacrilato, dietilenglicol dimetacrilato, dietilenglicol diacrilato, metilenebismetacrilamida, y metilenbisacrilamida. Se pueden introducir diversos grupos funcionales hidrófobos o diversos grupos de intercambio iónico mediante la post-reacción. Con el objeto de minimizar la influencia sobre los productos propuestos deseados para separarse debido a que la hidrofobicidad exhibida por el material base, o la hinchazón o encogimiento del material base debido al cambio en la concentración de la sal y el cambio en el valor del pH, preferiblemente el material base se prepara utilizando monómeros relativamente hidrófilos, tales como glicidil metacrilato, glicidil acrilato, hidroxietil acrilato, hidroximetacrilato, y vinil acetato. La preparación del material base incluye un primer paso en donde el monómero monofuncional y el monómero polifuncional se pesa a una relación apropiada y se añaden precisamente diluyente o solvente pesados los cuales se utilizan para el propósito de ajustar los poros en las partículas formadas y similarmente el iniciador de polimerización se pesa de manera precisa, seguido por agitación. La mezcla se somete posteriormente a una polimerización de suspensión tipo aceite-en-agua en donde la mezcla se añade dentro de un estabilizante de la dispersión disuelto en una solución acuosa pesada precisamente de ante mano, y gotitas de aceite con el tamaño propuesto y se forman mediante mezclado por agitación, y la polimerización se lleva a cabo mediante calentamiento gradual de la solución mezclada. La relación de monómero monofuncional a monómero polifuncional generalmente es de alrededor de 1 mol de monómero monofuncional, y de alrededor de 0.01 a 0.2 moles de monómero polifuncional de manera que se obtienen partículas suaves del material base. La relación del monómero polifuncional se puede incrementar a alrededor de 0.2 a 0.5 moles de manera que se obtienen partículas duras de los materiales base. El monómero polifuncional solo se puede utilizar para obtener partículas incluso más duras. Un iniciador de polimerización tampoco se restringe particularmente, y se utiliza comúnmente el tipo azobis y/o tipo de peróxido.

Los estabilizantes de suspensión tales como agentes tensioactivos iónicos, agentes tensioactivos no iónicos y polímeros con propiedad amfipática o mezclas de los mismos también se pueden utilizar para prevenir la agregación entre las.gotitas de aceite. El diámetro de las partículas formadas generalmente es de alrededor de 2 a 500 µ??. El diámetro preferido de las partículas está comprendido entre 2 a 30 µ??, y más preferiblemente alrededor de 2 a 10 µ?t?. Cuando se propone una purificación a gran escala de los ácidos nucleicos con alta pureza, ésta se encuentra alrededor de 10 a 100 µ?t? y, cuando se separa el producto aiming a partir de la solución de almacenamiento sin purificar, ésta puede ser de 100 a 500 µ?t?, más preferiblemente de alrededor de 200 a 400 µ?t?. Para el ajuste del diámetro de la partícula, la velocidad rotacional de la agitación se puede ajustar durante la polimerización. Cuando se necesitan partículas con diámetro pequeño, se puede incrementar el número de revoluciones y, cuando se desean partículas grandes, se puede disminuir el número de revoluciones. En la presente invención, puesto que el diluyente a ser utilizado se utiliza para el ajuste de poros en las partículas formadas, la selección del diluyente es particularmente importante. Como un concepto fundamental, para el solvente a ser utilizado para polimerización, el ajuste se realiza mediante la combinación diversa de un solvente que es un solvente pobre para el monómero con un solvente que es un buen solvente para el monómero. El tamaño del diámetro de poro se puede seleccionar de manera apropiada dependiendo del tamaño molecular de los ácidos nucleicos diseñados para separarse, pero preferiblemente se encuentra dentro de un intervalo de 500 a 4000 angstroms para el material para empaquetamiento para la cromatografía por interacción hidrófoba y dentro de un intervalo de 1500 a 4000 angstroms para el material para empaquetamiento para la cromatografía de intercambio iónico. En la cromatografía por interacción hidrófoba, para la separación de ácidos nucleicos con diferentes hidrofobicidades preferibles mediante la utilización de materiales para empaquetamiento con diferentes hidrofobicidades, respectivamente, es importante la modificación de superficie del material base. Los grupos hidrófobos se pueden seleccionar entre los grupos del hidrocarburo de cadena larga o ramificada, incluyendo grupos hidrocarburo saturados o grupos hidrocarburos no saturados con de 2 a 20 átomos de carbono. El anillo aromático también puede estar contenido en el grupo hidrocarburo. Los grupos hidrocarburo también se pueden seleccionar entre los compuestos que tienen la siguiente fórmula: Materiales base en donde n = 0 a alrededor de 20 y el grupo metileno puede ser de cadena recta o ramificada, m = 0 a aproximadamente 3 y grupo hidrocarburo puede ser de cadena recta o ramificada, y A es un grupo C = O o un grupo éter, pero el grupo metileno se puede unir directamente al material base sin A. Los grupos hidrófobos pueden incluir adicionalmente un grupo éter de alquilen glicol con de 2 a 20 átomos de carbono, el cual consiste de unidades repetidas de 0 a 10, en donde el extremo opuesto del grupo funcional que reacciona con el material base puede ser un grupo OH residual tal como se encuentra o puede estar cubierto con un grupo alquilo con de 1 a 4 átomos de carbono. Los grupos hidrófobos anteriormente descritos se pueden utilizar solamente o en mezcla para modificar la superficie. Los grupos de cadena de alquilo con de 6 a 20 átomos de carbono se prefieren para baja hidrofobicidad semejante a los plásmidos. La cadena larga de los grupos alquilo que tiene de 2 a 15 átomos de carbono para la separación de compuestos con alta hidrofobicidad tal como ARN que se origina a partir de Escherichia coli y ARN en las células de humanos y de animales. Los grupos alquilo de 4 a 18 átomos de carbono para la separación de compuestos con hidrofobicidad relativamente baja tales como ADNs que se originan a partir de Escherichia coli y ADNs en las células de humanos y de animales. Después de la separación de estos compuestos, los compuestos se pueden seleccionar adecuadamente para modificar la superficie sin ser confinados a dicha ejemplificación. En efecto, el grado de hidrofobicidad del material para empaquetamiento varía dependiendo de la concentración de sal en el medio o la concentración de sal en el eluyente para la absorción. Además el grado de hidrofobicidad del material para empaquetamiento depende de la cantidad del grupo introducido dentro del material base. El diámetro de poro del material base para la cromatografía por interacción hidrófoba es particularmente preferible para que sea de 500 a 4000 angstroms, pero se puede seleccionar apropiadamente a partir de dicho intervalo dependiendo del tamaño molecular de los ácidos nucleicos que se desea separar. En general, puesto que la retención de ácidos nucleicos en el material para empaquetamiento y la capacidad de adsorción (muestra principal) difiere dependiendo del diámetro de poro, es preferible utilizar un material base con un gran diámetro de poro para los ácidos nucleicos con un tamaño molecular grande y un material base con un diámetro de poro pequeño para los ácidos nucleicos con un tamaño molecular pequeño. Por ejemplo el material base de estireno se puede hacer reaccionar con un grupo hidrófobo que comprende grupos alquilo de cadena larga, utilizando compuestos que contienen halógeno y/o haluro de carbonilo y un catalizador tales como FeCI3, SnCI2 o AICI3, y utilizando la reacción de Friedel-Craft, es posible añadir directamente a un anillo aromático en un material base como un compuesto deshalogenado y/o un compuesto acilatado. En el caso de material base que es una partícula que contiene un grupo halógeno, por ejemplo, utilizando compuestos con OH contenido en el grupo funcional a ser añadido, como el butano!, y utilizando la reacción de Williamson con un catalizador alcalino tal como NaOH o KOH, es posible introducir el grupo funcional a través del enlace éter. En el caso del grupo funcional descrito para ser añadido al compuesto que contiene un grupo amino, tal como hexilamina, es posible añadir utilizando un catalizador alcalino tal como NaOH o KOH y utilizando una reacción ácida deshalogénica. En el caso del material base que contiene un grupo OH, de manera inversa, si la introducción del grupo epoxi, grupo halógeno o grupo haluro de carbonil de antemano hacia el grupo funcional que se desea añadir, es posible introducir el grupo funcional a través del enlace éter o éster. En el caso del material base que contiene un grupo epoxi, si se hace reaccionar con el compuesto con la adición del grupo OH o con el grupo amino contenido en el grupo funcional deseado, es posible introducir el grupo funcional a través del enlace éter o amino. Además, en el caso de que se añada el grupo funcional deseado que contiene el grupo halógeno, es posible añadir el grupo funcional a través del enlace éter utilizando catalizador ácido. Puesto que la proporción del grupo funcional a ser introducida dentro del material base se influye por la hidrofobicidad del producto sujeto que se desea separar, ésta no se puede restringir, pero, en general, es adecuado el material para empaquetamiento con aproximadamente 0.05 a 4.0 milimoles del grupo funcional que se añade por 1 g de material base seco. Con respecto a la modificación de superficie, un método para la adición del grupo funcional a través de la post-reacción después de la formación del material base o partículas es como se describió. La modificación de superficie se lleva a cabo de conformidad con el mismo método, en donde el material base se forma después de la polimerización utilizando monómeros con dichos grupos funcionales añadidos antes de la polimerización. El material base también puede ser gel de sílice poroso. Un método para la elaboración de gel de sílice, que comprende silano acoplado utilizando un compuesto tal como alquiltrimetoxisilano directamente sobre las partículas elaboradas de conformidad con el método descrito en "Latest High-Speed Liquid Chromatography", página 289 ff. (escrito por Toshio Nambara y Nobuo Ikegawa, publicado por Tokyo Hirokawa Bookstore en 1988). Antes o después del acoplamiento del silano utilizando agente para acoplamiento de silano que contiene un grupo epoxi, se puede añadir un grupo funcional de conformidad con el método anteriormente mencionado. Es adecuada la proporción del grupo funcional que se introduce alrededor de 0.05 a 4.0 milimoles del grupo funcional añadido por 1 g de material base seco. Los eluyentes se utilizan en la separación mediante cromatografía por interacción hidrófoba o paso de purificación. Generalmente, se utilizan dos tipos de eluyentes. Un eluyente contiene una alta concentración de sal, mientras que un segundo eluyente contiene una baja concentración de sal. El método de elución comprende un cambio paso a paso a partir de un eluyente que tiene una alta concentración de sal hacia un eluyente que tiene una baja concentración de sal y se puede utilizar el método con gradiente de elución que cambia continuamente la composición a partir de un eluyente hacia otro. Para los reguladores de pH y sales generalmente utilizados para la interacción hidrófoba se puede utilizar la cromatografía. Para el eluyente que contiene una elevada concentración de sal, es particularmente preferible la solución acuosa con una concentración de sal de 1.0 a 4.5 M y un valor de pH de 6 a 8. Para el eluyente que contiene una baja concentración de sal, es particularmente preferible la solución acuosa con una concentración de sal de 0.01 a 0.5 M y valor de pH de 6 a 8. Generalmente, el sulfato de amonio y el sulfato de sodio se pueden utilizar como sales. La cromatografía por interacción hidrófoba del paso de purificación de ADN plasmídico se puede llevar a cabo mediante la combinación de un material para empaquetamiento que tiene introducido un grupo funcional con una hidrofobicidad débil con material para empaquetamiento introducido en el grupo funcional con fuerte hidrofobicidad en la secuencia. En efecto, la Escherichia coli cultivada en medio contiene una gran cantidad de diversos compuestos diferentes en hidrofobicidad tales como polisacáridos, ADN de genoma de Escherichia coli, plásmidos de ARNs y proteínas. También se sabe que existen diferencias en la hidrofobicidad incluso entre los ácidos nucleicos mismos. Las proteínas que se vuelven impurezas tienen una mayor hidrofobicidad en comparación con los plásmidos. Muchas resinas para cromatografía por interacción hidrófoba están comercialmente disponibles, tales como Fractogel propyl, Toyopearl, Source isopropyl, o cualesquiera otras resinas que tienen grupos hidrófobos. Las resinas más preferidas son medio polimérico en masa Toyopearl. Toyopearl es un polímero de metacrílico que incorpora una alta estabilidad mecánica y química. Las resinas están disponibles como series "HW" de resinas no funcionalizadas y se pueden derivar con químicas de superficie para interacciones por cromatografía de intercambio iónico o interacciones hidrófobas. Se pueden utilizar cuatro tipos de resinas ToyopearI HIC con características diferentes en cuanto a química de superficie y niveles de hidrofobicidad. La hidrofobicidad de las resinas ToyopearI HIC se incrementa a través de las series: Eter, Fenilo, Butilo, y Hexilo. Las estructuras de las resinas preferidas ToyopearI HIC, por ejemplo, Toyopeari HW-65 que tienen un diámetro de poro de 1000 angstroms se muestran a continuación: ToyopearI Ether-650 ToyopearI Phenil-650 ToyopearI Butyl-650 -CH2-CH3 ToyopearI Hexyl-650 Las resinas ToyopearI anteriormente mencionadas pueden tener diversos grados de tamaño de partículas. ToyopearI 650C tiene un tamaño de partícula de alrededor de 50 a 150 µ??, preferiblemente de alrededor de 100 µ?t?, mientras que ToyopearI 650M tiene un tamaño de partícula de alrededor de 40 a 90 µ??, preferiblemente de alrededor de 65 µ?? y ToyopearI 650S tiene un tamaño de partícula de alrededor de 20 a 50 µ ?, preferiblemente de alrededor de 35 µG?. Se sabe bien que el tamaño de partícula influye sobre la resolución, por ejemplo, mejorar la resolución de grado de tamaño de partícula de C a M a S, y por lo tanto se incrementa con tamaños de partícula más pequeños. La resina Toyopearl más preferida utilizada en el paso de cromatografía HIC en el proceso de separación y purificación del ADN plasmídico de conformidad con la presente invención es Toyopearl butyl-650S la cual se comercializa por Tosoh Bioscience. De conformidad con una modalidad preferida, se lleva a cabo un paso de diafiltración adicional. Los materiales estándares para diafiltración, comercialmente disponibles son adecuados para uso en este proceso, de conformidad con técnicas estándares conocidas en la técnica. Un método de diafiltración preferido es la diafiltración utilizando una membrana de ultrafiltración que tiene un límite de peso molecular en el intervalo de 30,000 a 500,000, dependiendo del tamaño del plásmido. Este paso de diafiltración permite un intercambio de regulador de pH y se lleva a cabo la concentración. El eluído del paso 12 se concentró 3 a 4 veces mediante filtración por flujo tangencial (límite de membrana, 30 kDa) a una concentración blanco de aproximadamente 2.5 a 3.0 mg/mL y el concentrado se intercambia de regulador de pH mediante diafiltración a un volumen constante con 10 volúmenes de solución salina y se ajustó a la concentración del plásmido blanco con solución salina. La concentración del ADN plasmídico se calculó a partir de la absorbancia a 260 nm de las muestras del concentrado. La solución de ADN plasmídico se filtró a través de un filtro de cápsula de 0.2 µp? y se dividió en varias alícuotas, las cuales se almacenaron en recipientes en un cuarto frío a 2-8°C hasta procesamiento adicional. Esto produce un concentrado purificado con una concentración de ADN plasmídico de plásmido superenrollado que es de alrededor de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, y preferiblemente 99%. La recuperación general del plásmido con este proceso es de al menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, y 80%, con una recuperación por medio de 60%. De conformidad con esta modalidad, el paso de diafiltración se lleva a cabo de conformidad con las siguientes condiciones: se utilizan los reguladores de pH para el paso a) y para el paso b): i) una primera diafiltración (paso a) en contra de 12.5 a 13.0 volúmenes de 50 mM de Tris/HCI, 150 mM de NaCI, pH 7.4 (denominado el regulador de pH I), y ii) llevando a cabo una segunda diafiltración del retenido a partir del paso a) anteriormente mencionado (paso b) en contra de 3.0 a 3.5 volúmenes de excipiente de solución salina (150 mM de NaCI). Este paso de diafiltración preferido de conformidad con la presente invención remueve eficientemente de manera extensiva el sulfato de amonio y el EDTA de manera extensa. También, de manera subsecuente a estos pasos de diafiltración, se obtienen la concentración fisiológica apropiada de NaCI (alrededor de 150 mM) y la concentración final de Tris por debajo de 1 mM (entre 200 µ? y 1 mM).

