PL206844B1 - Sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA - Google Patents
Sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA Download PDFInfo
- Publication number
- PL206844B1 PL206844B1 PL359265A PL35926501A PL206844B1 PL 206844 B1 PL206844 B1 PL 206844B1 PL 359265 A PL359265 A PL 359265A PL 35926501 A PL35926501 A PL 35926501A PL 206844 B1 PL206844 B1 PL 206844B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- double
- stranded dna
- oligonucleotide
- sequence
- dna
- Prior art date
Links
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 title claims description 106
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 claims description 161
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 31
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 22
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 13
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 claims description 12
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 229920002759 Circular DNA Polymers 0.000 claims description 8
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 claims description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 claims description 4
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 claims description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000126 Latex Polymers 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- 230000002633 protecting Effects 0.000 claims description 3
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 41
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 8
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M Potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 5
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 5
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M Caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- -1 lipopolysaccharides) Chemical class 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 description 4
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 4
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N DEOXYTHYMIDINE Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M Sodium chlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)=O YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102100015207 VEGFB Human genes 0.000 description 2
- 101700070240 VEGFB Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 description 2
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography media Substances 0.000 description 2
- 230000001808 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-Bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CN=C2[C]1C(Cl)=C(Br)C=C2 BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2,3-dimethylquinoxaline Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N=C(C)C(C)=NC2=C1 CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-Hydroxyadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M AC1L4ZKD Chemical compound [O-]I(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100008450 AFP Human genes 0.000 description 1
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N Cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000030933 DNA methylation on cytosine Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 229960000301 Factor VIII Drugs 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101700014779 GLB1 Proteins 0.000 description 1
- 241000447437 Gerreidae Species 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-hydroxy-Succinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010008267 Nerve Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- BEQRNMYYQZTIJC-UHFFFAOYSA-N OP([O-])NN1CCOCC1 Chemical compound OP([O-])NN1CCOCC1 BEQRNMYYQZTIJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidite Chemical compound NP([O-])[O-] LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M Sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229940104230 Thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229940035893 Uracil Drugs 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Vitamin C Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 101700047627 deoR Proteins 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N ethanolamine Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 108060003167 galK Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 101710030587 ligN Proteins 0.000 description 1
- 101700077585 ligd Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011528 polyamide (building material) Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 101700084252 recA1 Proteins 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002142 suicide Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical class [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
Description
Opis patentowy przedrukowano ze wzgl edu na zauwa zone bledy (54) Sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA (30) Pierwsze nstwo: 26.05.2000, US, 09/580,923 (43) Zg loszenie og loszono: 23.08.2004 BUP 17/04 (45) O udzieleniu patentu og loszono: 30.09.2010 WUP 09/10 (73) Uprawniony z patentu: CENTELION S.A.S., Vitry sur seine, FR (72) Twórca(y) wynalazku: JOEL CROUZET, Sceaux, FR DANIEL SCHERMAN, Pary z, FR PIERRE WILS, Oakland, US FRANCIS BLANCHE, Pary z, FR BEATRICE CAMERON, Pary z, FR (74) Pe lnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczy nska PL 206844 B1PL 206 844 B1 2 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku s a sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA z roztworu. Tlo wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów oczyszczania DNA. Sposoby wed lug wynalazku umo z- liwiaj a szybkie oczyszczenie farmakologicznie u zytecznego dwuniciowego DNA. Bardziej szczegó lowo, sposoby oczyszczania wed lug wynalazku obejmuj a specyficzn a hybrydyzacj e mi edzy sekwencj a DNA a oligonukleotydem. Techniki terapii genowej i komórkowej ulegaj a obecnie niezwyk lemu rozwojowi. Jednak ze, te tech- niki wymagaj a mo zliwo sci wytworzenia du zych ilo sci DNA o farmaceutycznej czysto sci. W efekcie, w tych nowych terapiach, lek cz esto sk lada si e z samego DNA i niezb edna jest mo zliwo sc wytwarza- nia go w odpowiednich ilo sciach, izolowania i oczyszczania w sposób dostosowany do terapeutyczne- go stosowania u cz lowieka. W ostatnich latach mo zliwo sc wstrzykiwania plazmidowego DNA dla terapii genowej lub szcze- pienia zosta la wykazana przez liczne doniesienia pokazuj ace, ze ekspresyjne wektory DNA mog a by c pobierane przez ró zne typy komórek, a geny kodowane przez te plazmidy mog a w nast epstwie ulega c ekspresji (Ledley, 1995 Hum. Gene Ther. 6, 1129). Geny interesuj ace z punktu widzenia terapii genowej lub zastosowa n w szczepieniu mog a obej- mowa c, na przyk lad, gen supresora nowotworu, geny samobójcze lub sekwencje antysensowne. Mog a one równie z kodowa c bia lka, takie jak alfa-fetoproteina AFP (Morinaga, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4604), enzymy, hormony, cytokiny, czynniki wzrostowe, takie jak FGF (Jouanneau i wsp., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2893) lub VEGFB (Olofsson B i wsp., 1996, Proceedings 93, 576), czynniki krzepni ecia, takie jak czynnik VIII z delecj a B (Truett i wsp., 1985, DNA 4, 333), apoli- poproteiny, neuroprzeka zniki, czynniki neurotroficzne, naturaln a lub chimerow a immunoglobulin e. U zywane s a tak ze geny reporterowe, takie jak lacZ koduj acy ß-galaktozydaz e Escherichia coli. Zasadniczymi wyzwaniami dla stosowania plazmidowego DNA jako wektora dostarczaj acego geny u cz lowieka s a i) wytwarzanie i ii) czystosc tego srodka farmaceutycznego. Technologie wytwa- rzania wektorów plazmidowych o du zej liczbie kopii w gospodarzach Escherichia coli zosta ly ostatnio opracowane. Plazmidy u zywane obecnie s a albo plazmidami pochodnymi ColE1, takimi jak pBR322, pUC lub pBluescript (Lahijani i wsp., 1996, Hum. Gene Ther., 7, 1971) lub plazmidami pCOR (Soubrier i wsp., 1999, Gene Therapy, 6, 1482). Drug a wa zn a spraw a zwi azan a z u zyciem plazmidowego DNA jako wektora do terapii genowej jest czysto sc samego wektora plazmidowego. Obecne metody oczyszczania, takie jak ultrawirowanie w gradientach CsCl lub chromatografia mog a by c nieefektywne przy usuwaniu zanieczyszcze n, takich jak genomowy DNA i RNA gospodarza lub bia lka. W szczególno sci genomowy DNA, którego struktura chemiczna jest bardzo zbli zona do plazmidowego DNA, jest niezwykle trudny do usuni ecia przy u zyciu klasycznej chromatografii. Typowo w preparatach plazmidowych uzyskiwanych przez klasyczn a chro- matografi e stwierdza si e st ezenia genomowego DNA gospodarza a z do 0,5 do 1%. Dlatego te z, aby móc wykorzystywa c plazmidowy DNA jako bezpieczny wektor dla ludzkiej terapii genowej, potrzebne s a technologie oczyszczania, które obniza zawartosc genomowego DNA gospodarza do znacznie ni z- szych poziomów, zazwyczaj 0,1% lub nawet 0,01% albo ni zszych. Niniejszy wynalazek opisuje prosty i szczególnie efektywny nowy sposób oczyszczania DNA. Umo zliwia on w szczególno sci uzyskanie wyj atkowo wysokiej czysto sci przy du zej wydajno sci. Spo- sób wed lug wynalazku jest zasadniczo oparty na specyficznym oddzia lywaniu pomi edzy sekwencj a wstawion a do DNA, które ma by c oczyszczone i oligonukleotydem z lo zonym z naturalnych lub zmody- fikowanych zasad. Ostatnio wykazano, ze niektóre oligonukleotydy s a zdolne do specyficznego oddzia lywania w wi ekszym rowku podwójnej helisy DNA, tworz ac lokalnie potrójne helisy, co prowadzi do zahamo- wania transkrypcji docelowych genów (Hélène i Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Te oligonukleotydy wybiórczo rozpoznaj a podwójn a helis e DNA w sekwencjach oligopurynowo- oligopirymidynowych, to znaczy w