ES2298239T3 - Purificacion de una formacion de triple helice con oligonucleotido inmovilizado. - Google Patents
Purificacion de una formacion de triple helice con oligonucleotido inmovilizado. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2298239T3 ES2298239T3 ES01937755T ES01937755T ES2298239T3 ES 2298239 T3 ES2298239 T3 ES 2298239T3 ES 01937755 T ES01937755 T ES 01937755T ES 01937755 T ES01937755 T ES 01937755T ES 2298239 T3 ES2298239 T3 ES 2298239T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- dna
- oligonucleotide
- sequence
- stranded dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 186
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 41
- 241000520223 Helice Species 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 70
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 142
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 13
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 7
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 claims description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 31
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 12
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- -1 acids nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IWYGVDBZCSCJGT-UHFFFAOYSA-N 1-(2,5-dimethoxy-4-methylphenyl)-n-methylpropan-2-amine Chemical compound CNC(C)CC1=CC(OC)=C(C)C=C1OC IWYGVDBZCSCJGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000447437 Gerreidae Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 101000742579 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor B Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 2
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M sodium chlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)=O YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N (3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolane-2,4-diol Chemical compound CO[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 1
- VJUBYQUPDRGGMP-UHFFFAOYSA-N (morpholin-4-ylamino)phosphonous acid Chemical compound OP(O)NN1CCOCC1 VJUBYQUPDRGGMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2,3-dimethylquinoxaline Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N=C(C)C(C)=NC2=C1 CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 208000011616 HELIX syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Un método para purificar ADN bicatenario a partir de una disolución que contiene el ADN bicatenario mezclado con otros componentes, que comprende pasar la disolución a través de un soporte que comprende un oligonucleótido acoplado covalentemente capaz de formar una triple hélice con el ADN bicatenario por hibridación con una secuencia específica presente en el ADN bicatenario sin formación de ninguna tríada no canónica, en el que el oligonucleótido acoplado covalentemente comprende la secuencia TCTTTTTTTCCT (SEQ ID NO:28) o TTCTTTTTTTTCTT (SEQ ID NO:30).
Description
Purificación de una formación de triple hélice
con oligonucleótido inmovilizado.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
prioridad de la Solicitud de EE.UU. S.N. 09/580.923, presentada el
26 de mayo de 2000, que es una solicitud de continuación en parte de
la Solicitud de EE.UU. S.N. 08/860.038, presentada el 9 de junio de
1997, que es la etapa nacional de EE.UU. de la solicitud de PCT
FR95/01468, presentada el 8 de noviembre de 1995.
La presente invención se refiere a un nuevo
método para la purificación de ADN. El método según la invención
permite purificar rápidamente ADN bicatenario farmacológicamente
utilizable. Más especialmente, el método de purificación según la
invención implica una hibridación específica entre una secuencia del
ADN y un oligonu-
cleótido.
cleótido.
Las técnicas de terapia génica y celular están
experimentando actualmente un desarrollo notable. Sin embargo,
estas técnicas conllevan la posibilidad de producir grandes
cantidades de ADN de pureza farmacéutica. En efecto, en estas
nuevas terapias, el medicamento a menudo consiste en el propio ADN,
y es esencial ser capaz de fabricarlo en cantidades adecuadas,
aislarlo y purificarlo de una manera adecuada para el uso
terapéutico en el hombre.
En los últimos años, se ha demostrado la
viabilidad de la inyección de ADN plásmido para terapia génica o
vacunación, mediante numerosos informes que demuestran que los
vectores de expresión del ADN pueden emprenderse por diversos tipos
celulares y los genes codificados por estos plásmidos se pueden
expresar posteriormente (Ledley, 1995 Hum. Gene Ther. 6, 1129).
Los genes de interés para las aplicaciones de
terapia génica o vacunación pueden incluir, por ejemplo, el gen
supresor de tumores, genes suicidas, o secuencias
anti-sentido. También pueden codificar proteínas
tales como la alfa-fetoproteína AFP (Morinaga,
1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4604), enzimas, hormonas,
citocinas, factores de crecimiento tales como FGF (Jouanneau et
al ., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2893) o VEGFB
(Olofsson B al., 1996, Proceedings 93, 576), factores de coagulación
tales como Factor VIII carente del dominio B (Truett et al
., 1985, DNA 4, 333), apolipoproteínas, neurotransmisores,
factores neurotróficos, inmunoglobulina natural o quimérica.
También se utilizan genes indicadores tales como lacZ que
codifica la \beta-galactosidasa de la
Escherichia coli.
Los principales retos para usar ADN plásmido
como un vector de administración de genes en seres humanos son i)
la fabricación y ii) la pureza de este fármaco. Recientemente se han
desarrollado las tecnologías para la producción de vectores
plásmidos con alto número de copias en anfitriones Escherichia
coli. Los plásmidos utilizados actualmente son o plásmidos
derivados de ColE1 tales como pBR322, pUC o pBluescript (Lahijani
et al ., 1996, Hum. Gene Ther., 7, 1971 y WINNACKER
E-L: "FROM GENES TO CLONES" FROM GENES TO
CLONES. INTRODUCTION TO GENE TECHNOLOGY, WEINHEIM, VCH
VERLAGSGESELLSCHAFT, DE, 1987, pages 125-132) o
plásmidos pCOR (Soubrier et al ., 1999, Gene Therapy, 6,
1482).
La segunda cuestión planteada por el uso de ADN
plásmido como un vector de terapia génica es la pureza del propio
vector plásmido. Los actuales métodos de purificación tales como
ultracentrifugación en gradientes de CsCl o cromatografía pueden
ser ineficaces para eliminar los contaminantes tales como ADN y ARN
genómicos o proteínas del anfitrión. En particular, el ADN genómico
del anfitrión cuya estructura química es muy similar a las del ADN
plásmido, es extremadamente difícil de quitar utilizando la
cromatografía clásica. En las preparaciones de plásmido obtenidas
por cromatografía clásica se encuentran concentraciones típicas de
hasta 0,5 a 1% de ADN genómico del anfitrión. Por lo tanto, para
desarrollar ADN plásmido como un vector seguro para terapia génica
humana, existe una necesidad de tecnologías de purificación que
disminuyan el contenido de ADN genómico del anfitrión a niveles
mucho más bajos, típicamente 0,1% o incluso 0,01% o menores.
La presente invención describe un nuevo método
simple y especialmente eficaz para la purificación de ADN. Hace
posible, en particular, obtener purezas especialmente altas con
altos rendimientos. El método según la invención se basa
esencialmente en una interacción específica entre una secuencia
insertada dentro del ADN que se va a purificar y un oligonucleótido
compuesto de bases naturales o modificadas.
Recientemente se ha demostrado que algunos
oligonucleótidos son capaces de interactuar específicamente en el
amplio surco de la doble hélice de ADN para formar triple hélices
localmente, conduciendo a una inhibición de la transcripción de los
genes tomados como objetivo (Hélène et Toulmé, Biochim. Biophys.
Acta 1049 (1990) 99). Estos oligonucleótidos reconocen
selectivamente la doble hélice de ADN en secuencias de
oligopurina-oligopirimidina, es decir en regiones
que poseen una secuencia de oligopurina en una cadena y una
secuencia de oligopirimidina en la cadena complementaria, y forman
una triple hélice localmente en aquel lugar. Las bases de la tercera
cadena (el oligonucleótido) forman enlaces de hidrógeno (enlaces de
Hoogsteen o de Hoogsteen inversos) con las purinas de los pares de
bases de Watson-Crick.
Un uso de este tipo de interacciones para aislar
un plásmido se ha descrito en la técnica anterior. El documento
WO9618744 (Rhone Poulenc Rorer S.A.) describe la purificación de
plásmidos vía hibridación de triple hélice con oligonucleótidos que
están dirigidos contra el origen de replicación. El documento
WO9949067 (Rhone Poulenc Rorer S.A.) describe oligonucleótidos
específicos que se unen a secuencias plásmidas en una hibridación de
triple hélice. Así, Ito et al . (PNAS 89 (1992) 495)
describen el uso de oligonucleótidos biotinilados capaces de
reconocer una secuencia particular de un plásmido y de formar una
triple hélice con la misma. Los complejos así formados son puestos
en contacto a continuación con microesferas magnéticas recubiertas
con estreptavidina. Después, la interacción entre la biotina y la
estreptavidina permite aislar al plásmido por separación magnética
de las microesferas seguido por elución. Sin embargo, este método
tiene algunos inconvenientes. En particular, se necesitan dos
interacciones específicas sucesivas, la primera entre el
oligonucleótido y el plásmido y la segunda entre el complejo
biotinilado y las microesferas de estreptavidina. Además, la
disolución final se puede contaminar con oligonucleótido
biotinilado, que no se puede utilizar en una composición
farmacéutica.
La presente invención describe un método nuevo y
mejorado de purificación de ADN que hace uso de este tipo de
interacción. Más especialmente, el método de la invención emplea
oligonucleótidos acoplados covalentemente a un soporte. Este método
es especialmente rápido, y conduce a rendimientos y grados de pureza
especialmente altos. Además, permite purificar ADN a partir de
mezclas complejas que comprenden, en particular, otros ácidos
nucleicos, proteínas, endotoxinas (tales como lipopolisacáridos),
nucleasas y similares. El soporte utilizado, además, se puede
reciclar fácilmente, y los ADNs obtenidos manifiestan mejores
propiedades de seguridad farmacéutica. Por último, este método
supone solamente una etapa, al contrario que la técnica
anterior.
