CN116855359A - 一种质粒碱裂解的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵工程领域，特别是涉及一种质粒碱裂解的系统和方法。本发明的质粒碱裂解的系统包含第一混合模块、中转模块和第二混合模块，第一混合模块、中转模块、第二混合模块依次连接；所述第一混合模块包含依次连接的用于运送裂解液B的第一泵、用于运送含细菌的裂解液A的第二泵和第一静态混合器；所述第二混合模块包含用于运送裂解液C的第三泵和第二静态混合器；所述中转模块包含中转瓶或盘管；和/或，所述中转瓶上设有进液口和出液口，所述进液口设于中转瓶的底部，所述出液口设于中转瓶的顶部。本发明降低碱溶液使用浓度，提高有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，提高裂解液中质粒超螺旋比例；所用中转瓶结构简单，易于维护。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，特别是涉及一种质粒碱裂解的系统和方法。
背景技术
在质粒生产过程中，碱裂解是为了裂解大肠杆菌细胞，释放质粒，从而为下游纯化提供内含质粒的细胞裂解液。质粒粗纯液的超螺旋比例和裂解效率对整个工艺中质粒的回收率有很大的影响，其中碱浓度、菌泥重悬比和具体工艺流程是关键调控点。
行业内传统碱裂解过程使用，裂解液的具体成分如下表所示：
| 溶液名称 | 溶液成份 |
| 裂解液1 | 50mM Tris,10mM EDTA,pH 8.0 |
| 裂解液2 | 200mM NaOH,1％SDS |
| 裂解液3 | 3M KAc pH5.5 |
基于上表所示的裂解液，传统工艺按照菌泥：裂解液1＝1:10重悬，且裂解液1：裂解液2：裂解液3＝1：1：1(体积比)进行处理，裂解方式为搅拌式裂解。虽然上述处理工艺可以小规模操作且简单便捷，但是放大规模后，传统的搅拌式工艺可操作性差，可控性差，并且对于一些大型质粒(＞10000bp)而言，上述裂解工艺容易造成开环质粒比例较高的问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种质粒碱裂解的系统和方法，用于解决现有技术中裂解工艺容易造成开环质粒比例较高的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种质粒碱裂解的系统，所述系统包含第一混合模块、中转模块和第二混合模块，第一混合模块、中转模块、第二混合模块依次连接；所述第一混合模块包含依次连接的用于运送裂解液B的第一泵、用于运送含细菌的裂解液A的第二泵和第一静态混合器；所述第二混合模块包含依次连接的用于运送裂解液C的第三泵和第二静态混合器所述中转模块包含中转瓶或盘管；和/或，所述中转瓶上设有进液口和出液口，所述进液口设于中转瓶的底部，所述出液口设于中转瓶的顶部。
优选地，所述用于质粒碱裂解的系统还包含过滤浓缩模块，所述过滤浓缩模块与所述第二混合模块连接。
本发明还提供一种质粒碱裂解的方法，所述方法为：使用前述质粒碱裂解的系统裂解含有质粒的细菌，所述方法包括如下步骤：
S1，将所述含细菌的裂解液A与裂解液B于第一静态混合器中混合；
S2，S1中混合液进入所述中转模块以延长S1中含细菌的裂解液A与裂解液B的反应时长；
S3，将S2中混合液与裂解液C在第二静态混合器中混合；
S4，S3中混合液进入所述过滤浓缩模块浓缩传化，获得质粒。
如上所述，本发明的一种质粒碱裂解的系统和方法，具有以下有益效果：
1)将传统搅拌式工艺更换为连续流裂解工艺，降低碱溶液使用浓度，提高有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，提高裂解液中质粒超螺旋比例；
2)所用中转瓶结构简单，易于维护，并且能够在不改变质粒超螺旋比例的基础上，提高质粒收率。
附图说明
图1显示为本发明的裂解工艺中NaOH浓度的筛选电泳图。