regionach posiadaj acych sekwencj e oligopurynow a na jednej nici oraz sekwencj e oligopirymidynow a na nici komplementarnej i tworz a w tych miejscach lokalnie potrój- n a helis e. Zasady trzeciej nici (oligonukleotydu) tworz a wi azania wodorowe (wi azania Hoogsteena lub odwrotne wi azania Hoogsteena) z purynami par zasad typu Watsona-Cricka. Wykorzystanie tego typu oddzia lywania do izolowania plazmidu zosta lo opisane w stanie tech- niki. Tak wi ec, Ito i wsp. (PNAS 89 (1992) 495) opisuj a u zycie biotynylowanych oligonukleotydów zdol-PL 206 844 B1 3 nych do rozpoznawania okre slonej sekwencji plazmidu i tworzenia z ni a potrójnej helisy. Utworzonym w ten sposób kompleksom zapewnia si e kontakt z kulkami magnetycznymi op laszczonymi streptawi- dyn a. Oddzia lywanie miedzy biotyn a i streptawidyn a umozliwia nast epnie oczyszczenie plazmidu po- przez magnetyczne rozdzielenie kulek, po którym nast epuje wymywanie. Jednak ze, ten sposób ma pewne wady. W szczególno sci, potrzebne s a dwa nast epuj ace po sobie specyficzne oddzia lywania, pierwsze mi edzy oligonukleotydem a plazmidem oraz drugie pomi edzy biotynylowanym kompleksem a kulkami streptawidynowymi. Ponadto, ko ncowy roztwór mo ze by c zanieczyszczony biotynylowanym oligonukleotydem, który nie mo ze by c u zywany w sk ladzie kompozycji farmaceutycznej. Streszczenie wynalazku Zgodnie z wynalazkiem opisano udoskonalone sposoby oczyszczania DNA przy wykorzystaniu tego typu oddzia lywania. Bardziej szczegó lowo, w sposobach wed lug wynalazku stosuje si e oligonu- kleotydy po laczone kowalencyjnie z no snikiem. Sposoby te s a szczególnie szybkie i prowadz a do szcze- gólnie du zej wydajno sci oraz stopnia czysto sci. Ponadto, umo zliwiaj a one oczyszczenie DNA ze z lo- zonych mieszanin zawieraj acych w szczególno sci inne kwasy nukleinowe, bia lka, endotoksyny (takie jak lipopolisacharydy), nukleazy i tym podobne. U zywane no sniki mog a by c dodatkowo latwo odzys- kane, a otrzymywany DNA wykazuje ulepszone w la sciwo sci bezpiecze nstwa farmaceutycznego. W koncu, sposoby te wymagaj a tylko jednego etapu, w przeciwie nstwie do wcze sniejszych doniesie n. Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania dwuniciowego DNA z roztworu zawieraj ace- go dwuniciowy DNA zmieszany z innymi sk ladnikami, polegaj acy na tym, ze obejmuje etap, w którym przepuszcza si e roztwór przez no snik zawieraj acy przy laczony kowalencyjnie oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e ze specyficzn a sekwencj a obecn a w dwuniciowym DNA bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, przy czym przylaczo- ny kowalencyjnie oligonukleotyd zawiera sekwencj e TCTTTTTTTCCT (SEK NR ID: 28) albo TTCTTT- TTTTTCTT (SEK NR ID: 30). Przedmiotem wynalazku jest równie z sposób oczyszczania dwuniciowego DNA z roztworu za- wierajacego dwuniciowy DNA zmieszany z innymi sk ladnikami, polegaj acy na tym, ze obejmuje etap, w którym przepuszcza si e roztwór przez no snik zawieraj acy przy laczony kowalencyjnie oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e ze specyficzn a sek- wencj a obecn a w dwuniciowym DNA bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, przy czym przy laczony kowalencyjnie oligonukleotyd zawiera sekwencj e AGAAAAAAAGGA (SEK NR ID: 27) albo AAGAAAAAAAAGAA (SEK NR ID: 29). Przedmiotem wynalazku jest tak ze sposób oczyszczania pierwszego dwuniciowego DNA z roz- tworu zawieraj acego pierwszy dwuniciowy DNA i drugi dwuniciowy DNA, polegaj acy na tym, ze obej- muje etapy, w których (i) przepuszcza si e roztwór przez pierwszy no snik, zawieraj acy kowalencyjnie przy laczony oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z drugim dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z obecn a w nim okre slon a sekwencj a bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, (ii) odzyskuje si e roztwór, który przechodzi przez pierwszy no snik i (iii) przepuszcza si e odzyskany roztwór przez drugi no snik, zawieraj acy kowalencyjnie przy laczony oligonukleotyd, zdolny do tworzenia potrójnej helisy z pierwszym dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z okre slon a sekwencj a tego pierwszego dwuniciowego DNA bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, przy czym specy- ficzna sekwencja obecna w pierwszym dwuniciowym DNA zawiera sekwencj e AAGAAAAAAAAGAA (SEK NR ID: 29), a specyficzna sekwencja obecna w drugim dwuniciowym DNA zawiera sekwencj e AGAAAAAAAGGA (SEK NR ID: 27). Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób oczyszczania pierwszego dwuniciowego DNA z roz- tworu zawieraj acego pierwszy dwuniciowy DNA i drugi dwuniciowy DNA, polegaj acy na tym, ze obej- muje etapy, w których (i) przepuszcza si e roztwór przez pierwszy no snik, zawieraj acy kowalencyjnie przy laczony oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z drugim dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z obecn a w nim okre slon a sekwencj a bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, (ii) odzyskuje si e roztwór, który przechodzi przez pierwszy no snik i (iii) przepuszcza si e odzyskany roztwór przez drugi no snik, zawieraj acy kowalencyjnie przy laczony oligonukleotyd, zdolny do tworze- nia potrójnej helisy z pierwszym dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z okre slon a sekwencj a tego pierwszego dwuniciowego DNA bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, przy czym oligo- nukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z pierwszym dwuniciowym DNA zawiera sekwencj e TTCTTTTTTTTCTT (SEK NR ID: 30), a oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z drugim dwuniciowym DNA zawiera sekwencj e TCTTTTTTTCCT (SEK NR ID: 28). Korzystnie w sposobach opisanych powy zej jako roztwór stosuje si e lizat komórkowy.PL 206 844 B1 4 Korzystniej jako lizat komórkowy stosuje si e klarowany lizat. Korzystnie w sposobach opisanych powy zej dwuniciowy DNA wst epnie oczyszcza si e. Korzystnie w sposobach opisanych powy zej jako specyficzn a sekwencj e stosuje si e sekwencj e, która zosta la wprowadzona sztucznie do dwuniciowego DNA lub która jest obecna naturalnie w dwu- niciowym DNA. Korzystnie w sposobach opisanych powyzej stosuje si e oligonukleotyd po laczony z no snikiem wi azaniem dwusiarczkowym, tioeterowym, estrowym, amidowym albo aminowym. Korzystniej stosuje si e oligonukleotyd po laczony z kolumn a poprzez rami e zawieraj ace lancuch w eglowy (CH 2 ) n , gdzie n to liczba ca lkowita mi edzy 1 a 18 w lacznie, i gdzie rami e jest po laczone z oligo- nukleotydem przez fosforan a z kolumn a przez wi azanie amidowe. Korzystnie w sposobach opisanych powy zej stosuje si e oligonukleotyd posiadaj acy co najmniej jedn a modyfikacj e chemiczn a, czyni ac a go odpornym na nukleazy lub chroni ac a go przed nukleazami albo zwi ekszaj ac a jego powinowactwo do specyficznej sekwencji. Korzystniej co najmniej jedna cytozyna oligonukleotydu jest metylowana. Korzystnie w sposobach opisanych powy zej jako dwuniciowy DNA stosuje si e DNA kolisty. Korzystniej jako DNA kolisty stosuje si e plazmid. Korzystnie w sposobach opisanych powy zej jako specyficzn a sekwencj e obecn a w dwunicio- wym DNA stosuje si e sekwencj e zawieraj ac a kilka pozycji dla hybrydyzacji z oligonukleotydem. Korzystnie w sposobach opisanych powy zej jako no snik stosuje si e no snik chromatograficzny z grup a funkcyjn a, powierzchni e plastykow a z grup a funkcyjn a lub kulki lateksowe z grup a funkcyjn a. Korzystniej jako no snik stosuje si e no snik chromatograficzny z grup a funkcyjn a. Jeszcze korzystniej oczyszczony dwuniciowy DNA ma zawarto sc chromosomowego DNA mniej- sz a ni z lub równ a 0,5%. Najkorzystniej oczyszczony dwuniciowy DNA ma zawarto sc chromosomowego DNA mniejsz a ni z lub równ a 0,01%. A zatem, zgodnie z wynalazkiem opisano sposób oczyszczania dwuniciowego DNA, wed lug któ- rego roztwór zawieraj acy ten DNA zmieszany z innymi sk ladnikami przepuszcza si e przez no snik, z którym po laczony jest kowalencyjnie oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy poprzez hybrydyzacj e ze specyficzn a sekwencj a obecn a w tym DNA. Ta specyficzna sekwencja mo ze by c sek- wencj a naturalnie obecn a w dwuniciowym DNA lub te z syntetyczn a sekwencj a wprowadzon a sztucz- nie do tego ostatniego. Oligonukleotydy stosowane w niniejszym wynalazku s a oligonukleotydami, które hybrydyzuj a bezpo srednio z dwuniciowym DNA. Te oligonukleotydy mog a zawiera c nast epuj ace zasady: – tymidyn e (T), która ma zdolno sc tworzenia trypletów z dubletami A.T dwuniciowego DNA (Ra- jagopal i wsp., Blochem 28 (1989) 7859); – adenin e (A), która ma zdolnosc tworzenia trypletów z dubletami A.T dwuniciowego DNA; – guanin e (G), która ma zdolnosc tworzenia trypletów z dubletami G.C dwuniciowego DNA; – protonowan a cytozyn e (C+), która ma zdolno sc tworzenia trypletów z dubletami G.C dwuni- ciowego DNA (Rajagopal i wsp., jak wy zej); – uracyl (U), który ma zdolno sc tworzenia trypletów z parami zasad A.U lub A.T. Zalecane jest stosowanie oligonukleotydu zawieraj acego bogat a w cytozyn e sekwencj e homo- pirymidynow a, a zalecan a specyficzn a sekwencj a obecn a w DNA jest sekwencja homopurynowo-ho- mopirymidynowa. Obecno sc cytozyn umo zliwia otrzymanie potrójnej helisy, która jest stabilna w kwa s- nym pH, gdzie cytozyny s a protonowane, a destabilizowana w zasadowym pH, gdzie cytozyny s a neu- tralizowane. Aby pozwoli c na utworzenie potrójnej helisy, wa zne jest zeby oligonukleotyd i specyficzna sek- wencja obecna w DNA by ly komplementarne. W zwi azku z tym, aby uzyska c najlepsz a wydajno sc i najlepsz a selektywno sc, w sposobie wed lug wynalazku u zywane s a oligonukleotyd i specyficzna sekwencja, które s a w pe lni