La formulación de ADN plasmídico así obtenida mediante el uso de este paso de diafiltración comprende NaCI como un excipiente en solución salina y una concentración apropiada de regulador de pH de Tris de manera que mantiene o controla el valor de pH entre 7 y 7.5. Las formulaciones de ADN plasmídico de conformidad con la presente solicitud son particularmente útiles como el ADN plasmídico se pueden almacenar de manera sorprendente en una forma no degradable estable en estas condiciones por un período prolongado de tiempo a 5°C y hasta 25°C, que es a temperatura ambiente. Como se describe, de conformidad con el método de la invención para la separación del ADN plasmídico con alta pureza éste se puede obtener en una gran cantidad mediante la manipulación más simple sobre el método convencional. Se puede utilizar el proceso de purificación de plásmidos subsecuentemente al método de Tisis continua como se describió anteriormente, o cualesquiera métodos alternativos de lisis los cuales se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar la lisis con calor a través de flujo de células microbianas que contienen plásmido. Este método se describe entre otros en la Publicación Internacional WO 96/02658. El intercambiador de calor particular consiste de un tubo de acero inoxidable de 10 ft. (2.8 m) x 0.25 pulgadas (0.6 cm) O. D. con forma de espiral. El espiral se sumerge completamente dentro de un baño de agua con una temperatura elevada constante. El volumen contenido por el espiral es de aproximadamente 50 mL. Se utilizaron los Termoacopladores y un termómetro para medir las temperaturas de entrada y de salida, y la temperatura del baño con agua, respectivamente. La corriente producto se bombea dentro del espiral de calentamiento utilizando una bomba peristáltica Masterflex con un tubo de silicón. El lisado celular que sale del espiral se centrifuga posteriormente en una centrífuga Beckman J-21 para lote para precipitación. Después de la centrifugación, el ADN plasmídico se puede purificar utilizando el método de purification de conformidad con la presente invención. La lisis celular alternativa puede hacer uso de los mezcladores estáticos en serie. En efecto, como se describió en el documento WO 97/23601 (incorporado en la presente invención como referencia), un primer mezclador estático para lisis de las células a través de un primer mezclador estático y para la precipitación del lisado celular a través de un segundo mezclador estático se puede utilizar como un método alternativo para lisis de las célula antes del método de purificación del ADN plasmídico de conformidad con la presente invención. Los grandes volúmenes de células se pueden Iisar suavemente y continuamente en línea utilizando el mezclador estático y que otros mezcladores estáticos se colocan en línea para lograr otras funciones tales como la dilución y la precipitación. Los mezcladores estáticos adecuados útiles en el método de la presente invención incluyen cualquier flujo a través del dispositivo referido en la técnica como un mezclador estático o sin movimiento de una longitud adecuada que permite el procesamiento de la presente invención. Por ejemplo, para el propósito de la lisis celular, el mezclador estático podría necesitar tener una longitud la cual podría proveer suficiente tiempo de contacto entre la solución de lisado y las células para ocasionar la lisis 5 de las células sujetos durante el paso a través de mezclador. En una modalidad preferida, los mezcladores 5 estáticos adecuados contienen una estructura helicoidal interna la cual ocasiona que dos líquidos se pongan en contacto entre sí en un flujo rotacional opuesto que ocasiona que los líquidos se mezclen juntos en un flujo turbulento. El método de separación y purificación del ADN plasmídico de conformidad con la presente invención se puede utilizar para separar y purificar cualesquiera tipos de vectores con cualesquiera tamaños. El intervalo de tamaño del ADN plasmídico que se puede separar mediante el método de conformidad con la presente invención es de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 50 kb, preferiblemente de 15 kb a 50 kb, dicho ADN incluye una estructura base del vector de aproximadamente 3 kb, un gen terapéutico y secuencias reguladoras asociadas. Por lo tanto, una estructura base del vector útil en la invención será capaz de portar insertos de aproximadamente 10-50 kb o más grandes. El inserto puede incluir ADN a partir de cualquier organismo, pero preferiblemente será de origen de mamífero, y puede incluir, además de un gen que codifica una proteína terapéutica, secuencias reguladoras tales como promotores, secuencias de poliadenilación, potenciandores, regiones control en el locus, etc. El gen que codifica una proteína terapéutica puede ser de origen genómico, y por lo tanto contiene exones e intrones como se refleja en su organización genómica, o se puede derivar a partir de ADN complementario. Dichos vectores pueden incluir por ejemplo una estructura base del vector que se puede replicar con una replicación de elevado número de copias, que tiene un poliadaptador para la inserción de un gen terapéutico, un gen que codifica un marcador de selección, por ejemplo, SupPhe tRNA, el gen de resistencia a tetraciclina canamicina, y es físicamente pequeño y estable. La estructura base del vector plasmídico permite de manera ventajosa insertar los fragmentos de ADN de mamífero, otros ADN eucariontes, procariontes o virales, y el plásmido resultante se puede purificar y utilizar en terapia basada en plásmido in vivo o ex vivo. Los vectores que tienen un número de copias relativamente alto, por ejemplo, en el intervalo de 20-40 copias/célula hasta 1000-2000 copias/célula, se pueden separar y purificar mediante el método de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, un vector que incluye el origen pUC de replicación se prefiere de conformidad con el método de la invención. El origen pUC de replicación permite una replicación más eficiente del ADN plasmídico y resulta en un incremento de diez veces en el número de copias del plásmido/célula sobre, por ejemplo, un origen pBR322. Preferiblemente, el ADN plasmídico con origen de replicación condicional o pCOR como se describe en el documento US2003/1618445, se puede separar mediante el proceso de conformidad con la presente invención. El elevado número de copias resultante incrementa en gran medida la relación de ADN plasmídico con respecto al ADN cromosomal, ARN, proteínas celulares y co-factores, mejora la producción del plásmido, y facilita la purificación hacia el extremo 3' más fácil. Por consiguiente, cualquier vector (ADN plasmídico) se puede utilizar de conformidad con la invención. Los vectores representativos incluyen pero no se limitan al plásmido NV1 FGF. NV1 FGF es un piásmido que codifica un factor de crecimiento fibroblástico ácido o factor de crecimiento fibroblástico tipo 1 (FGF-1), útil para el tratamiento de pacientes con enfermedad oclusiva arterial periférica en etapa terminal (PAOD) o con enfermedad arterial periférica (PAD), alcanza los requirimientos de manera segura. Camerota et al. (J Vasc. Surg., 2002, 35, 5: 930-936) describen que 51 pacientes con PAD que no se puede reconstruir de etapa terminal, con dolor durante el reposo o necrosis de tejido, se han inyectado de manera intramuscular con dosis particulares o repetidas en incremento del NV1 FGF dentro del muslo y pantorrilla isquémicos. Los diversos parámetros tales como la presión transcutánea del oxígeno, índices braquiales de tobillo y dedo del pie, evaluación del dolor, y cicatrización de úlcera han sido evaluados subsecuentemente. Se observó un incremento significativo en los índices brachial, reducción del dolor, resolución del tamaño de la úlcera, y una perfusión mejorada que altera la administración de NV1 FGF. Las células hospederas útiles de conformidad con la invención pueden ser de cualquier cepa bacteriana, por ejemplo tanto cepas Gram positivas como cepas Gram negativas, tales como E. coli y Salmonella Typhimurium o Bacillus que es capaz de mantener un elevado número de copias de los plásmidos anteriormente descritos; por ejemplo 20-200 copias. Las cepas hospederas de E. coli se pueden utilizar de conformidad con la invención e incluyen HB101 , DH1 , y DH5aF, XAC-1 y XAC-1pir 116, TEX2, y TEX2pir42 (WO 04/033664). Las cepas que contienen el plásmido F o los derivados del plásmido F (por ejemplo J 109) generalmente no se prefieren debido a que el plásmido F se puede co-purificar con el producto plasmídico terapéutico. De conformidad con otro aspecto, la presente invención también comprende una composición de ADN plasmídico altamente purificado que está esencialmente libre de contaminantes o en el intervalo de contaminantes en sub-ppm y por lo tanto es ADN grado farmacéutico. La composición de ADN plasmídico grado farmacéutico de conformidad con la presente invención contiene así sub-ppm (< 0.0001%, por ejemplo < 0.0001 mg por 100 mg de ADN plasmídico) ADNg, ARN, y contaminantes de la proteína La composición de ADN plasmídico grado farmacéutico contiene así menos de aproximadamente 0.01 %, o menos de 0.001 %, y preferiblemente menos de 0.0001 %, o preferiblemente menos de 0.00008% (< 0.0008%, por ejemplo < 0.0008 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de ADN cromosomal o ADN genómico. La composición de ADN plasmídico grado farmacéutico contiene así menos de aproximadamente 0.01%, o menos de 0.001 %, y preferiblemente menos de 0.0001%, o preferiblemente menos de 0.00002% (< 0.0002%, por ejemplo < 0.0002 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de los contaminantes de ARN.