图2显示为本发明的裂解工艺中NaOH浓度的筛选SEC数据图。
图3显示为本发明的裂解工艺中含细菌的裂解液A中细菌比例的筛选电泳图。
图4显示为本发明的裂解工艺中含细菌的裂解液A中细菌比例的筛选SEC数据图。
图5显示为本发明的连续流裂解工艺质粒生产全流程图；裂解液1菌泥重悬液即含菌裂解液A，裂解液2即裂解液B，裂解液3即裂解液C，泵1即第一泵，泵2即第二泵，泵3即第三泵，静态混合器1即第一静态混合器，静态混合器2、3即第二静态混合器。
图6显示为本发明的不含中转模块的质粒碱裂解的系统流程图；裂解液1菌泥重悬液即含菌裂解液A，裂解液2即裂解液B，裂解液3即裂解液C，泵1即第一泵，泵2即第二泵，泵3即第三泵，静态混合器1即第一静态混合器，静态混合器2、3即第二静态混合器。
图7显示为本发明的含中转瓶的质粒碱裂解的系统流程图；裂解液1菌泥重悬液即含菌裂解液A，裂解液2即裂解液B，裂解液3即裂解液C，泵1即第一泵，泵2即第二泵，泵3即第三泵，静态混合器1即第一静态混合器，静态混合器2、3即第二静态混合器。
图8显示为本发明的含中转盘管的质粒碱裂解的系统流程图；裂解液1菌泥重悬液即含菌裂解液A，裂解液2即裂解液B，裂解液3即裂解液C，泵1即第一泵，泵2即第二泵，泵3即第三泵，静态混合器1即第一静态混合器，静态混合器2、3即第二静态混合器。
图9显示为本发明的中转瓶的结构示意图。
图10显示为本发明的裂解工艺中中转模块的筛选SEC数据图。
图11显示为本发明的静态混合器的结构示意图。
具体实施方式
本发明提供一种质粒碱裂解的系统，所述系统包含第一混合模块、中转模块和第二混合模块，第一混合模块、中转模块、第二混合模块依次连接。
在一些具体实施方式中，所述第一混合模块包含依次连接的用于运送裂解液B的第一泵、用于运送含细菌的裂解液A的第二泵和第一静态混合器。所述裂解液B和含细菌的裂解液A于所述第一静态混合器中混合。所述第一静态混合器设有1个或多个。优选地，所述第一静态混合器为1个。
在一些具体实施方式中，所述静态混合器为管道混合器。更具体地，所述管道混合器为市售管道混合器，如选自上海琅创机械科技有限公司的不锈钢管道静态混合器(SK-20/40)。
在一些具体实施方式中，所述中转模块包含中转瓶或盘管(如兰格；LongerPump#36硅胶管；05.50.001)。更具体地，所述中转瓶上设有进液口和出液口，所述进液口设于中转瓶的底部，所述出液口设于中转瓶的顶部。所述进液口或出液口为1个或多个。优选地，所述进液口或出液口为1个。
在一些具体实施方式中，所述第二混合模块包含依次连接的用于运送裂解液C的第三泵和第二静态混合器。所述裂解液C与所述中转模块中流出的液体于第二静态混合器中混合。所述第二静态混合器为1个或多个。优选地，所述第二静态混合器为2个，所述第二静态混合器之间相互连接。
在一些具体实施方式中，所述第一混合模块中第一静态混合器与中转模块连接；中转模块与第二混合模块的第二混合器连接。更具体地，所述第一混合模块中第一静态混合器与中转模块中中转瓶的进液口连接；所述中转模块中中转瓶的出液口与所述第二混合模块中第二静态混合器连接。
在一些具体实施方式中，所述第一静态混合器或所述第二静态混合器长向垂直于水平面，所述第一静态混合器或所述第二静态混合器的近地端为液体流入端，远地端为液体流出端。
在一些具体实施方式中，所述质粒碱裂解的系统还包含过滤浓缩模块。其中，所述第二混合模块与所述过滤浓缩模块依次连接。
在一些具体实施方式中，所述过滤浓缩模块包含滤袋、滤器和超滤浓缩装置。其中，所述滤袋、所述滤器和所述超滤浓缩装置依次连接。
进一步地，所述第二混合模块中第二静态混合器与所述过滤浓缩模块中滤袋连接。
在一些具体实施方式中，所述滤袋的过滤孔径为80-120μm。更具体地，所述滤袋的过滤孔径为80-85μm、85-90μm、90-95μm、95-100μm、100-105μm、105-110μm、110-115μm或115-120μm。优选地，所述滤袋的过滤孔径为95-105μm。