komplementarne. Mog a by c to w szczególno sci oligonukleotyd poli (CTT) i specyficzna sekwencja poli (GAA). Jako przyk lad mo zna wymieni c oligonukleotyd o sekwencji 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT) 7 ; SEK NR ID: 1), w którym zasady GAGG nie tworz a potrójnej helisy, ale umo zliwiaj a oddzielenie oligonukleotydu od ramienia lacz acego; sek- wencja (CTT) 7 (SEK NR ID: 26) mo ze równie z zosta c wymieniona. Te oligonukleotydy s a zdolne do tworzenia potrójnej helisy ze specyficzn a sekwencj a zawieraj ac a komplementarne jednostki (GAA). Sekwencja, o której mowa, mo ze w szczególno sci by c regionem zawieraj acym 7, 14 lub 17 jednostek GAA, jak opisano w przyk ladach.PL 206 844 B1 5 Inn a sekwencj a b ed ac a przedmiotem szczególnego zainteresowania jest sekwencja: 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEK NR ID: 5). Ta sekwencja tworzy potrójn a helis e z oli- gonukleotydami 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEK NR ID: 6) lub 5'-TTGGTGTGGTGGGTG- GGTT-3' (SEK NR ID: 7). W tym przypadku, oligonukleotyd wi aze si e w orientacji antyrównoleg lej do nici polipurynowej. Te potrójne helisy s a stabilne tylko w obecno sci Mg 2+ Vasquez i wsp., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal i Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363). Jak nadmieniono powy zej, specyficzna sekwencja mo ze by c sekwencj a naturalnie wyst epuj ac a w dwuniciowym DNA lub syntetyczn a sekwencj a wprowadzon a sztucznie do tego ostatniego. Szcze- gólnie zalecane jest stosowanie oligonukleotydu zdolnego do tworzenia potrójnej helisy z sekwencj a naturalnie obecn a w dwuniciowym DNA, na przyklad w miejscu startu replikacji plazmidu lub w genie markerowym. W zwi azku z tym, Zg laszaj acy przeprowadzi l analizy sekwencji plazmidów i by l w stanie wykaza c, ze niektóre regiony tych DNA, w szczególno sci miejsca startu replikacji, mog a posiada c regio- ny homopurynowo-homopirymidynowe. Synteza oligonukleotydów zdolnych do tworzenia potrójnych helis z tymi naturalnymi regionami homopurynowo-homopirymidynowymi umo zliwia dogodne zasto- sowanie sposobu wed lug wynalazku do niezmienionych plazmidów, w szczególno sci komercyjnych plazmidów typu pUC, pBR322, pSV i tym podobnych. W sród sekwencji homopurynowo-homopirymi- dynowych naturalnie wyst epuj acych w dwuniciowym DNA mozna wymieni c sekwencj e zawieraj ac a ca lo sc lub cz esc sekwencji 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEK NR ID: 2), obecn a w miejscu startu replikacji plazmidu ColE1 E. coli. W tym przypadku, oligonukleotyd tworz acy potrójn a helis e po- siada sekwencj e: 5'-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3' (SEK NR ID: 3) i wiaze si e na przemian do dwóch nici podwójnej helisy, jak opisano w Beal i Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) oraz Jayasena i Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Mo zna równie z wspomnie c sek- wencj e 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEKNRID: 4) genu ß-laktamazy plazmidu pBR322 (Duval-Valentin i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508). Dwie dodatkowe sekwencje docelowe, które mog a tworzy c struktury tripleksowe z okre slonymi oligonukleotydami, zosta ly zidentyfikowane w miejscach startu replikacji ColE1 oraz pCOR. Plazmidy pochodne ColE1 zawieraj a 12 merow a sekwencj e homopurynow a (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (SEK NR ID: 27), zmapowan a powy zej transkryptu RNA-II, zaanga zowanego w replikacj e plazmidu (Lacatena i wsp., 1981, Nature, 294, 623). Ta sekwencja tworzy stabiln a struktur e tripleksu z 12 merowym kom- plementarnym oligonukleotydem 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEK NR ID: 28). Rdze n pCOR zawiera ho- mopurynowy ci ag 14 nie powtarzaj acych si e zasad (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEK NR ID: 29), zlokalizowany w A+T-bogatym odcinku miejsca startu replikacji replikonu ? pCOR (Levchenko i wsp., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). Ta sekwencja tworzy stabiln a struktur e tripleksu z 14 merowym komplementarnym oligonukleotydem 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEK NR ID: 30). Odpowiadaj ace sobie oligonukleotydy 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEK NR ID: 28) oraz 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEK NR ID: 30) wydajnie i specyficznie rozpoznaj a odpowiednie sekwencje komplementarne zlokalizowane w obr ebie miejsca startu replikacji albo ori ColE1, albo pCOR (ori ?). W rzeczywisto sci, pojedyncza nie-kano- niczna triada (T*GC lub C*AT) mo ze skutkowa c ca lkowit a destabilizacj a struktury tripleksu. Zastosowanie oligonukleotydu zdolnego do tworzenia potrójnej helisy z sekwencj a obecn a w miejscu startu replikacji lub w genie markerowym jest szczególnie zalecane, jako ze umo zliwia ono, przy zastosowaniu tego samego oligonukleotydu, oczyszczenie jakiegokolwiek DNA zawieraj acego wspomniane miejsce startu replikacji lub wspomniany gen markerowy. St ad nie ma konieczno sci mo- dyfikowania plazmidu lub dwuniciowego DNA w celu wprowadzenia do niego sztucznej specyficznej sekwencji. Jakkolwiek zalecane s a sekwencje w pe lni komplementarne, jest jednak ze zrozumia le, ze pew- ne niedopasowania mi edzy sekwencj a oligonukleotydu a sekwencj a obecn a w DNA mog a by c tolero- wane, o ile nie prowadz a one do zbyt du zej utraty powinowactwa. Mo zna tu wspomnie c sekwencj e 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEK NR ID: 8), obecn a w genie ß-laktamazy E. coli. W tym przypad- ku, tymina przerywaj aca sekwencj e polipurynow a mo ze by c rozpoznawana przez guanin e trzeciej nici, tworz ac tym samym tryplet G*TA, który jest stabilny, je sli jest oflankowany przez dwa tryplety T*AT (Kiessling i wsp., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834). W konkretnym wykonaniu, oligonukleotydy tu opisane zawieraj a sekwencj e (CCT) n , sekwencj e (CT) n lub sekwencj e (CTT) n , w których n jest liczb a ca lkowit a, mieszcz ac a si e w przedziale mi edzy 1 i 15 lacznie. Szczególnie zalecane jest stosowanie sekwencji typu (CT) n lub (CTT) n . Zg laszaj acy wy- kaza l, w rezultacie, ze na wydajnosc oczyszczania wp lywa la ilo sc C w oligonukleotydzie. W szczegól-PL 206 844 B1 6 no sci, jak pokazano w przyk ladzie 7, wydajnosc oczyszczania wzrasta, gdy oligonukleotyd zawiera mniej cytozyn. Jest zrozumia le, ze oligonukleotydy tu opisane mog a zawiera c kombinacje jednostek (CTT), (CT) lub (CTT). U zywany oligonukleotyd mo ze by c naturalny (z lo zony z niezmienionych naturalnych zasad) lub chemicznie zmodyfikowany. W szczególno sci, oligonukleotyd mo ze posiada c pewne dogodne modyfi- kacje chemiczne, powoduj ace jego odporno sc lub jego ochron e przed nukleazami lub zwi ekszenie jego powinowactwa do okre slonej sekwencji. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem oligonukleotyd jest równie z rozumiany w znaczeniu jakiego- kolwiek po laczonego szeregu nukleozydów, które zosta ly poddane modyfikacji szkieletu w celu uczy- nienia go bardziej odpornym na nukleazy. W sród mo zliwych modyfikacji, fosforotioniany oligonukle- otydów, które s a zdolne do tworzenia potrójnych helis z DNA (Xodo i wsp., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), jak równie z oligonukleotydy posiadaj ace szkielety formacetalowe lub metylofosfonia- nowe (Matteucci i wsp., J. Am. Chem. Soc, 1991, 113, 7767-7768), mog a zosta c wymienione. Jest równie z mo zliwe stosowanie oligonukleotydów syntetyzowanych orzy u zyciu a-anomerów nukleoty- dów, które tak ze tworz a potrójne helisy z DNA (Le Doan i wsp., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749- -7760). Inn a modyfikacj a szkieletu jest po laczenie fosforoamidowe. Jako przyk lad mo zna wspomnie c mi edzynukleotydowe po laczenie fosforoamidowe N 3' -P 5' opisane przez Gryaznov i Chen, które daje oligonukleotydy tworz ace szczególnie stabilne potrójne helisy z DNA (J. Am. Chem. Soc, 1994, 116, 3143-3144). W sród innych modyfikacji szkieletu mo zna równie z wymieni c u zycie rybonukleotydów, 2'-0-metylorybozy, fosfodiestru itd. (Sun i Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Wresz- cie, szkielet bazuj acy na fosforze mo ze zosta c zast apiony szkieletem poliamidowym, jak w PNA (kwa- sach peptydylonukleinowych), które mog a równie z tworzy c potrójne helisy (Nielsen i wsp.. Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim i wsp., J. Am. Chem. Soc, 1993, 115, 6477-6481) lub szkieletem bazuj a- cym na guanidynie, jak w DNG (guanidynie deoksyrybonukleinowej, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101) lub polikationowymi analogami DNA, które równie z tworz a potrójne helisy. Tymina trzeciej nici mo ze równie z by c zast apiona przez 5-bromouracyl, który zwi eksza powino- wactwo oligonukleotydu do DNA (Povsic i Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1989, 111, 3059-3061). Trzecia ni c mo ze równie z zawiera c nienaturalne zasady, w sród których mo zna wspomnie c 7-deaza-2'-deo- ksyksantozyn e (Milligan i wsp., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-deoksy- ß-D-rybofurano- zylo)-3-metylo-5-amino-1H-pirazolo[4, 3-d]pirymidyno-7-on (Koh i Dervan, J.Am. Chem. Soc, 1992, 114, 1470-1478), 8-oksoadenin e, 2-aminopuryn e, 2'-0-metylopseudoizocytydyn e lub ka zd a inn a mo- dyfikacj e znan a specjali scie w tej dziedzinie (dla przegl adu patrz Sun i Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356). Inny typ modyfikacji oligonukleotydu ma na celu w szczególno sci poprawienie oddzia lywania i/lub powinowactwa pomi edzy oligonukleotydem i okre slon a sekwencj a. Konkretnie, najbardziej zalecana modyfikacja tu opisana polega na metylowaniu cytozyn oligonukleotydu (patrz przyk lad 5). Zmetylo- wany w ten sposób oligonukleotyd wykazuje godn a uwagi w la sciwo sc tworzenia stabilnej potrójnej helisy z okre slon a sekwencj a w zakresach pH bli zszych oboj etnemu ( = 5). St ad, umo zliwia to dzia lanie przy wy zszych warto sciach pH ni z w przypadku oligonukleotydów opisywanych wcze sniej, czyli przy warto sciach pH, w których ryzyko degradacji plazmidowego DNA jest znacznie mniejsze. D lugosc oligonukleotydu u zywanego w sposobie wed lug wynalazku wynosi przynajmniej 3 za- sady, a najlepiej mi edzy 5 a 30. Najbardziej zalecane jest stosowanie oligonukleotydu o d lugo sci wi ek- szej ni z 10 zasad. D lugosc mo ze by c dostosowana przez specjalist e w tej dziedzinie w ka zdym indy- widualnym przypadku w celu dopasowania po zadanej selektywno sci i stabilno sci oddzia lywania. Oligonukleotydy tu opisane mog a by c syntetyzowane przy u zyciu jakiejkolwiek znanej techniki. W szczególno sci, mog a one by c przygotowywane przy zastosowaniu syntetyzatorów kwasów nukle- inowych. Jakikolwiek inny sposób znany specjali scie w tej dziedzinie mo ze oczywi scie by c u zyty. Aby umo zliwi c kowalencyjne po laczenie oligonukleotydu z no snikiem, oligonukleotyd jest zazwy- czaj aktywowany przez dodanie grupy funkcyjnej. Mo ze on by c zatem zmieniony poprzez ko ncow a grup e tiolow a, aminow a lub karboksylow a w pozycji 5' lub 3'. W szczególno sci, dodanie grupy tiolowej, aminowej lub karboksylowej umo zliwia przyk ladowo polaczenie oligonukleotydu z no snikiem posiada- jacym grupy funkcyjne dwusiarczkowe, maleimidowe, aminowe, karboksylowe, estrowe, epoksydowe, bromocyjanogenowe lub aldehydowe. Te po laczenia tworz a si e przez utworzenie wi aza n dwusiarcz- kowych, tioeterowych, estrowych, amidowych lub aminowych pomi edzy oligonukleotydem a no sni- kiem. Jakikolwiek inny sposób znany specjali scie w tej dziedzinie mo ze by c u zyty, taki jak na przyk lad dwufunkcyjne odczynniki lacz ace.PL 206 844 B1 7 Ponadto, w celu poprawienia hybrydyzacji z przy laczonym oligonukleotydem, mo ze by c zaleca- ne, by oligonukleotyd zawiera l sekwencj e zasad „ramienia” oraz „odcinka rozdzielaj acego”. U zycie ramienia umo zliwia, w rezultacie, wi azanie oligonukleotydu w wybranej odleg lo sci od no snika, pozwa- laj ac na poprawienie warunków jego oddzia lywania z DNA. Rami e dogodnie sk lada si e z liniowego lancucha w eglowego, obejmuj acego 1 do 18, a najlepiej 6 lub 12 grup (CH 2 ) oraz amine, która pozwa- la na zwi azanie do kolumny. Rami e jest przy laczone do fosforanu oligonukleotydu lub „odcinka roz- dzielajacego” z lo zonego z zasad, które nie przeszkadzaj a w hybrydyzacji. Tak wi ec, „odcinek rozdzie- laj acy” mo ze zawiera c zasady purynowe. Jako przyk lad, „odcinek rozdzielaj acy” mo ze zawiera c sek- wencj e GAGG. Zalecane rami e jest z lo zone z liniowego la ncucha w eglowego z lo zonego z 6 lub 12 atomów w egla. W wykonaniach niniejszego wynalazku mog a by c u zywane ró zne typy no sników. Mog a to by c no sniki chromatograficzne z grup a funkcyjn a, nie upakowane lub uprzednio upakowane w kolumn e, powierzchnie plastykowe z grup a funkcyjn a lub kulki lateksowe, magnetyczne lub innego rodzaju z grup a funkcyjn a. Zalecane jest u zycie no sników chromatograficznych. Jako przyk lad, mo zliwe do wy- korzystania no sniki chromatograficzne to agaroza, akryloamid lub dekstran, jak równie z ich pochodne (takie jak Sephadex, Sepharose, Superose itd.), polimery takie jak poli(styren/diwinylobenzen), albo na przyk lad szczepiona lub nie szczepiona krzemionka. Kolumny chromatograficzne mog a dzia la c w sposób dyfuzyjny lub perfuzyjny. W celu uzyskiwania lepszych wydajno sci oczyszczania, szczególne zalecane jest stosowanie na plazmidzie sekwencji zawieraj acej kilka pozycji hybrydyzacji z oligonukleotydem. Obecno sc kilku pozycji hybrydyzacji sprzyja, w rezultacie, oddzia lywaniom mi edzy wspomnian a sekwencj a a oligonu- kleotydem, co prowadzi do poprawienia wydajno sci oczyszczania. Tak wi ec, w przypadku oligonukle- otydu zawieraj acego n powtórze n motywów (CCT), (CT) lub (CTT), zalecane jest stosowanie sekwen- cji DNA zawieraj acej przynajmniej n motywów komplementarnych, a zw laszcza n+1 motywów kom- plementarnych. Sekwencja nios aca n+1 motywów komplementarnych dostarcza w ten sposób dwie pozycje hybrydyzacji z oligonukleotydem. Dogodnie sekwencja DNA zawiera do 11 pozycji hybrydyza- cji, czyli n+10 motywów komplementarnych. Sposób wed lug niniejszego wynalazku mo ze by c u zyty do oczyszczania ka zdego rodzaju dwu- niciowego DNA. Przyk ladem tego ostatniego jest DNA kolisty, taki jak plazmid, zwykle nios acy jeden lub wi ecej genów wa znych terapeutycznie. Ten plazmid mo ze równie z niesc miejsce startu replikacji, gen markerowy i tym podobne. Sposób wed lug wynalazku mo ze by c stosowany bezpo srednio do lizatu komórkowego. W tym wykonaniu plazmid, powielony poprzez transformacj e, po której nast epuje hodowla komórek, jest oczyszczany bezpo srednio po lizie komórek. Sposób wed lug wynalazku mo ze by c równie z stosowany do klarowanego lizatu, czyli do supernatantu uzyskanego po neutralizacji i wi- rowaniu lizatu komórkowego. Mo ze on by c oczywi scie stosowany równie z do roztworu uprzednio oczyszczonego przy u zyciu znanych metod. Ten sposób pozwala równie z na oczyszczenie liniowego lub kolistego DNA nios acego istotn a sekwencj e z mieszaniny obejmuj acej cz asteczki DNA o ró znej sekwencji. Sposób wed lug wynalazku mo ze równie z by c u zywany do oczyszczania dwuniciowego DNA. Lizat komórkowy mo ze by c lizatem komórek prokariotycznych lub eukariotycznych. Co si e tyczy komórek prokariotycznych, bakterie E. coli, B. suhtilis, S. typhimurium lub Strepto- myces, mog a by c wymienione jako przyk lady. Je sli chodzi o komórki eukariotyczne, mo zna wymieni c komórki zwierz ece, dro zd ze, grzyby i tym podobne, a bardziej szczegó lowo dro zd ze Kluyveromyces lub Saccharomyces lub komórki COS, CHO, C127, NIH3T3 i tym podobne. Sposób wed lug wynalazku jest szczególnie dogodny, jako ze umo zliwia szybkie i latwe uzyska- nie plazmidowego DNA o bardzo wysokiej czysto sci. W szczególno sci, jak to zilustrowano w przyk la- dach, sposób ten umo zliwia efektywne oddzielenie plazmidowego DNA, o którym mowa, od sk ladni- ków zanieczyszczaj acych, takich jak pofragmentowany chromosomalny DNA, endotoksyny, bia lka, nuk- leazy i tym podobnych. Bardziej szczegó lowo, sposób wed lug wynalazku umo zliwia uzyskanie prepa- ratu dwuniciowego DNA, w szczególno sci pochodzenia plazmidowego, o zawarto sci chromosomalne- go DNA mniejszej ni z lub równej 0,5%. Otrzymywane preparaty DNA posiadaj a dogodnie zawarto sc chromosomalnego DNA mniejsz a ni z lub równ a 0,2%. A zatem niniejszy wynalazek opisuje mieszani- ny zawieraj ace plazmidowy DNA, który mo ze by c u zywany farmaceutycznie, w szczególno sci w terapii genowej lub komórkowej. W zwi azku z tym, zgodnie z wynalazkiem opisano równie z kompozycj e far- maceutyczn a zawieraj ac a dwuniciowy DNA, liniowy lub pochodzenia plazmidowego, otrzymany spo- sobem opisanym powy zej.PL 206 844 B1 8 Zgodnie z wynalazkiem opisano równie z preparaty plazmidowego DNA, posiadaj ace zawartosc chromosomalnego DNA mniejsz a ni z lub równ a 0,5%, zw laszcza mniejsz a ni z lub równ a 0,2%, a w szcze- gólno sci mniejsz a ni z lub równ a 0,1%, lub mniejsz a ni z lub równ a 0,01%. Jak zilustrowano w przyk la- dach poni zej, etap oddzia lywania oparty na powinowactwie tripleksu zosta l w laczony do procesu oczy- szczania poni zej klasycznych etapów chromatograficznych. Ten etap powinowactwa znacznie popra- wia czysto sc preparatu plazmidowego DNA, niezale znie od jego czysto sci pocz atkowej. Tworzenie stru- ktury tripleksu pomi edzy oligonukleotydem (kowalencyjnie zwi azanym do no snika chromatograficzne- go) i plazmidem b ed acym przedmiotem zainteresowania, który ma by c oczyszczony, zale zy od obec- no sci na plazmidzie sekwencji, która mo ze tworzy c struktur e tripleksu z oligonukleotydem. Ta struktura tripleksu jest stabilna tylko w kwa snym pH, gdzie cytozyny oligonukleotydu s a protonowane. Nast ep- nie, plazmidowy DNA jest wymywany z kolumny po prostu poprzez podwy zszenie pH do oboj etnego. Kompozycje mog a zawiera c plazmidowy DNA, który jest „nagi” lub po laczony z no snikami trans- portuj acymi, takimi jak liposomy, nanocz asteczki, lipidy kationowe, polimery, zrekombinowane wirusy lub bia lka i tym podobne. W jednym wykonaniu, sposób wed lug niniejszego wynalazku mo ze by c u zyty do oczyszczania jednego rodzaju dwuniciowego DNA z mieszaniny zawieraj acej dwa lub wi ecej DNA ró znego rodzaju i o ró znej sekwencji. Ten sposób mo ze by c stosowany bezpo srednio do lizatu komórkowego, w którym dwuniciowe DNA, powielone poprzez hodowl e komórkow a, s a oczyszczane po zlizowaniu hodowa- nych komórek. Ten sposób mo ze równie z by c stosowany do klarowanego lizatu, czyli do supernatantu otrzymanego po neutralizacji i zwirowaniu lizatu komórkowego. Sposób ten mo ze by c ponadto stoso- wany do uprzednio oczyszczonego roztworu. Bardziej precyzyjnie, sposób oczyszczania pierwszego dwuniciowego DNA z roztworu zawiera- j acego pierwsze i drugie dwuniciowe DNA obejmuje (i) przepuszczenie roztworu przez pierwszy no snik, zawieraj acy kowalencyjnie polaczony oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z drugim dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z obecn a w nim okre slon a sekwencj a, (ii) odzyskanie roz- tworu, który przechodzi przez pierwszy no snik, który b edzie wzbogacony w niezwi azany, pierwszy dwuniciowy DNA i (iii) przepuszczenie odzyskanego roztworu przez drugi no snik, zawieraj acy kowa- lencyjnie przy laczony