La composición de ADN plasmídico grado farmacéutico contiene así menos de aproximadamente 0.0001 %, y más preferiblemente menos de 0.00005% de contaminantes de proteína. La composición de ADN plasmídico grado farmacéutico contiene así menos de 0.1 EU/mg de endotoxinas. La composición de ADN plasmídico grado farmacéutico contiene así de manera predominante la forma circular, y más precisamente contiene más de 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de ADN plasmídico en forma circular cerrada. La presente invención también se refiere a ADN plasmídico en formulación líquida que es estable y permanece sin degradación a temperatura ambiente por un largo período de tiempo, y por lo tanto es útil para el almacenamiento del ADN plasmídico que se utiliza en investigación y se relaciona con la terapia en humano. Por lo tanto la presente invención se refiere a una formulación estable de ADN plasmídico que comprende ADN plasmídico, una solución de regulador de pH muy diluida, y un excipiente de solución salina, en donde la solución de regulador de pH está presente en una concentración de manera que se mantiene el pH de dicha formulación o composición entre 7 y 7.5. Las soluciones de regulador de pH que son capaces de mantener el pH de la composición entre 7 y 7.5 consisten ya sea de un sistema ácido/base que comprende Tris [tris (hidroximetil)-aminometano], o lisina y ácido elegido a partir de un ácido fuerte (ácido clorhídrico por ejemplo) o un ácido débil (ácido maléico, ácido málico o acido acético por ejemplo), o de un sistema de ácido/base que comprende Hepes [ácido 2-(4-(2- hidroxietilpiperazin)-1-il)etansulfónico] y una base fuerte (hidróxido de sodio por ejemplo). La solución de regulador de pH también puede comprender Tris/HCI, lisina/HCI, Tris/ácido maléico, Tris/ácido málico, Tris/ácido acético, o Hepes/hidróxido de sodio. Preferiblemente, el pH se mantiene entre 7 y 7.5 e incluso más particularmente alrededor de 7.2. El excipiente de solución salina que se puede utilizar en la formulación de la presente invención preferiblemente es NaCI a una concentración entre 100 y 200 mM, y preferiblemente a una concentración de alrededor de 150 mM. Otro excipiente de solución salina puede comprender aniones y cationes seleccionados a partir del grupo que consiste de acetato, fosfato, carbonato, SO2 4, Cl", Br, NO3", Mg2+, Li+, Na+, K+, y NH4+. La concentración molar de la solución del regulador de pH se determina de manera que se ejerce el efecto de regulación de pH dentro de un límite y en un volumen en donde el valor de pH se estabiliza entre 7 y 7.5. La composición de almacenamiento de plásmido-ADN estable de conformidad con la presente invención comprende así ADN plasmídico, un excipiente de solución salina, y una solución de regulador de pH en donde la solución de regulador de pH está presente en una concentración de hasta 1 mM, y preferiblemente entre 250 µ? y 1 mM, o preferiblemente entre 400 µ? y 1 mM de manera que se mantiene el pH de dicha formulación o composición entre 7 y 7.5. Entre los sistemas de regulador de pH de conformidad con la invención, la solución de regulador de pH de Tris a una concentración de 400 µ? proporciona resultados particularmente satisfactorios y se prefiere así en la formulación de plásmido de la presente invención. Como se muestra en los ejemplos a continuación, la formulación de ADN plasmídico de conformidad con la presente invención exhibe una estabilidad excelente tanto a 4°C y una temperatura ambiente (RT), por ejemplo, 20 o 25°C. Particularmente, la formulación de ADN plasmídico es útil para un período de tiempo prolongado de 1 mes, 2 meses, 3 meses, a 6 meses y hasta 12 meses a 4°C y a 25°C, por ejemplo, RT. Por lo tanto la presente invención se refiere a una composición que comprende ADN plasmídico, una solución de regulador de pH y un excipiente de solución salina, en donde la solución de regulador de pH está presente en una concentración adecuada para preservar el ADN plasmídico en forma estable de 4°C a 25°C. La presente invención también se refiere a una composición que comprende ADN plasmídico, una solución de regulador de pH y un excipiente de solución salina, en donde la solución de regulador de pH está presente en una concentración adecuada para preservar el ADN plasmídico en forma estable de 4°C a 25°C por un período de tiempo prolongado, de 1 mes, 2 meses, 3 meses, a 6 meses y hasta 12 meses. En efecto, el ADN plasmídico que se almacena a 5°C o a temperatura ambiente durante un lado período de tiempo exhibe una depuración muy baja y relaciones de circularización-abierta, inferiores a 20%, 15%, 10%, 5%, o < 1 % por mes. La composición de conformidad con la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante, tal como por ejemplo un polímero seleccionado de entre polietilenglicol, un plurónico, o un azúcar polisorbato, o alcohol. De conformidad con otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la conservación de ADN plasmídico en una composición que comprende a) la preparación de una muestra purificada de ADN plasmídico y b) combinar dicha muestra purificada de ADN plasmídico con un excipiente de solución salina y una solución de regulador de pH que mantiene el pH de la composición resultante entre 7 y 7.5. La presente invención también se refiere a un método para la conservación de ADN plasmídico en una composición a una temperatura de hasta aproximadamente 20°C, que comprende a) la preparación de una muestra purificada de ADN plasmídico, b) combinar la muestra purificada de ADN plasmídico con un excipiente salino y una solución de regulador de pH en donde la solución de regulador de pH está presente en una concentración de menos de 1 mM, o entre 250 µ? y 1 mM, y preferiblemente 400 µ?; y c) almacenamiento de la composición de ADN plasmídico a una temperatura de aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 20°C.

EJEMPLOS Técnicas generales de clonación y de biología molecular Los métodos tradicionales de biología molecular, tales como digestión con enzimas de restricción, electroforesis en gel, transformación en E. coli, precipitación de ácidos nucleicos y los similares, se describen en la literatura (Maniatis et al., T., E. F. Fritsch, y J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman y K. Struhl. 1987. Current protocols ¡n molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York.). Las secuencias nucleotídicas se determinaron mediante el método determinación de cadena de conformidad con el protocolo ya publicado (Ausubel et al., 1987). Las enzimas de restricción se abastecieron por New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs). Para llevar a cabo las ligaciones, los fragmentos de ADN se incubaron en un regulador de pH que comprende 50 mM de Tris-HCI pH 7.4, 10 mM de MgCI2, 10 mM de DTT, 2 mM de ATP en la presencia de una ADN ligasa del fago T4 (Biolabs). Los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando la química de fosforamidita con las fosforamiditas protegidas en la posición ß mediante un grupo cianoetilo (Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus y H. Koster, 1984.

Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of p-cyanoetil-N,N-dialkylamino-/N-morpholino fosforamidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucí. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.) con un sintetizador de ADN automatizado Biosearch 8600, utilizando las recomendaciones del fabricante. Los ADNs ligados o ADNs a ser evaluados por su eficiencia de transformación se utilizan para transformar la siguiente cepa que se volvió competente: E. coli DH5a /endA1 , hsdR17, supE44, thj-1 , recA1 , gyrA96, reJAl, A(lacZYA-arqF)U169, deoR, O80dlac (lacZAM15)l (para cualquier plásmido Col E1 ); o E. coli XAC-pir (para cualquier plásmido derivado de pCor). Las minipreparaciones de ADN plasmídico se elaboran de conformidad con el protocolo de Klein et al., 1980. El medio de cultivo LB se utiliza para el crecimiento de cepas de E. coli (Maniatis et al., 982). Las cepas se incubaron a 37°C. Las bacterias se sembraron sobre discos de medio LB suplementados con antibióticos adecuados.

EJEMPLO 1 ¦ El ajuste de los diámetros de las velocidades de flujo se utilizó después del cálculo de los números Reynolds en espirales del sistema de lisis continua. Debido a que el siguiente análisis asume que la conducta de los fluidos es Newtoniana, las figuras reportadas a continuación son solamente completamente válidas en B1a y hasta cierto grado en B2. El valor de los números Reynolds permitió que un experto en la técnica especificara el tipo de conducta encontrada. En la presente invención, los inventores se dirigirán solamente al flujo de fluido en un tubo (ingeniería hidráulica). 1 ) fluido no Newtoniano Los dos tipos de fluidos no Newtonianos más comúnmente encontrados en la industria son Bingham y Ostwald de Waele. En este caso, el número Reynolds (Re) se calcula como sigue: ReN es el número Reynolds generalizado ReN= (1/ (2n"3)) x (n/3n+1 )n x ( (p x Dn x w2"n)/m) (1 ) D: diámetro interno de la sección transversal (m) p: masa volumétrica del fluido (kg/m3) w: velocidad espacial del fluido (m/s) n: índice de conducta del fluido (sin dimensión) m: coeficiente de consistencia del fluido (dyn.s cm2) y n y m se determinan empíricamente (estudio de la conducta reológica). 2) Fluido Newtoniano Como para la primera sección, en la ecuación (1) tenemos: Re = f (diámetro interno, µ, p, y u) puesto que n y m son funciones de µ. Re = (u x D x p) / µ (2) p: masa volumétrica del fluido (kg/m3) µ: viscosidad del fluido (Pa. s, y 1 mPa. s = 1 cP) D: diámetro interno de la sección transversal (m) u: media de la velocidad espacial del fluido (m/s) Ecuación (1 ), para n=1 , se reduce a la ecuación (2). Con Q = velocidad de flujo (m3/h) y S = área de superficie de la sección transversal (m2) y si se proporciona en cP, entonces: Re = (4 x (Q/3600) x ?)/((µ/1000) x ? x D) (3) En un conducto circular, el flujo es laminar para un número de Reynolds por debajo de 2500, y el flujo de turbulencia es hidráulicamente homogéneo para un número Reynolds entre 2000 y 500,000. El límite es deliberadamente vago entre 2000 y 2500, en donde se utilizan ambos tipos de conducta para determinar qué puede ocurrir posteriormente, y la elección se hace a posteriori. 3) Cálculos Puesto que n y m generalmente se desconocen, se han utilizado las siguientes aproximaciones para estimar las tendencias: Fluido Newtonianos (en todas las secciones transversales) p = 1000 kg/m3 (para todos los fluidos) µ = 5 cP en B1a y 40 cP en B1 b (los datos de los inventores) 2.5 cP en B2 (los datos de los inventores) Los siguientes cálculos se llevaron a cabo utilizando la ecuación (3) para dos configuraciones estándares de tubo evaluadas denominadas configuración 1 y configuración 2 (sin el tubo B1 b): CUADRO 2 En las dos configuraciones, los flujos son laminares en todas las etapas y las soluciones no se mezclaron adecuadamente juntas. Para las configuraciones de tubo (no tubo B1 b), los inventores CUADRO 3 Se llevaron a cabo cálculos similares utilizando la ecuación (3) para las diversas configuraciones de tubo tanto con los tubos B1a como con los tubos B b presentes: CUADRO 4 Claramente, los valores Reynolds predeterminados se pueden obtener mediante el ajuste de los diámetros del tubo y las velocidades de flujo.