Por lo tanto un primer objeto de la invención
consiste en un método para la purificación de ADN bicatenario,
según el cual una disolución que contiene el mencionado ADN mezclado
con otros componentes se pasa a través de un soporte al que está
acoplado covalentemente un oligonucleótido capaz de formar una
triple hélice por hibridación con una secuencia específica presente
en dicho ADN. La secuencia específica puede ser una secuencia
presente naturalmente en el ADN bicatenario, o una secuencia
sintética introducida artificialmente dentro de este
último.
último.
Los oligonucleótidos utilizados en la presente
invención son oligonucleótidos que hibridan directamente con el ADN
bicatenario. Estos oligonucleótidos pueden contener las bases
siguientes:
- \bullet
- timidina (T), que puede formar tripletes con dobletes A.T de ADN bicatenario (Rajagopal et al ., Biochem 28 (1989) 7859);
- \bullet
- adenina (A), que puede formar tripletes con dobletes A.T de ADN bicatenario;
- \bullet
- guanina (G), que puede formar tripletes con dobletes G.C de ADN bicatenario;
- \bullet
- citosina protonada (C+), que puede formar tripletes con dobletes G.C de ADN bicatenario (Rajagopal et al ., loc. cit.);
- \bullet
- uracilo (U), que puede formar tripletes con pares de bases A.U o A.T.
Preferiblemente, el oligonucleótido utilizado
comprende una secuencia de homopirimidina rica en citosinas y la
secuencia específica presente en el ADN es una secuencia
homopurina-homopirimidina. La presencia de
citosinas permite tener una triple hélice que es estable a pH ácido
en el que las citosinas están protonadas y se desestabiliza a pH
alcalino en el que las citosinas están neutralizadas.
Para permitir la formación de una triple hélice
por hibridación, es importante que el oligonucleótido y la
secuencia específica presente en el ADN sean complementarios. En
este sentido, para obtener los mejores rendimientos y la mejor
selectividad, en el método de la invención se utilizan un
oligonucleótido y una secuencia específica que son totalmente
complementarios. Estos pueden ser, en particular, una
oligonucleótido poli(CTT) y una secuencia específica
poli(GAA). Como ejemplo, cabe mencionar el oligonucleótido de
secuencia
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'
(GAGG(CTT)_{7}; SEQ ID NO: 1), en la que las bases
GAGG no forman una triple hélice pero permiten al oligonucleótido
estar separado del brazo de acoplamiento; la secuencia
(CTT)_{7} (SEQ ID No: 26) también cabe mencionarse. Estos
oligonucleótidos son capaces de formar una triple hélice con una
secuencia específica que contiene unidades complementarias (GAA).
La secuencia en cuestión puede ser, en particular, una región que
contiene 7, 14 ó 17 unidades GAA, como se describe en los
ejemplos.
Otra secuencia de interés específico es la
secuencia:
(SEQ. ID NO:
5).5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3'
\newpage
Esta secuencia forma una triple hélice con los
oligonucleótidos
(SEQ ID No: 6)
o5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'
(SEQ ID NO:
7).5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'
En este caso, el oligonucleótido se une en una
orientación antiparalela a la cadena de polipurina. Estas triples
hélices son estables sólo en presencia de Mg^{2+} (Vasquez et
al ., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal y
Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
Como se ha indicado anteriormente, la secuencia
específica puede ser una secuencia presente naturalmente en el ADN
bicatenario o una secuencia sintética introducida artificialmente en
este último. Es especialmente ventajoso utilizar un oligonucleótido
capaz de formar una triple hélice con una secuencia que está
presente naturalmente en el ADN bicatenario, por ejemplo, en el
origen de replicación de un plásmido o en un gen marcador. A este
respecto, el Solicitante ha realizado los análisis de secuencias de
plásmido, y pudo demostrar que algunas regiones de estos ADNs, en
particular en el origen de replicación, podían poseer regiones de
homopurina-homopirimidina. La síntesis de
oligonucleótidos capaces de formar triples hélices con estas
regiones naturales homopurina-homopirimidina
permite ventajosamente aplicar el método de la invención a plásmidos
sin modificar, en particular, a plásmidos comerciales del tipo pUC,
pBR322, pSV, y semejantes. Entre las secuencias
homopurina-homopirimidina presentes de manera
natural en un ADN bicatenario, puede mencionarse una secuencia que
comprende toda o parte de la secuencia
5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID
NO: 2) presente en el origen de replicación del plásmido de E.
coli ColE1. En este caso, el oligonucleótido que forma la triple
hélice tiene la secuencia:
5'-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3'
(SEQ ID NO: 3), y se une alternativamente a las dos cadenas de la
doble hélice, como describen Beal y Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992,
114, 4976-4982) y Jayasena y Johnston (Nucleic Acids
Res. 1992, 20, 5279-5288). También puede
mencionarse la secuencia
5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 4)
del gen de la \beta-lactamasa del plásmido pBR322
(Duval-Valentin et al ., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1992, 89, 504-508).
Dos secuencias adicionales tomada como objetivo
que pueden formar estructuras tríplex con oligonucleótidos
particulares se han identificado en los orígenes de replicación en
ColE1 y en pCOR. Los plásmidos derivados de ColE1 contienen una
secuencia de homopurina de 12-mer
(5'-AGAAAAAAAGGA-3') (SEQ ID NO: 27)
mapeada en posición 5' respecto al transcrito de
ARN-II implicado en la replicación del plásmido
(Lacatena et al ., 1981, Nature, 294, 623). Esta secuencia
forma una estructura tríplex estable con el oligonucleótido
complementario de 12-mer
5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28).
La parte central de pCOR contiene una cadena de homopurina de 14
bases no repetidas
(5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID NO:
29) localizada en el segmento rico en A+T del origen de replicación
\gamma de pCOR (Levchenko et al ., 1996, Nucleic Acids
Res., 24, 1936). Esta secuencia forma una estructura tríplex
estable con el oligonucleótido complementario de
14-mer
5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO:
30). Los oligonucleótidos correspondientes
5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28) y
5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30)
localizan de manera eficaz y específica sus secuencias
complementarias respectivas localizadas en el origen de replicación
bien de ColE1 ori o pCOR (ori\gamma). De hecho, una tríada única
no-canónica (T*GC o C*AT) puede resultar en la
completa desestabilización de la estructura tríplex.
La utilización de un oligonucleótido capaz de
formar una triple hélice con una secuencia presente en un origen de
replicación o en un gen marcador es especialmente ventajosa, ya que
hace posible, con el mismo oligonucleótido, la purificación de
cualquier ADN que contiene dicho origen de replicación o dicho gen
marcador. Por lo tanto, no es necesario modificar el plásmido o el
ADN de doble hebra con el fin de incorporar en éste una secuencia
artificial.
Aunque se prefieren secuencias totalmente
complementarias, se entiende, sin embargo, que pueden tolerarse
algunos emparejamientos erróneos entre la secuencia del
oligonucleótido y la secuencia presente en el ADN, siempre que no
den lugar a una gran pérdida de afinidad. Puede mencionarse la
secuencia
5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ
ID NO: 8) presente en el gen de \beta-lactamasa de
E. coli. En este caso, la timina que interrumpe la secuencia
de polipurina puede reconocerse mediante una guanina de la tercera
cadena, formando así un triplete G*TA que es estable cundo está
flanqueado por dos tripletes T*AT (Kiessling et al .,
Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
Según una realización particular, los
oligonucleótidos de la invención comprenden la secuencia
(CCT)n, la secuencia (CT)n o la secuencia
(CTT)n, en las que n es un número entero entre 1 y 15
inclusive. Es especialmente ventajosa la utilización de secuencias
del tipo (CT)n o (CTT)n. El Solicitante ha mostrado,
en efecto, que la cantidad de C en el oligonucleótido influye en el
rendimiento de la purificación. En particular, como se muestra en
el Ejemplo 7, el rendimiento de la purificación aumenta cuando el
oligonucleótido contiene menos citosinas. Se entiende que los
oligonucleótidos de la invención también pueden combinar unidades
(CCT), (CT) o (CTT).
El oligonucleótido utilizado puede ser natural
(compuesto por bases naturales sin modificar) o puede estar
modificado químicamente. En particular, el oligonucleótido puede
tener ventajosamente determinadas modificaciones químicas que
permiten incrementar su resistencia a o su protección frente a
nucleasas o su afinidad por la secuencia específica.
Según la presente invención, también se entiende
que oligonucleótido significa cualquier sucesión de nucleósidos
unidos que han sufrido una modificación del esqueleto con el fin de
hacerlo más resistente a nucleasas. Entre las modificaciones
posibles, pueden mencionarse los fosforotioatos de oligonucleótido,
que son capaces de formar triples hélices con ADN (Xodo et al
., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), así
como los oligonucleótidos que tienen esqueletos de formacetal o
metilfosfonato (Matteucci et al ., J. Am. Chem. Soc, 1991,
113, 7767-7768). También es posible utilizar
oligonucleótidos sintetizados con anómeros \alpha de nucleótidos,
que también forman triples hélices con ADN (Le Doan et al
., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760).
Otra modificación del esqueleto es la unión fosforamidato. Por
ejemplo, puede mencionarse la unión internucleotídica fosforamidato
N^{3'}-p^{5'} descrita por Gryaznov y Chen, que
da oligonucleótidos que forman triples hélices con ADN
especialmente estables (J. Am. Chem. Soc, 1994, 116,
3143-3144). Entre otras modificaciones del
esqueleto, también puede mencionarse la utilización de
ribonucleótidos, de
2'-O-metilribosa, fosfodiéster, etc.