oligonukleotyd, zdolny do tworzenia potrójnej helisy przez hybrydyzacj e z okre- slon a sekwencja tego pierwszego dwuniciowego DNA. Po ewentualnym etapie p lukania, pierwszy dwuniciowy DNA mo ze zosta c wymyty z drugiego no snika. Stosuj ac ten podwójny sposób oczyszcza- nia, pierwszy dwuniciowy DNA mo ze zosta c odzyskany z drugiego no snika bez zadnych wykrywalnych sladów drugiego dwuniciowego DNA. W konkretnym wykonaniu niniejszego wynalazku, pierwsza cz asteczka dwuniciowego DNA jest plazmidem pCOR, posiadaj acym specyficzn a sekwencj e 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEK NR ID: 29), która tworzy stabiln a struktur e tripleksu z oligonukleotydem posiadaj acym sekwencj e 5'-TTCTTTTT- TTTCTT-3' (SEK NR ID: 30). Druga cz asteczka dwuniciowego DNA jest plazmidem pochodnym ColE1 posiadaj acym specyficzn a sekwencj e 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEK NR ID: 27), która tworzy tripleks z oligonukleotydem posiadaj acym sekwencj e 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEK NR ID: 28). Zatem, plazmid pCOR jest dogodnie oczyszczany z roztworu zawieraj acego inne plazmidy, takie jak plazmidy pocho- dne ColE1 poprzez u zycie podwójnego sposobu oczyszczania wed lug niniejszego wynalazku. Niniejsze zg loszenie zostanie opisane bardziej szczegó lowo poprzez nast epuj ace dalej przy- k lady, które powinny by c uwa zane za ilustracyjne i nieograniczaj ace. Szczegó lowy opis Ogólne techniki klonowania i biologii molekularnej Tradycyjne metody klonowania i biologii molekularnej, takie jak trawienie enzymami restrykcyj- nymi, elektroforeza w zelu, transformacja E. coli, wytr acanie kwasów nukleinowych i temu podobne s a opisane w literaturze (Maniatis i wsp., T., E. F. Fritsch i J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a labo- ratory manual, wydanie drugie. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman i K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York.). Sekwen- cje nukleotydowe ustalano poprzez metod e terminacji lancuchów wed lug opublikowanych uprzednio protoko lów (Ausubel i wsp., 1987). Enzymy restrykcyjne by ly dostarczone przez New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs). W celu przeprowadzenia ligacji, fragmenty DNA inkubuje si e w buforze zawieraj acym 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 2 mM ATP w obecno sci ligazy DNA faga T4 (Biolabs).PL 206 844 B1 9 Oligonukleotydy syntetyzuje si e przy zastosowaniu reakcji chemicznych z fosforamidytami, gdzie fosforamidyty s a chronione w pozycji ß przez grup e cyjanoetylow a (Sinha, N. D., J. Biernat, J. McMa- nus i H. Köster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of ß-cyanoethyl-N, N-di- alkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., List./Grudz.) z zastosowaniem auto- matycznego syntetyzatora DNA Biosearch 8600 zgodnie z zaleceniami producenta. Poddawane ligacji DNA albo DNA do testowania pod k atem skuteczno sci transformacji s a u zy- wane do transformacji nast epuj acych uczynionych kompetentnymi szczepów: E. coli DH5 a[F/endAl, hsdR17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, ?(lacZYA-arqF)U169, deoR, f80dlac (1acZ ?M15)] (dla dowolnego plazmidu Gol E1) lub E. coli XAC-pir (dla dowolnego plazmidu pochodnego pCor). Minipreparaty plazmidowego DNA wykonuje si e zgodnie z protoko lem Klein i wsp., 1980. Do hodowania szczepów E. coli u zywa si e po zywk e hodowlan a LB (Maniatis i wsp., 1982). Szczepy inkubuje si e w 37°C. Bakterie wysiewa si e na p lytki z po zywk a LB uzupe lnion a odpowiednimi antybiotykami. P r z y k l a d 1 1.1. Przygotowanie kolumny Wyposa zenie U zywan a kolumna jest 1 ml kolumna HiTrap aktywowana NHS (N-hydroksysukcynimidem, Pharmacia) po laczona z pomp a perystaltyczn a (wyp lyw < 1 ml/min). U zyty specyficzny oligonukleotyd posiada grup e NH 2 na ko ncu 5', a sekwencja jest nast epuj aca: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEK NR ID: 1) Bufory u zyte w tym przyk ladzie s a nast epuj ace: Bufor do laczenia: 0,2 M NaHCO 3 , 0,5 M NaCl, pH 8,3. Bufor A: 0,5 M etanoloamina, 0,5 M NaCl, pH 8,3. Bufor B: 0,1 M octan, 0,5 M NaCl, pH 4. Metoda Kolumn e p lucze si e 6 ml 1 mM HCl i oligonukleotyd rozcie ncza si e w buforze do laczenia (50 nmol w 1 ml) nak lada si e na kolumn e i pozostawia na 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolumn e prze- mywa si e trzykrotnie kolejno 6 ml buforu A, a nast epnie 6 ml buforu B. Oligonukleotyd jest w ten spo- sób wi azany kowalencyjnie z kolumn a poprzez po laczenie CONH. Kolumn e przechowuje si e w 4°C w PBS, 0,1% NaN 3 i mo zna j a u zy c co najmniej cztery razy. 1.2. Konstrukcja plazmidów Zsyntetyzowano dwa nast epuj ace oligonukleotydy. oligonukleotyd 4817: 5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG- G-3' SEK NR ID: 9) oligonukleotyd 4818: 5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3' (SEK NR ID: 10). Oligonukleotydy te, po zhybrydyzowaniu i sklonowaniu do plazmidu wprowadzaj a sekwencj e homopurynowo-homopirymidynow a (GAA) 17 (SEK NR ID: 33) do odpowiedniego plazmidu, jak opisa- no powy zej. Sekwencj e odpowiadaj ac a tym dwom zhybrydyzowanym oligonukleotydom sklonowane w zgru- powaniu miejsc do klonowania plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), który niesie gen oporno sci na ampicylin e. W tym celu oligonukleotydy hybrydyzowano w nast epuj acy sposób: jeden µg tych dwóch oligonukleotydów umieszczano razem w 40 ml ko ncowego buforu zawieraj acego 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl 2 . Mieszanin e t a ogrzewano do 95°C, a nast epnie umieszczano w temperaturze pokojowej, tak aby temperatura powoli opada la. Dziesi ec ng mieszaniny zhybrydyzo- wanych oligonukleotydów poddawano ligacji z 200 plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) strawionego BamHI i EcoRI w ko ncowej obj eto sci 30 µl. Po ligacji, próbki transformowano do DH5a. Mieszaniny transformacyjne wysiewano na po zywk e L uzupe lnion a ampicylin a (50 mg/l) i X-gal (20 mg/l). Zrekombinowane klony powinny wykazywa c brak niebieskiego zabarwienia na tej po zywce w przeciwie nstwie do rodzicielskiego plazmidu (pBKS+), który umo zliwia a-komplementacj e fragmentu ? ß-galaktozydazy E. coli. Otrzymane minipreparaty plazmidowego DNA z 6 klonów, wyka-PL 206 844 B1 10 zywa ly zanik miejsca PstI znajdujacego si e mi edzy miejscami EcoRI i BamHI pBKS+ i wzrost masy cz asteczkowej pr azka PvuII o wielko sci 448-pz zawieraj acego zgrupowanie miejsc do klonowania. Wyselekcjonowano jeden klon i odpowiadaj acy mu plazmid nazwano pXL2563. Sklonowan a sekwen- cje zweryfikowano poprzez zastosowanie startera do sekwencjonowania -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (SEK NR ID: 11)) (Viera J. i J. Messing. 1982. The pUC plas- mids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268) dla plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA). Plazmid pXL2563 oczyszczono wed lug zestawu Wizard Megaprep kit (Promega Corp. Madison, WI) zgodnie z zaleceniami dostawcy. Ten preparat plazmidowego DNA u zyto nast epnie w przyk ladach poni zej. 1.3. Oczyszczanie plazmidu Wyposa zenie Plazmid pXL2563 (opisany w 1.2) oczyszczono na kolumnie HiTrap po laczonej oligonukleoty- dem opisanym z 1.1., z roztworu zawieraj acego równie z plazmid pBKS+. Bufory u zyte do tego oczysz- czania by ly nast epuj ace: Bufor F: 2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5 do 5. Bufor E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA. Metoda Kolumn e przemywa si e 6 ml buforu F i plazmidy (20 µg pXL2563 i 20 µg pBKS+ w 400 µl buforu F) nak lada na kolumn e i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Kolumn e przemywa si e 10 ml buforu F i wymywanie przeprowadza nast epnie buforem E. Plazmidy wykrywa si e po elektroforezie w 1% zelu agarozowym i barwieniu bromkiem etydyny. Proporcj e plazmidów w roztworze ocenia si e poprzez pomiar ich aktywno sci transformacyjnej w E. coli. Wyniki Rozpoczynaj ac od mieszaniny zawieraj acej 30% pXL2563 i 70% pBKS+, w wycieku z kolumny odzyskuje si e roztwór zawieraj acy 100% pXL2563. Czysto sc, oceniana poprzez stosunek OD przy 260 i 280 nm osi aga od 1,9 do 2,5, co wskazuje, ze zanieczyszczaj ace bia lka s a usuwane t a metod a. P r z y k l a d 2 2.1. - Przyk lad ten opisuje do swiadczenie z oczyszczaniem DNA Przy laczanie oligonukleotydu (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEK NR ID: 1)) do kolumny przeprowadza si e jak opisano w przyk ladzie 1. Do przy laczania oligonukleotyd jest modyfiko- wany na ko ncu 5' grup a aminow a polaczon a z fosforanem odcinka rozdzielaj acego poprzez rami e zawieraj ace 6 atomów w egla (Modified oligonukleotyd Eurogentec SA, Belgium). Plazmid pXL2563 by l oczyszczony przy u zyciu zestawu Wizard Megaprep kit (Promega Corp., Madison, WI) zgodnie z zale- ceniami dostawcy. Bufory u zyte do tego oczyszczania s a nast epuj ace: Bufor F: 0-2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5 do 5. Bufor E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5 mM EDTA. Kolumn e przemywa si e 6 ml buforu F i 100 µg plazmidu pXL2563 rozcie nczonego w 400 µl bu- foru F nak lada si e nast epnie na kolumn e i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Kolu- mn e przemywa si e 10 ml buforu F i wymywanie przeprowadza nast epnie buforem E. Plazmid ocenia sie ilo sciowo poprzez pomiar g estosci optycznej przy 260 nm. W tym przyk ladzie wi azanie przeprowadza si e w buforze, którego molarno sc w odniesieniu NaCl waha si e od 0 do 2 M (bufor F). Ta wydajno sc oczyszczania zmniejsza si e, kiedy spada molarno sc NaCl. pH buforu wi azacego mo ze waha c si e od 4,5 do 5, przy czym wydajno sc oczyszczania jest lepsza przy 4,5. Mo zliwe