Un experto en la técnica puede imaginar muchas combinaciones de diámetros y longitudes para B2 o para las dos secciones de B1 (B a y B1 b). Por ejemplo, la primera sección de B1 se puede reducir a partir de 6 mm a 3 mm con el objeto de reducir la longitud e incrementar la agitación. Adicionalmente, n y m se pueden determinar a partir del estudio de la conducta reológica de los fluidos y se puede utilizar para determinar las características correctas de los tubos. Además de la eficiencia de agitación, uno también puede considerar la duración de la agitación, la cual en algunas modalidades de la presente invención se obtiene mediante el ajuste de la longitud de los espirales. El diámetro de los tubos o la velocidad de fluido no parece dominar en la ecuación (1 ) para un fluido no Newtoniano (datos mostrados). En otras palabras, no parece ser más efectivo para alterar el diámetro en comparación con lo efectivo que es para alterar la velocidad de flujo si se utiliza la ecuación (1 ) en los cálculos con B1 b y en B2. En donde se desean altas velocidades de flujo, el diámetro puede variar junto con la velocidad de flujo. Estos principios se pueden utilizar como una base para la limitación de la agitación tanto como sea posible en B1 b y B2 con el objeto de evitar la fragmentación del ADNg. Durante la lisis, la agitación puede ser bastante vigorosa siempre y cuando no se desnaturalice el ADNg. Reduciendo el diámetro al inicio de B1 se hace posible incrementar la agitación (Re incrementada) con el objeto de mezclar adecuadamente la solución 2 con las células. Por otra parte, cuando las células están lisadas, la agitación y fuerzas de fricción en contra de la pared se pueden reducir para evitar la fragmentación del ácido nucleico. El incremento del diámetro hace posible reducir la agitación (Re disminuida) y la fricción (velocidad disminuida). M1 : mezclado de los fluidos. B1a: ajuste del mezclado al inicio de la lisis: fenómeno de convección (macromezclado). B1 b: tolerancia a la desnaturalización que se presenta además del fenómeno de difusión (micromezclado). Se asume que el número Reynolds generalizado tiene el mismo significado para un fluido no Newtoniano que el número Reynolds clásico para un fluido Newtoniano. En particular, se asume que el límite para el régimen laminar en un conducto de sección transversal circular es de ReN < 2300. La neutralización se llevó a cabo con B2. Las altas velocidades de flujo tienden a incrementar la fragmentación del ADN genómico mediante la producción de agitación que es demasiado vigorosa y mediante las fuerzas de fricción en la pared (tensión mecánica). El uso de un tubo con un diámetro más grande hace posible que se reduzca la agitación (Re) y las fuerzas de fricción (velocidad). Los inventores colocaron aquí un tubo de diámetro pequeño (6 mm) para evitar que no se presente la suficiente agitación. Las observaciones de los inventores mostraron que fue mejor tener solamente un tubo de diámetro pequeño para B2, con el objeto de agitar "violentamente y rápidamente" el lisado neutralizado.

EJEMPLO 2 Los inventores pudieron desglosar el sistema CL en 5 casos. En una modalidad particular, la configuración fue como sigue: 1) mezclado: células (en solución 1) + solución 2 (M1 + 3 m del tubo de 6 mm). Inicio de la lisis de las células mediante SDS, no existe riesgo de fragmentación del DNA siempre y cuando no se desnaturalice. 2) término de la lisis y desnaturalización del ADNg (13 m del tubo de 16 mm). 3) mezclado: lisado + solución 3 (M2 + 3 m del tubo de 6 mm). 4) cosecha del lisado neutralizado a 4°C 5) precipitación de las pequeñas masas floculentas y fragmentos más grandes de ADNg durante toda la noche a 4°C. Las siguientes condiciones se pueden utilizar para llevar a cabo la lisis continua: -Solución 1 : EDTA 10 mM, glucosa (Glc) 9 g/l y Tris HCI 25 mM, pH 7.2. -Solución 2: SDS 1 % y NaOH 0.2 N. -Solución 3: Acido acético 2 M y acetato de potasio 3M. - Velocidad de flujo 60 l/h: solución 1 y solución 2 -velocidad de flujo 90 l/h: solución 3. -Células ajustadas a 38.5 g/l con la solución 1. Las células en la solución 1 pasan a través de 3 boquillas que las dispersan hacia la solución 2, la cual llega a partir de una dirección opuesta. -Mezclador M1 tiene una geometría que hace posible optimizar el mezclado de los dos fluidos (véase la figura 2, dibujo esquemático del mezclador). -Primera sección del tubo después del mezclado por M1 es B1a y la siguiente sección es B1b. B1a: 3 m de largo, 6 mm de diámetro, 2.5 segundos de tiempo de residencia B1 b: 13 m de largo, 16 mm de diámetro, 77 segundos de tiempo de residencia El proceso de la presente invención provee una ventaja en términos de eficiencia, resumidos como: dispersión, breve mezclado violento, y mezclado suave mediante difusión. Utilizando el proceso de la presente invención, el número de células lisadas se incrementa y por lo tanto se incrementa la cantidad de ADNp recuperado. La idea de la difusión es especialmente importante debido a la dificultad de mezclar estos fluidos debido a sus propiedades, en particular la viscoelasticidad.

El proceso de la presente invención hace posible limitar el esfuerzo cortante y por lo tanto se limita la fragmentación del ADNg, facilitando su remoción durante la purificación cromatográfica subsecuente. El problema se mezcla posteriormente con la solución 3, la cual se puede enfriar a 4°C. En una modalidad, el proceso de la invención utiliza: - Mezclador M2, el cual es una Y de diámetro interno de aproximadamente 10 mm - La sección del tubo B2 se coloca después el mezclador M2. B2: 2 m del tubo de 6 mm; tiempo de residencia: 1 segundo El cuadro 5 a continuación proporciona los resultados obtenidos en las pruebas comparativas para mostrar las ventajas del proceso de lisis continua de los inventores en comparación con la lisis en lote.

CUADRO 5 EJEMPLO 3 La columna utilizada es una columna de 1 mi HiTrap activada con NHS (N-hidroxisuccinimida, Pharmacia) conectada a una bomba peristáltica (salida <1 ml/min). El oligonucleótido específico utilizado posee un grupo NH2 en el extremo 5', su secuencia es como sigue: 5'- GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1 ) Los reguladores de pH utilizados en este ejemplo son los siguientes: Regulador de pH para acoplamiento: 0.2 M de NaHCO3, 0.5 M de NaCI, pH 8.3. Regulador de pH A: 0.5 M de etanolamina, 0.5 M de NaCI, pH 8.3. Regulador de pH B: 0.1 M de acetato, 0.5 M de NaCI, pH 4. La columna se lava con 6 mi de 1 mM de HCI, y el oligonucleótido se diluye en el regulador de pH para acoplamiento (50 nanomoles en 1 mi) luego se aplica a la columna y se deja por 30 minutos a temperatura ambiente. La columna se lava tres veces en sucesión con 6 mi de regulador de pH A y luego 6 mi de regulador de pH B. El oligonucleótido se une así covalentementemente a la columna a través de un enlace CONH. La columna se almacena a 4°C en PBS, 0.1 % de NaN3, y se puede utilizar al menos cuatro veces. Se sintetizaron los siguientes dos oligonucleótidos: oligonucleótido 4817: 5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG AA GAAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 13) y oligonucleótido 4818 5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT CTTCG-3' (SEQ ID NO: 14) Estos oligonucleótidos, cuando se hibridan y clonan en un plásmido, introducen una secuencia homopurina-homopirimidina (GAA) 7 (SEQ ID NO: 15) dentro del plásmido correspondiente, como se describió anteriormente. La secuencia que corresponde a estos dos oligonucleótidos hibridados se clonó en el sitio de clonación múltiple del plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), el cual porta un gen de resistencia a ampicilina. Para este fin, los oligonucleótidos se hibridaron de la siguiente manera: un µg de estos dos oligonucleótidos se colocaron juntos en 40 mi de un regulador de pH final que comprende 50 mM de Tris-HCI pH 7.4, 10 mM de MgCl2- Esta mezcla se calentó a 95°C y luego se colocó a temperatura ambiente de manera que la temperatura pudo descender lentamente. Diez ng de la mezcla de oligonucleótidos hibridados se ligaron con 200 ng del plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) digerido con BamHI y EcoRI en 30 µ? finales. Después de la ligación, se transformó una alícuota dentro de DH5a. Las mezclas para transformación se sembraron sobre medio L suplementado con ampicilina (50 mg/l) y X-gal (20 mg/l). Las clonas recombinantes debían exhibir una ausencia de coloración azul en este medio, de manera contraria al plásmido parental (pBKS+) el cual permite la a-complementación del fragmento ? de E. coli ß-galactosidasa. Después de la minipreparación del ADN plasmídico a partir de 6 clonas, éstas mostraron la desaparición del sitio Pstl localizado entre los sitios EcoRI y BamHI de pBKS+, y un incremento en el peso molecular de la banda de 448-pb de Pvull que contenía el sitio de clonación múltiple. Se seleccionó una clona y el plásmido correspondiente se designó pXL2563. La secuencia clonada se verificó mediante secuenciación utilizando el iniciador -20 (5 -TGACCGGCAGCAAAATG-3' (SEQ ID NO: 16)) (Viera J. y J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268) para el plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA). El plásmido pXL2563 se purificó de conformidad con el equipo Wizard Megaprep (Promega Corp. adison, Wl) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Esta preparación de ADN plasmídico se utilizó posteriormente en los ejemplos descritos a continuación. El plásmido pXL2563 se purificó sobre la columna HiTrap acoplada al oligonucleótido, descrita en 1.1., a partir de una solución que también contenía el plásmido pBKS+. Los reguladores de pH utilizados en esta purificación también son los siguientes: Regulador de pH F: 2 M de NaCI, 0.2 M de acetato, pH 4.5 a 5. Regulador de pH E: 1 M de Tris-HCI, pH 9, 0.5 mM de EDTA. La columna se lava con 6 mi de regulador de pH F, y los plásmidos (20 µg de pXL2563 y 20 µg de pBKS+ en 400 µ? de regulador de pH F) se aplican a la columna y se incuban por 2 horas a temperatura ambiente. La columna se lava con 10 mi de regulador de pH F y la elución se lleva a cabo entonces con regulador de pH E. Los plásmidos se detectan después de la electroforesis sobre gel de agarosa al 1 % y tinción con bromuro de etidio. La proporción de los plásmidos en la solución se estima mediante la medición de su actividad transformadora sobre E. coli. Iniciando a partir de una mezcla que contiene 30% de pXL2563 y 70% de pBKS+, una solución que contiene 100% de pXL2563 se recuperó en la salida de la columna. La pureza, estimada por la relación de DO a 260 y 280 nm, se eleva a partir de 1.9 a 2.5, lo cual indica que las proteínas contaminantes se remueven mediante este método.

EJEMPLO 4 El acoplamiento del oligonucleótido (5 -GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1 )) a la columna se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 3. Para el acoplamiento, el oligonucleótido se modifica en el extremo 5' terminal con un grupo amina asociado al fosfato del espaciador mediante un brazo que contiene 6 átomos de carbono (Modified oligonucleotide Eurogentec SA, Bélgica). El plásmido pXL2563 se purificó utilizando el equipo Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, Wl) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Los reguladores de pH utilizados en este ejemplo son los siguientes: Regulador de pH F: 0-2 M de NaCI, 0.2 M de acetato, pH 4.5 a 5. Regulador de pH E: 1 M de Tris-HCI pH 9, 0.5 mM de EDTA.

La columna se lava con 6 mi de regulador de pH F, y 100 µg de plásmido pXL2563 diluido en 400 µ? de regulador de pH F luego se aplican a la columna y se incuban por 2 horas a temperatura ambiente. La columna se lava con 10 mi de regulador de pH F y la elución se lleva a cabo entonces con regulador de pH E. El plásmido se cuantifica mediante la medición de la densidad óptica a 260 nm. En este ejemplo, la unión se lleva a cabo en un regulador de pH cuya molaridad con respecto a NaCI varía de 0 a 2 M (regulador de pH F). La producción de la purificación disminuye cuando la molaridad de NaCI cae. El pH del regulador de pH para unión puede variar de 4.5 a 5, la producción de la purificación es mejor a 4.5. También es posible utilizar otro regulador de pH para elución de pH básico: posteriormente la elución se llevó a cabo con un regulador de pH que comprendía 50 mM de borato, pH 9, 0.5 mM de EDTA. El acoplamiento del oligonucleótido (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1) a la columna se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 3. El plásmido pXL2563 se purificó utilizando el equipo Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, Wl) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Los reguladores de pH utilizados en este ejemplo son los siguientes: Regulador de pH F: 0.1 M de NaCI, 0.2 M de acetato, pH 5. Regulador de pH E: 1 M de Tris-HCI pH 9, 0.5 mM de EDTA. La columna se lava con 6 mi de regulador de pH F, y 100 µg de plásmido pXL2563 diluido en 400 µ? de regulador de pH F se aplican entonces a la columna y se incuban por una hora a temperatura ambiente. La columna se lava con 10 mi de regulador de pH F y la elución se lleva a cabo entonces con regulador de pH E. Se mide el contenido del ADN de E. coli genómico o cromosomal presente en las muestras de plásmido antes y después del paso a través de la columna de oligonucleótido. Este ADN genómico se cuantifica mediante PCR utilizando los iniciadores en el gen de E. coli galK. De conformidad con el siguiente protocolo: la secuencia de estos iniciadores se describe por Debouck et al. (Nucleic Acids Res. 9 85, 13, 1841-1853): 5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEQ ID NO: 17) y 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (SEQ ID NO: 18). El medio de reacción comprende, en 25 µ? de regulador de pH de PCR (Promega France, Charbonniéres): 1.5 mM de MgCI2; 0.2 mM de dXTP (Pharmacia, Orsay); 0.5 µ? de iniciador; 20 U/ml de Taq polimerasa (promega). La reacción se llevó a cabo de conformidad con la secuencia: -5 minutos a 95°C - 30 ciclos de 10 segundos a 95°C 30 segundos a 60°C 1 minuto a 78°C - 10 minutos a 78°C El fragmento de ADN amplificado de 124 pares de bases en longitud se separó mediante electroforesis sobre un gel de azarosa al 3% en la presencia de SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, EUA), y luego se cuantificó mediante referencia a una serie de ADN genómico Ultrapur a partir de E. coli cepa B (Sigma, refD4889).

EJEMPLO 5 Este ejemplo describe la purificación de ADN plasmídico a partir de un lisado claro de un cultivo bateriano, a la escala denominada "miniprep": 1.5 mi de un cultivo durante toda la noche de las cepas DH5a que contienen el plásmido pXL2563 se centrifugó, y el concentrado se resuspendió en 100 µ? de glucosa 50 mM, Tris-Hcl 25 mM, pH 8, EDTA 10 mM. 200 µ? de NaOH 0.2 M, 1 % de SDS se añadieron, los tubos se invirtieron para mezclar. Después de centrifugación, el sobrenadante se recuperó y se cargó sobre la columna de oligonucleótido obtenida como se describió en el ejemplo 3. Aproximadamente 1 µg de plásmido se recuperó a partir de 1.5 mi del cultivo. El plásmido obtenido, se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa y se tiñó con bromuro de etidio, tomó la forma de una banda particular de ADN circular "superenrollado". No se observaron trazas de ADN de alto peso molecular (cromosomal) o de ARN en el plásmido purificado mediante este método.

EJEMPLO 6 Este ejemplo describe un experimento de purificación del ADN plasmídico que se lleva a cabo bajo las mismas condiciones que el ejemplo 5, iniciando a partir de 20 mi de cultivo bacteriano de cepas DH5a que contienen el plásmido pXL2563. El concentrado celular se toma en 1.5 mi de 50 mM glucosa, 25 mM Tris-HCI, pH 8, 10 mM EDTA. La lisis se lleva a cabo en 2 mi de 0.2 M NaOH, 1 % de SDS, y neutralización con 1.5 mi de 3 M de acetato de potasio, pH 5. Posteriormente el ADN se precipita con 3 mi de 2-propanol, y el concentrado se toma en 0.5 mi de 0.2 M de acetato de sodio, pH 5, 0.1 M NaCI y se carga sobre la columna de oligonucleótido obtenida como se describió en el ejemplo anteriormente mencionado. La unión, lavado de la columna y elución se llevan a cabo como se describió en el ejemplo anteriormente mencionado, excepto para el regulador de pH para lavado, la molaridad del cual con respecto a NaCI es de 0.1 M. El plásmido que se obtiene, se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa y se tiñó con bromuro de etidio, toma la forma de una banda particular de ADN circular "superenrollado". No se encontraron trazas de ADN de alto peso molecular (cromosomal) o de ARN en el plásmido purificado. La digestión del plásmido con una enzima de restricción produce una banda particular en el peso molecular esperado de 3 kilobases. El plásmido utilizado contiene un cassette que contiene el promotor de citomegalovirus, el gen que codifica para luciferasa y la secuencia de homopurina-homopirimidina (GAA) 7 (SEQ ID NO: 15) que se origina a partir del plásmido pXL2563. La cepa DH1 (Maniatis et al., 1989) que contiene este plásmido se cultivó en un termentador de 7 litros. Se preparó un lisado claro a partir de 200 gramos de las células: el concentrado de células se tomó en 2 litros de 25 mM Tris, pH 6.8, 50 m glucosa, 10 mM EDTA, a los cuales se les añadieron 2 litros de 0.2 M NaOH, 1 % de SDS. El lisado se neutralizó mediante la adición de un litro de acetato de potasio 3M. Después de la diafiltración, 4 mi de este lisado se aplicaron a una columna de 5 mi de HiTrap-NHS acoplada al oligonucleótido de secuencia S^GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-S' (SEQ ID NO: 1), de conformidad con el método descrito en el ejemplo 3. El lavado y la elución se llevaron a cabo como se describió en el ejemplo anteriormente mencionado.

EJEMPLO 7 Este ejemplo describe el uso de un oligonucleótido que contiene citosinas metiladas. La secuencia del oligonucleótido utilizado es como sigue: 5'-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCCTMeCTTMeCTT-3' (SEQ ID NO: 19) Este oligonucleótido posee un grupo NH2 en el extremo 5'. MeC = 5-metilcitosina. Este oligonucleótido permite que el plásmido pXL2563 se purifique bajo las condiciones del ejemplo 1 con una unión al regulador de pH de pH 5 (por lo tanto disminuye el riesgo de degradación del plásmido).

EJEMPLO 8 En los ejemplos anteriormente mencionados, el oligonucleótido utilizado se modifica en el extremo 5'-terminal con un grupo amina asociado al fosfato a través de un brazo que contiene 6 átomos de carbono: NH2-(CH2)6. En este ejemplo, el grupo amina se asocia al fosfato del extremo 5'-terminal a través de un brazo que contiene 12 átomos de carbono: NH2-(CH2)i2- El acoplamiento del oligonucleótido y el paso a través de la columna se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 3 con un regulador de pH F: 2 M NaCI, 0.2 M acetato, pH 4.5. Este oligonucleótido hace posible tener mejores rendimientos de purificación: se obtiene un rendimiento de 53%, mientras que, con el oligonucleótido que contiene 6 átomos de carbono, este rendimiento se encuentra en el orden de 45 % bajo las mismas condiciones.

EJEMPLO 9 Siguiendo la estrategia de clonación descrita en el ejemplo 3, se construyeron otros dos plásmidos que portan secuencias de homopurina-homopírimidina: el plásmido pXL2725 el cual contiene la secuencia (GGA)^, (SEQ ID NO: 20) y el plásmido pXL2726 el cual contiene la secuencia (GA)25 (SEQ ID NO: 21 ).

Los plásmidos pXL2725 y pXL2726, análogos del plásmido pXL2563, se construyeron de conformidad con la estrategia de clonación descrita en el ejemplo 3, utilizando los siguientes pares de oligonucleótidos: 5986: 5'-GATCC(GA)25GGG-3' (SEQ ID NO: 22) 5987: S - TTCCCÍTCksG-S' (SEQ ID NO: 23) 5981 : 5'-GATCC(GGA)17GG-3' (SEQ ID NO: 24) 5982: 5'-AATT(CCT)17CCG-3' (SEQ ID NO: 25) El par de oligonucleótidos 5986 y 5987 se utilizó para construir el plásmido pXL2726 mediante la clonación de los nucleótidos en los sitios BamHI y EcoRI de pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), mientras que los oligonucleótidos 5981 y 5982 se utilizaron para la construcción del plásmido pXL2725. Se utilizaron las mismas condiciones experimentales que para la construcción del plásmido pXL2563, y solamente se cambió el par de oligonucleótidos. De manera similar, las secuencias clonadas se verificaron mediante la secuenciación de los plásmidos. Esto permitió que se observara que el plásmido pXL2725 posee una modificación relativa a la secuencia esperada: en lugar de la secuencia GGA repetidas 17 veces, se presenta la secuencia GGAGA(GGA)15 (SEQ ID NO: 26).

EJEMPL0 10 Los oligonucleótidos que forman triples hélices con estas secuencias de homopurina se acoplaron a las columnas HiTrap de conformidad con la técnica descrita en el ejemplo 1.1. El oligonucleótido de la secuencia 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (SEQ ID NO: 27) se utilizó para la purificación del plásmido pXL2725, y el oligonucleótido de la secuencia 5V\GTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEQ ID NO: 28) se utilizó para la purificación del plásmido pXL2726. Las dos columnas así obtenidas permitieron que los plásmidos correspondientes se purificaran de conformidad con la técnica descrita en el ejemplo 2, con los siguientes reguladores de pH: Regulador de pH F: 2 M NaCI, 0.2 M acetato, pH 4.5. Regulador de pH E: 1 M Tris-HC1 , pH 9, 0.5 mM EDTA. Los rendimientos obtenidos son 23% y 31 % para pXL2725 y pXL2726, respectivamente.

EJEMPLO 11 Este ejemplo ¡lustra la influencia de la longitud de la secuencia específica presente en el plásmido sobre los rendimientos de purificación. El gen reportero utilizado en estos experimentos para demostrar la actividad de las composiciones de la invención es el gen que codifica para luciferasa (Luc). El plásmido pXL2621 contiene un cassette que contiene el promotor de 661 -pb de citomegalovirus (CMV), extraído a partir de pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) mediante escisión con las enzimas de restricción Mlul y HindIII, clonado hacia el extremo 5 del gen que codifica para luciferasa, en los sitios Mlul y HindIII, dentro del vector pGL basic Vector (Promega Corp., Madison, Wl). Este plásmido se construyó utilizando técnicas estándares de biología molecular. Los plásmidos pXL2727-1 y pXL2727-2 se construyeron de la siguiente manera: Dos microgramos de plásmido pXL2621 se linearizaron con BamHI; la enzima se inactivo mediante tratamiento por 10 minutos a 65°C; al mismo tiempo, los oligonucleótidos 6006 y 6008 se hibridaron como se describe para la construcción del plásmido pXL2563. 6006: 5'-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3' (SEQID NO: 29) 6008: 5'-GATCAGATCTGCAG(TTC)i7A-3' (SEQ ID NO: 30). Esta mezcla de hibridación se clonó en los extremos BamHI del plásmido pXL2621 y, después de la transformación hacia DH5a, las clonas recombinantes se identificaron mediante análisis de restricción enzimático Pstl, puesto que los oligonucleótidos introducen un sitio Pstl. Se seleccionaron dos clonas, y la secuencia nucleotídica del fragmento clonado se verificó utilizando el iniciador (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (SEQ ID NO: 31 )) como un iniciador de reacción de secuenciación (Viera J. y J. Messing, 1982). The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. (Gene 19: 259-268).

La primera clona (pXL2727-1 ) contenía la secuencia GAA repetida 10 veces. La segunda (pXL2727-2) contenía la secuencia 5'-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3' (SEQ ID NO: 32). Se utilizó una columna tal como aquella descrita en el ejemplo 3, y la cual se acopla al oligonucleótido 5'-G AG G CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1 ). El plásmido pXL2727-1 porta 14 repetidos de la secuencia GAA. El oligonucleótido anteriormente descrito, el cual contiene solamente 7 repetidos de la secuencia correspondiente para hibridación CTT, puede hibridar entonces con el plásmido en 8 diferentes posiciones. El plásmido pXL2727-2, en contraste, posee una secuencia para hibridación (GAA)7 (SEQ ID NO: 36) de la misma longitud que aquella del oligonucleótido unido a la columna. Por lo tanto este oligonucleótido se híbrida solamente en una posición en pXL2727-2. El experimento es idéntico a aquel descrito en el ejemplo 4, con los siguientes reguladores de pH: Regulador de pH F: 2 M NaCI, 0.2 M acetato, pH 4.5. Regulador de pH E: 1 M Tris-HCI, pH 9, 0.5 mM EDTA. El rendimiento de purificación es de 29% con el plásmido pXL2727-1 y 19% con el plásmido pXL2727-2. Las células utilizadas son las células NIH 3T3, inoculadas el día anterior al experimento en la placa de cultivo de 24 pozos en la base de 50,000 células/pozo. El plásmido se diluye en NaCI 150 mM y se mezcla con la lipofectant RPR115335. Se utilizó una relación de lipofectant con carga positiva/ADN con carga negativa es igual a 6. La mezcla se sometió a vórtex, se dejó por diez minutos a temperatura ambiente, se diluyó en medio sin suero de ternera total y luego se añadió a las células en la proporción de 1 µg de ADN pozo de cultivo. Después de dos horas a 37°C, 10% del volumen/volumen de suero de ternera fetal se añadió a las células y se incubaron por 48 horas a 37°C en la presencia de 5% de C02. Las células se lavaron dos veces con PBS y la actividad de luciferasa se midió de conformidad con el protocolo descrito (Promega kit, Promega Corp. Madison, Wl) en un luminómetro Lumat LB9501 (EG and G Berthold, Evry). El plásmido pXL2727-1, se purificó como se describió en el ejemplo 8.2, produciendo rendimientos de transfección dos veces más grandes que los obtenidos con el mismo plásmido purificado utilizando el equipo Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, Wl).

EJEMPLO 12 El siguiente ejemplo demuestra la purificación de plásmidos derivados de pCOR utilizando cromatografía de triple hélice por afinidad. Se ha mostrado que esta tecnología remueve los contaminantes de ácido nucleico (particularmente de ADN genómico y ARN del hospedero) hacia abajo a niveles que no se han alcanzado con los métodos convencionales de cromatografía.

Un gel de afinidad triple se sintetizó con Sephacryl S- 000 SF (Amersham-Pharmacia Biotech) como la matriz para cromatografía. Sephacryl S- 000 se activó inicialmente con m-peryodato de sodio (3 mM, temperatura ambiente, 1 hora) en 0.2 M acetato de sodio (pH 4.7). Posteriormente el oligonucieótido se acopló a través de su porción 5'-NH2 terminal a los grupos aldehido de la matriz activada mediante la aminación reductora en la presencia de ácido ascórbico (5 mM) como se describió previamente para el acoplamiento de las proteínas (Hornsey et al., J. Immunol. Methods, 986, 93, 83-88). El oligonucieótido de homopirimidina utilizado para estos experimentos (a partir de Eurogentec, se purificó mediante CLAR) tuvo una secuencia la cual fue complementaria con una secuencia corta de 14 elementos de homopurina (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID NO: 10) presente en el origen de replicación (oriy) del plásmido pCOR (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482-1488). Como se discutió anteriormente, la secuencia del oligonucieótido de homopirimidina es 5 -TTC I I I I I I I I CTT-3' (SEQ ID NO: 11 ). Los siguientes plásmidos se sometieron a cromatografía: pXL3296 (pCOR sin transgén, 2.0 kpb), pXL3179 (pCOR-FGF, 2.4 kpb), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2.5 kbp), pXL3678 (pCOR-AFP, 3.7 kbp), pXL3227 (pCOR-lacZ 5.4 kbp) y pXL3397 (pCOR-B deletado FVlll, 6.6 kbp). Todos estos plásmidos se purificaron mediante dos pasos de cromatografía por intercambio aniónico a partir de lisados claros obtenidos como se describió en el ejemplo 4. También se estudió el plásmido pBKS+ (pBluescript II KS + a partir de Stratagene), un plásmido derivado a partir de ColE1 , purificado mediante ultracentrifugación en CsCI. Todos los plásmidos se encontraron en su estado topológico superenrollado (> 95 %). En cada experimento de purificación de ADN plasmídico, se cargaron 300 µg de ADN plasmídico en 6 mi de 2 M NaCI, 0.2 M acetato de potasio (pH 5.0) a una velocidad del flujo de 30 cm/h en una columna por afinidad que contenía el oligonucleótido anteriormente mencionado 5'-TTCT I I I I I I I CTT-3' (SEQ ID NO: 11). Después del lavado de la columna con 5 volúmenes del mismo regulador de pH, el plásmido unido se eluyó con 1 M Tris/HCI, 0.5 mM EDTA (pH 9.0) se cuantificó mediante UV (260 nm) y se sometió a cromatografía por intercambio iónico con una columna Millipore Gen-Pak ( arquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26-37). Las recuperaciones del plásmido en la fracción recolectada fueron de 207 µg para pXL3296, 196 µg para pXL3179, 192 µg para pXL3579, 139 g para pXL3678, 97 µg para pXL 3227, y 79 µg para pXL 3397. No se pudo detectar ninguna unión no plasmídica (<3 µg) cuando pBKS se sometió a cromatografía en esta columna. Esto indica que el oligonucleótido 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 11) produce estructuras triples estables con la secuencia complementaria de 14 elementos 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID NO: 10) presente en pCOR (?p?), pero no con la secuencia cercanamente relacionada 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEQ ID NO: 8) presente en pBKS. Esto indica que la introducción de una tríada no canónica particular (T*GC en este caso) resulta en una desestabilización completa de la estructura triple. Como un control, no se observó la unión de ningún plásmido (<1 µg) cuando pXI_3179 se sometió a cromatografía en una columna de blanco sintetizada bajo condiciones estrictamente similares pero sin oligonucleótido. Mediante la operación de esta columna de purificación por afinidad en las condiciones reportadas en la presente intención, el nivel de contaminación por el ADN genómico de hospedero se redujo de 2.6 % a 0.07% para una preparación de pXL3296. De manera similar el nivel de contaminación por el ADN hospedero se redujo de 0.5 % a 0.008 % para una preparación de pXL3179 cuando la muestra se sometió a cromatografía a través de la misma columna de afinidad.

EJEMPLO 13 El siguiente ejemplo demuestra la purificación de plásmidos derivados a partir de ColE1 utilizando la cromatografía de triple hélice por afinidad. Se ha mostrado que ésta tecnología remueve los contaminantes de ácido nucleico (particularmente el ADN genómico y ARN del hospedero) hacia niveles que no se han obtenido con métodos convencionales de cromatografía. Un gel de afinidad triple se sintetizó mediante el acoplamiento de un oligonucleótido que tiene la secuencia 5'-TCTT I I I I I CCT-3' (SEQ ID NO: 9) sobre Sephacryl S-1000 SF oxidado con peryodato como se describió en el ejemplo anteriormente mencionado. Los plásmidos pXL3296 (pCOR sin transgén) y pBKS, un plásmido derivado a partir de ColE1 , se sometieron a cromatografía en una columna de 1 mi que contenía el oligonucleótido 5'-TCT l i l i l í CCT-3* (SEQ ID NO: 9) en las condiciones descritas en el ejemplo 9. Las recuperaciones del plásmido en las fracciones recolectada fueron de 175 µg para pBKS y < 1 µg para pXL3296. Esto indica que el oligonucleótido 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 9) hace las estructuras triples estables con la secuencia complementaria de 12 elementos (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (SEQ ID NO: 8) presentes en pBKS, pero no con la secuencia muy cercana relacionada de 12 elementos (5'-AGAAAAAAAAGA-3') (SEQ ID NO: 34) presente en pCOR. Esto indica que la introducción de una tríada no canónica particular (C*AT en este caso) puede resultar en la desestabilización completa de la estructura triple.

EJEMPLO 14 Un cultivo semilla se produjo en un matraz Erlenmeyer sin deflector mediante el siguiente método. El banco celular para trabajo se inoculo dentro de un matraz Erlenmeyer que contenía medio M9modG5, a una relación de semilla de 0.2% v/v. La cepa se cultivo a 220 rpm en un agitador rotatorio a 37 ± 1 °C por aproximadamente 18 ± 2 horas hasta que se acabe la glucosa. Esto resulta en un cultivo de 200 mi de semilla. La densidad óptica del cultivo se espera que sea a ?ß?? de alrededor de 2-3. Entonces se crea un pre-cultivo en un primer termentador. El cultivo de semilla se transfiere asépticamente hacia un pre-fermentador que contiene medio M9modG5 para asegurar una relación de semilla de 0.2% (v/v) y se cultivo bajo aereación y agitación. El pO2 se mantiene por arriba de 40% de saturación. El cultivo se cosechó cuando la glucosa se consumió después de 16 horas. Esto resulta en aproximadamente 30 litros de pre-cultivo. La densidad óptica del cultivo se espera que sea a A6oo de alrededor de 2-3. Se crea entonces un cultivo principal en un segundo fermentador. 30 litros de precultivo se transfieren asépticamente a un fermentado!" llenado con 270 litros de medio FmodG2 esterilizado para asegurar una relación de semilla de aproximadamente 10% (v/v). El cultivo se inició en un monto de lote para producir cierta biomasa. El ingreso de glucosa se inició una vez que el azúcar inicial se consumió después de aproximadamente 4 horas. La aereación, agitación, p02 (40%), pH (6.9 ± 0.1 ), temperatura (37 ± 1 °C) e ingreso de glucosa se controlan con el objeto de mantener una velocidad de crecimiento especifica cercana a 0.09h"1. El cultivo se terminó después de aproximadamente 35 horas de ingreso de la materia prima. Esto resultó en aproximadamente 400 litros de cultivo. Se espera que la densidad óptica del cultivo sea a A60o de aproximadamente 100. Se llevó a cabo un primer paso de separación, el cual se denominó cosecha de la célula. La biomasa se cosechó con una centrífuga de disco apilado. El caldo se concentró 3 a 4 veces para eliminar el medio de cultivo gastado y se resuspendió de manera continua en 400 litros de regulador de pH S1 estéril. Esto resulta en aproximadamente en 500 litros de biomasa pre-condicionada. DCW = 25 ± 5 g/L. Se llevó a cabo un segundo paso de separación, la cual se denominó un paso de concentración. Después de la resuspensión/homogeneización en regulador de pH S1 , las células se procesaron de nuevo con el separador para producir una pasta aguada concentrada. Esto resulta en aproximadamente 60-80 litros de pasta aguada lavada y concentrada. DCW = 150 ± 30 g/L; ADNp = 300 ± 60 mg/L. Posteriormente se llevó a cabo un paso de congelamiento. La pasta aguada se despachó asépticamente dentro de bolsas de 20 L de Flexboy™ (llenadas al 50% de su capacidad) y subsecuentemente se congelaron a -20 ± 5°C antes de procesarlas adicionalmente. Esto resultó en una biomasa congelada. ADNp = 300 ¦± 60 mg/L; forma superenrollada > 95 %. Posteriormente se realizó un paso de descongelamiento de células. Las bolsas congeladas se calentaron hasta 20°C y la pasta aguada celular se diluyó a 40 g/L, pH 8.0 con 100 mM Tris clorhidrato, 10 mM EDTA, 20 mM glucosa y la suspensión se dejó a 20 + 2°C por 1 hora bajo agitación antes de la lisis celular. Esto resultó una pasta aguada de biomasa descongelada. pH= 8.0 ± 0. 2.

Se pueden utilizar las temperaturas de alrededor de 20°C durante este paso. Posteriormente se realizó un paso de lisis alcalina. El paso de lisis de célula comprende el bombeo de la suspensión celular diluida vía un mezclador en línea con una solución de 0.2 N NaOH-35 mM SDS (solución S2), seguido por un paso de contacto continuo en un tubo espiral. El paso de contacto continuo se asegura para completar la lisis celular y la naturalización del ADN genómico y de las proteínas. La solución de células lisadas se mezcla en línea con la solución 3 (S3) de 3 M acetato de potasio-2 N ácido acético frío, antes de la recolección en un recipiente enfriado en agitación. La adición de la solución S3 resulta en la precipitación de un ADN genómico, ARN, proteínas y KDS. A continuación se llevó a cabo una filtración del lisado. Posteriormente el lisado neutralizado se incubó a 5 ± 3°C por 2 a 24 horas sin agitación y se filtró a través de un filtro de malla de 3-5 mm para remover la masa de material precipitado (fase de masa flocosa) seguido por una filtración profunda como un paso de filtración profunda. Esto resulta en un lisado aclarado, con una concentración de plásmido superenrollado de más de 90%. Posteriormente se llevó a cabo la cromatografía de intercambio aniónico. La solución clara de lisado se diluyó con agua purificada hasta un valor de conductividad blanco de 50 mS/cm, se filtró a través de un filtro de doble capa (3 µ??-0.8 µ?t?) y se cargó sobre una columna para cromatografía por intercambio aniónico. Se utilizó una columna de 300-mm empaquetada con 11.0 L do resina Fractogel® TMAE HiCap (M) (Merck; #1. 03 6.5000). El lisado claro se cargó sobre la columna y la elución se llevó a cabo utilizando un gradiente por etapas de NaCI. La masa de contaminantes unidos a la columna se eluyó con una solución de NaCI a aproximadamente 61 mS/cm, y el ADN plasmídico se eluyó con una solución de NaCI a aproximadamente 72 mS/cm. Esto resultó en un eluído de cromatografía de intercambio iónico que tiene una alta concentración de ADN plasmídico. Esto se siguió por cromatografía por afinidad triple. El eluído a partir de la columna de cromatografía de intercambio aniónico se diluyó con aproximadamente 0.5 volúmenes de una solución de 500 mM acetato de sodio (pH 4.2) que contenía 4.8 M NaCI y se bombeó a través de una columna para cromatografía por afinidad triple equilibrada con 50 mM de acetato de sodio (pH 4.5) que contenía 2 M NaCI. La columna es de 300 mm en diámetro y contiene 10.0 L de THAC Sephacryl™ S-1000 gel (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ). La columna se lava con una solución de 50 mM acetato de sodio (pH 4.5) que contenía 1 M de NaCI y NV1 FGF se eluyó con 100 mM Tris (pH 9.0) que contenía 0.5 mM EDTA. Esto resulta en un eluído por cromatografía por afinidad triple que tiene una concentración elevada de plásmido. Luego siguió un paso de cromatografía por interacción hidrófoba.

El eluído de la columna de cromatografía por afinidad se diluyó con 3.6 volúmenes de una solución de 3.8 M de sulfato de amonio en Tris (pH 8.0). Después de filtración a través de un filtro de 0.45 µ?t?, el filtrado se cargó a 60 cm/h sobre una columna para interacción hidrófoba (diámetro 300 mm) empaquetada con 9.0 L de ToyopearI® Butyl-650S resina (TosoH corp., Grove City, OH). La columna se lavó con una solución de sulfato de amonio a aproximadamente 240 mS/cm y NV1 FGF se eluyó con sulfato de amonio a 220 mS/cm. Esto resultó en eluido HIC libre de formas relajadas. De conformidad con una modalidad preferida, se llevó a cabo un paso de diafiltración adicional. Los materiales estándares para diafiltración, comercialmente disponibles son adecuados para uso en este proceso, de conformidad con las técnicas estándares conocidas en la técnica. Un método de diafiltración preferido es una diafiltración que utiliza una membrana para ultrafiltración que tiene un límite de peso molecular en el intervalo de 30,000 a 500,000, dependiendo del tamaño del plásmido. Este paso de diafiltración permite el intercambio de regulador de pH y así se reguló la concentration. El paso de eluído 12 se concentró 3 a 4 veces mediante filtración por flujo tangencial (límite de la membrana, 30 kDa) a una concentración blanco de aproximadamente 2.5 a 3.0 mg/mL y el concentrado se intercambió con regulador de pH mediante diafiltración a un volumen constante con 10 volúmenes de solución salina y se ajustó a la concentración blanco del plásmido con solución salina. La concentración de NV1 FGF se calculó para la absorbancia a 260 nm de las muestras del concentrado. La solución de NV FGF se filtró a través de un filtro de cápsula de 0.2 µ?? y se almacenó en contenedores en un cuarto frío a 2-8°C hasta procesamiento adicional. Esto produjo un concentrado purificado con una concentración de ADN plasmídico de plásmido superenrollado de alrededor de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, y preferiblemente 99%. La recuperación general del plásmido con este proceso es de al menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, y 80%, con una recuperación por medio de 60 %.

EJEMPLO 15 El método del ejemplo anteriormente mencionado comprende un paso de cromatografía por intercambio iónico (AEC), un paso de cromatografía de triple hélice por afinidad (THAC), y un paso de cromatografía hidrófoba (HIC) que resulta en una preparación más purificada de ADN plasmídico en comparación con los métodos previamente conocidos. Este método novedoso se ha comparado con los métodos previamente conocidos y ha resultado en preparaciones de ADNp que tienen cantidades mucho menores de ADN genómico, ARN, proteína, y endotoxina. Esto se refleja en el cuadro A. Estos experimentos muestran que AEC, THAC y HIC proveen un rendimiento de purificación sorprendentemente alto en comparación con aquellos de las combinaciones de 2-pasos para la remoción efectiva de todos los contaminantes. Las combinaciones de estos pasos proveen una sinergia evidente en términos de eficiencia de la separación del ADN plasmídico a partir de otros materiales biológicos y contaminantes, tales, proteína y endotoxina, ARN y ADN genómico, así como plásmido circular abierto. Además, la combinación de pasos sinergisticos, por ejemplo, AEC/THAC/HIC de conformidad con la presente invención permiten no solamente la obtención de un ADN grado farmacéutico altamente purificado, sino también composiciones de elevada pureza y completamente superenrolladas, de más de 80%, 85%, 90%, 95% y más de 99% de ADN plasmídico.

CUADRO A Secuencia ADN ARN Proteína Endotoxina Forma Comentarios genómico (%) (%) (EU/mg de ccc (%) plásmido) (%) Lisis 500 >1000 >2000 >100 000 «95 Cromatografía 10 a 50 5 a 20 0.0002 20 a >200 «95 Remoción de de intercambio proteína muy aniónico (AEC) eficiente (> 06 [FractoqeITMAE veces) (HiCapj] Remoción de endotoxina eficiente (1000 veces) Cromatografía 0.3 a 1.0 0.002 O.0001 10 a 200 «95 Remoción de de intercambio a 0.01 ARN muy aniónico y eficiente (1000 cromatografía veces) por afinidad de Remoción de triple hélice ADN genómico (THAC- eficiente (100 SephacrylS1000) veces) Remoción deficiente de endotoxina (<10 veces) No hay remoción de forma de plásmido circular abierto Cromatografía de 0.2 a 0.6 <0.01 ND <0.2 >99 Remoción de intercambio aniónico y la forma de cromatografía de plásmido oc interacción hidrófoba muy eficiente /HIC) [Toyopearl Butyl (10 veces) (650s)] Remoción de ADN y ARN muy eficiente (100 veces) Remoción de endotoxina eficiente (1000 veces) Cromatografía de O.00008 <0.00 <0.00005 <0.1 >99 Remoción de intercambio aniónico y 002 ADN cromatografía de genómico, afinidad de triple ARN, hélice y cromatografía proteína, de interacción endotoxina, y hidrófoba en de forma de combinación(AEC/TH plásmido oc AC/HIC) muy eficiente El cuadro A compara los rendimientos de purificación en términos de ADNg, ARN, proteínas, endotoxina contaminante utilizando un solo paso de la cromatografía un intercambio de aniones (AEC), o un método de dos pasos con un paso de cromatografía de intercambio de aniones en combinación con la cromatografía por afinidad de la triple hélice (THAC) y un método de tres pasos que comprende un paso de cromatografía de intercambio de aniones, un paso de cromatografía por afinidad de la triple hélice y un paso de cromatografía por interacción hidrófoba (HIC) en combinación ND significa no detectado : métodos analíticos de baja sensibilidad.

EJEMPLO 16 El método del ejemplo anteriormente mencionado, el cual comprende un paso de cromatografía por intercambio iónico, un paso de cromatografía por afinidad de triple hélice, y un paso de cromatografía hidrófoba para la elaboración de una preparación de ADN plasmídico altamente purificado en comparación con los métodos previamente conocidos. Como se muestra en el cuadro B, el método de conformidad con la presente invención resulta sorprendentemente en preparaciones de ADNp que tienen cantidades mucho más pequeñas de ADN genómico, ARN, proteína, y endotoxina, en el intervalo de sub-ppm. También, como se muestra en el cuadro B, el proceso de la presente invención muestra una calidad de producto obtenida hasta 10 g.

CUADRO B El cuadro B compara diversos métodos de separación y purificación de ADN plasmídico, tales como cromatografía por intercambio de aniones (AEC), cromatografía con hidroxiapatita (HAC), cromatografía por interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de fase reversa (RPC), cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), cromatografía por afinidad de la triple hélice (THAC) solo o en combinación, y el método de conformidad con la presente invención. Los resultados en los términos de calidad del ADN plasmídico purificado se proveen a continuación. ND, no detectado (métodos analíticos de baja sensibilidad).

EJEMPLO 17 El paso de diafiltración como se describe en el ejemplo 14 se lleva a cabo de conformidad con las siguientes condiciones: los reguladores de pH para el paso a y para el paso b se utilizaron para determinar las mejores condiciones para: iii) una primera diafiltración (paso a) en contra de 12.5 a 13.0 volúmenes de 50 mM Tris/HCI, 150 mM NaCI, pH 7.4 (denominado regulador de pH I), y iv). Llevar a cabo una segunda diafiltración la solución retenida a partir del paso a) anteriormente mencionado (paso b) en contra de 3.0 a 3.5 volúmenes de excipiente de solución salina (150 mM NaCI).

Este paso de diafiltración alternativo de conformidad con la presente invención remueve eficientemente y de manera extensiva el sulfato de amonio y el EDTA de manera extensa. También, de manera subsecuente a los pasos de diafiltración, se obtiene la concentración apropiada del NaCI blanco alrededor de 150 mM y la concentración final de Tris entre 400 uM y 1 mM. Los ejemplos de formulaciones de composiciones de ADN plasmídico se proveen en el cuadro 6 a continuación, y CUADRO 6 EJEMPLO 18 Un lote técnico de ADN plasmídico NV1 FGF API (ingredientes farmacéuticos activos) denominado LS06 se elaboró de conformidad con el ejemplo 13 con el paso del procedimiento de diafiltración descrito en el ejemplo 17. El eluído se sometió a diafiltración inicialmente alrededor de 2 mg API /mL en contra de aproximadamente 13 volúmenes del regulador de pH I y la solución retenida resultante se sometió a diafiltración en contra de aproximadamente 3 volúmenes de excipiente de solución salina. La solución retenida final se filtró posteriormente a través de un filtro de 0.2 µ?t? y se ajustó a 1 mg/mL. La API final (pH 7.24) se almacenó en una botella de vidrio Duran a +5°C hasta la elaboración de DP. Se llevó a cabo un estudio de estabilidad sobre las muestras de LS06 almacenadas en botellas de vidrio Duran (API) así como en viales de 8-mL utilizados para la elaboración del producto fármaco. Después de 90 días a +5°C tanto el grado de depuración como la elaboración en círculos abiertos de todas las muestras se detectó difícilmente (<0.3%). Después de 90 días a +25°C las relaciones de depuración y de elaboración en círculos abiertos de las muestras LS06 también fueron bastante bajas. La depuración y las relaciones de circularización-abierta calculadas a partir de este estudio fueron < 1 % por mes (figuras 3A y 3B). Este estudio demuestra que el perfil de estabilidad del ADN plasmídico NV1 FGF es muy estable en la formulación de la presente invención en donde los valores de pH se mantienen alrededor de 7 a 7.5. Mientras que la relación de depuración y de rompimiento del plásmido generalmente se aceleran fuertemente a +25°C, el solicitante ha mostrado que el ADN plasmídico permanece estable en una forma no degradada para un largo período de tiempo incluso a RT. La especificación se debe entender a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la presente especificación. Las modalidades dentro de la especificación proveen una ilustración de las modalidades de la invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención. El experto en la técnica fácilmente reconoce que se consideran muchas otras modalidades por la invención. Todas las publicaciones y patentes citadas en esta descripción se incorporan como referencia en su totalidad. Hasta el grado en que el material incorporado como referencia contradice o es inconsistente con esta especificación, la especificación sustituirá cualquiera de dichos materiales. La cita de cualesquiera referencias en la presente invención no es una aseveración de que dichas referencias son técnica previa a la presente invención. A menos que se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, y así sucesivamente utilizados en la especificación, incluyendo reivindicaciones, se deben considerar como que pueden ser modificados en todos los casos mediante el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique otra manera por el contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas buscadas que se desean obtener por la presente invención. Finalmente, y no como un intento para limitar la solicitud de la doctrina de equivalentes del alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe ser considerado a la luz de los números de dígitos significativos y de los métodos de redondeo comunes. A menos que se indique de otra manera, el término "al menos" que precede una serie de elementos se debe entender que se refiere a cada elemento en la serie. Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de evaluar el uso de no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención se describen en la presente invención. Se pretende que dichas equivalentes sean considerados por las siguientes reivindicaciones.

Referencias Patentes: WO 98/00815 (utilization of T [Tee], Pasteur Mérieux Sérums et Vaccins [Sera and Vaccines]) WO 96/02658, A. L. Lee et al., A Method for Large Scale Plasmid Purification (1996). WO97/23601 , N. C. Wan et al., Method for Lysing Cells (1997). WO 99/29832, D. S. McNeilly, Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNA substantially free of genomic DNA (1999). Patente de E.U.A. No. 6,214,568, D. S. McNeilly Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNA substantially free of genomic DNA (2001 ).

Publicaciones: H. C. Birnboim y J. Doly, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Nucleic Acid Research 7 (6): 1513-1523 (1979). D. Stephenson, F. Norman y R. H. Cumming, Shear thickening of DNA in SDS lysates Bioseparation 3: 285-289 (1993). M. S. Levy, L. A. S. Ciccolini, S. S. S. Yim, J. T. Tsai, N. Titchener-Hooker, P. Ayazi Shamlou y P.Dunnill, The effects of material properties and fluid flow intensity on plasmid DNA recovery during cell lysis Chemical Engineering Science 54: 3171 -3178 (1999).

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para la preparación de una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que comprende la provisión de un extracto celular que contiene ADN plasmídico, en donde las células han sido lisadas a través de lisis alcalina en las membranas celulares y ADN genómico han sido removidas mediante una extracción inicial o filtración; y posteriormente llevar a cabo al menos dos pasos de cromatografía, conociendo un paso de cromatografía de triple hélice y el segundo se selecciona de entre cromatografía por intercambio de aniones, cromatografía por permeación en gel, y cromatografía por interacción hidrófoba, en donde la composición preparada tiene menos de aproximadamente 0.0001 % de contaminación de ADN genómico de la célula hospedera. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los al menos dos pasos de cromatografía comprende tres pasos que se llevan a cabo en el siguiente orden: cromatografía por intercambio de aniones, cromatografía por afinidad de triple hélice, y cromatografía por interacción hidrófoba. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer paso de la cromatografía que se lleva a cabo es precedido por una filtración del lisado. 4. - Ei método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer paso de la cromatografía que se lleva a cabo es precedido por la remoción de la masa floculenta. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la composición tiene menos de aproximadamente 0.0001 % de ARN contaminante de la célula hospedera. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la composición tiene menos de aproximadamente 0.0001 % de proteína contaminante de la célula hospedera. 7 - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la composición tiene menos de aproximadamente 0.0001 % de contaminación por proteína de la célula hospedera. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la composición tiene menos de aproximadamente 0.1 UE/mg de endotoxina. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la composición tiene menos de aproximadamente 0.1 UE/mg de endotoxina. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque la composición tiene menos de o aproximadamente 0.1 UE/mg de endotoxina, menos de o aproximadamente 0.00008% de proteína contaminante de la célula hospedera, menos de o aproximadamente 0.00008% de ARN contaminante de la célula hospedera, y menos de o aproximadamente 0.00008% de ADN genómico contaminante de la célula hospedera. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la composición tiene menos de o aproximadamente 0.00005% de ADN genómico contaminante de la célula hospedera. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la composición tiene menos de o aproximadamente 0.00008% de ADN genómico contaminante de la célula hospedera. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la composición tiene menos de o aproximadamente 0.1 UE/mg de endotoxina, y menos de o aproximadamente 0.00005% de proteína contaminante de la célula hospedera. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la composición tiene menos de o aproximadamente 0.00002% de ARN contaminante de la célula hospedera, y menos de o aproximadamente 0.00008% de ADN genómico contaminante de la célula hospedera. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la composición tiene menos de o aproximadamente 0.1 UE/mg de endotoxina, y menos de o aproximadamente 0.00002% de ARN contaminante de la célula hospedera. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la composición tiene menos de o aproximadamente 0.1 UE/mg de endotoxina, y menos de o aproximadamente 0.00005% de proteína contaminante de la célula hospedera. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la composición tiene no más de 0.00002% de ARN contaminante de la célula hospedera, y no más de 0.00005% de proteína contaminante de la célula hospedera. 18. - El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1-17, caracterizado además porque es posible escalar para elaboración a gran escala. 19. - Una composición de ADN plasmídico preparada mediante el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-18. 20. - La composición de ADN plasmídico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque comprende al menos un polímero para mejorar la transferencia de ADN plasmídico dentro de una célula. 21.- La composición de ADN plasmídico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 22. - La composición de ADN plasmídico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque se formula para la administración mediante inyección, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intratumoral, bombardeo de partícula pequeña, o aplicación tópica a un tejido. 23. - La composición de ADN plasmídico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque el ADN plasmídico está sustancialmente en la forma de ADN circular cerrado superenrollado. 24. - Un método para la elaboración a gran escala de ADN plasmídico altamente puro, en donde las células hospederas que contienen el plásmido son lisadas mediante lisis alcalina a través de un flujo laminar continuo, el extracto resultante se neutraliza, y el ADN plasmídico en el extracto se aisla mediante un primer paso de cromatografía por intercambio de aniones, un paso de cromatografía por afinidad de triple hélice, y seguido por un paso de cromatografía por interacción hidrófoba. 25. - Un método para la producción y purificación de un ADN plasmídico grado farmacéutico que comprende los pasos de a) producir células que contienen ADN plasmídico, b) preparar un lisado de las células que contienen ADN plasmídico mediante la fragmentación de las células por un método de lisis alcalina continua, c) concentrar el extracto de célula lisada mediante precipitación, d) llevar a cabo un paso de cromatografía por intercambio de aniones, e) llevar a cabo un paso de cromatografía en triple hélice, f) llevar a cabo un paso de cromatografía por interacción hidrófoba, y g) opcionalmente llevar a cabo un paso de diafiltración o un caso de intercambio de regulador de pH. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado además porque el ADN plasmídico purificado está presente en una solución con menos de o aproximadamente 0.1 UE/mg de endotoxina, menos de o aproximadamente 0.00005% de proteína contaminante de la célula hospedera, menos de o aproximadamente 0.00002% de ARN contaminante de la célula hospedera, y menos de o aproximadamente 0.00008% de ADN genómico contaminante de la célula hospedera. 27.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado además porque comprende adicionalmente un paso previo de remoción de la masa floculenta mediante el paso de la solución a través de un filtro de malla o a través de una filtración profunda. 28. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado además porque comprende adicionalmente un paso de diafiltración después del último paso de cromatografía. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el paso de diafiltración resulta en valores apropiados de sal, regulador de pH, y pH para una composición final útiles en la preparación de una composición farmacéutica. 30. - Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que comprende en cantidades sub-ppm (< 0.00001 %) contaminantes de ADNg, ARN, y proteína de la célula hospedera. 31. - Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que está esencialmente libre de contaminante de ADNg, ARN, y proteína detectables. 32. - Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que está sustancialmente libre de ADN cromosoma! detectable del hospedero bacteriano. 33.- Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que comprende menos de aproximadamente 0.01 %, o menos de aproximadamente 0.001 %, o menos de aproximadamente 0.0001 %, o preferiblemente menos de 0.00008% de ADN cromosomal o ADN genómico. 34. - Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que está sustancialmente libre de ARN detectable de la célula hospedera. 35. - Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que comprende menos de aproximadamente 0.01 %, o menos de 0.001 %, y preferiblemente menos de 0.0001 %, o preferiblemente menos de 0.00002% de ARN contaminante de la célula hospedera. 36.- Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que está sustancialmente libre de proteína contaminante detectable de la célula hospedera. 37. - Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que contiene menos de aproximadamente 0.0001 %, y más preferiblemente menos de 0.00005% de proteína contaminante de la célula hospedera. 38. - Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que está sustancialmente libre de contaminantes mensurables de endotoxina. 39. - Una composición de ADN plasmídico grado farmacéutico que comprende menos de 0.1 UE/mg de endotoxinas. 40. - La composición de ADN plasmídico grado farmacéutico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30-39, caracterizada además porque comprende ADN plasmídico en forma sustancialmente superenrollada. 41. - La composición de ADN plasmídico grado farmacéutico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30-39, caracterizada además porque comprende aproximadamente o más de 99% de ADN plasmídico en forma circular cerrada. 42. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado además porque comprende un paso de filtración estéril, formulación y llenado de los viales con el ADN plasmídico purificado. 43.- Un vial de ADN plasmídico purificado obtenido mediante el método de conformidad con la reivindicación 42. 44. - El vial de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque el ADN plasmídico purificado es un plásmido designado NV FGF. 45. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado además porque uno o más de los pasos de cromatografía se llevan a cabo en un soporte sólido que comprende cualquier material orgánico, inorgánico o material compuesto, soporte poroso, super-poroso o no poroso, adecuado para separaciones cromatográficas, el cual se deriva con poli(alquenglicoles), aléanos, alquenos, alquinos, árenos u otras moléculas que confieren un carácter hidrófobo al soporte. 46. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 18 ó 24 a 29, caracterizado además porque uno o más de los pasos de cromatografía se llevan a cabo como cromatografía por desplazamiento, cromatografía en cama con movimiento simulado, cromatografía en cama continua, cromatografía líquida rápida para proteína, o cromatografía líquida de alta resolución. 47. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 ó 24 a 29, caracterizado además porque la cromatografía por interacción hidrófoba se lleva a cabo en una cama fija o en una cama expandida.