(Sun y Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116,
3143-3144). Por último, el esqueleto basado en
fósforo puede reemplazarse por un esqueleto de poliamida como en
PNA (ácidos nucleicos peptídicos), que también pueden formar triples
hélices (Nielsen et al ., Science, 1991, 254,
1497-1500; Kim et al ., J. Am. Chem. Soc,
1993, 115, 6477-6481), o por un esqueleto basado en
guanidina, como en DNG (guanidina desoxiribonucleica, Proc Natl.
Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), o por
análogos policatiónicos del ADN, que también forman triples
hélices.
La timina de la tercera cadena también puede
reemplazarse por un 5-bromouracilo, que aumenta la
afinidad del oligonucleótido por el ADN (Povsic y Dervan, J. Am.
Chem. Soc, 1989, 111, 3059-3061). La tercera cadena
también puede contener bases no naturales, entre las cuales pueden
mencionarse
7-deaza-2'-desoxixantosina
(Milligan et al ., Nucleic Acids Res., 1993, 21,
327-333),
1-(2-desoxi-\beta-D-ribofuranosil)-3-metil-5-amino-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona
(Koh y Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1992, 114,
1470-1478), 8-oxoadenina,
2-aminopurina,
2'-O-metilseudoisocitidina, o
cualquier otra modificación conocida por el experto en la técnica
(para una revisión véase Sun y Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol.,
1993, 3, 345-356).
Otro tipo de modificación del oligonucleótido
tiene la finalidad, más especialmente, de mejorar la interacción
y/o afinidad entre el oligonucleótido y la secuencia específica. En
particular, una modificación más ventajosa según la invención
consiste en metilar las citosinas del oligonucleótido (véase el
Ejemplo 5). El oligonucleótido así metilado presenta la propiedad
destacada de formar una triple hélice estable con la secuencia
específica en intervalos de pH cercanos a la neutralidad (\geq5).
Por lo tanto, esto hace posible trabajar a valores de pH mayores
que los oligonucleótidos de las técnicas anteriores, es decir, a
valores de pH en los que son mucho menores los riesgos de
degradación del ADN plasmídico.
La longitud del oligonucleótido utilizado en el
método de la invención es por lo menos 3 bases, y preferentemente
entre 5 y 30. Se utiliza ventajosamente un oligonucleótido con una
longitud mayor de 10 bases. La longitud puede adaptarse por un
experto en la técnica para cada caso individual para obtener la
selectividad y estabilidad deseadas de la interacción.
Los oligonucleótidos según la invención pueden
sintetizarse mediante cualquier técnica conocida. En particular,
pueden prepararse mediante sintetizadores de ácidos nucleicos.
Obviamente puede utilizarse cualquier otro método conocido por el
experto en la técnica.
Con el fin de permitir su acoplamiento covalente
al soporte, generalmente el oligonucleótido se funcionaliza. Así,
puede modificarse mediante un tiol, amina o grupo carboxilo terminal
en la posición 5' ó 3'. En particular, la adición de un tiol, amina
o grupo carboxilo permite, por ejemplo, acoplar el oligonucleótido a
un soporte que tiene funciones disulfuro, maleimida, amina,
carboxilo, éster, epóxido, bromuro de cianógeno o aldehído. Estos
acoplamientos se forman mediante la formación de uniones disulfuro,
tioéter, éster, amida o amina entre el oligonucleótido y el
soporte. Puede utilizarse cualquier otro método conocido por el
experto en la técnica, tal como reactivos de acoplamiento
bifuncionales, por ejemplo.
Más aún, para mejorar la hibridación con el
oligonucleótido acoplado, puede ser ventajoso que el oligonucleótido
contenga una secuencia de bases "brazo" y "espaciador".
La utilización de un brazo permite, de hecho, unir el
oligonucleótido a una distancia elegida del soporte, permitiendo
mejorar sus condiciones de interacción con el ADN. El brazo
consiste ventajosamente en una cadena carbonada lineal que comprende
1 a 18 y preferiblemente 6 ó 12 grupos (CH2), y una amina que
permite la unión a la columna. El brazo está unido a un fosfato del
oligonucleótido o de un "espaciador" compuesto por bases que
no interfieren con la hibridación. Así, el "espaciador" puede
comprender bases de purina. Como ejemplo, el "espaciador" puede
comprender la secuencia GAGG. El brazo está compuesto
ventajosamente por una cadena carbonada lineal que comprende 6 ó 12
átomos de carbono.
Para la implementación de la presente invención,
se pueden utilizar diversos tipos de soporte. Estos pueden ser
soportes cromatográficos funcionalizados, a granel o preempaquetados
en una columna, superficies plásticas funcionalizadas o
microesferas de látex funcionalizadas, magnéticos u otros.
Preferiblemente se utilizan soportes cromatográficos. Como ejemplo,
los soportes cromatográficos que pueden utilizarse son agarosa,
acrilamida o dextrano así como sus derivados (tales como Sefadex,
Sefarosa, Superosa, etc.), polímeros tales como
poli(estireno/divinilbenceno), o sílice injertada o no
injertada, por ejemplo. Las columnas de cromatografía pueden operar
en el modo de difusión o perfusión.
\newpage
Para obtener mejores rendimientos en la
purificación, es especialmente ventajoso utilizar, en el plásmido,
una secuencia que contiene varias posiciones de hibridación con el
oligonucleótido. La presencia de varias posiciones de hibridación
promueve, en efecto, las interacciones entre dicha secuencia y el
oligonucleótido, que dan lugar a una mejora en los rendimientos de
la purificación. Así, para un oligonucleótido que contiene n
repeticiones de motivos (CCT), (CT) o (CTT), es preferible utilizar
una secuencia de ADN que contiene al menos n motivos
complementarios y preferiblemente n+1 motivos complementarios. Una
secuencia que tiene n+1 motivos complementarios proporciona dos
posiciones de hibridación con el oligonucleótido. Ventajosamente,
la secuencia de ADN contiene hasta 11 posiciones de hibridación, es
decir, n+10 motivos complementarios.
El método según la presente invención puede
utilizarse para purificar cualquier tipo de ADN de doble hebra. Un
ejemplo de este último es ADN circular, tal como un plásmido, que
generalmente tiene uno o más genes con importancia terapéutica.
Este plásmido también puede llevar un origen de replicación, un gen
marcador y semejantes. El método de la invención puede aplicarse
directamente a un lisado celular. En esta realización, el plásmido,
amplificado por transformación seguida de cultivo celular, se
purifica directamente después de la lisis de las células. El método
de la invención también puede aplicarse a un lisado aclarado, es
decir al sobrenadante obtenido después de la neutralización y
centrifugación del lisado celular. Obviamente también puede
aplicarse a una disolución prepurificada mediante métodos
conocidos. Este método también permite purificar ADN lineal o
circular que tiene una secuencia importante a partir de una mezcla
que comprende ADN de diferentes secuencias. El método según la
invención también puede utilizarse para purificar ADN de doble
hebra.
El lisado celular puede ser un lisado de células
procariotas o eucariotas.
Respecto a las células procariotas, pueden
mencionarse como ejemplos las bacterias E. coli, B.
subtilis, S. typhimurium o Streptomyces.
Respecto a las células eucariotas pueden mencionarse las células
animales, de levaduras, fúngicas y semejantes y más específicamente
las levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces o las
células COS, CHO, C127, NIH3T3, y semejantes.
El método de la invención es especialmente
ventajoso, ya que permite obtener ADN plásmido de pureza muy alta
de manera fácil y rápida. En particular, como se ilustra en los
ejemplos, este método permite separar el ADN plásmido en cuestión
de manera eficaz de los componentes contaminantes tales como ADN
cromosómico fragmentado, endotoxinas, proteínas, nucleasas y
similares. Más especialmente, el método de la invención permite
obtener la preparación de ADN bicatenario, en particular el del
origen plásmido, que tiene un contenido de ADN cromosómico de menor
de o igual a 0,5%. Aún más preferentemente, las preparaciones de ADN
obtenidas tienen un contenido de ADN cromosómico menor de o igual a
0,2%. La presente invención por lo tanto describe composiciones que
comprenden ADN plásmido que se puede utilizar farmacéuticamente, en
particular en terapia génica o celular. A este respecto, el objeto
de la invención es también una composición farmacéutica que
comprende ADN bicatenario, lineal de origen plásmido, preparado
según el método descrito más arriba.
La invención también se refiere a preparaciones
de ADN plásmido que tienen un contenido de ADN cromosómico menor de
o igual a 0,5%, preferentemente menor de o igual a 0 m 2% y aún más
preferentemente menor de o igual a 0,1%, y aún más preferentemente
menor de o igual a 0,01%. Como se ejemplifica más abajo, se ha
incorporado una etapa de interacción de afinidad tríplex en un
procedimiento de purificación subsiguiente a las etapas
cromatográficas clásicas. Esta etapa de afinidad mejora
significativamente la pureza de la preparación del plásmido,
cualquiera que sea su pureza inicial. La formación de la estructura
tríplex entre un oligonucleótido (unido covalentemente a un soporte
cromatográfico) y el plásmido de interés que se va a purificar
depende de la presencia en el plásmido de una secuencia que puede
formar una estructura tríplex con el oligonucleótido. Esta
estructura tríplex es estable solamente a pH ácido, en el que las
citosinas del oligonucleótido están protonadas. A continuación, el
ADN plásmido se eluye de la columna simplemente aumentando el pH a
neutro.