jest równie z u zycie innego buforu do wymywania o zasadowym pH: wymywanie przeprowadzano wi ec buforem zawieraj acym 50 mM boran, pH 9, 0,5 mM EDTA. 2.2. - Przy laczanie oligonukleotydu (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEK NR ID: 1) do kolumny przeprowadza si e jak opisano w przyk ladzie 1. Plazmid pXL2563 py l oczyszczony przy u zyciu zestawu Wizard Megaprep kit (Promega Corp., Madison, WI) zgodnie z zaleceniami dostawcy. Bufory u zyte do tego oczyszczania s a nast epuj ace: Bufor F: 0,1 M NaCl, 0,2 M octan, pH 5. Bufor E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5 mM EDTA. Kolumn e przemywa si e 6 ml buforu F i 100 µg plazmidu pXL2563 rozcie nczonego w 400 µl bu- foru F nak lada si e nast epnie na kolumn e i inkubuje przez jedn a godzin e w temperaturze pokojowej. Kolumn e przemywa si e 10 ml buforu F i wymywanie przeprowadza nast epnie buforem E. Mierzy si e zawarto sc chromosomowego DNA E. coli obecnego w próbkach plazmidu przed i po przepuszczeniu oligonukleotydu przez kolumn e. Ten genomowy DNA ocenia si e ilo sciowo poprzez PCR u zywaj acPL 206 844 B1 11 starterów z genu galK E. coli wed lug nast epuj acego protoko lu: Sekwencja starterów jest opisana przez Debouck i wsp. (Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841-1853): 5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEK NR ID: 24) i 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (SEK NR ID: 25). Mieszanina reakcyjna zawiera, w 25 µl buforu do PCR (Promega France, Charbonnières): 1,5 mM MgCl 2 ; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 µM startera; 20 jedn./ml polimerazy Taq (Promega). Reakcj e przeprowadza si e w nast epuj acej kolejno sci: – 5 min w 95°C – 30 cykli 10 sek w 95°C 30 sek w 60°C 1 min w 78°C – 10 min w 78°C. Powielony fragment DNA o d lugo sci 124 par zasad jest oddzielany poprzez elektroforez e na 3% zelu agarozowym w obecno sci SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA), a nast epnie oceniany ilo sciowo w odniesieniu do ultraczystego DNA genomowego szczepu B E. coli (Sigma, nr kat. D4889). W próbce nanoszonej na kolumn e jest 1% chromosomowego DNA, a 0,2% w próbce oczysz- czonej przez kolumn e z oligonukleotydem. P r z y k l a d 3 Do swiadczenie na klarowanym lizacie Przyk lad ten opisuje oczyszczanie plazmidowego DNA z klarowanego lizatu z hodowli bakteryj- nej na skal e tzw. „miniprep”: 1,5 ml nocnej hodowli szczepu DH5 a zawieraj acego plazmid pXL2563 odwirowuje si e i osad zawiesza w 100 µl 50 mM glukozy, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Doda- je si e 200 µl 0,2 M NaOH, 1% SDS, probówki odwraca w celu zamieszania, dodaje si e do 150 µl 3 M octanu potasu, pH 5, a nast epnie probówki odwraca w celu zamieszania. Po odwirowaniu, superna- tant odzyskuje si e i nak lada na kolumn e z oligonukleotydem, otrzyman a jak opisano w przyk ladzie 1. Wi azanie, p lukanie i wymywanie s a identyczne jak te opisane w przyk ladzie 1. Oko lo 1 µg plazmidu odzyskuje si e z 1,5 ml hodowli. Otrzymany plazmid, analizowany przez elektroforez e w zelu agarozo- wym i barwienie bromkiem etydyny, przyjmuje posta c pojedynczego prazka „superskr econego” koli- stego DNA. Zadnych sladów DNA o wysokiej masie molekularnej (chromosomowego) lub RNA nie wykrywa si e w plazmidzie oczyszczonym t a metod a. Stosunek g esto sci optycznych przy 260 i 280 nm jest wy zszy ni z 2. P r z y k l a d 4 4.1: Przyk lad ten opisuje do swiadczenie z oczyszczaniem plazmidowego DNA przeprowadzone w tych samych warunkach jak w przyk ladzie 3, rozpoczynaj ac od 20 ml hodowli bakteryjnej szczepu DH5 a zawieraj acego plazmid pXL2563. Osad komórkowy wprowadza si e do 1,5 ml 50 mM glukozy, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Liz e przeprowadza si e z uzyciem 2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS, a neutralizacj e 1,5 ml 3 M octanu potasu, pH 5. DNA wytr aca si e nast epnie 3 ml 2-propanolu i osad wprowadza si e do 0,5 ml 0,2 M octanu sodowego, pH 5, 0,1 M NaCl i nak lada na kolumn e z oligonu- kleotydem otrzyman a jak opisano w przyk ladzie 1. Wi azanie, p lukanie kolumny i wymywanie s a iden- tyczne jak te opisane w przyk ladzie 1, z t a ró znic a, ze molarno sc buforu do przemywania, w odniesie- niu do NaCl wynosi 0,1 M. Otrzymuje sie oko lo 16 µg plazmidowego DNA. Otrzymany plazmid anali- zowany przez elektroforez e w zelu agarozowym i barwienie bromkiem etydyny, przyjmuje postac po- jedynczego prazka „superskr econego” kolistego DNA. Zadnych sladów DNA o wysokiej masie cz aste- czkowej (chromosomowego) lub RNA nie wykrywa si e w oczyszczonym plazmidzie. Trawienie plazmidu enzymem restrykcyjnym daje pojedynczy prazek o spodziewanej masie cz asteczkowej 3 tys. par za- sad. St ezenie bia lka w próbkach spada od 125 µg/ml w klarowanych lizatach do mniej ni z 1 µg/ml w oczyszczonym plazmidzie (test Micro-BCA, Pierce). St ezenie endotoksyny, oznaczone w te scie LAL (Biosepra) dzieli si e przez czynnik ponad 10 w oczyszczonym plazmidzie, w stosunku do wyj sciowego klarowanego lizatu. 4.2: U zyty plazmid zawiera kaset e zawieraj ac a promotor cytomegalowirusa, gen koduj acy lucy- feraz e i sekwencj e homopuryno-homopirymidynow a (GAA) 17 (SEK NR ID: 33) pochodz ac a z plazmidu pXL2563. Szczep DH1 (Maniatis i wsp., 1989) zawieraj acy ten plazmid hoduje si e w 7-litrowym ferme- ntorze. Klarowany lizat sporz adza si e z 200 gramów komórek: osad komórkowy wprowadza si e do 2 litrów 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM glukozy, 10 mM EDTA, do których dodaje si e 2 litry 0,2 M NaOH, 1% SDS. Lizat neutralizuje si e poprzez dodanie 1 litra 3 M octanu potasu. Po diafiltracji, 4 ml tego lizatu nak lada si e na 5 ml kolumn e HiTrap-NHS z przy laczonym oligonukleotydem o sekwencji 5'-GAG-PL 206 844 B1 12 GCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEK NR ID: 1), zgodnie z metod a opisan a w przyk ladzie 1.1. P lu- kanie i wymywanie przeprowadza si e jak opisano w przyk ladzie 1. Odzyskuje si e oko lo 400 mikrogra- mów plazmidu. Poziom genomowego DNA w tej próbce, mierzony technik a opisana w przyk ladzie 2.2, wynosi 0,1%. P r z y k l a d 5 U zycie zmodyfikowanego oligonukleotydu Przyk lad ten opisuje u zycie oligonukleotydu nios acego zmetylowane cytozyny. Sekwencja za- stosowanego oligonukleotydu jest nast epuj aca: 5'-GAGG Me CTT Me CTT Me CTT Me CTT Me CCT Me CTT Me - CTT-3' (SEK NR ID: 12). Oligonukleotyd ten posiada grup e NH 2 na ko ncu 5'. Me C = 5-metylocytozyna. Oligonukleotyd ten umo zliwia oczyszczanie plazmidu pXL2563 w warunkach przyk ladu 1 z buforem wi azacym o pH 5 (ryzyko degradacji plazmidu jest zatem zmniejszone). P r z y k l a d 6 W powy zszych przyk ladach, u zyty oligonukleotyd jest modyfikowany na ko ncu 5' grup a amino- w a przy laczon a do fosforanu poprzez rami e zawieraj ace 6 atomów w egla: NH 2 -(CH 2 ) 6 . W tym przyk la- dzie grupa aminowa jest przy laczona do fosforanu na ko ncu 5' poprzez rami e zawieraj ace 12 atomów w egla: NH 2 -(CH 2 ) 12 . Przylaczenie oligonukleotydu i przepuszczanie przez kolumn e przeprowadza si e jak opisano w przyk ladzie 2 z buforem F: 2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5. Oligonukleotyd ten umo zliwia uzyskanie wy zszych wydajno sci oczyszczania: otrzymuje si e wydajno sc 53%, podczas gdy z oligonu- kleotydem zawieraj acym 6 atomów w egla, wydajno sc ta jest rz edu 45% w tych samych warunkach. P r z y k l a d 7 Post epuj ac zgodnie ze strategi a klonowania opisan a w przyk ladzie 1.2, skonstruowano dwa inne plazmidy nios ace sekwencje homopurynowo-homopirymidynowe: plazmid pXL2725, który za- wiera sekwencj e (GGA) 16 , (SEK NR ID: 34) i plazmid pXL2726, który zawiera sekwencj e (GA) 25 (SEK NR ID: 35). P r z y k l a d 7.1 Konstrukcja plazmidów Plazmidy pXL2725 i pXL2726, analogiczne do plazmidu pXL2563, skonstruowano zgodnie ze strategi a klonowania opisan a w przyk ladzie 1-2, z u zyciem nast epuj acej pary oligonukleotydów: 5986: 5'-GATCC(GA) 25 GGG-3' (SEK NR ID: 13) 5987: 5'-AATTCCC(TC) 25 G-3' (SEK NR ID: 14) 5981: 5'-GATCC(GGA) 17 GG-3' (SEK NR ID: 15) 5982: 5'-AATT(CCT) 17 CCG-3' (SEK NR ID: 16). Par e oligonukleotydów 5986 i 5987 u zyto do konstrukcji plazmidu pXL2726 poprzez klonowanie oligonukleotydów w miejscach BamHI i EcoRI pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), pod- czas gdy oligonukleotydy 5981 i 5982 u zyto do konstrukcji plazmidu pXL2725. Zastosowano te same warunki eksperymentalne jak przy konstrukcji plazmidu pXL2563 i zmieniono jedynie par e oligonukle- otydów. Podobnie, sklonowane sekwencje weryfikowano poprzez sekwencjonowanie na plazmidach. Umo zliwi lo to stwierdzenie, ze plazmid pXL2725 posiada modyfikacj e w stosunku do spodziewanej sekwencji: zamiast sekwencji GGA powtórzonej 17 razy, wyst epuje GGAGA(GGA) 15 (SEK NR ID: 17). P r z y k l a d 7.2 Przygotowanie kolumn i oczyszczanie Oligonukleotydy tworz ace potrójne helisy z tymi sekwencjami homopurynowymi przy laczano do kolumn HiTrap zgodnie z technik a opisan a w przyk ladzie 1.1. Oligonukleotyd o sekwencji 5'-AAT- GCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (SEK NR ID: 18) u zyto do oczyszczania plazmidu pXL2725, a sekwencj e oligonukleotydow a 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEK NR ID: 19) u zyto do oczyszczania plazmidu pXL2726. Dwie otrzymane w ten sposób kolumny umo zliwi ly oczyszczanie odpowiednich plazmidów zgodnie z technik a opisan a w przyk ladzie 2, z nast epuj acymi buforami: Bufor F: 2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5. Bufor E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA. Uzyskane wydajno sci wynosz a 23% i 31% dla pXL2725 i pXL2726, odpowiednio. P r z y k l a d 8 Przyk lad ten ilustruje wp lyw d lugo sci specyficznej sekwencji obecnej w plazmidzie na wydajno- sci oczyszczania.PL 206 844 B1 13 P r z y k l a d 8.1 Konstrukcja plazmidów Genem reporterowym u zytym w tym do swiadczeniu w celu wykazania aktywno sci kompozycji tu opisanej jest gen koduj acy lucyferaz e (Luc). Plazmid pXL2621 zawiera kaset e zawieraj ac a promotor cytomegalowirusa (CMV) o d lugo sci 661 pz, uzyskany z pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) poprzez ci ecie enzymami restrykcyj- nymi Mlul i Hindlll, sklonowanie przed genem koduj acym lucyferaz e w miejscach Mlul i Hindlll do wek- tora podstawowego pGL basie Vector (Promega Corp., Madison, WI). Plazmid ten skonstruowano przy zastosowaniu standardowych technik biologii molekularnej. Plazmidy pXL2727-1 i pXL2727-2 skonstruowano w nast epuj acy sposób: Dwa mikrogramy plazmidu pXL2621 linearyzowano BamHI; enzym inaktywowano poprzez trak- towanie przez 10 min 65°C; w tym samym czasie hybrydyzowano oligonukleotydy 6006 i 6008 jak opisano dla konstrukcji plazmidu pXL2563. 