在一些具体实施方式中，所述滤器的过滤孔径为0.1-2μm。更具体地，所述滤器的过滤孔径为0.1-0.5μm、0.5-0.7μm、0.7-0.9μm、0.9-1μm、1-1.1μm、1.1-1.3μm、1.3-1.5μm、1.5-1.7μm或1.7-2μm。优选地，所述滤器的过滤孔径为0.9-1.1μm。
在一些具体实施方式中，所述超滤浓缩装置滤出的物质大小为500KD以下。更具体地，所述超滤浓缩装置滤出的物质大小为450KD、400KD、350KD、330KD、310KD、300KD、290KD、270KD或250KD以下。优选地，所述超滤浓缩装置滤出的物质大小为300KD以下。
在一些具体实施方式中，所述滤袋选自(科百特；EBF系列针刺毡经济型滤袋(100μm)；货号：EBF-PP100H-1TRE-P)；所述滤器选自(科百特；1.0μm STBT2-囊式滤器；STBT2-PFSA2-0100P)(科百特；囊式过滤器(Capsule Filter)-0.5μm；92WM-PFSA2-0050P)；所述超滤浓缩装置选自中空纤维膜，(科百特；300KD中空纤维膜；HFEPI03000530P)。
在一些具体实施方式中，所述质粒碱裂解的系统还包含硫酸铵沉淀装置、离心收集装置、分子筛层析装置、亲和层析装置、离子层析装置、超滤浓缩换液装置、除菌过滤装置或质粒分装装置中一种或多种，所述硫酸铵沉淀装置、离心收集装置、分子筛层析装置、亲和层析装置、离子层析装置、超滤浓缩换液装置、除菌过滤装置和质粒分装装置依次连接。
本发明还提供一种质粒碱裂解的方法，所述方法为：使用前述质粒碱裂解的系统裂解含有质粒的细菌。
在一些具体实施方式中，前述方法还包含如下步骤：
S1，所述含细菌的裂解液A与裂解液B于第一静态混合器中混合；
S2，S1中混合液进入所述中转模块延长S1中含细菌的裂解液A与裂解液B的反应时长；
S3，S2中混合液于裂解液C在第二静态混合器中混合；
S4，S3中混合液进入所述过滤浓缩模块浓缩传化，获得质粒。
在一些具体实施方式中，所述含细菌的裂解液A包含细菌、Tris、EDTA和水。以裂解液A的总体积为基准，所述细菌占裂解液A总体积的2-8％。更具体地，所述细菌占裂解液A总体积的2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8％；优选地，所述细菌占裂解液A总体积的4-7％。所述含细菌的裂解液A中Tris的浓度为40-60mM；更具体地，所述含细菌的裂解液A中Tris的浓度为40-45mM、45-50mM、50-55mM或55-60mM；优选地，所述含细菌的裂解液A中Tris的浓度为45-55mM。所述含细菌的裂解液A中EDTA的浓度为5-15mM。更具体地，所述含细菌的裂解液A中EDTA的浓度为5-8mM、8-10mM、10-12mM或12-15mM；优选地，所述含细菌的裂解液A中EDTA的浓度为8-12mM。所述含细菌的裂解液A的pH为7-9。更具体地，所述含细菌的裂解液A的pH为7-7.5、7.5-8、8-8.5或8.5-9。优选地，所述细菌的裂解液A的pH为7.5-8.5。
在一些具体实施方式中，所述裂解液B包含碱溶液和表面活性剂。所述碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液；优选地，所述碱溶液为氢氧化钠溶液。所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠、甘胆酸钠、苯扎氯铵、苯扎溴铵、椰油基葡糖苷、月桂基葡糖苷或鲸蜡硬脂基葡糖苷。优选地，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。以裂解液B的总质量为基准，所述表面活性剂占裂解液B总质量的0.5-2％。更具体地，所述表面活性剂占裂解液B总质量的0.5-0.8％、0.8-1％、1-1.2％、1.2-1.5％、1.5-17％或1.7-2％。优选地，所述表面活性剂占裂解液B总质量的0.8-1.2％。
在一些具体实施方式中，所述裂解液B中氢氧化钠溶液的浓度为60-160mM。更具体地，所述裂解液B中氢氧化钠溶液的浓度为60-80mM、80-100mM、100-120mM、120-140mM、140-150mM或150-160mM。优选地，所述裂解液B中氢氧化钠溶液的浓度为80-150mM。
在一些具体实施方式中，所述裂解液C包含含醋酸根离子的溶液。更具体地，所述含醋酸根离子的溶液选自醋酸钠溶液或醋酸钾溶液。优选地，所述含醋酸根离子的溶液为醋酸甲溶液。所述裂解液C中醋酸钾溶液的浓度为1-4M。更具体地，所述裂解液C中醋酸钾溶液的浓度为1-2M、2-2.5M、2.5-3M、3-3.5M或3.5-4M；优选地，所述裂解液C中醋酸钾溶液的浓度为2.5-3.5M。所述裂解液C的pH为4-7。更具体地，所述裂解液C的pH为4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5或6.5-7；优选地，所述裂解液C的pH为5-6。
在一些具体实施方式中，所述方法还包含如下特征中的一种或多种：
1)所述裂解液B和所述含细菌的裂解液A混合的体积比例为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)；优选地，所述裂解液B和含细菌的裂解液A混合体积比例为1：1；
2)所述裂解液C与所述中转模块中流出的液体混合的体积比例为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)；优选地，所述裂解液C与所述中转模块中流出的液体混合的体积比例为1：1；
3)所述裂解液B和所述含细菌的裂解液A混合液注满中转模块的时间为2-8min；具体地，所述裂解液B和所述含细菌的裂解液A混合液注满中转模块的时间为2-4min、4-6min或6-8min；优选地，所述裂解液B和所述含细菌的裂解液A混合液注满中转模块的时间为4-6min；所述注满中转模块的时间为优化过的菌液与碱接触的裂解时间。
4)所述超滤浓缩装置将经过所述滤器的滤液的体积浓缩为原来的1/10-1/20；优选地，所述超滤浓缩装置将经过所述滤器的滤液的体积浓缩为流入超滤浓缩装置前的1/14-1/16；
5)所述裂解液B和所述含细菌的裂解液A混合液，自所述第一静态混合器的近地端流入第一静态混合器，自所述第一静态混合器的远地端流出第一静态混合器；或所述裂解液C与所述中转模块中流出的混合液体，自所述第二静态混合器的近地端流入第二静态混合器，自所述第二静态混合器的远地端流出第二静态混合器。
在一些具体实施方式，所述方法还包含如下步骤中的一种或多种：硫酸铵沉淀、离心收集、分子筛层析、亲和层析、离子层析、超滤浓缩换液、除菌过滤和质粒分装。更具体地，所述硫酸铵沉淀中硫酸铵的浓度为1-3M，沉淀时间为15-25min；所述离心收集中离心力的大小为3000g-4000g，离心时间为5-10min；所述分子筛层析中填料为Sepharose 6FastFlow(Cytiva；17-0159-01)，层析柱为手动层析柱S25/60(单层)(常州天地人和生物科技有限公司；S25/60)；所述亲和层析中填料为PlasmidSelectXtra(Cytiva；28-4024-03)，层析柱为手动层析柱(赛分科技；202000-1525-AA)；所述离子层析中填料为Source 30Q(Cytiva；17-1275-03)，层析柱为手动层析柱(赛分科技；202000-1525-AA)。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1裂解液B中NaOH浓度的筛选
如图5的系统示意图，按照细菌占裂解液A总体积10％的比例，配置含细菌的裂解液A。按照体积：含细菌的裂解液A:裂解液B:裂解液C＝1:1:1配制各裂解液。含细菌的裂解液A于5L量杯中，放入硅胶管，用硅胶管连接蠕动泵1；裂解液B置于5L量杯中，放入硅胶管，用硅胶管连接蠕动泵2；裂解液C置于5L量杯中，放入硅胶管，用硅胶管连接蠕动泵3。控制蠕动泵1和蠕动泵2泵速一致(95ml/min)，将放置于含细菌的裂解液A的硅胶管和放置于裂解液B的硅胶管用“Y”形三通连接随后由下自上进入静态混合器，随后混合液进入中转瓶保留4-6min，待混合液充满中转瓶从顶部出液管流出时，打开蠕动泵3，控制蠕动泵3的流速与蠕动泵1、蠕动泵2相同(95ml/min)，将裂解液C和混合液的硅胶管用“Y”形三通连接随后由下自上进入静态混合器，完成中和。中和液使用硅胶管泵入100μm滤袋，滤过液收集至量杯中，随后分别用1μm滤器过滤澄清，300KD中空纤维膜规格进行浓缩约15倍(TMP≤5psi)，添加硫酸铵至终浓度为2M，静置沉淀20min，3274g离心10min收集上清，随后0.5μm滤器过滤澄清，取40ml进行分子筛层析测试(200ml Cytiva 6FF，S25/60层析柱，0.2CV)，比较质粒的产量(质粒mg/湿菌g)，开环情况(凝胶电泳纯度)，选择合适的NaOH浓度。注：蠕动泵1/2/3均为型号BT300-2J的兰格蠕动泵。实验过程如表1所示：
表1裂解工艺中NaOH浓度的筛选
裂解工艺裂解液B即裂解液二中NaOH浓度100mM、150mM、200mM数据结果如图1，根据图1的统计结果得到表2：
表2裂解工艺中NaOH浓度的筛选实验数据
根据表2做出图2，由表2和图2可知，降低NaOH浓度可明显减少开环DNA比例，裂解液二碱浓度降低为100mM、150mM NaOH时，超螺旋质粒电泳纯度明显高于200mM NaOH，纯度可提升约13％。
随着碱液浓度降低后，虽然开环质粒比例会下降，但菌泥质粒得率也会降低，存在碱裂解不充分现象。因此，选择100mM、150mM NaOH作为初始条件，可进一步优化菌泥重悬比例，提高裂解效率。
实施例2含细菌的裂解液A中细菌比例的筛选
菌体在不同的重悬比下裂解效率会有所不同，从而影响质粒的收率。为了提高质粒收率，在100mM、150mM NaOH的裂解条件下分别设置含细菌的裂解液A中细菌比例为10％，7.2％和5％，筛选质粒收率和超螺旋比例都相对较高的实验条件作为碱裂解工艺参数。实验流程如实施例1。
实验过程如表3：
表3含细菌的裂解液A中细菌比例的筛选
在100mM、150mM NaOH的裂解条件下分别设置含细菌的裂解液A即裂解液一中细菌比例为10％，7.2％和5％，结果如图3，根据图3的统计结果得出表4:
表4菌泥重悬比研究实验数据
根据表4做出图4，由表4和图4可知，裂解液B中NaOH浓度为100mM与150mM时，均表现出随着菌泥重悬比例提高，质粒对菌泥的得率也随之提高，其中，5％得率＞7.2％得率＞10％得率。并且在相同菌泥重悬比例下，150mM NaOH浓度质粒得率＞100mM NaOH浓度质粒得率，5％重悬比例下，两种碱浓度质粒得率无明显差异。由以上实验，最终碱裂解工艺选择裂解液B中NaOH浓度为150mM，含细菌的裂解液A中细菌比例为5％，含细菌的裂解液A:裂解液B:裂解液C混合时比例选择1:1:1。
实施例3不同裂解中转方式的筛选
在连续流裂解中裂解物中转容器的使用可以控制碱裂解时间，方便条件探究以获得产量和超螺旋旋比例较高的生产工艺，其中操作过程如图6-图8所示，其中图7中的中转瓶具体结构如图9所示，图6-图8中静态混合器的具体结构如图11所示。其他条件参照实施例1。
实验过程如表5：
表5中转筛选
由图10可知，添加中转瓶和中转导管的连续流裂解，延长了菌液与碱接触的裂解时间，单位菌泥产量较不添加中转容器的实验组有明显提升，质粒超螺旋比例并无明显差别。最终，综合质粒收率和质粒超螺旋产量，选择中转瓶的方案作为质粒连续流裂解的锁定工艺。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (12)
1.一种质粒碱裂解的系统，其特征在于，所述系统包含第一混合模块、中转模块和第二混合模块，第一混合模块、中转模块、第二混合模块依次连接；
所述第一混合模块包含依次连接的用于运送裂解液B的第一泵、用于运送含细菌的裂解液A的第二泵和第一静态混合器；
所述第二混合模块包含依次连接的用于运送裂解液C的第三泵和第二静态混合器；所述中转模块包含中转瓶或盘管；和/或，所述中转瓶上设有进液口和出液口，所述进液口设于中转瓶的底部，所述出液口设于中转瓶的顶部。
2.根据权利要求1所述的质粒碱裂解的系统，其特征在于，所述质粒碱裂解的系统还包含过滤浓缩模块，所述过滤浓缩模块与所述第二混合模块连接。
3.根据权利要求2所述的质粒碱裂解的系统，其特征在于，所述过滤浓缩模块包含滤袋、滤器和超滤浓缩装置，所述滤袋、所述滤器和所述超滤浓缩装置依次连接。
4.根据权利要求3所述的质粒碱裂解的系统，其特征在于，还包括如下特征中的任一项或多项：
1)所述滤袋的过滤孔径为80-120μm；
2)所述滤器的过滤孔径为0.1-2μm；
3)所述超滤浓缩装置滤出的物质大小为500KD以下。
5.根据权利要求1所述的质粒碱裂解的系统，其特征在于，所述第一静态混合器或所述第二静态混合器的长向垂直于水平面，所述第一静态混合器或所述第二静态混合器的近地端为液体流入端，远地端为液体流出端。
6.权利要求1-5任一所述质粒碱裂解的系统在质粒裂解中的用途。
7.一种质粒碱裂解的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1-5任一所述的质粒碱裂解的系统裂解含有质粒的细菌，所述方法包括如下步骤：
S1，将所述含细菌的裂解液A与裂解液B于第一静态混合器中混合；
S2，S1中混合液进入所述中转模块以延长S1中含细菌的裂解液A与裂解液B的反应时长；
S3，将S2中混合液与裂解液C在第二静态混合器中混合；
S4，S3中混合液进入所述过滤浓缩模块浓缩传化，获得质粒。
8.根据权利要求7所述的质粒碱裂解的方法，其特征在于，所述含细菌的裂解液A包含细菌、Tris、EDTA和水；和/或，以裂解液A的总体积为基准，所述细菌占裂解液A总体积的2-8％。
9.根据权利要求8所述的质粒碱裂解的方法，其特征在于，所述裂解液B包含氢氧化钠溶液和十二烷基硫酸钠；和/或，所述裂解液B中氢氧化钠溶液的浓度为60-160mM；和/或，所述十二烷基硫酸钠占裂解液B总质量的0.8-1.2％。
10.根据权利要求7所述的质粒碱裂解的方法，其特征在于，所述裂解液C为含醋酸根离子的溶液。
11.根据权利要求10所述的质粒碱裂解的方法，其特征在于，所述含醋酸根离子的溶液为醋酸钾溶液；优选的，所述醋酸钾溶液的浓度为1-4M。
12.根据权利要求7所述的质粒碱裂解的方法，其特征在于，所述方法还包含如下特征中的一种或多种：
1)所述裂解液B和所述含细菌的裂解液A混合的体积比例为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)；
2)所述裂解液C所述中转模块流出的液体混合的体积比例为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)；
3)所述裂解液B和所述含细菌的裂解液A混合液注满中转模块的时间为2-8min；
4)所述超滤浓缩装置将经过所述滤器的滤液的体积浓缩为流入超滤浓缩装置前的1/10-1/20
5)所述裂解液B和所述含细菌的裂解液A混合液自所述第一静态混合器的近地端流入第一静态混合器，自所述第一静态混合器的远地端流出第一静态混合器；或，所述裂解液C和所述中转模块中流出的混合液体，自所述第二静态混合器的近地端流入第二静态混合器，自所述第二静态混合器的远地端流出第二静态混合器。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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