Las composiciones pueden contener ADN plásmido
que está "desnudo" o combinado con vehículos de transporte
tales como liposomas, nanopartículas, lípidos catiónicos, polímeros,
virus o proteínas recombinantes, y similares.
En una realización, el método según la presente
invención se puede utilizar para purificar un tipo de ADN
bicatenario a partir de una mezcla que comprende dos o más ADNs
bicatenarios de diversos tipos y secuencias. Este método se puede
aplicar directamente a un lisado celular, en el que los ADNs
bicatenarios, amplificados a través del cultivo celular, se
purifican después de lisar las células cultivadas. Este método
también se puede aplicar a un lisado aclarado, es decir, al
sobrenadante obtenido después de la neutralización y centrifugación
del lisado celular. El método puede además aplicarse a una
disolución prepurificada.
Más precisamente, el método para purificar un
primer ADN bicatenario a partir de una disolución que contiene el
primer y segundo ADNs bicatenarios, comprende (i) pasar la
disolución a través de un primer soporte que comprende un
oligonucleótido acoplado covalentemente capaz de formar una triple
hélice con el segundo ADN bicatenario por hibridación con una
secuencia específica en el mismo, (ii) recuperar la disolución que
pasa a través del primer soporte, que estará enriquecida en el
primer ADN bicatenario no enlazado, y (iii) pasar la disolución
recuperada a través de un segundo soporte que comprende un
oligonucleótido acoplado covalentemente capaz de formar una triple
hélice por hibridación con una secuencia específica de dicho primer
ADN bicatenario. Después de una etapa opcional de lavado, el primer
ADN bicatenario se puede eluir del segundo soporte. Utilizando este
método de purificación doble, el primer ADN bicatenario se puede
recuperar del segundo soporte sin niveles detectables del segundo
ADN bicatenario.
En una realización específica de la presente
invención, la primera molécula de ADN bicatenario es un plásmido
pCOR que tiene una secuencia específica
5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID NO:
29), que forma una estructura tríplex estable con un
oligonucleótido que tiene una secuencia
5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO:
30). La segunda molécula de ADN bicatenario es un plásmido derivado
de ColE1 que tiene una secuencia específica
5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEQ ID NO: 27),
que forma un tríplex con un oligonucleótido que tiene una secuencia
5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28).
Por consiguiente, el plásmido pCOR se purifica ventajosamente a
partir de una disolución que contiene otros plásmidos tales como
plásmidos derivados de ColE1 utilizando el método de purificación
doble según la presente invención.
La presente solicitud se describirá con más
detalle por medio de los ejemplos que siguen, que han de ser
considerados como ilustrativos y no limitantes.
Los métodos tradicionales de biología molecular,
tales como digestión con enzimas de restricción, electroforesis en
gel, transformación en E. coli, precipitación de ácidos
nucleicos y similares, están descritos en la bibliografía
(Maniatis et al ., T., E.F. Fritsch, y J. Sambrook,
1989. Molecular cloning: a laboratory manual, segunda edición. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva
York; Ausubel F.M., R. Brent, R.E. Kinston, D.D. Moore, J.A.
Smith, J.G. Seidman y K. Struhl. 1987. Current protocols in
molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons,
Nueva York.). Las secuencias de nucleótidos se determinaron mediante
el método de terminación de la cadena según el protocolo publicado
previamente (Ausubel et al ., 1987).
Las enzimas de restricción se obtuvieron de New
England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).
Para llevar a cabo las ligaciones, los
fragmentos de ADN se incuban en un tampón que comprende 50 mM
Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT, 2 mM
ATP en presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs).
Los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando
química de fosforamidita con las fosforamiditas protegidas en la
posición \beta mediante un grupo cianoetilo (Sinha, N.D., J.
Biernat, J. McManus y H. Köster, 1984. Polymer support
oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of
\beta-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino
phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA
fragments simplifying deprotection and isolation of the final
product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J.
W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol.,
Nov./Dic.) con un sintetizador automático de ADN Biosearch 8600
utilizando las recomendaciones del fabricante.
Los ADN ligados o los ADN que se van a ensayar
para determinar su eficacia de transformación se utilizan para
transformar la cepa siguiente que se ha hecho competente: E.
coli DH5\alpha[F/endA1, hsdR17, supE44,
thi-1, recA1, gyrA96, relA1,
\Delta(lacZYA-arqF)U169, deoR, \Phi80dlac
(lacZ\DeltaM15)] (para cualquier plásmido Col E1); o E.
coli XAC-pir (para cualquier plásmido derivado
de pCor).
Las minipreparaciones de ADN plasmídico se
realizan según el protocolo de Klein et al ., 1980.
El medio de cultivo LB se utiliza para crecer
las cepas de E. coli (Maniatis et al ., 1982). Las
cepas se incuban a 37ºC. Las bacterias se plaquean en placas de
medio LB suplementado con antibióticos adecuados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La columna utilizada es una columna HiTrap de 1
ml activada con NHS (N-hidroxisuccinimida,
Pharmacia) conectada a una bomba peristáltica (salida < 1
ml/min. El oligonucleótido específico utilizado tiene un grupo NH2
en el extremo 5' y su secuencia es como sigue:
(SEQ ID NO:
1)5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'
Los tampones utilizados en este ejemplo son los
siguientes:
Tampón de acoplamiento: 0,2 M NaHCO3, 0,5 M
NaCl, pH 8,3.
Tampón A: 0,5 M etanolamina, 0,5 M NaCl, pH
8,3.
Tampón B: 0,1 M acetato, 0,5 M NaCl, pH 4.
La columna se lava con 6 ml de 1 mM HCl, y el
oligonucleótido diluido en el tampón de acoplamiento (50 nmoles en
1 ml) se aplica a la columna y se deja durante 30 minutos a
temperatura ambiente. La columna se lava tres veces sucesivamente
con 6 ml de tampón A y después con 6 ml de tampón B. El
oligonucleótido se une así covalentemente a la columna mediante una
conexión CONH. La columna se almacena a 4ºC en PBS, 0,1% NaN_{3},
y puede utilizarse al menos cuatro veces.
Se sintetizaron los dos oligonucleótidos
siguientes.
oligonucleótido 4817:
oligonucleótido
4818:
\vskip1.000000\baselineskip
Estos oligonucleótidos cuando se hibridan y
clonan en un plásmido, introducen una secuencia
homopurina-homopirimidina (GAA)_{17} (SEQ
ID NO: 33) en el plásmido correspondiente, como se ha descrito
anteriormente.
La secuencia correspondiente a estos dos
oligonucleótidos hibridados se clonó en el sitio de clonación
múltiple del plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla
CA), que porta un gen de resistencia a ampicilina. Para este fin,
los oligonucleótidos se hibridaron de la manera siguiente: un \mug
de estos dos oligonucleótidos se pusieron juntos en 40 ml de un
tampón final que comprende Tris-HCl 50 mM pH 7,4,
MgCl_{2} 10 mM. Esta mezcla se calentó a 95ºC y a continuación se
puso a temperatura ambiente de manera que la temperatura disminuyera
lentamente. Diez ng de la mezcla de oligonucleótidos hibridados se
ligaron con 200 ng de plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La
Jolla CA) digerido con BamHI y EcoRI en 30 \mul
finales. Después de la ligación, se transformó una alícuota en
DH5a. Las mezclas de transformación se plaquearon en medio L
suplementado con ampicilina (50 mg/l) y X-gal (20
mg/l). Los clones recombinantes deben mostrar una ausencia de
coloración azul en este medio, al contrario que el plásmido
precursor (pBKS+) que permite la complementación \alpha del
fragmento \omega de la \beta-galactosidasa de
E. coli. Después de la minipreparación de ADN plásmido a
partir de 6 clones, todos mostraron la desaparición del sitio
PstI localizado entre los sitios EcoRI y BamHI
del pBKS+, y un aumento en el peso molecular de la banda de
448-pb PvuII que contiene el sitio de
clonación múltiple. Se seleccionó un clon y el plásmido
correspondiente se denominó pXL2563. La secuencia clonada se
verificó secuenciando utilizando el cebador -20
(5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3'(SEQ ID NO:
11)) (Viera J. y J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an
M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and
sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19,
259-268) para el plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning
System, La Jolla CA). El plásmido pXL2563 se purificó según el kit
Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI) según las
recomendaciones del proveedor. Esta preparación de ADN plasmídico
se utilizó a partir de entonces en los ejemplos descritos más
adelante.
El plásmido pXL2563 (descrito en 1.2) se
purificó en la columna HiTrap acoplada al oligonucleótido, descrito
en 1.1., a partir de una disolución que también contiene el plásmido
pBKS+. Los tampones utilizados en esta purificación son los
siguientes:
Tampón F: 2 M NaCl, 0,2 M acetato, pH 4,5 a
5.
Tampón E: 1 M Tris-HCl, pH 9,
0,5 mM EDTA.
La columna se lava con 6 ml de tampón F, y los
plásmidos (20 \mug de pXL2563 y 20 \mug de pBKS+ en 400 \mul
de tampón F) se aplican a la columna y se incuba durante 2 horas a
temperatura ambiente. La columna se lava con 10 ml de tampón F y la
elución se realiza con el tampón E. Los plásmidos se detectan
después de electroforesis en gel de agarosa al 1% y tinción con
bromuro de etidio. La proporción de los plásmidos en la disolución
se estima midiendo su actividad transformante en E. coli.