6006: 5'-GATCT(GAA) 17 CTGCAGATCT-3' (SEK NR ID: 20) 6008: 5'-GATCAGATCTGCAG(TTC) 7 A-3' (SEK NR ID: 21). Te mieszanin e hybrydyzacyjna sklonowane na ko ncach BamHI plazmidu pXL2621 i po transfor- macji do DH5 a, zidentyfikowano zrekombinowane klony poprzez analiz e restrykcyjn a Pstl, poniewa z oligonukleotydy wprowadzaj a miejsce Pstl. Wyselekcjonowano dwa klony i sekwencj e nukleotydow a sklonowanego fragmentu zweryfikowano przy u zyciu startera (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCG- ACG-3' (SEK NR ID: 22)) jako startera do reakcji sekwencjonowania (Viera J. i J. Messing, 1982. The plazmids pUC an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19:259-268). Pierwszy klon (pXL2727-1) zawiera sekwencj e GAA powtórzon a 10 razy. Drugi (pXL2727-2) zawiera sekwencj e 5'-GAAGAAGAG(GAA) 7 GGAAGAGAA-3' (SEK NR ID: 23). P r z y k l a d 8.2 Przygotowanie kolumn i oczyszczanie U zywan a kolumn a jest taka, jak opisana w przyk ladzie 1 i która jest po laczona z oligonukleotydem 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEK NR ID: 1). Plazmid pXL2727-1 niesie 14 powtórze n sekwencji GAA. Dligonukleotyd opisany powy zej, który zawiera jedynie 7 powtórze n odpowiedniej sekwencji hybrydyzuj acej CTT, mo ze hybrydyzowa c zatem z plazmidem w 8 ró znych pozycjach. W przeciwie nstwie do tego, plazmid pXL2727-2, ma sekwencj e hybrydyzuj ac a (GAA) 7 (SEK NR ID: 36) tej samej d lugo sci co oligonukleotyd zwi azany z kolumn a. Ten oligonukleotyd mo ze zatem hybrydyzowa c tylko w jednej pozycji na pXL2727-2. Do swiadczenie jest identyczne jak opisane w przyk ladzie 2, z nast epuj acymi buforami: Bufor F: 2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5. Bufor E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA. Wydajnosc oczyszczania wynosi 29% dla plazmidu pXL2727-1 i 19% dla pXL2727-2. P r z y k l a d 8.3 Transfekcja komórek ssaczych in vitro U zytymi komórkami s a komórki NIH 3T3, wysiane na dzie n przed do swiadczeniem do 24-stu- dzienkowych p lytek hodowlanych w ilo sci 50000 komórek/studzienk e. Plazmid rozcie ncza si e w 150 mM NaCl i miesza z odczynnikiem do lipofekcji RPR115335. Zastosowany stosunek ladunku dodatniego odczynnika do lipofekcji/ ladunku ujemnego DNA wynosi 6. Mieszanin e miesza si e na worteksie pozo- stawia na dziesiec minut w temperaturze pokojowej, rozcie ncza w po zywce bez p lodowej surowicy cielecej, a nast epnie dodaje do komórek w proporcji 1 µg DNA na studzienk e hodowli. Po dwóch go- dzinach w 37°C, dodaje si e 10% obj eto sc/obj eto sc p lodowej surowicy ciel ecej i komórki inkubuje si e przez 48 godzin w 37°C w obecno sci 5% CO 2 . Komórki przemywa si e dwukrotnie PBS i mierzy si e aktywno sc lucyferazy zgodnie z opisanym protoko lem (Promega kit, Promega Corp. Madison, WI) w luminometrze Lumat LB9501 (EG and G Berthold, Evry). Plazmid pXL2727-1, oczyszczony jak opi- sano w przyk ladzie 8.2, daje wydajno sci transfekcji dwukrotnie wy zsze ni z otrzymywane dla tego same- go plazmidu oczyszczonego przy u zyciu zestawu Wizard Megaprep kit (Promega Corp. Madison, WI). P r z y k l a d 9 Oczyszczanie plazmidów pochodnych pCOR Nast epuj acy przyk lad przedstawia oczyszczanie plazmidów pochodnych pCOR przy zastoso- waniu chromatografii w oparciu o potrójn a helis e. Wykazano, ze technologia ta usuwa zanieczyszcza- nia kwasów nukleinowych (a w szczególno sci genomowy DNA i RNA gospodarza) do poziomów takPL 206 844 B1 14 niskich, których nie osi aga si e konwencjonalnymi metodami chromatograficznymi. Zel powinowactwa dla tripleksu zsyntetyzowano przy u zyciu Sephacryl S-1000 SF (Amersham-Pharmacia Biotech) jako pod lo za chromatograficznego. Sephacryl S-1000 najpierw aktywowano m-nadjodanem sodowym (3 mM, temperatura pokojowa, 1 godz.) w 0,2 M octanie sodowym (pH 4,7). Nast epnie oligonukleotyd przy la- czano poprzez jego reszt e 5'-NH 2 -ko ncow a do grup aldehydowych aktywowanego pod lo za poprzez redukcyjn a aminacj e w obecno sci kwasu askorbinowego (5 mM), jak opisano uprzednio dla przy la- czania bia lek (Hornsey i wsp., J. Immunol. Methods, 1986, 93, 83-88). Oligonukleotyd homopirymidy- nowy u zyty w tych do swiadczeniach (z Eurogentec, oczyszczony poprzez HPLC) mia l sekwencj e, która by la komplementarna do krótkiej 14-merowej sekwencji homopurynowej (5'-AAGAAAAAAAA- GAA-3') (SEK NR ID: 29) obecnej w miejscu startu replikacji (ori ?) plazmidu pCOR (Soubrier i wsp., Gene Therapy, 1999, 6, 1482-1488). Jak dyskutowano powy zej, sekwencja oligonukleotydu homopi- rymidynowego to 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEK NR ID: 30). Chromatografii poddano nast epuj ace plazmidy: pXL3296 (pCOR bez transgenu, 2,0 kb), pXL3179 (pCOR-FGF, 2,4 kb), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2,5 kb), pXL3678 (pCOR-AFP, 3,7 kb), pXL3227 (pCOR-lacZ 5,4 kb) i pXL3397 (pCOR-FVIII z delecj a B), 6,6 kb). Wszystkie te plazmidy oczyszczano poprzez dwa etapy chromatografii z klarowanych lizatów, jak opisano w przykladzie 4. Badano równie z plazmid pBKS+ (pBluescript II KS+ ze Stratagene), plazmid pochodz acy z ColE1, oczyszczony poprzez ultrawirowanie w CsCl. Wszystkie u zyte plazmidy by ly w superskr econej ( 95%) postaci topologicznej. W ka zdym do swiadczeniu z oczyszczaniem plazmidowego DNA, 300 µq plazmidowego DNA w 6 ml 2 M NaCl, 0,2 M octanu potasowego (pH 5,0) nak ladano przy szybko sci przep lywu 30 cm/godz. na kolumn e powinowactwa zawieraj ac a wspomniany powy zej oligonukleotyd 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEK NR ID: 30). Po przemywaniu kolumny 5 obj eto sciami tego samego buforu, zwi azany plazmid wymywano 1 M Tris/HCl, 0,5 mM EDTA (pH 9,0) i oceniano ilo sciowo w UV (260 nm) i poprzez chro- matografi e jonowymienn a na kolumnie Millipore Gen-Pak (Marquet i wsp., BioPharm, 1995, 8, 26-37). Odzysk plazmidu w zebranych frakcjach wynosi l 207 µg dla pXL3296, 196 µg dla pXL3179, 192 µg dla pXL3579, 139 µg dla pXL3678, 97 µg dla pXL3227 i 79 µg dla pXL3397. Nie wykrywano wi azania plazmidu (< 3 µg) kiedy chromatografii na tej kolumnie poddano pBKS. Wskazuje to, ze oligonukleotyd 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEK NR ID: 30) tworzy stabilne struktury tripleksowe z komplementarn a 14-merow a sekwencj a 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEK NR ID: 29) obecn a w pCOR (ori ?), ale nie ze sci sle spokrewnion a sekwencj a 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEK NR ID: 27) obecn a w pBKS. To wskazuje, ze wprowadzenie pojedynczej nie-kanonicznej triady (w tym przypadku T*GC) prowadzi do ca lkowitej destabilizacji struktury tripleksowej. Jako kontrola, nie obserwowano wi azania plazmidu (< 1 µg), kiedy chromatografii poddano pXL3179 na kolumnie zsyntetyzowanej w bardzo podobnych warunkach, ale bez oligonukleotydu. Przeprowadzaj ac oczyszczanie na kolumnie powinowactwa w opisanych tu warunkach, poziom zanieczyszczania przez genomowy DNA gospodarza zosta l zmniejszony z 2,6% do 0,07% dla prepa- ratu pXL3296. Podobnie, poziom zanieczyszczania przez genomowy DNA gospodarza zosta l zmniej- szony z 0,5% do 0,008% dla preparatu pXL3179 kiedy próbk e poddano chromatografii na tej samej kolumnie powinowactwa. Ponadto, poziom zanieczyszczania przez RNA by l znacznie zmniejszony, z 43% RNA do 0,2% RNA, w preparacie pXL3179 przy u zyciu tej kolumny powinowactwa. Dodatkowo, odzysk plazmidu PXL3579 wynosi l mniej ni z 8% kiedy oligonukleotyd 5'-TTCTTT- TTTTTCTT-3' (SEK NR ID: 30) zosta l zast apiony oligonukleotydem 5'-TTTTTTTTCTT-3' (SEK NR ID: 31) na tej kolumnie powinowactwa. Podczas gdy oligonukleotyd przedstawiony w SEK NR ID: 31 jest kom- plementarny do cz esci sekwencji VEGFB w pXL3579 (tj., nukleotydów 379 do 389 w stosunku do ATG), nie wyst epuje znacz ace powinowactwo tripleksowe. To wskazuje, ze to oczyszczanie przez powino- wactwo wymaga nie-losowej homopurynowo-homopyrymidynowej sekwencji DNA. P r z y k l a d 10 Oczyszczanie plazmidu pochodnego ColE1 Nast epuj acy przyk lad pokazuje oczyszczanie plazmidów pochodnych ColE1 przy zastosowaniu chromatografii powinowactwa w oparciu o potrójn a helis e. Wykazano, ze technologia ta usuwa zanie- czyszczania kwasów nukleinowych (a w szczególno sci genomowy DNA i RNA gospodarza) do pozio- mów tak niskich, których nie osi aga si e konwencjonalnymi metodami chromatograficznymi. Zel powinowactwa dla tripleksu zsyntetyzowano poprzez przy laczenie oligonukleotydu maj ace- go sekwencj e 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEK NR ID: 28) do utlenionego nadjodanem Sephacryl S-1000 SF, jak opisano w przyk ladzie 9.PL 206 844 B1 15 Plazmidy pXL3296 (pCOR bez transgenu) i pBKS, plazmid pochodz acy od ColE1, poddano chromatografii na 1 ml kolumnie zawieraj acej oligonukleotyd 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEK NR ID: 28) w warunkach opisanych w przyk ladzie 9. Odzysk plazmidu w zebranych frakcjach wynosi l 175 µg dla pBKS i <1 µg dla pXL3296. To wskazuje, ze oligonukleotyd 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEK NR ID: 28) tworzy stabilne struktury tripleksowe z komplementarn a 12 merow a sekwencj a (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (SEK NR ID: 27) obecn a w pBKS, ale nie sci sle spokrewnion a 12 merow a sekwencj a (5'-AGAAAAA- AAAGA-3') (SEK NR ID: 32) obecn a w pCOR. To wskazuje, ze wprowadzenie pojedynczej nie-kanoni- cznej triady (w tym przypadku C*AT) prowadzi do ca lkowitej destabilizacji struktury tripleksowej. P r z y k l a d 11 Metoda podwójnego oczyszczania Nast epuj acy przyk lad pokazuje oczyszczanie superskr econej dwuniciowej cz asteczki DNA, ta- kiej jak pXL3296 w mieszaninie zawieraj acej inn a superskr econ a dwuniciow a cz asteczk e DNA, tak a jak pBSK przy zastosowaniu chromatografii powinowactwa w oparciu o potrójn a helis e. Obydwie dwu- niciowe cz asteczki DNA mog a mie c podobne rozmiary, ale ka zda cz asteczka DNA zawiera unikatow a sekwencj e, która jest zdolna do tworzenia potrójnej helisy z odmienn a sekwencj a docelow a. Jak uprzed- nio dyskutowano, cz asteczki, takie jak pXL3296 zawieraj a sekwencj e 5'-AAG7\AAAAAAAG7\A-3' (SEK NR ID: 29), ale nie zawieraj a sekwencji 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEK NR ID: 27). W przeciwie nstwie do tego, cz asteczki, takie jak pBSK zawieraj a SEK NR ID: 27, ale nie zawieraj a SEK NR ID: 29. W pierwszym etapie, mieszanin e zawieraj ac a pXL3296 i pBSK nak ladano na pierwsz a kolumn e powinowactwa zawieraj ac a oligonukleotyd 5'-TCTTTTTTTCCTT-3' (SEK NR ID: 28), tak a jak kolumna opisana w przyk ladzie 10. Roztwór przepuszczano przez pierwsz a kolumn e zawieraj ac a niezwi azane cz asteczki DNA. W drugim etapie, niezwi azane cz asteczki DNA z pierwszego etapu nak ladano na drug a kolumn e powinowactwa zawieraj ac a oligonukleotyd 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEK NR ID: 30), tak a jak kolumna opisana w przyk ladzie 9. Drug a kolumn e przemywano nast epnie i zwi azane cz asteczki wy- mywano, jak opisano w przyk ladzie 9. Jedynie cz asteczki pXL3296 wymywa ly si e z drugiej kolumny. Zadnych cz asteczek pBSK nie wykrywano w wycieku (tj. roztworze, który wyp lywa l z kolumny) z dru- giej kolumny.PL 206 844 B1 16PL 206 844 B1 17PL 206 844 B1 18PL 206 844 B1 19PL 206 844 B1 20PL 206 844 B1 21PL 206 844 B1 22PL 206 844 B1 23PL 206 844 B1 24 PL PL
Claims (19)
1. Zastrze zenia patentowe 1. Sposób oczyszczania dwuniciowego DNA z roztworu zawieraj acego dwuniciowy DNA zmieszany z innymi sk ladnikami, znamienny tym, ze obejmuje etap, w którym przepuszcza si e roz- twór przez no snik zawieraj acy przy laczony kowalencyjnie oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrój- nej helisy z dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e ze specyficzn a sekwencj a obecn a w dwuni- ciowym DNA bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, przy czym przy laczony kowalencyj- nie oligonukleotyd zawiera sekwencj e TCTTTTTTTCCT (SEK NR ID: 28) albo TTCTTTTTTTTCTT (SEK NR ID: 30).
2. Sposób oczyszczania dwuniciowego DNA z roztworu zawieraj acego dwuniciowy DNA zmie- szany z innymi sk ladnikami, znamienny tym, ze obejmuje etap, w którym przepuszcza si e roztwór przez no snik zawieraj acy przy laczony kowalencyjnie oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z dwu- niciowym DNA poprzez hybrydyzacj e ze specyficzn a sekwencj a obecn a w dwuniciowym DNA bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, przy czym przy laczony kowalencyjnie oligonukleotyd zawiera sekwencj e AGAAAAAAAGGA (SEK NR ID: 27) albo AAGAAAAAAAAGAA (SEK NR ID: 29).
3. Sposób oczyszczania pierwszego dwuniciowego DNA z roztworu zawieraj acego pierwszy dwuniciowy DNA i drugi dwuniciowy DNA, znamienny tym, ze obejmuje etapy, w których (i) przepu- szcza si e roztwór przez pierwszy no snik, zawieraj acy kowalencyjnie przy laczony oligonukleotyd zdol- ny do tworzenia potrójnej helisy z drugim dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z obecn a w nim okre slon a sekwencj a bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, (ii) odzyskuje si e roztwór, który przechodzi przez pierwszy no snik i (iii) przepuszcza si e odzyskany roztwór przez drugi no snik, zawieraj acy kowalencyjnie przy laczony oligonukleotyd, zdolny do tworzenia potrójnej helisy z pierw- szym dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z okre slon a sekwencj a tego pierwszego dwuniciowe- go DNA bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, przy czym specyficzna sekwencja obecna w pierwszym dwuniciowym DNA zawiera sekwencj e AAGAAAAAAAAGAA (SEK NR ID: 29), a specy- ficzna sekwencja obecna w drugim dwuniciowym DNA zawiera sekwencj e AGAAAAAAAGGA (SEK NR ID: 27).
4. Sposób oczyszczania pierwszego dwuniciowego DNA z roztworu zawieraj acego pierwszy dwuniciowy DNA i drugi dwuniciowy DNA, znamienny tym, ze obejmuje etapy, w których (i) przepu- szcza si e roztwór przez pierwszy no snik, zawieraj acy kowalencyjnie przy laczony oligonukleotyd zdol- ny do tworzenia potrójnej helisy z drugim dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z obecn a w nim okre slon a sekwencj a bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, (ii) odzyskuje si e roztwór, który przechodzi przez pierwszy no snik i (iii) przepuszcza si e odzyskany roztwór przez drugi no snik, zawieraj acy kowalencyjnie przy laczony oligonukleotyd, zdolny do tworzenia potrójnej helisy z pierw- szym dwuniciowym DNA poprzez hybrydyzacj e z okre slon a sekwencj a tego pierwszego dwuniciowe- go DNA bez tworzenia jakiejkolwiek triady nie-kanonicznej, przy czym oligonukleotyd zdolny do two- rzenia potrójnej helisy z pierwszym dwuniciowym DNA zawiera sekwencj e TTCTTTTTTTTCTT (SEK NR ID: 30), a oligonukleotyd zdolny do tworzenia potrójnej helisy z drugim dwuniciowym DNA zawiera sekwencj e TCTTTTTTTCCT (SEK NR ID: 28).
5. Sposób wed lug jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, ze jako roztwór stosuje si e lizat ko- mórkowy.
6. Sposób wed lug zastrz. 5, znamienny tym, ze jako lizat komórkowy stosuje si e klarowany lizat.
7. Sposób wed lug jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, ze dwuniciowy DNA wst epnie oczyszcza si e.
8. Sposób wed lug jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, ze jako specyficzn a sekwencj e stosuje si e sekwencj e, która zosta la wprowadzona sztucznie do dwuniciowego DNA lub która jest obecna naturalnie w dwuniciowym DNA.
9. Sposób wed lug jednego z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, ze stosuje si e oligonukleotyd po- laczony z no snikiem wi azaniem dwusiarczkowym, tioeterowym, estrowym, amidowym albo aminowym.
10. Sposób wed lug zastrz. 9, znamienny tym, ze stosuje si e oligonukleotyd po laczony z ko- lumn a poprzez rami e zawieraj ace la ncuch w eglowy (CH 2 ) n gdzie n to liczba ca lkowita mi edzy 1 a 18 w lacznie, i gdzie rami e jest po laczone z oligonukleotydem przez fosforan a z kolumn a przez wi azanie amidowe.
11. Sposób wed lug jednego z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, ze stosuje si e oligonukleotyd posiadaj acy co najmniej jedn a modyfikacj e chemiczn a, czyni ac a go odpornym na nukleazy lub chro- ni ac a go przed nukleazami albo zwi ekszaj ac a jego powinowactwo do specyficznej sekwencji.PL 206 844 B1 25
12. Sposób wed lug zastrz. 11, znamienny tym, ze co najmniej jedna cytozyna oligonukleotydu jest metylowana.
13. Sposób wed lug jednego z zastrz. 1 do 12, znamienny tym, ze jako dwuniciowy DNA stosu- je si e DNA kolisty.
14. Sposób wed lug zastrz. 13, znamienny tym, ze jako DNA kolisty stosuje si e plazmid.
15. Sposób wed lug jednego z zastrz. 1 do 14, znamienny tym, ze jako specyficzn a sekwencj e obecn a w dwuniciowym DNA stosuje si e sekwencj e zawieraj ac a kilka pozycji dla hybrydyzacji z oligo- nukleotydem.
16. Sposób wed lug jednego z zastrz. 1 do 15, znamienny tym, ze jako no snik stosuje si e no- snik chromatograficzny z grup a funkcyjn a, powierzchni e plastykow a z grup a funkcyjn a lub kulki latek- sowe z grup a funkcyjn a.
17. Sposób wed lug zastrz. 16, znamienny tym, ze jako no snik stosuje si e no snik chromatogra- ficzny z grup a funkcyjn a.
18. Sposób wed lug zastrz. 17, znamienny tym, ze oczyszczony dwuniciowy DNA ma zawar- tosc chromosomowego DNA mniejsz a ni z lub równ a 0,5%.
19. Sposób wed lug zastrz. 18, znamienny tym, ze oczyszczony dwuniciowy DNA ma zawar- tosc chromosomowego DNA mniejsz a ni z lub równ a 0,01%.PL 206 844 B1 26 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 z l (w tym 23% VAT) PL PL
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/580,923 | 2000-05-26 | ||
| US09/580,923 US6319672B1 (en) | 1994-12-16 | 2000-05-26 | Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL359265A1 PL359265A1 (pl) | 2004-08-23 |
| PL206844B1 true PL206844B1 (pl) | 2010-09-30 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2009045070A (ja) | 固定化させたオリゴヌクレオチドと三重らせんを形成させることによるｄｎａ精製 | |
| US8399636B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide | |
| KR100502116B1 (ko) | 약제성 플라스미드 디엔에이의 정제 | |
| AU2007202804B8 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide | |
| PL206844B1 (pl) | Sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA | |
| JP2004523245A (ja) | 三重螺旋相互作用によるターゲット二本鎖ｄｎａ配列の精製及び検出方法 | |
| AU2001263459A1 (en) | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide | |
| IL152860A (en) | Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide |