CN115404154A - 用于提取细菌中质粒dna的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于提取细菌中质粒DNA的装置，涉及生物医药技术领域。该装置包括：第一混合组件和第二混合组件；所述第一混合组件与所述第二混合组件通过裂解螺旋管相连接；所述裂解螺旋管与所述第二混合组件的连接管路上设有至少一个进液口；本发明优点在于，采用混合组件串联的形式，使得裂解和中和过程在密闭的环境中，降低污染环境的几率，使用后方便进行清洗，且实现了连续的加工，提升了生产效率；装置简单，设计及生产成本小。

Description

用于提取细菌中质粒DNA的装置
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于提取细菌中质粒DNA的装置。
背景技术
近年来，由于基因治疗和DNA疫苗的临床成功，对工业化规模的质粒发酵生产需求已经非常迫切。
当前规模化质粒的生产技术主要包括以下几道工序：载体构建、细菌发酵、菌体裂解、固液分离及澄清、质粒纯化。虽然目前的质粒生产工艺可以生产出符合药学质量标准的质粒，能够满足临床要求，但在这些工艺中还存在一些难以克服的瓶颈。如产量规模化(千克级)较难，载体拷贝数、稳定性问题，裂解过程中导致DNA变性、HCD残留去除，固液分离较难，内毒素残留等难题。
用于生物制药的质粒DNA主要在大肠杆菌中生产，碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。利用碱性条件将细胞裂解，同时染色体DNA发生不可逆变性，而质粒DNA在pH恢复中性时可复性的原理，将质粒与染色体DNA分离。质粒复性的第一步也是最关键的一步是细胞裂解，如何将细胞彻底裂解，染色体DNA完全共沉淀，去除大部分的RNA成为细胞裂解的核心问题。目前工业规模的质粒提取工艺存在的主要问题有：1、碱裂解无自动化设备或设备能力满足不了充分混合的要求；2、使用大量有机溶剂及酸液，这在大规模工业化生产中增加安全风险及对厂房设备要求较高；3、使用中和液(溶液Ⅲ)混合后，无自动化的混合设备或混合设备满足不了均匀且低剪切的混合要求；4、中和反应液固液分离生产成本较高；5、宿主DNA残留较高；6、RNA去除率较低，影响下游纯化。7、重复用管路设备清洗困难，不利于CIP清洗，而一次性耗材设备成本较高。
中国专利CN205710712U公开了一种质粒提取中的裂解装置，包括机架，可转动地设置在机架上的至少一个容纳仓，容纳仓具有放置至少一个装有培养液的瓶体的腔体，用于驱动容纳仓转动的驱动件，以及控制驱动件驱动容纳仓带动瓶体以所需速度、方向和圈数转动的控制器。上述技术方案即为较为传统的加工手段，属于实验室生产，虽然结构较为简洁，但是生产速度较慢，不能进行连续作业。
中国专利CN111733060A公开了一种质粒DNA碱裂解设备，包括菌液管道；缓冲液管道；菌液悬浮循环装置，包括首尾相连构成回路的循环管道，连接所述的菌液管道和缓冲液管道；所述循环管道上设置有泵和阀门；碱裂解液预配管道；溶胞反应器；中和反应器；酸液管道；收集装置。上述技术装置实现了连续化的裂解，配合相应的过滤装置，可以有效提升生产水平。但是，该技术方案反应装置仍需要通气进行起泡混合，装置结构复杂，管路交错设置，并不利于管路清洗。
中国专利CN111808716A公开了一种质粒提取装置，包括裂解容器、沉淀容器、洗脱液容器、收集容器和层析柱，所述裂解容器与沉淀容器之间通过第一连接管连通，所述沉淀容器与层析柱之间通过第二连接管连通，所述洗脱液容器与层析柱之间通过第三连接管连通，所述第一连接管、第二连接管和第三连接管上均设置有阀门，所述收集容器设置在层析柱的下方，所述层析柱连接有振动机构。上述技术方案采取了振动式结构，加工过程不连续，需要进一步提升加工效率，并且该种方式存在宿主DNA残留较高的问题，还需要进一步改进。
虽然我们为了解决目前大规模生产质粒DNA的方法存在的缺陷，先前研发了一种通过混合腔震荡的方式进行裂解、中和提取细菌中质粒DNA的方法(参见：200610114061.6，一种连续大量提取质粒的方法)，但是其不容易放大，提取的质粒DNA的效率较低；为解决这一问题，我们又研发了一种通过气泡混合器提取质粒DNA的装置(参见：202011120617.9，用于提取细菌中质粒DNA的气泡发生装置)，其使菌液与裂解液能均一且充分混合，气泡混合有效降低剪切力，有效提高收率与质量，但是此装置仍存在不容易放大的问题，需要根据规模定制不同大小的气泡混合器，摸索通气量，流速等放大条件。
因此，我们发明设计了一种新的质粒DNA的提取设备和方法，除了能有效控制混合过程的剪切力，更容易实现放大工艺，相比通过气泡混合器(气泡发生装置)的方式，能有效提高裂解及中和过程的混合效率，增加收率；通过易控地调节混合参数，能有效控制剪切力，提高质粒质量。并且该装置原理简单，可精准调控，因此缩短放大条件摸索的时间，进一步提高工作效率，会大大促进连续地、大规模提取质粒DNA相关研究的发展，具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于提取细菌中质粒DNA的装置，能够解决上述问题。
为此目的，本发明由如下技术方案实施。
一方面，本发明提供一种用于提取细菌中质粒DNA的装置，包括：第一混合组件和第二混合组件；
所述第一混合组件与所述第二混合组件通过所述裂解螺旋管相连接；所述裂解螺旋管与所述第二混合组件的连接管路上设有至少一个进液口；
重悬菌液流入所述第一混合组件混合后，通过所述裂解螺旋管裂解得到裂解液，再通入所述第二混合组件与溶液Ⅲ中和得到中和反应液，所述裂解液通过所述进液口进入所述第二混合组件。
进一步，所述第一混合组件和第二混合组件的结构均可为搅拌式、乳化式、离心式中的一种。
更进一步，所述第一混合组件结构为搅拌式或乳化式；所述第二混合组件为离心式结构，优选地，所述第一混合组件和第二混合组件均为混合泵或搅拌器；更优选地，所述第一混合组件和第二混合组件分别为第一混合泵和第二混合泵，所述第一混合泵和第二混合泵的叶轮均优选为半闭式叶轮。通过采用混合泵的形式，使得裂解和中和过程在密闭的环境中，降低污染环境的几率，使用后方便进行CIP和SIP。
更进一步，所述第一混合泵和第二混合泵的叶轮均可包括后盖板；所述后盖板上均匀分布有多个导流柱，所述导流柱上至少沿叶轮旋转方向的外侧面呈弧面设置；所述导流柱优选为圆柱、圆台或扇形柱中的一种或多种的组合。
更进一步，所述导流柱的直径为0.5mm-40mm，优选为2mm-10mm；所述导流柱优选为圆柱，或所述导流柱的截面积为中间最大，且由中间至两端的截面积逐渐变小。导流柱多个均匀分布，且直径在合适的范围内，能够减小剪切力，防止宿主DNA污染产品，使得裂解中和可以自动化进行。
更进一步，所述导流柱的截面积中间最大，且由中间至两端的截面积逐渐变小，具体实施时，所述导流柱的结构可为纺锤形。
更进一步，所述裂解螺旋管内径为0.5cm-15cm，优选为0.5cm-9cm，所述第一混合泵和第二混合泵的泵头直径均可为2cm-100cm，优选为4cm-30cm；所述第一混合泵和第二混合泵的泵腔体积与单个混合泵额定每分钟进料体积的比值范围均可为1:6-1:1，优选的比例为1:6-1:3；或所述第一混合泵和第二混合泵的泵腔体积均为料液流经泵腔内10s-60s的体积，优选为料液流经泵腔内10s-20s的体积。
更进一步，所述导流柱的长度与分布位置关联，各导流柱的长度由所述后盖板的中心处向外缘依次递减，且各导流柱的顶点均位于同一抛物面上。
更进一步，所述第一混合泵和第二混合泵的进液端均可与出液端同轴设置；所述进液端位于泵壳的中心处，所述出液端位于泵座的中心处。这样流体进入泵腔内需沿后盖板中心至边缘的顺序经过，绕至后方才可排出，使其充分接触导流柱，达到均匀混合的目的，提升中和反应质量。
更进一步，所述装置还包括过滤组件，所述第二混合组件的出液端连接至所述过滤组件的进液端，所述中和反应液通过所述过滤组件过滤。
更进一步，所述重悬菌液包括溶液Ⅰ和含有质粒DNA的菌体，所述重悬菌液通过第一输送泵混合输送至第一混合组件，与通过第二输送泵输送至第一混合组件的溶液Ⅱ混合后通入裂解螺旋管裂解。
进一步，所述过滤组件结构为筛网式、深层过滤式、离心过滤式中的一种或多种组合。
更进一步，所述过滤组件结构为筛网式或深层过滤式结构；过滤孔径为0.2μm-800μm，具体可选取0.2μm-200μm；过滤材质包括但不限于纤维素、硅藻土、活性炭、聚丙烯纤维和硅胶。
更进一步，所述过滤组件结构为离心式结构；离心力为1000g-20000g，离心时间为2min-60min，温度为2℃-40℃。
另外一方面，本发明还提供一种通过上述装置用于提取细菌中质粒DNA的方法，在两个串联的混合组件中实现质粒生产过程中的裂解和中和，具体包括以下步骤：
步骤S1：混合；
步骤S2：裂解；
步骤S3：中和；
其中，步骤S1在第一混合组件中完成，步骤S2在裂解螺旋管中完成，步骤S3在第二混合组件中完成，第一混合组件、裂解螺旋管和第二混合组件依次串联。
进一步，在步骤S2中，裂解2min-10min，优选5min。
进一步，所述第一混合组件的转速为50rpm-1500rpm，优选为200rpm-500rpm；所述第二混合组件的转速为20rpm-1000rpm，优选为150rpm-500rpm。
进一步，所述用于提取细菌中质粒DNA的方法具体包括以下步骤：
步骤S1：用溶液I重悬菌体后，得到重悬菌液，再将重悬菌液、溶液II导入第一混合组件混合，得到菌体混合液；
步骤S2：所述菌体混合液从第一混合组件中流出，进入裂解螺旋管进行裂解，裂解后得到裂解液；
步骤S3：所述裂解液与溶液III进入第二混合组件后，进行中和反应(或裂解液与溶液III先预混后，再通入第二混合组件)，得到中和反应液；
优选地，得到中和反应液后，还包括将其进行固液分离和纯化的步骤。
其中，
步骤S1中，重悬菌液与菌体的体积质量比为3-20:1(L:kg)，进一步优选为7:1(L:kg)。
步骤S1中，溶液I与溶液II的体积比为1:0.5-1:3，进一步优选为1:1。通过不同的管路粗细和长度，控制碱裂解时间为2min-10min，保证菌体裂解完全及裂解效果。
步骤S1中，所述溶液I包括Tris-HCl和EDTA-2Na，进一步优选地，所述Tris-HCl浓度为2mmol/L-100mmol/L，EDTA-2Na浓度为0.1mmol/L-50mmol/L，溶液I的pH范围为6.0-9.0。
步骤S1中，所述溶液II包括NaOH和SDS，进一步优选地，所述NaOH浓度为0.02mol/L-5mol/L，SDS浓度为0.1％-10％。
步骤S2中，所述裂解的时间为2min-10min，进一步优选为5min。
步骤S3中，所述溶液III包括KAc和NH4Ac，进一步优选地，所述KAc浓度为0.1mol/L-6mol/L，NH4Ac浓度为0.2mol/L-10mol/L。
步骤S3中，裂解液与溶液III的体积比为1:0.3-5，进一步优选为1:1。通过上述条件来控制裂解、中和效果，保证宿主DNA的沉淀和宿主RNA去除效果。
本发明具有如下优点：
本发明在质粒生产过程中的碱裂解和中和环节，开拓性地采用混合组件串联的形式，并结合输送泵使得裂解和中和过程在密闭的环境中，降低污染环境的几率，使用后方便进行CIP和SIP，且实现了连续的加工，提升了生产效率，同时也方便生产规模的放大，相较于目前主流的气泡混合器Airmix的生产体系来讲，比较容易放大，不需要根据规模定制不同大小的气泡混合器，缩短了放大条件摸索的时间，提高了工作效率；
进一步，本发明的设备简单，操作方便，且成本低廉，不需要专业的定制化、价格高昂的设备，易于在生产中放大，生产成本低；使用的两台混合组件既可以使菌液和裂解液的充分混合又可以保证和中和液温和地混合中和，避免使用复杂的低剪切中和设备，裂解时混合充分且混合时间较短，中和时条件温和均一，裂解中和后，宿主DNA和RNA残留均低于起泡混合器的效果，产品质量好；同时优化了泵腔的大小，使得裂解中和的时间和剪切力适合产品生产，裂解后的质粒超螺旋比例较高，宿主DNA、RNA残留较少；此外，不需要使用复杂的多级的膜过滤系统，裂解后也不需要过夜沉淀等步骤，设备可直接用CIP清洗，符合药物生产的生产规范，同时节省了工艺时间，降低成本。
进一步，通过优化泵腔的大小，结合调整泵腔和流速的比例，使得裂解中和的时间和剪切力适合产品生产，同时也方便生产规模的放大；对混合泵头的性状尺寸进行优化，使用3D打印技术，对泵头进行设计和定制在保证混合效果的前提下，降低了剪切力，防止宿主DNA污染产品，使得裂解中和可以自动化进行。
并且制备过程中不添加高风险的动物来源成分，如RNase、溶菌酶、蛋白酶K等，生产工艺不使用有毒害的有机溶剂如异丙醇、酚、无水乙醇和其他诱变剂等，所用的试剂可以使用一般的试剂或满足药用级别，不使用酸液中和，对厂房设备要求较低，适合大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明的一个或几个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的用于提取细菌中质粒DNA的装置的示意图；
图2为本发明实施例1中第一混合组件叶轮立体图；
图3为本发明实施例1中第二混合组件立体图；
图4为图3中的第二混合组件爆炸图；
图5为图3中第二混合组件去除泵壳后结构图；
图6为图3中第二混合组件的叶轮立体图；
图7为本发明实施例1中产品电泳结果对照图，其中，泳道1：Marker，泳道2：离心上清，泳道3：对照；
图8为本发明实施例2中第二混合组件叶轮侧视图；
图9为本发明实施例3中第二混合组件立体图；
图10为本发明实施例3中第二混合组件立体图；
图11为本发明实施例1、4、5的电泳结果对照图，其中，泳道1：实施例5的中和反应液上清，泳道2：实施例1的中和反应液上清，泳道3：实施例4的中和反应液上清，泳道4：标准品，泳道5：Marker；
图12为本发明对比例1的电泳结果图，其中，泳道1：实施例1的中和反应液上清，泳道2：对比例1的中和反应液上清，泳道3：标准品，泳道4：Marker；
图13为本发明对比例2中第二混合组件叶轮立体图；
图14为本发明对比例3中第二混合组件叶轮立体图；
图15为本发明实施例1与对比例3电泳结果对照图，其中，泳道1：实施例1的中和反应液上清，泳道2：对比例3的中和反应液上清，泳道3：标准品，泳道4：Marker；
图16为本发明实施例6中导流柱立体图；
其中，图1-6、9-10和16中：
1-第一混合组件；2-第二混合组件；202-泵座；203-密封圈；204-叶轮；205-泵壳；2021-环形槽；2041-后盖板；2042-导流柱；3-裂解螺旋管；4-过滤组件；5-重悬菌液；6-溶液Ⅱ；7-溶液Ⅲ；201-主轴。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请实施例中的特征可以相互组合。
还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”等应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
除非特别指明，本文中的“裂解溶液”均指“溶液Ⅱ”。
除非特别指明，本文中的“中和液”均指“溶液Ⅲ”。
下面将结合附图，对本发明做进一步说明。
如图1所示，本发明的用于提取细菌中质粒DNA的装置，包括：第一混合组件1、第二混合组件2和过滤组件4。两混合组件按功能区分，第一混合组件1可为裂解混合组件，第二混合组件2为中和混合组件。
第一混合组件1与第二混合组件2串联连接；两混合组件之间还串接有裂解螺旋管3。具体地，裂解反应所需的溶液Ⅰ与含质粒DNA的菌体配比后形成重悬菌液5，通过第一输送泵控制流量与流速，向第一混合组件1即裂解混合泵输送。具体实施时，输送管路上还串接有一个第一三通接头(即“Y”形连接器)，重悬菌液5与溶液Ⅱ6可分别通过第一输送泵、第二输送泵送至第一三通接头处，再通入第一混合组件1混合，得到菌体混合液。
第一混合组件1的出液端连接裂解螺旋管3的进液端；裂解螺旋管3的出液端连接第二混合组件2的进液端。其中，裂解螺旋管3与第二混合组件2之间的管路上设有一个进液口，具体为串接管路中的第二三通接头，即“Y”形连接器，第二三通接头的一端还通过第三输送泵连接溶液Ⅲ7的容器。
优选地，本实施例所用的第一混合组件1和第二混合组件2可为搅拌器或混合泵，具体地可分别为第一混合泵和第二混合泵，包括不限于搅拌泵、乳化泵、离心泵等，其中搅拌泵的搅拌桨可选用桨式搅拌器、推进式搅拌器、涡轮式搅拌器、锚式搅拌器、框式搅拌器、螺旋式搅拌器；乳化泵的转子和定子包括但不限于：粗齿、中齿、细齿。通过一定规则形状的泵头，实现了溶液的充分混合，且剪切力较低，保证染色体DNA不发生大量断裂，且可以在密闭环境下进行，没有污染。进一步由于第一混合组件1用于裂解反应，优选第一混合组件1结构优选为搅拌式或乳化式其中一种，具体可选取乳化泵，其叶片结构可如图2中所示(还可为现有技术中的其他乳化泵的形式，此处仅以图2示之)；第二混合组件2用于中和反应，可选取离心式结构，如图3、4所示，第二混合组件2主要包括主轴201、泵座202、密封圈203、叶轮204、泵壳205。流体输送路线如图3中箭头所示方向，流体通过泵壳205中心处的进液端进入泵内部，经过离心混合后可通过泵壳205侧向设置的出液端流出，出液端内部管路与泵内腔相切。其中主轴201一端连接外部电机的输出端，另一端通过密封装置穿过泵座202的中心处，并与叶轮204固定连接，泵座202与泵壳205接触区域加工有环形槽，用于安装密封圈203。叶轮204优选为半闭式叶轮；但是传统的叶轮存在较大缺点，即剪切力比较大，故本实施例中，叶轮204如图5、6所示设计，包括后盖板2041。后盖板2041上均匀分布有多个导流柱2042，共计32根，分三层环绕中心处，且导流柱2042垂直于后盖板2041的表面。进一步，为了更好的降低产生的剪切力，导流柱2042的形状可为圆柱、圆台或扇形台的一种或多种组合，优选为圆柱。导流柱2042的直径范围为0.5mm-40mm；经检验，优选直径为2mm-10mm时可获得较佳的效果。通过优化设计可以减小剪切力，防止宿主DNA污染产品，使得裂解中和可以自动化进行。经过实验可知第二混合组件2通过设定一定转速范围，控制不同规模的混合效果及剪切力的大小，结合第一混合组件1可实现不同规模的菌液自动裂解、中和，从而实现连续化、大规模生产，具体实施时，第一混合组件1的结构还可与第二混合组件1的结构相同。具体地，第二混合组件2的叶轮转速为20rpm-1000rpm时产生较好的混合效果。还可针对第二混合组件2改变泵头性状、大小、转速以控制中和效果；第二混合泵的泵头直径为2cm-100cm，优选为4cm-30cm，转速控制在20rpm-1000rpm，优选为150rpm-500rpm，泵腔体积与该混合泵额定每分钟进料体积的比值范围为1：6-1:1，优选为1:6-1:3；或泵腔体积设计为料液流经泵腔内10s-60s的体积，优选为料液流经泵腔内10s-20s的体积；保证中和完全且产生较低的剪切力，减少染色体DNA的断裂，提高质粒DNA的质量。
第二混合组件2的出液端连接过滤组件4的进液端。
优选地，过滤组件4结构为筛网式、深层过滤式、离心过滤式中的一种或多种组合。具体地，本实施例中过滤组件4结构为深层过滤式结构；过滤孔径为0.2μm-800μm；具体可选过滤孔径在0.1μm-200μm之间。通过深层过滤的方式对中和后上清液进行二次澄清，过滤的材质成分包括不限于纤维素、硅藻土、活性炭、聚丙烯纤维、硅胶及其组合产品。深层过滤膜包膜面积在0.01m2-2m2之间。
工作过程如下：
步骤S1：溶液Ⅰ、含质粒DNA的菌体预混得到重悬菌液，重悬菌液5与溶液Ⅱ6可分别通过第一输送泵送至第一三通接头处，进行管路内的预混合，之后进入第一混合组件1进行搅拌混匀，得到菌体混合液；
步骤S2：搅拌混匀后的菌体混合液进入裂解螺旋管3进行裂解反应，之后流出，得到裂解液；
步骤S3：流出裂解螺旋管3的裂解液与溶液Ⅲ7预混后，再通过第二三通接头输送至第二混合组件2中(或流出裂解螺旋管3的裂解液，流过第二输送泵的溶液Ⅲ，均输送至第二三通接头处，再通入第二混合组件2中)，发生中和反应，得到中和后的中和反应液；
步骤S4：中和后的中和反应液流出后进入过滤组件4过滤，进行固液分离和纯化。
其中，
步骤S1中，重悬菌液与菌体的体积质量比为3-20:1(v:m)，进一步优选为7:1(v:m)。
步骤S1中，溶液I与溶液II的体积比为1:0.5-1:3，进一步优选为1:1。
步骤S1中，溶液I包括Tris-HCl和EDTA-2Na，进一步优选地，Tris-HCl浓度为2mmol/L-100mmol/L，EDTA-2Na浓度为0.1mmol/L-50mmol/L，溶液I的pH范围为6.0-9.0。
步骤S1中，溶液II包括NaOH和SDS，进一步优选地，NaOH浓度为0.02mol/L-5mol/L，SDS浓度为0.1％-10％。
步骤S2中，裂解的时间为2min-10min，进一步优选为5min。
步骤S3中，溶液III包括KAc和NH4Ac，进一步优选地，KAc浓度为0.1mol/L-6mol/L，NH4Ac浓度为0.2mol/L-10mol/L。
步骤S3中，流出裂解螺旋管3的裂解液与溶液III的体积比为1:0.3-5，进一步优选为1:1。通过上述条件来控制裂解、中和效果，保证染色体DNA的沉淀和宿主RNA去除效果。
步骤S4中，固液分离方式包括但不限于过滤、深层过滤、离心等方式中的一种或多种组合。优选地，选择过滤时，过滤的材质包括不限于纤维素、硅藻土、活性炭、聚丙烯纤维和硅胶中的一种或多种，过滤孔径在0.2μm-800μm；优选地，选择深层过滤时，深层过滤的材质包括不限于纤维素、硅藻土、活性炭、聚丙烯纤维和硅胶中的一种或多种，深层过滤孔径在0.1μm-200μm，深层过滤膜包面积在0.01m2-2m2；优选地，选择离心时，离心方式包括不限于选用台式离心机、管式离心机或碟式离心机，离心力为1000g-20000g，离心时间为2min-60min，离心温度为2℃-40℃。
上述实施例中的提取装置均可用于以下实施例，如有不同具体会示出，具体从细菌中提取质粒DNA的方法可如下所示：
实施例1：50L发酵规模处理实例
实施例1的用于提取细菌中质粒DNA的装置，泵头直径为10cm，两个泵的泵头叶轮均如附图6所示，导流柱直径为5mm。
(1)将含有质粒A的大肠杆菌(E.coli)高密度发酵菌液，分光光度计测定OD600为84.2，将发酵液23.3L离心收获菌体3684g，湿重为15.8％。将3684g的细胞重悬于由25mMTris-HCl和10mM EDTA-2Na组成的pH为8.0重悬液(溶液Ⅰ)中，得重悬菌液，重悬后体积为25.8L(菌体与重悬体积重量体积比为1:7)。
(2)将重悬菌液，以140ml/min的速度泵送至裂解混合泵，同时将由0.2M NaOH和1％SDS组成的裂解溶液(溶液Ⅱ)以140ml/min的速度泵送至裂解混合泵(第一混合组件)。调节裂解混合泵转速为200rpm，开始裂解混合，得到菌体混合液。其中，裂解混合泵的泵腔体积为与单个混合泵额定每分钟进料体积的比值1:3。
(3)菌体混合液从裂解混合泵中泵出后，进入裂解螺旋管3，裂解螺旋管3内径为1.9cm，长度为5m，在裂解螺旋管3中裂解时间为5min，得到裂解液。
(4)裂解后的裂解液进入中和混合泵(第二混合组件)，中和混合泵另一端由1MKAc和7M NH4Ac组成的溶液Ⅲ(预冷2-8℃)以280ml/min的速度进入，中和混合泵设置转速250rpm，其中，中和混合泵叶轮上的导流柱的直径为5mm，导流柱的形状为圆柱，中和混合泵的泵头直径为8.5cm；其中，中和混合泵的泵腔体积为与单个混合泵额定每分钟进料体积的比值1:4。
(5)中和完成后，收集中和中和反应液，进入过滤组件4，选取离心式过滤方式，以离心力8000g，离心20min收集上清液进行下一步纯化。
结果检测：
重悬菌液测得质粒浓度为545mg/L(通过QIAGEN的质粒小提试剂盒测得)，质粒总量为14.06g。
中和后得到中和反应液100L，离心后得到上清82L，以HPLC定量法测得质粒浓度为121.8mg/L(HPLC机型:Waters 2695；色谱柱型号:TOSOH，Tskgel DNA-NPR 4.6mm*7.5cm2.5μm，下述实施例中的HPLC测定条件相同)。裂解收率71％。
电泳图见图7，从图7可以看出通过本申请的装置和方法裂解后的上清中质粒纯度较高，RNA及宿主DNA较少。
通过HPLC试验以及药典方法检测上述方法制得的质粒DNA，结果表明质粒为目的质粒，且纯度较高，超螺旋比例大于95％，开环比例较少。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例中导流柱2042的长度与分布位置关联，各导流柱2042的长度由后盖板2041的中心处向外缘依次递减，且各导流柱2042的顶点均位于同一抛物面上，如图8中虚线所示。相应的泵壳205的内表面也设计为抛物面型，与导流柱2042相配合。
过滤组件4结构为离心式结构，可选为串接的台式、管式或碟式离心机；离心力为1000g-20000g，离心时间为2min-60min，温度为2℃-40℃。
实施例3
在实施例1的基础上，本实施例中第二混合组件2的进液端与出液端同轴设置，结合图9、10所示，进液端设置于泵壳205的中心处，而出液端不在设于泵壳205的周侧面，为了进一步增加混合效果，避免进出液口相邻较近导致混合不均匀的情况，将出液口设于泵座202的中心处，即后盖板2041的后方，围绕转轴加工环形槽2021，并可在槽底或槽的侧面开口作为出液端，这样流体进入泵腔内需沿后盖板2041中心至边缘的顺序经过，绕至后方才可通过环形槽2021排出，使其充分接触导流柱2042，达到均匀混合的目的，提升中和反应质量。
实施例4
与实施例1不同的是，第一混合泵的转速为400rpm，第二混合泵的转速为500rpm，裂解螺旋管的直径为1.9cm；第二混合泵的泵头直径为10cm。导流柱为圆柱，其直径为1mm。其余皆相同。
然后将其中和后的中和反应液进行琼脂糖核酸电泳，测试结果如图11中所示，发现实施例4中裂解上清中宿主DNA和RNA均高于实施例1裂解上清，证明转速偏高时，杂质会较多。
实施例5
与实施例1不同的是，菌体重悬液为2.5L，第一混合泵的转速为100rpm，第二混合泵的转速为50rpm，裂解螺旋管的直径为1.9cm；第二混合泵的泵头直径为10cm。导流柱为圆柱，其直径为1mm。其余皆相同。
然后将中和后得到中和反应液10L，离心得到上清液共7.8L，测得上清液质粒浓度为96mg/L(HPLC测定)，裂解收率55.0％，电泳测试结果如图11中所示，从图11可以看出第一混合泵和第二混合泵转速较低时会导致混合和中和不充分，质粒DNA收率较实施例1低。
实施例6
与实施例1不同的是，本实施例中导流柱2042为变截面设计，目的是为了进一步降低剪切了对中和过程的影响，通过流体运动分析，如图16中箭头所示，单根导流柱转动中，流体相对主体的流速分布情况；即从中间层向两边减小，原因分析为流体上下两侧分别受到泵壳即泵座的粘滞阻力，速度呈梯度分布，由此为了保持单根导流柱对流体中遗传物质产生的剪切力较为一致，故将其设计为变截面结构。具体地，以实施例1中圆柱体为例，单根导流柱的截面从泵壳一侧至泵座一侧依次为先增加后减小，形成“纺锤形”结构，具体参阅图16。上述设计，虽然导流柱2042中心处相对速度较大，冲击较强，但是结合较大曲率半径及受力面积，可以有效减少对质粒的剪切作用，一定程度上提升了质粒产率。
对比例1
与实施例1不同的是，对比例1的中和步骤不使用泵，在气泡混合器中进行，具体步骤如下：
(1)将含有质粒A的大肠杆菌高密度发酵菌液，分光光度计测定OD600为78.9。取该发酵液23.5L离心，收获菌体3603g，湿重为15.3％。将3603g的细胞重悬于由25mM Tris-HCl和10mM EDTA-2Na构成的pH为8.0重悬液(溶液I)中，得重悬菌液，体积为25.2L(菌体与溶液I的质量体积比为1:7)。
(2)将重悬菌液与以140ml/min的速度泵送至“Y”形连接器的一侧，同时将由0.2MNaOH和1％SDS构成的裂解溶液(溶液II)以140ml/min的速度泵送至“Y”形连接器的另一侧。将“Y”形连接器接入裂解混合泵(第一混合组件)，调节转速为200rpm，开始裂解混合，得到菌体混合液。其中，溶液I与溶液II的体积比为1:1。
(3)菌体混合液从裂解混合泵中泵出后，进入裂解螺旋管，裂解螺旋管内径为1.9cm，长度为5m，在裂解螺旋管中裂解时间为5min，得到裂解液。
(4)裂解后的裂解液进入另一“Y”形连接器，连接器另一端由1M KAc和7M NH4Ac组成的溶液III(预冷2-8℃)以280ml/min的速度进入，通过“Y”形连接器进入气泡混合器，气泡混合器设置压缩空气流速为1.2L/min。裂解液和溶液III的体积比为1:1。
(5)中和完成后，收集中和反应液，以8000g离心力离心20min，收集到对比上清液，可进行下一步纯化。
通过酶标仪方法检测，结果表明，重悬菌液测得质粒浓度为570mg/L(质粒小提试剂盒提取计算得出)，质粒总量为14.36g。
中和后得到中和反应液101L，离心得到上清液共79.3L，测得对比上清液质粒浓度为116.3mg/L(HPLC测定)，裂解收率64.2％。电泳结果如图12所示，从图12可以看出本对比例中和过程使用气泡发生器的方法得到质粒DNA与实施例1的方法得到的质粒DNA相比，质粒浓度相当，但是其宿主RNA较多，说明本申请的制备方法更优，并且更容易放大，操作简单。
对比例2
与实施例1不同的是，对比例2中第二混合泵所用离心泵头叶轮如图13所示，其余皆相同。
通过酶标仪检测中和后得到中和反应液80L，离心得到上清液共66L，测得上清液质粒浓度为106.6mg/L(HPLC测定)，裂解收率64.5％。裂解收率低于实施例1。
对比例3
与实施例1不同的是，对比例3中第二混合泵所用离心泵头叶轮如图14所示。其余设置均相同。
与实施例1结果相比，测试电泳图如图15所示，从图中可以看出，该对比例中泵头裂解上清中宿主DNA和RNA含量均较多，不利于质粒纯化。
基于上述实施例结果可知，本发明的提取装置，最终产品裂解时混合充分且混合时间较短，中和时条件温和均一，裂解中和后，宿主DNA和RNA残留均低于起泡混合器的效果，产品质量较好，且速度适中时提取的质粒DNA杂质少，收率高。
本发明在质粒生产过程中的碱裂解和中和环节，开拓性地采用混合组件串联的形式，并结合输送泵使得裂解和中和过程在密闭的环境中，降低污染环境的几率，使用后方便进行CIP和SIP，且实现了连续的加工，提升了生产效率，同时也方便生产规模的放大，相较于目前主流的气泡混合器Airmix的生产体系来讲，比较容易放大，不需要根据规模定制不同大小的气泡混合器，缩短了放大条件摸索的时间，提高工作效率；设备简单，操作方便，且成本低廉，不需要专业的定制化、价格高昂的设备，易于在生产中放大，生产成本低；使用的两台混合组件既可以使菌液和裂解液的充分混合又可以保证和中和液(溶液Ⅲ)温和地混合中和，避免使用复杂的低剪切中和设备，裂解时混合充分且混合时间较短，中和时条件温和均一，裂解中和后，宿主DNA和RNA残留均低于起泡混合器的效果，产品质量好；同时优化了泵腔的大小，使得裂解中和的时间和剪切力适合产品生产，裂解后的质粒超螺旋比例较高，宿主DNA、RNA残留较少[；此外，不需要使用复杂的多级的膜过滤系统，裂解后也不需要过夜沉淀等步骤，设备可直接用CIP清洗，符合药物生产的生产规范，同时节省了工艺时间，降低成本。
进一步，通过优化混合泵腔的大小，结合调整泵腔和流速的比例，使得裂解中和的时间和剪切力适合产品生产，同时也方便生产规模的放大；对混合泵头的性状尺寸进行优化，使用3D打印技术，对泵头进行设计和定制在保证混合效果的前提下，降低了剪切力，防止宿主DNA污染产品，使得裂解中和可以自动化进行。
并且制备过程中不添加高风险的动物来源成分，如RNase、溶菌酶、蛋白酶K等，生产工艺不使用有毒害的有机溶剂如异丙醇、酚、无水乙醇和其他诱变剂等，所用的试剂可以使用一般的试剂或满足药用级别，不使用酸液中和，对厂房设备要求较低，适合大规模生产。
以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，包括第一混合组件和第二混合组件；所述第一混合组件与所述第二混合组件通过裂解螺旋管相连接；所述裂解螺旋管与所述第二混合组件的连接管路上设有至少一个进液口；
重悬菌液流入所述第一混合组件混合后，通过所述裂解螺旋管裂解得到裂解液，再通入所述第二混合组件与溶液Ⅲ中和得到中和反应液，所述裂解液通过所述进液口进入所述第二混合组件。
2.根据权利要求1所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述第一混合组件和第二混合组件的结构均为搅拌式、乳化式、离心式中的一种，优选地，所述第一混合组件和第二混合组件均为混合泵或搅拌器，所述第一混合组件和第二混合组件可分别优选为第一混合泵和第二混合泵。
3.根据权利要求2所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述第一混合泵和第二混合泵的叶轮均包括后盖板；所述后盖板上均匀分布有多个导流柱；所述导流柱上至少沿叶轮旋转方向的外侧面呈弧面设置。
4.根据权利要求3所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述导流柱为圆柱、圆台或扇形柱中一种或多种的组合。
5.根据权利要求3所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述导流柱的横截面宽度最大值为0.5mm-40mm，优选为2mm-10mm；所述导流柱优选为圆柱，或所述导流柱的截面积为中间最大，且导流柱的截面积由中间至两端逐渐变小。
6.根据权利要求3所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述裂解螺旋管内径为0.5cm-15cm，优选为0.5cm-9cm；所述第一混合泵和第二混合泵的泵头直径均为2cm-100cm，优选为4cm-30cm；所述第一混合泵和第二混合泵的泵腔体积与单个混合泵额定每分钟进料体积的比值范围均为1:6-1:1，优选的比例为1:6-1:3；或所述第一混合泵和第二混合泵的泵腔体积设计均为料液流经泵腔内10s-60s的体积，优选为料液流经泵腔内10s-20s的体积。
7.根据权利要求3中所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述第一混合泵和第二混合泵的进液端均与出液端同轴设置；所述进液端位于泵壳的中心处，所述出液端位于泵座的中心处。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述装置还包括过滤组件，所述第二混合组件的出液端连接至所述过滤组件的进液端，所述中和反应液通过所述过滤组件过滤。
9.根据权利要求8所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述重悬菌液包括溶液Ⅰ和含有质粒DNA的菌体，所述重悬菌液通过第一输送泵混合输送至第一混合组件，与通过第二输送泵输送至第一混合组件的溶液Ⅱ混合后通入裂解螺旋管裂解。
10.根据权利要求8所述的用于提取细菌中质粒DNA的装置，其特征在于，所述过滤组件结构为筛网式、深层过滤式、离心过滤式中的一种或多种组合；优选地，所述过滤组件结构为筛网式或深层过滤式结构；过滤孔径为0.2μm-800μm；过滤材质为纤维素、硅藻土、活性炭、聚丙烯纤维或硅胶。
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