Comenzando con una mezcla que contiene 30% de
pXL2563 y 70% de pBKS+, se recupera una disolución que contiene
100% de pXL2563 a la salida de la columna. La pureza, estimada por
la proporción de DO a 260 y 280 nm se incrementa de 1,9 a 2,5, lo
que indica que mediante este método se han eliminado las proteínas
contaminantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
2.1. - Este ejemplo describe un
experimento de purificación de ADN
plásmido.
El acoplamiento del oligonucleótido
(5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'
(SEQ ID NO: 1)) a la columna se realiza como se describe en el
Ejemplo 1. Para el acoplamiento, el oligonucleótido se modifica en
el extremo 5' con un grupo amino unido al fosfato del espaciador
por un brazo que contiene 6 átomos de carbono (Modified
oligonucleotide Eurogentec SA, Bélgica). El plásmido pXL2563 se
purificó utilizando el kit Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison,
WI) según las recomendaciones del proveedor. Los tampones utilizados
en este ejemplo son los
siguientes:
siguientes:
Tampón F: NaCl 0-2 M, acetato
0,2 M, pH 4,5 a 5.
Tampón E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5
mM EDTA.
La columna se lava con 6 ml del tampón F, y 100
\mug del plásmido pXL2563 diluidos en 400 \mul de tampón F se
aplican a la columna y se incuba durante 2 horas a temperatura
ambiente. La columna se lava con 10 ml de tampón F y la elución se
realiza con el tampón E. El plásmido se cuantifica determinando la
densidad óptica a 260 nm.
En este ejemplo, la unión se realiza en un
tampón cuya molaridad respecto a NaCl varía de 0 a 2 M (tampón F).
El rendimiento de la purificación disminuye al disminuir la
molaridad de NaCl. El pH del tampón de unión puede variar de 4,5 a
5, siendo el rendimiento de la purificación mayor a 4,5. También es
posible utilizar otro tampón de elución de pH básico: la elución se
realiza así con un tampón que comprende borato 50 mM, pH 9, EDTA
0,5 mM.
(5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'
(SEQ ID NO: 1) a la columna se realiza como se describe en el
Ejemplo 1. El plásmido pXL2563 se purificó utilizando el kit Wizard
Megaprep (Promega Corp. Madison, WI) según las recomendaciones del
proveedor. Los tampones utilizados en este ejemplo son los
siguientes:
Tampón F: 0,1 M NaCl, 0,2 M acetato, pH 5.
Tampón E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5
mM EDTA.
La columna se lava con 6 ml del tampón F, y 100
\mug del plásmido pXL2563 diluidos en 400 \mul de tampón F se
aplican a la columna y se incuba durante una hora a temperatura
ambiente. La columna se lava con 10 ml de tampón F y a continuación
la elución se realiza con tampón E. Se mide el contenido de ADN
genómico o cromosómico de E. coli presente en las muestras
de plásmido antes y después de pasar a través de la columna con el
oligonucleótido. Este ADN genómico se cuantifica mediante PCR
utilizando cebadores en el gen galK de E. coli. Según el
protocolo siguiente: La secuencia de estos cebadores se describe
por Debouck et al . (Nucleic Acids Res. 1985, 13,
1841-1853): 5'-CCG AAT TCT GGG GAC
CAA AGC AGT TTC-3' (SEQ ID NO: 24) y
5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG
TGT-3' (SEQ ID NO: 25).
El medio de reacción comprende, en 25 \mul de
tampón de PCR (Promega France, Charbonnières): MgCl_{2} 1,5 mM;
dXTP 0,2 mM (Pharmacia, Orsay); cebador 0,5 \muM; 20 U/ml de
polimerasa Taq (Promega). La reacción se realiza según la
secuencia:
5 min a 95ºC
30 ciclos de 10 seg a 95ºC
30 s a 60ºC
1 min a 78ºC
10 min a 78ºC.
\newpage
El fragmento de ADN amplificado de 124 pares de
bases de longitud se separa mediante electroforesis en gel de
agarosa al 3% en presencia de SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene,
EEUU), y se cuantifica por referencia con una serie de ADN genómico
Ultrapur de la cepa B de E. coli (Sigma, ref D4889).
Hay 1% de ADN cromosómico en la muestra aplicada
a la columna, y 0,2% en la muestra purificada en la columna con
oligonucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo describe la purificación de ADN
plasmídico a partir de un lisado aclarado de un cultivo bacteriano,
en la denominada escala "miniprep": se centrifugan 1,5 ml de un
cultivo de toda la noche de cepas DH5\alpha que contienen el
plásmido pXL2563, y el sedimento se resuspende en 100 \mul de
glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8, EDTA 10 mM. Se
añaden 200 \mul de NaOH 0,2 M, SDS al 1%, se invierten los tubos
para mezclar, a continuación se añaden 150 \mul de acetato de
potasio 3 M pH 5 y los tubos se invierten para mezclar. Después de
centrifugar, se recupera el sobrenadante y se carga en la columna
del oligonucleótido obtenida como se describe en el Ejemplo 1. La
unión, lavados y elución son idénticos a los descritos en el Ejemplo
1. Se recupera aproximadamente 1 \mug de plásmido a partir de 1,5
ml de cultivo. El plásmido obtenido, analizado mediante
electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio,
forma una única banda de ADN circular "superenrollado". No se
detecta ninguna traza de ADN o ARN de alto peso molecular
(cromosómico) en el plásmido purificado mediante este método. La
relación de las densidades ópticas a 260 y 280 nm es mayor de 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
4.1: Este ejemplo describe un
experimento de purificación de ADN plásmido realizado en las mismas
condiciones que en el Ejemplo 3, comenzando a partir de 20 ml de
cultivo bacteriano de cepas DH5\alpha que contienen el plásmido
pXL2563. El sedimento celular se resuspende en 1,5 ml de 50 mM
glucosa, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. La lisis
se realiza con 2 ml de 0,2 M NaOH, 1% SDS, y la neutralización con
1,5 ml de 3 M acetato de potasio, pH 5. El ADN se precipita con 3
ml de 2-propanol, y el sedimento se resuspende en
0,5 ml de acetato de sodio 0,2 M, pH 5, NaCl 0,1 M y se carga en la
columna de oligonucleótido obtenida como se describe en el Ejemplo
1. La unión, lavado de la columna y elución se realizan como se
describe en el Ejemplo 1, excepto en el tampón de lavado, cuya
molaridad respecto a NaCl es 0,1M. Se obtienen aproximadamente 16
\mug de ADN plásmido. El plásmido obtenido, analizado mediante
electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio,
forma una única banda de ADN circular "superenrollado". No se
detecta ninguna traza de ADN o ARN de alto peso molecular
(cromosómico) en el plásmido purificado. La digestión del plásmido
con una enzima de restricción proporciona una única banda en el
peso molecular esperado de 3 kilobases. La concentración de
proteína en las muestras cae desde 125 \mug/ml en el lisado
aclarado a menos de 1 \mug/ml en el plásmido purificado
(Micro-BCA assay, Pierce). La concentración de
endotoxina, estimada por ensayo LAL (Biosepra) se divide por un
factor mayor de 10 en el plásmido purificado, con relación al lisado
aclarado de
partida.
4.2: El plásmido utilizado contiene
un casete que contiene el promotor de citomegalovirus, el gen que
codifica la luciferasa y la secuencia
homopurina-homopirimidina (GAA)_{17} (SEQ
ID NO: 33) que se origina a partir del plásmido pXL2563. La cepa
DH1 (Maniatis et al ., 1989) que contiene este plásmido se
cultiva en un fermentador de 7 litros. Se prepara un lisado
aclarado a partir de 200 gramos de células: el sedimento celular se
resuspende en 2 litros de 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM glucosa, 10 mM
EDTA, a los que se añaden 2 litros de 0,2 M NaOH, 1% SDS. El lisado
se neutraliza mediante la adición de un litro de 3M acetato de
potasio. Después de la diafiltración, se aplican 4 ml de este
lisado a una columna HiTrap-NHS de 5 ml acoplada al
oligonucleótido de secuencia
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'
(SEQ ID NO: 1), según el método descrito en el Ejemplo 1.1. El
lavado y la elución se llevan a cabo como se describe en el Ejemplo
1. Se recuperan aproximadamente 400 microgramos del plásmido. El
nivel de ADN genómico en esta muestra, medido por la técnica
descrita en el Ejemplo 2.2, es
0,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Este ejemplo describe la utilización de un
oligonucleótido que presenta citosinas metiladas. La secuencia del
oligonucleótido utilizado es como sigue: 5'
-GAGG^{Me}CTT^{Me}CTT^{Me}CTT^{Me}CTT^{Me}CCT^{Me}CTT^{Me}CTT-3'
(SEQ ID NO: 12)
Este oligonucleótido tiene un grupo NH2 en el
extremo 5' terminal. ^{Me}C = 5-metilcitosina.
Este oligonucleótido permite purificar el plásmido pXL2563 en las
condiciones del Ejemplo 1 con un tampón de unión de pH 5 (de esta
manera se disminuye el riesgo de degradación del plásmido).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
En los ejemplos anteriores, el oligonucleótido
utilizado está modificado en el extremo 5' terminal con un grupo
amino unido al fosfato mediante un brazo que contiene 6 átomos de
carbono: NH_{2}-(CH_{2})_{6}. En este ejemplo, el
grupo amino está unido al fosfato del extremo 5' terminal mediante
un brazo que contiene 12 átomos de carbono:
NH_{2}-(CH_{2})_{12}. El acoplamiento del
oligonucleótido y el paso a través de la columna se realizan como
se describe en el Ejemplo 2 con un tampón F: 2 M NaCl, 0,2 M
acetato, pH 4,5. Este oligonucleótido permite obtener rendimientos
de purificación mejores: se obtiene un rendimiento del 53% mientras
con el oligonucleótido que contiene 6 átomos de carbono, este
rendimiento es del orden del 45% en las mismas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Siguiendo la estrategia de clonación descrita en
el Ejemplo 1.2, se construyeron otros dos plásmidos que portan
secuencias homopurina-homopirimidina: el plásmido
pXL2725 que contiene la secuencia (GGA)_{16}, (SEQ ID NO:
34) y el plásmido pXL2726 que contiene la secuencia
(GA)_{25} (SEQ ID NO: 35).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.1
Los plásmidos pXL2725 y pXL2726, análogos al
plásmido pXL2563, se construyeron según la estrategia de clonación
descrita en el Ejemplo 1.2, utilizando los pares de oligonucleótidos
siguientes:
(SEQ ID NO:
13)5986:
5'-GATCC(GA)_{25}GGG-3'
(SEQ ID NO:
14)5987:
5'-AATTCCC(TC)_{25}G-3'
(SEQ ID NO:
15)5981:
5'-GATCC(GGA)_{17}GG-3'
(SEQ ID NO:
16)5982:
5'-AATT(CCT)_{17}CCG-3'
La pareja de oligonucleótidos 5986 y 5987 se
utilizó para construir el plásmido pXL2726 clonando los
oligonucleótidos en los sitios BamHI y EcoRI del
pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), mientras que los
oligonucleótidos 5981 y 5982 se utilizaron para la construcción del
plásmido pXL2725. Se utilizaron las mismas condiciones
experimentales que para la construcción del plásmido pXL2563, y sólo
se cambiaron las parejas de oligonucleótidos. De manera similar, se
verificaron las secuencias clonadas mediante secuenciación en los
plásmidos. Esto permite observar que el plásmido pXL2725 tiene una
modificación respecto a la secuencia esperada: en lugar de la
secuencia GGA repetida 17 veces, está
GGAGA(GGA)_{15} (SEQ ID NO: 17).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.2
Los oligonucleótidos que forman hélices triples
con estas secuencias de homopurina se acoplaron a las columnas
HiTrap según la técnica descrita en el Ejemplo 1.1. El
oligonucleótido de secuencia
5'-AATGCCTCCTCCTCCTCGT
CCTCCT-3' (SEQ ID NO: 18) se utilizó para la purificación del plásmido pXL2725, y el oligonucleótido de secuencia 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEQ ID NO: 19) se utilizó para la purificación del plásmido pXL2726.
CCTCCT-3' (SEQ ID NO: 18) se utilizó para la purificación del plásmido pXL2725, y el oligonucleótido de secuencia 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEQ ID NO: 19) se utilizó para la purificación del plásmido pXL2726.
Las dos columnas obtenidas de esta manera
permiten purificar los plásmidos correspondientes según la técnica
descrita en el Ejemplo 2, con los tampones siguientes:
Tampón F: 2 M NaCl, 0,2 M acetato, pH 4,5.
Tampón E: 1 M Tris-HCl, pH 9,
0,5 mM EDTA.
Los rendimientos obtenidos son 23% y 31% para
pXL2725 y pXL2726, respectivamente.
\newpage
Ejemplo
8
Este ejemplo ilustra la influencia de la
longitud de la secuencia específica presente en el plásmido en los
rendimientos de la purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.1
El gen informador utilizado en estos
experimentos para demostrar la actividad de las composiciones de la
invención es el gen que codifica la luciferasa (Luc).
El plásmido pXL2621 contiene un casete que
contiene el promotor citomegalovirus (CMV) de
661-pb, extraído a partir de pcDNA3 (Invitrogen
Corp., San Diego, CA) por escisión con las enzimas de restricción
MluI y HindIII, clonado antes del extremo 5' del gen
que codifica la luciferasa, en los sitios MluI y
HindIII, dentro del vector Vector básico pGL (Promega Corp.,
Madison, WI). Este plásmido se construyó utilizando técnicas
estándar de biología molecular.
Los plásmidos pXL2727-1 y
pXL272--2 se construyeron de la manera siguiente:
Dos microgramos del plásmido pXL2621 se
linearizaron con BamHI; la enzima se inactivó mediante
tratamiento durante 10 min a 65ºC; simultáneamente, los
oligonucleótidos 6006 y 6008 se hibridaron como se describe para la
construcción del plásmido pXL2563.
(SEQ ID NO:
20).6006:
5'-GATCT(GAA)_{17}CTGCAGATCT-3'
(SEQ ID NO:
21).6008:
5'-GATCAGATCTGCAG(TTC)_{17}A-3'
Esta mezcla de hibridación se clonó en los
extremos BamHI del plásmido pXL2621 y, después de la
transformación en DH5\alpha, se identificaron los clones
recombinantes mediante análisis de restricción enzimática con
PstI, ya que los oligonucleótidos introducen un sitio
PstI. Se seleccionaron dos clones, y la secuencia de
nucleótidos del fragmento clonado se verificó utilizando el cebador
(6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3'
(SEQ ID NO: 22)) como cebador de la reacción de secuenciación
(Viera J. y J. Messing, 1982. The pUC plasmids an
M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and
sequencing with synthetic universal primers. Gene
19:259-268).
El primer clon (pXL2727-1)
contiene la secuencia GAA repetida 10 veces. El segundo
(pXL2727-2) contiene la secuencia
(SEQ ID NO:
23).5'-GAAGAAGAG(GAA)_{7}GGAAGAGAA-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8.2
Se utiliza una columna tal como la descrita en
el Ejemplo 1, y que está acoplada al oligonucleótido
5'-GAGGCTTC
TTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1).
TTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1).
El plásmido pXL2727-1 tiene 14
repeticiones de la secuencia GAA. El oligonucleótido descrito
anteriormente, que contiene sólo 7 repeticiones de la secuencia de
hibridación correspondiente CTT, puede hibridar así con el plásmido
en 8 posiciones diferentes. El plásmido pXL2727-2,
por el contrario, tiene una secuencia de hibridación
(GAA)_{7} (SEQ ID NO: 36) de la misma longitud que la del
oligonucleótido unido a la columna. Este oligonucleótido puede
hibridar así sólo en una posición en pXL2727-2.
El experimento es idéntico al descrito en el
Ejemplo 2, con los tampones siguientes:
Tampón F: NaCl 2 M, acetato 0,2 M, pH 4,5.
Tampón E: Tris-HCl 1M, pH 9,
EDTA 0,5 mM.
El rendimiento de la purificación es 29% con el
plásmido pXL2727-1 y 19% con
pXL2727-2.
\newpage
Ejemplo
8.3
Las células utilizadas son células NIH 3T3,
inoculadas el día anterior al experimento en placas de cultivo de
24 pocillos con 50.000 células/pocillo. El plásmido se diluye en 150
mM NaCl y se mezcla con el lipofectante RPR115335. Se utiliza una
proporción de cargas positivas de lipofectante/cargas negativas de
ADN igual a 6. La mezcla se agita en un vortex, se deja durante 10
minutos a temperatura ambiente, se diluye en medio sin suero fetal
de ternera y a continuación se añade a las células en la proporción
de 1 \mug de ADN por pocillo de cultivo. Después de dos horas a
37ºC, se añade 10% volumen/volumen de suero fetal de ternera y las
células se incuban durante 48 horas a 37ºC en presencia de 5% de
CO_{2}. Las células se lavan dos veces con PBS y se determina la
actividad luciferasa según el protocolo descrito (kit de Promega,
Promega Corp. Madison, WI) en un luminómetro Lumat LB9501 (EG y G
Berthold, Evry). El plásmido pXL2727-1, purificado
como se describe en el Ejemplo 8.2, proporciona unos rendimientos
en la transfección dos veces mayores que los obtenidos con el mismo
plásmido purificado utilizando el kit Wizard Megaprep (Promega Corp.
Madison, WI).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
El ejemplo siguiente demuestra la purificación
de plásmidos derivados de pCOR utilizando cromatografía de afinidad
de triple hélice. Se ha mostrado que esta tecnología elimina ácidos
nucleicos contaminantes (particularmente ADN genómico y ARN de la
célula anfitriona) hasta niveles que no se han conseguido alcanzar
con métodos cromatográficos convencionales.
Se sintetizó un gel de afinidad de tríplex con
Sephacryl S-1000 SF
(Amersham-Pharmacia Biotech) como matriz
cromatográfica. Sephacryl S-1000 se activó en primer
lugar con m-peryodato de sodio (3 mM, temperatura
ambiente, 1 h) en acetato de sodio 0,2 M (pH 4,7). Después, el
oligonucleótido se acopló mediante su resto
5'-NH_{2} terminal a grupos aldehído de la matriz
activada mediante aminación reductora en presencia de ácido
ascórbico (5 mM) como se ha descrito previamente para el
acoplamiento de proteínas (Hornsey et al ., J. Immunol.
Methods, 1986, 93, 83-88). El oligonucleótido
homopirimidina utilizado en estos experimentos (de Eurogentec,
purificado mediante HPLC) tenía una secuencia que era
complementaria a una secuencia de homopurina corta de
14-mer
(5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID NO:
29) presente en el origen de replicación (ori\gamma) del plásmido
pCOR (Soubrier et al ., Gene Therapy, 1999, 6,
1482-1488). Como se ha discutido anteriormente, la
secuencia del oligonucleótido homopirimidina es
5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO:
30).
Se cromatografiaron los plásmidos siguientes:
pXL3296 (pCOR sin transgén, 2,0 kpb), pXL3179
(pCOR-FGF, 2,4 kpb), pXL3579 (pCOR- VEGFB, 2,5
kpb), pXL3678 (pCOR-AFP, 3,7 kpb), pXL3227
(pCOR-lacZ 5,4 kpb) y pXL3397
(pCOR-Bdeleted FVIII, 6,6 kpb). Todos estos
plásmidos se purificaron mediante dos etapas de cromatografía de
intercambio aniónico a partir de lisados aclarados obtenidos como
se describe en el Ejemplo 4. También se estudió el plásmido pBKS+
(pBluescript II KS + de Stratagene), un plásmido derivado de ColE1,
purificado mediante ultracentrifugación en CsCl. Todos los
plásmidos utilizados estaban en su estado topológico o forma
superenrollada (> 95%).
En cada experimento de purificación de ADN
plásmido, se cargaron 300 \mug de ADN plásmido en 6 ml de NaCl 2
M, acetato de potasio 0,2 M (pH 5,0) a una velocidad de flujo de 30
cm/h en una columna de afinidad que contenía el oligonucleótido
mencionado anteriormente
5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO:
30). Después de lavar la columna con 5 volúmenes del mismo tampón,
el plásmido unido se eluyó con Tris/HCl 1 M, EDTA 0,5 mM (pH 9,0) y
se cuantificó mediante UV (260 nm) y cromatografía de intercambio
iónico con una columna Millipore Gen-Pak (Marquet
et al ., BioPharm, 1995, 8, 26-37).
Las recuperaciones de los plásmidos en la fracción recogida fueron
207 \mug para pXL3296, 196 \mug para pXL3179, 192 \mug para
pXL3579, 139 \mug para pXL3678, 97 \mug para pXL 3227, y 79
\mug para pXL 3397.
No se pudo detectar ninguna unión de plásmido
(< 3 \mug) cuando se cromatografió pBKS en esta columna. Esto
indica que el oligonucleótido
5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30)
forma estructuras tríplex estables con la secuencia complementaria
de 14-mer 5'- AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ
ID NO: 29) presente en pCOR (ori\gamma), pero no con la secuencia
muy relacionada 5'-AGAAAAAAAGGA-3'
(SEQ ID NO: 27) presente en pBKS. Esto indica que la introducción
de una tríada no canónica única (T*GC en este caso) resulta en una
desestabilización completa de la estructura tríplex.
Como control, no se observó ninguna unión de
plásmido (< 1 \mug) cuando se cromatografió pXL3179 en una
columna blanco sintetizada en condiciones estrictamente similares
pero sin oligonucleótido.
Realizando esta columna de purificación de
afinidad en las condiciones indicadas en la presente memoria, el
nivel de contaminación por el ADN genómico del anfitrión se redujo
del 2,6% hasta el 0,07% para una preparación de pXL3296. De manera
similar, el nivel de contaminación por el ADN del anfitrión se
redujo del 0,5% hasta el 0,008% para una preparación de pXL3179
cuando la muestra se cromatografió mediante la misma columna de
afinidad. Además, se redujo en gran parte el nivel de contaminación
por ARN desde 43% de ARN hasta 0,2% en una preparación de pXL3179
utilizando esta columna de purificación de afinidad.
Además, la recuperación de plásmido PXL3579 fue
menor de 8% cuando el oligonucleótido
5'-TTCTTTTTTTTC
TT-3' (SEQ ID NO: 30) se sustituyó por el oligonucleótido 5'- TTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 31) en la columna de afinidad. Aunque el oligonucleótido que se expone en la SEQ ID NO: 31 es complementario de una porción de la secuencia VEGFB dentro de pXL3579 (es decir, nucleótidos 379 a 389 relativo a ATG), no ocurre ninguna afinidad tríplex significativa. Esto indica que esta purificación por afinidad requiere una secuencia de ADN homopurina-homopirimidina no aleatoria.
TT-3' (SEQ ID NO: 30) se sustituyó por el oligonucleótido 5'- TTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 31) en la columna de afinidad. Aunque el oligonucleótido que se expone en la SEQ ID NO: 31 es complementario de una porción de la secuencia VEGFB dentro de pXL3579 (es decir, nucleótidos 379 a 389 relativo a ATG), no ocurre ninguna afinidad tríplex significativa. Esto indica que esta purificación por afinidad requiere una secuencia de ADN homopurina-homopirimidina no aleatoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
El ejemplo siguiente demuestra la purificación
de plásmidos derivados de ColE1 utilizando cromatografía de
afinidad de triple hélice. Se ha mostrado que esta tecnología
elimina ácidos nucleicos contaminantes (particularmente ADN
genómico y ARN de la célula anfitriona) hasta niveles que no se han
conseguido alcanzar con métodos cromatográficos convencionales.
Se sintetizó un gel de afinidad de tríplex
acoplando un oligonucleótido que tiene la secuencia
5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28)
en Sephacryl S-1000 SF oxidado con peryodato como se
describe en el Ejemplo 9.
Los plásmidos pXL3296 (pCOR sin transgén) y
pBKS, un plásmido derivado de ColE1, se cromatografiaron en una
columna de 1 ml que contenía el oligonucleótido
5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28)
en las condiciones descritas en el Ejemplo 9. Las recuperaciones de
los plásmidos en la fracción recogida fueron 175 \mug para pBKS y
<1 \mug para pXL3296. Esto indica que el oligonucleótido
5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28)
forma estructuras tríplex estables con la secuencia complementaria
de 12-mer
(5'-AGAAAAAAAGGA-3') (SEQ ID NO: 27)
presente en pBKS, pero no con la secuencia muy relacionada de
12-mer
(5'-AGAAAAAAAAGA-3') (SEQ ID NO: 32)
presente en pCOR. Esto indica que la introducción de una tríada no
canónica única (C*AT en este caso) puede resultar en una
desestabilización completa de la estructura tríplex.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
El siguiente ejemplo demuestra la purificación
de una molécula de ADN bicatenario superenrollada, tal como
pXL3296, en una mezcla que contiene otra molécula bicatenaria
superenrollada, tal como pBSK, utilizando cromatografía de afinidad
de triple hélice. Ambas moléculas de ADN bicatenario pueden tener un
tamaño similar, pero cada molécula de ADN contiene una única
secuencia que es capaz de formar una triple hélice con una secuencia
tomada como objetivo diferente. Como se ha discutido previamente,
las moléculas tales como pXL3296 contienen una secuencia
5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID NO:
29), pero no contienen la secuencia
5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEQ ID NO: 27).
En contraste, moléculas tales como pBSK contienen la SEQ ID NO: 27,
pero no contienen la SEQ ID NO: 29.
En una primera etapa, la mezcla que contenía
pXL3296 y pBSK se cargó en una primera columna de afinidad que
contenía el oligonucleótido
5'-TCTTTTTTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 28),
tal como la columna descrita en el Ejemplo 10. La disolución se
pasó a través de la primera columna que contenía moléculas de ADN no
unidas. En la segunda etapa, las moléculas de ADN no unidas de la
primera etapa se cargaron en una segunda columna de afinidad que
contenía el oligonucleótido
5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO:
30), tal como la columna descrita en el Ejemplo 9. A continuación
se lavó la segunda columna y se eluyeron las moléculas no unidas,
como se describe en el Ejemplo 9. Solamente eluyeron moléculas de
pXL3296 de la segunda columna. No se detectó ninguna molécula de
pBSK en el eluato (es decir, la disolución que eluye de la columna)
de la segunda columna.
<110> AVENTIS PHARMA S.A.
\hskip1cmCROUZET, Joel
\hskip1cmSCHERMAN, Daniel
\hskip1cmWILS, Pierre
\hskip1cmCAMERON, Beatrice
\hskip1cmBLANCHE, Francis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PURIFICACIÓN DE UNA FORMACIÓN DE
TRIPLE HÉLICE CON UN OLIGONUCLEÓTIDO INMOVILIZADO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3804.1381304
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/580,923
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-05-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggcttctt cttcttcttc ttctt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcccgaag ggagaaagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagggcttc cctctttcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaaaggaa gag
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagggaggga ggagaggaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggagagga gggagggaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggtgtggt gggtgggtt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaggga ataaggg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaccggcag caaaatg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> todas las citosinas (C) en la
secuencia están metiladas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggcttctt cttcttcctc ttctt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgcctcct cctcctcctc ctcct
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgctctct ctctctctct ctctct
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagtcataa gtgcggcgac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgaattctg gggaccaaag cagtttc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagcttca ctgttcacga cgggtgt
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcttcttc ttcttcttct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaaaaaaag ga
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctttttttc ct
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagaaaaaaa agaa
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcttttttt tctt
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttttttcc t
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaaaaaaaa ga
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagaagaag aagaagaaga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Un método para purificar ADN bicatenario a
partir de una disolución que contiene el ADN bicatenario mezclado
con otros componentes, que comprende pasar la disolución a través de
un soporte que comprende un oligonucleótido acoplado covalentemente
capaz de formar una triple hélice con el ADN bicatenario por
hibridación con una secuencia específica presente en el ADN
bicatenario sin formación de ninguna tríada no canónica, en el que
el oligonucleótido acoplado covalentemente comprende la secuencia
TCTTTTTTTCCT (SEQ ID NO:28) o TTCTTTTTTTTCTT (SEQ ID NO:30).
2. Un método para purificar ADN bicatenario a
partir de una disolución que contiene el ADN bicatenario mezclado
con otros componentes, que comprende pasar la disolución a través de
un soporte que comprende un oligonucleótido acoplado covalentemente
capaz de formar una triple hélice con el ADN bicatenario por
hibridación con una secuencia específica presente en el ADN
bicatenario sin formación de ninguna tríada no canónica, en el que
la secuencia específica presente en el ADN bicatenario comprende la
secuencia AGAAAAAAAGGA (SEQ ID NO:27) o AAGAAAAAAAAGAA (SEQ ID
NO:29).
3. Un método para purificar un primer ADN
bicatenario a partir de una disolución que contiene el primer ADN
bicatenario y un segundo ADN bicatenario, que comprende (i) pasar la
disolución a través de un primer soporte que comprende un
oligonucleótido acoplado covalentemente capaz de formar una triple
hélice con dicho segundo ADN bicatenario por hibridación con una
secuencia específica en el mismo sin formación de ninguna triada no
canónica, (ii) recuperar la disolución que pasa a través del primer
soporte, y (iii) pasar la disolución recuperada a través de un
segundo soporte que comprende un oligonucleótido acoplado
covalentemente capaz de formar una triple hélice con dicho primer
ADN bicatenario por hibridación con una secuencia específica en el
mismo sin formación de ninguna triada no canónica, en el que la
secuencia específica presente en dicho primer ADN bicatenario
comprende la secuencia AAGAAAAAAAAGAA (SEQ ID NO:29) y la secuencia
específica presente en dicho segundo ADN bicatenario comprende la
secuencia AGAAAAAAAGGA (SEQ ID NO:27).
4. Un método para purificar un primer ADN
bicatenario a partir de una disolución que contiene el primer ADN
bicatenario y un segundo ADN bicatenario, que comprende (i) pasar la
disolución a través de un primer soporte que comprende un
oligonucleótido acoplado covalentemente capaz de formar una triple
hélice con dicho segundo ADN bicatenario por hibridación con una
secuencia específica en el mismo, (ii) recuperar la disolución que
pasa a través del primer soporte, y (iii) pasar la disolución
recuperada a través de un segundo soporte que comprende un
oligonucleótido acoplado covalentemente capaz de formar una triple
hélice con dicho primer ADN bicatenario por hibridación con una
secuencia específica en el mismo, en el que el oligonucleótido capaz
de formar una triple hélice con dicho primer ADN bicatenario
comprende la secuencia TTCTTTTTTTTCTT (SEQ ID NO:30) y el
oligonucleótido capaz de formar una triple hélice con dicho segundo
ADN bicatenario comprende la secuencia TCTTTTTTTCCT (SEQ ID
NO:28).
5. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la disolución es un lisado
celular.
6. El método según la reivindicación 5, en el
que el lisado celular es un lisado aclarado.
7. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que se purifica el ADN
bicatenario.
8. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la secuencia específica se ha
introducido artificialmente dentro del ADN bicatenario o está
presente de manera natural en el ADN bicatenario.
9. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el oligonucleótido se acopla al
soporte a través de un enlace disulfuro, tioéter, éster, amida o
amina.
10. El método según la reivindicación 9, en el
que el oligonucleótido se enlaza a la columna vía un brazo que
comprende una cadena de carbono (CH_{2})_{n} en la que n
es un número entero entre 1 y 18 inclusive, y en el que el brazo
está unido al oligonucleótido por un fosfato y a la columna por un
enlace amida.
11. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el oligonucleótido posee por lo
menos una modificación química que lo hace resistente a o protegido
contra nucleasas, o que aumenta su afinidad por la secuencia
específica.
12. El método según la reivindicación 11, en el
que por lo menos una de las citosinas del oligonucleótido está
metilada.
13. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el ADN bicatenario es un ADN
circular.
14. El método según la reivindicación 13, en el
que el ADN circular es un plásmido.
15. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que la secuencia específica presente
en el ADN bicatenario comprende varias posiciones para la
hibridación con el oligonucleótido.
16. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que el soporte es un soporte
cromatográfico funcionalizado, una superficie plástica
funcionalizada o microesferas de látex funcionalizadas.
17. El método según la reivindicación 16, en el
que el soporte es un soporte cromatográfico funcionalizado.
18. El método según la reivindicación 17, en el
que el ADN bicatenario purificado tiene un contenido en ADN
cromosómico menor de o igual a 0,5%.
19. El método según la reivindicación 18, en el
que el ADN bicatenario purificado tiene un contenido en ADN
cromosómico menor de o igual a 0,01%.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/580,923 US6319672B1 (en) | 1994-12-16 | 2000-05-26 | Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide |
| US580923 | 2000-05-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2298239T3 true ES2298239T3 (es) | 2008-05-16 |
Family
ID=24323138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01937755T Expired - Lifetime ES2298239T3 (es) | 2000-05-26 | 2001-05-25 | Purificacion de una formacion de triple helice con oligonucleotido inmovilizado. |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1290156B1 (es) |
| JP (1) | JP4803945B2 (es) |
| KR (1) | KR100853040B1 (es) |
| CN (1) | CN1446258B (es) |
| AT (1) | ATE382688T1 (es) |
| AU (3) | AU6345901A (es) |
| BR (1) | BR0111145B1 (es) |
| CA (1) | CA2410263C (es) |
| CZ (1) | CZ303086B6 (es) |
| DE (1) | DE60132200T2 (es) |
| DK (1) | DK1290156T3 (es) |
| ES (1) | ES2298239T3 (es) |
| HU (1) | HU228891B1 (es) |
| IL (2) | IL152860A0 (es) |
| MX (1) | MXPA02011463A (es) |
| NO (1) | NO330571B1 (es) |
| NZ (1) | NZ522860A (es) |
| PT (1) | PT1290156E (es) |
| RU (1) | RU2315104C2 (es) |
| SK (1) | SK287662B6 (es) |
| WO (1) | WO2001092511A2 (es) |
| ZA (1) | ZA200209579B (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005100542A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-10-27 | Centelion | Method for purifying plasmid dna |
| SI1737945T1 (sl) * | 2004-04-19 | 2011-05-31 | Aventis Pharma Sa | Postopek za čiščenje plazmidne DNA |
| WO2017186815A1 (en) * | 2016-04-26 | 2017-11-02 | Proqr Therapeutics Ii B.V. | Antisense oligonucleotides for enhanced expression of frataxin |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5681940A (en) * | 1994-11-02 | 1997-10-28 | Icn Pharmaceuticals | Sugar modified nucleosides and oligonucleotides |
| FR2728264B1 (fr) * | 1994-12-16 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise |
| FR2731014B1 (fr) * | 1995-02-23 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Molecules d'adn, preparation et utilisation en therapie genique |
| FR2746412B1 (fr) * | 1996-03-21 | 1998-06-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Purification d'adn plasmidique de qualite pharmaceutique |
| IL138624A0 (en) | 1998-03-24 | 2001-10-31 | Aventis Pharma Sa | Nucleic acid transfer vectors, compositions containing same and uses |
-
2001
- 2001-05-25 EP EP01937755A patent/EP1290156B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-25 CA CA2410263A patent/CA2410263C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-25 DK DK01937755T patent/DK1290156T3/da active
- 2001-05-25 BR BRPI0111145-0A patent/BR0111145B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 JP JP2002500703A patent/JP4803945B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-25 ES ES01937755T patent/ES2298239T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-25 CN CN018101682A patent/CN1446258B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-25 RU RU2002135091/13A patent/RU2315104C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 AU AU6345901A patent/AU6345901A/xx active Pending
- 2001-05-25 SK SK1660-2002A patent/SK287662B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 IL IL15286001A patent/IL152860A0/xx unknown
- 2001-05-25 NZ NZ522860A patent/NZ522860A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 AU AU2001263459A patent/AU2001263459B2/en not_active Ceased
- 2001-05-25 AT AT01937755T patent/ATE382688T1/de active
- 2001-05-25 DE DE60132200T patent/DE60132200T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-25 PT PT01937755T patent/PT1290156E/pt unknown
- 2001-05-25 MX MXPA02011463A patent/MXPA02011463A/es active IP Right Grant
- 2001-05-25 CZ CZ20023865A patent/CZ303086B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 HU HU0302565A patent/HU228891B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 KR KR1020027015971A patent/KR100853040B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 WO PCT/US2001/017122 patent/WO2001092511A2/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-11-20 NO NO20025567A patent/NO330571B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-11-25 ZA ZA200209579A patent/ZA200209579B/en unknown
-
2007
- 2007-06-15 AU AU2007202804A patent/AU2007202804B8/en not_active Ceased
-
2009
- 2009-01-11 IL IL196444A patent/IL196444A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2009045070A (ja) | 固定化させたオリゴヌクレオチドと三重らせんを形成させることによるｄｎａ精製 | |
| US8399636B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide | |
| KR100502116B1 (ko) | 약제성 플라스미드 디엔에이의 정제 | |
| ES2298239T3 (es) | Purificacion de una formacion de triple helice con oligonucleotido inmovilizado. | |
| AU2001263459A1 (en) | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide | |
| PL206844B1 (pl) | Sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA | |
| IL152860A (en) | Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide |