JP2009045070A - 固定化させたオリゴヌクレオチドと三重らせんを形成させることによるdna精製 - Google Patents
固定化させたオリゴヌクレオチドと三重らせんを形成させることによるdna精製 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】 二本鎖DNAの精製のための方法の提供。
【解決手段】 他の構成成分との混合物中にDNAを含む溶液を、前記DNA上に存在する特定の配列とハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを共有結合により結合させてある支持体に通して、三重らせんを形成させる。
【選択図】 なし
【解決手段】 他の構成成分との混合物中にDNAを含む溶液を、前記DNA上に存在する特定の配列とハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを共有結合により結合させてある支持体に通して、三重らせんを形成させる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、DNA精製のための新規方法に関する。本発明に従う方法により薬剤学的に利用可能な二本鎖DNAを迅速に精製することが可能となる。一層具体的には、本発明に従う精製法は、DNAの配列とオリゴヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションに関連する。
遺伝子療法および細胞療法の技術は現行では著しい発展を遂げている。しかしながらこれらの技術は薬剤学的純度の大量のDNAを産生することの可能性を必要とする。実際の所、これら新規療法では医薬がDNA自体を含むことがしばしばであり、かつその医薬を適切な量で製造し、単離し、そしてヒトにおける治療学的使用法に適する様式で精製できることが必須となる。
本発明は、DNA精製のための簡便、かつ特に効果的な新規方法を記述する。この方法により特に、高収率であって特に高い純度を得ることが可能となる。
本発明に従う方法は本質的には、精製すべきDNA内に挿入された配列と、天然もしくは改変された塩基からなるオリゴヌクレオチドとの間の特異的相互作用に基づく。
最近になって、幾つかのオリゴヌクレオチドはDNA二重らせんの広い溝の中で特異的に相互作用を行って局所的に三重らせんを形成し、標的遺伝子の転写の阻害をもたらすことが可能性があることが見いだされている(Helene et Toulme、Biochem.Biophys.Acta 1049(1990)99)。これらのオリゴヌクレオチドはオリゴプリン−オリゴピリミジン配列、すなわち一本鎖上にオリゴプリン配列を保持し、かつその相補鎖上にオリゴピリミジン配列を保持する領域で選択的にDNA二重らせんを認識し、そしてそのためそこで局所的に三重らせんを形成する。第三鎖(オリゴヌクレオチド)の塩基はワトソン−クリック(Watson−Crick)塩基対のプリンと水素結合(ホッグスティーン(Hoogsteen)もしくは逆ホッグスティーン(Hoogsteen)結合)を形成する。
プラスミドを単離するためのこの種の相互作用の使用は従来の技術に記載されている。従って、Itoら(PNAS 89(1992)495)は、あるプラスミドの特定の配列を認識し、かつそれと三重らせんを形成することが可能なビオチニル化されたオリゴヌクレオチドの使用を記載している。このように形成された複合体をその後には、ストレプトアビジンでコートした磁性ビーズと接触させる。ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用によりその後には、そのプラスミドをそのビーズの磁性分離、次いで溶離により単離することが可能となる。しかしながら、この方法には幾つかの欠点が存在する。具体的には2つの連続的な特異的相互作用が必要とされ、最初の相互作用はオリゴヌクレオチドとプラスミドとの間ものであり、そして第二のものはビオチニル化された複合体とストレプトアビジンビーズとの間ものである。それに加え、最終溶液に、薬剤学的組成物中では用いることができないビオチニル化オリゴヌクレオチドが混入することがある。
本発明は、この種の相互作用を利用するDNA精製の新規改善法を記載する。より特別には、本発明の方法は支持体に共有結合により連結させたオリゴヌクレオチドを利用する。この方法は特に迅速であり、かつこの方法により特に高い収率および純度がもたらされ
る。それに加えこの方法により、特に、他の核酸、蛋白質、エンドトキシン(例えばリポ多糖のようなもの)、およびヌクレアーゼなどを含む複合体混合物からDNAを精製することが可能となる。それに加え、用いられる支持体は容易に再利用することができてよく、かつ取得されるDNAは薬剤学的安全性という改善された特性を呈する。最後になるが、本方法は従来の方法とは対照的に一段階のみを必要とする。
る。それに加えこの方法により、特に、他の核酸、蛋白質、エンドトキシン(例えばリポ多糖のようなもの)、およびヌクレアーゼなどを含む複合体混合物からDNAを精製することが可能となる。それに加え、用いられる支持体は容易に再利用することができてよく、かつ取得されるDNAは薬剤学的安全性という改善された特性を呈する。最後になるが、本方法は従来の方法とは対照的に一段階のみを必要とする。
本発明の第一の主題は、二本鎖DNAの精製のための方法であり、この方法に従うと、他の構成成分と混合される前記DNAを含む溶液は、前記DNA内に存在する特定の配列とのハイブリダイゼーションにより三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドと共有結合される支持体を通過させられる。この特定の配列はその二本鎖DNA内に天然に存在する配列であるか、あるいは後者の中に人工的に組み込まれる合成配列であり得る。
本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは二本鎖DNAに直接ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは以下の塩基を含むことができる:
− チミジン(T)(これは二本鎖DNAのA・Tダブレットとトリプレットを形成することが可能である)(Rajagopal et al.、Biochem 28(1989)7859);
− アデニン(A)(これは二本鎖DNAのA・Tダブレットとトリプレットを形成することが可能である);
− グアニン(G)(これは二本鎖DNAのG・Cダブレットとトリプレットを形成することが可能である);
− プロトン化されたシトシン(C+)(これは二本鎖DNAのG・Cダブレットとトリプレットを形成することが可能である)(Rajagopal et al.、(上記引用));
− ウラシル(U)(これは二本鎖DNAのA・UもしくはA・Tダブレットとトリプレットを形成することが可能である)。
− チミジン(T)(これは二本鎖DNAのA・Tダブレットとトリプレットを形成することが可能である)(Rajagopal et al.、Biochem 28(1989)7859);
− アデニン(A)(これは二本鎖DNAのA・Tダブレットとトリプレットを形成することが可能である);
− グアニン(G)(これは二本鎖DNAのG・Cダブレットとトリプレットを形成することが可能である);
− プロトン化されたシトシン(C+)(これは二本鎖DNAのG・Cダブレットとトリプレットを形成することが可能である)(Rajagopal et al.、(上記引用));
− ウラシル(U)(これは二本鎖DNAのA・UもしくはA・Tダブレットとトリプレットを形成することが可能である)。
用いられるオリゴヌクレオチドがシトシンに富むホモピリミジン配列を含み、かつこのDNA内に存在する特定の配列がホモプリン−ホモピリミジン配列であることが好ましい。シトシンの存在により、そのシトシンがプロトン化される酸性pHでは安定化し、かつそのシトシンが中和されるアルカリ性pHでは脱安定化される三重らせんを有することが可能となる。
ハイブリダイゼーションによる三重らせんの形成を可能にさせるためには、そのオリゴヌクレオチドと、そのDNA内に存在する特定の配列とが相補的となることが重要である。これに関連し、最高の収率および最高の選択性を取得するためには、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと特定の配列とが本発明の方法に用いられる。特に、これらはオリゴヌクレオチドポリ(CTT)および特定の配列ポリ(GAA)であることができる。一例として、配列5′−GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(GAGG(CCT)7;配列番号1)のオリゴヌクレオチドを挙げることができ、この配列では塩基GAGGは三重らせんは形成しないが、そのオリゴヌクレオチドを、間隔を開かせることで結合用アームから遠ざけることができ;配列(CTT)7(配列番号26)も挙げることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、相補的単位(GAA)を含む特定の配列と共に三重らせんを形成することが可能である。問題の配列は特に、先の例に記載される要領で、7、14、もしくは17のGAA単位を含む領域であることができる。
具体的目的であるもう一つの配列は、配列:5′−AAGGGAGGGAGGAGAGGAA−3′(配列番号5)である。この配列はオリゴヌクレオチド5′−AAGGAGAGGAGGGAGGGAA−3′(配列番号6)もしくは5′−TTGGTGTGGT
GGGTGGGTT−3′(配列番号7)と共に三重らせんを形成する。
GGGTGGGTT−3′(配列番号7)と共に三重らせんを形成する。
この場合、このオリゴヌクレオチドは逆平行方向でポリプリン鎖に結合する。これらの三重らせんはMg2+の存在下でのみ安定となる(Vasquez et al.、Biochemistry、1995、34、7243−7251;Beal and Dervan、Science、1991、251、1360−1363)。
先に記載されるように、特定の配列は二本鎖DNA内に天然に存在する配列もしくは後者内に人工的に組み込まれた合成配列であることができる。例えば、あるプラスミドの複製起点内、もしくはマーカー遺伝子内で、二本鎖DNA内に天然に存在する配列と三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドを用いることが特に有利である。これに関連し、本出願人はプラスミドの配列分析を実施し、そして、特に複製起点内のそれらのDNAの内の幾つかの領域がホモプリン−ホモピリミジン領域を保持することができることを示すことができた。これらの天然のホモプリン−ホモピリミジン領域と三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドの合成により、本発明の方法を、改変させていないプラスミド、特にpUC、pBR322、およびpSVなどの種類の市販のプラスミドに適用することが可能となる。二本鎖DNA内に天然に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列の中では、大腸菌(E.coli)の複製起点ColE1内に存在する配列5′−CTTCCCGAAGGGAGAAAGG−3′(配列番号2)の全部もしくは部分を含む配列を挙げることができる。この場合、三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドは配列:5′−GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC−3′(配列番号3)を保持し、そしてBealおよびDervan(J.Am.Chem.Soc.1992、114、4976−4982)、ならびにJayasenaおよびJohnston(Nucleic Acids Res.1992、20、5279−5288)により記載されるように二重らせんの二本の鎖に交互に結合する。プラスミドpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子(Duval−Valentin et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1992、89、504−508)の配列5′−GAAAAAGGAAGAG−3′(配列番号4)も挙げることができる。複製起点もしくはマーカー遺伝子の存在する配列と三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドの使用は特に有利であり、なぜならそのことにより同一のオリゴヌクレオチドを用いて前記複製起点もしくは前記マーカー遺伝子を含むいずれかのDNAを精製することが可能となるためである。そのため、人工的な特定の配列をその中に組み込ませる目的でプラスミドもしくは二本鎖DNAを改変する必要はなくなる。
完全に相補的な配列が好ましいものの、しかしながら、そのオリゴヌクレオチドの配列と、そのDNA内に存在する配列との間の幾つかのミスマッチは、それらがあまりに大きすぎる親和性損失をもたらすことがなければ許容されることがあることが理解されている。大腸菌(E.coli)のβ−ラクタマーゼ遺伝子内に存在する配列5′−AAAAAAGGGAATAAGGG−3′(配列番号8)を挙げることができる。この場合、そのポリプリン配列を遮るチミンは第三鎖のグアニンにより認識されることがあり、そのことにより2つのTATトリプレットによりフランクされる場合には安定となるATGトリプレットが形成される(Kiessling et al.、Biochemistry、1992、31、2829−2834)。
ある特別な態様に従うと、本発明のオリゴヌクレオチドは配列(CCT)n、配列(CT)n、もしくは配列(CTT)nを含み、前記式中、nは1〜15を含む整数である。(CT)nもしくは(CTT)nの種類の配列を用いることが特に有利である。本出願人は実際、精製収率がそのオリゴヌクレオチド中のCの量により影響を受けることを示した。具体的には実施例7に示されるように、精製収率はそのオリゴヌクレオチドが含むシトシンが減少すると増大する。本発明のオリゴヌクレオチドは(CCT)、(CT)、もしくは(CTT)単位を合わせることもできることが理解される。
用いられるオリゴヌクレオチドは天然のものであるか(改変を受けていない天然の塩基でできている)もしくは化学的に改変されたものであってよい。具体的には、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対する耐性もしくはそれに対する防御、あるいは特定の配列に対す親和性を増加させることが可能となる所定の化学的改変を保持することが有利であるかも知れない。
本発明に従うとオリゴヌクレオチドは更に、ヌクレアーゼに対して一層強い耐性を示すようにさせる目的でのその主鎖の改変を受けているヌクレオシドのいずれかの連結される連続物であるとも理解される。可能な改変の中でも、オリゴヌクレオチドホスホチオエート(これはDNAと三重らせんを形成することが可能である)(Xodo et al.、Nucleic Acids Res.、1994、22、3322−3330)、ならびにホルムアセタールもしくはメチルホスフェート主鎖を保持するオリゴヌクレオチド(Matteucci et al.、J.Am.Chem.Soc.、1991、113、7767−7768)を挙げることができる。ヌクレオチドのαアノマーで合成されるオリゴヌクレオチド(これもDNAと三重ヘリックスを形成する)を用いることも可能である(Le Doan et al.、Nucleic Acids Res.、1987、15、7749−7760)。主鎖のもう一つの改変はホスホルアミデート連結である。例えば、GryaznovおよびChenにより記載されるN3’−P5’ヌクレオチド間ホスホルアミデート連結(これにより、オリゴヌクレオチドはDNAと特に安定な三重らせんを形成することになる)(J.Am.Chem.Soc.、1994、116、3143−3144)を挙げることができる。主鎖の他の改変の中でも、リボヌクレオチド、2’−O−メチルリボース、ホスホジエステルなどの使用(Sun and Helene、Curr.Opinion Struct.Biol.、116、3143−3144)も挙げることができる。最後に、リンを基にする主鎖をPNA(ペプチド核酸)における要領でポリアミド主鎖で置換してもよく(このことによっても三重らせんを形成することができる)(Nielsen et al.、Science、1991、254、1497−1500;Kim et al.、J.Am.Chem.Soc.、1993、115、6477−6481)、あるいはDNG(デオキシリボヌクレイックグアニジン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1995、92、6079−6101)(これはDNAのポリカチオン性アナログであり、これも三重らせんを形成する)におけるようにグアニジンを基にする主鎖で置換してもよい。
第三鎖のチミンが5−ブロモウラシルにより置換されてもよく、このことによりそのオリゴヌクレオチドのDNAに対する親和性が増加する(Povsic and Dervan、J.Am.Chem.Soc.、1989、111、3059−3061)。第三鎖は非天然の塩基を含んでいてもよく、これらの中でも、7−デアザ−2’−デオキシキサントシン(Milligan et al.、Nucleic Acids Res.、1993、21、327−333)、1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−メチル−5−アミノ−1H−ピラノゾロ[4,3−d]ピリミジン−7−オン(Koh and Dervan、J.Am.Chem.Soc.、1992、114、1470−1478)、8−オキソアデニン、2−アミノプリン、2’−O−メチルプソイドイソシチジン、もしくは当業者に知られるいずれかの他の改変(総説については、Sun and Helene、Curr.Opinion Struct.Biol.、1993、3、345−356、を参照されたい)を挙げることができる。
オリゴヌクレオチドのもう一つの種類の改変は、より特別には、そのオリゴヌクレオチドと特定の配列との間の相互作用および/または親和性を改善するという目的を有する。具体的には、本発明に従う最も有利な改変は、そのオリゴヌクレオチドのシトシンをメチ
ル化することである(実施例5を参照されたい)。このようにメチル化されたオリゴヌクレオチドは中性に近いpH範囲(≧5)で特定の配列と共に安定な三重らせんを形成させるという顕著な特質を示す。従って、このことにより従来の技術のオリゴヌクレオチドと比べると一層高いpH値、すなわちプラスミドDNAの変性の危険性が一層少なくなるpH値で作業することが可能となる。
ル化することである(実施例5を参照されたい)。このようにメチル化されたオリゴヌクレオチドは中性に近いpH範囲(≧5)で特定の配列と共に安定な三重らせんを形成させるという顕著な特質を示す。従って、このことにより従来の技術のオリゴヌクレオチドと比べると一層高いpH値、すなわちプラスミドDNAの変性の危険性が一層少なくなるpH値で作業することが可能となる。
本発明の方法において用いられるオリゴヌクレオチドの長さは少なくとも3塩基であり、そして好ましくは5と30との間である。10塩基を上回る長さのオリゴヌクレオチドが用いられることが有利である。当業者は、その相互作用の所望の選択性および安定性に合わせるための長さを各個別の事例について採用してよい。
本発明に従うオリゴヌクレオチドはいずれかの既知の技術により合成されてよい。具体的にはそれらは核酸合成機により調製されてよい。当業者に知られる他のいずれかの方法が用いられてよいことも極めて明白である。
支持体への共有結合を可能にさせるためには、そのオリゴヌクレオチドは一般的には機能化される。従って、オリゴヌクレオチドは、5’もしくは3’の位置でチオール、アミン、もしくはカルボニル末端基により改変されてよい。具体的には、チオール、アミン、もしくはカルボキシル基の付加により、例えばそのオリゴヌクレオチドを、ジスルフィド、マレイミド、アミン、カルボキシル、エステル、エポキシド、臭化シアノゲン、もしくはアルデヒド官能基を保持する支持体に結合させることが可能となる。オリゴヌクレオチドと支持体との間のジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、もしくはアミン連結の確立によりこれらのカップリングが形成される。当業者に知られる他のいずれかの方法が用いられてもよく、それらは例えば二官能性カップリング剤である。
それに加え、連結させたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを改善させるためには、そのオリゴヌクレオチドが「アーム」および「スペーサー」の塩基配列を含むことが有利であり得る。アームの使用により実際のところ、そのオリゴヌクレオチドを支持体からの選択された距離で結合させることが可能となり、このことによりDNAとの相互作用の条件が改善される。アームは1〜18、および好ましくは6もしくは12の(CH2)基を含む直鎖状炭素鎖、ならびにカラムへの結合を可能にさせるアミンからなることが有利である。このアームはそのオリゴヌクレオチドもしくはハイブリダイゼーションを妨害しない塩基からなる「スペーサー」のリン酸に連結する。従ってこの「スペーサー」はプリン塩基を含むことができる。一例として、この「スペーサー」は配列GAGGを含むことができる。アームは6〜12の炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていると有利である。
本発明の実施のためには様々な種類の支持体を用いてよい。これらはバルクの状態でかもしくはカラム内に予め充填された状態をとる機能化されたクロマトグラフィー用支持体か、機能化されたプラスティック表面か、あるいは機能化されたラテックスビーズ(磁性を有するもの、もしくはそうでないもの)であることができる。クロマトグラフィー用支持体が用いられることが好ましい。一例としては、用いられることが可能なクロマトグラフィー用支持体はアガロース、アクリルアミド、もしくはデキストラン、ならびにそれらの誘導体(例えば、セファデックス(Sephadex)、セファロース(Sepharose)、スペロース(Superose)など)、ポリマー類(例えば、ポリ(スチレン/ジビニルベンゼン))、あるいは一例ではグラフトさせたもしくはグラフトさせていないシリカである。クロマトグラフィー用カラムは拡散モードもしくは灌流モードで操作することができる。
精製収率をよりよくするためにはプラスミドに関しては、そのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの幾つかの位置を含む配列を用いることが特に有利である。事実、幾つかのハイブリダイゼーションの位置の存在により前記配列とそのオリゴヌクレオチ
ドとの間の相互作用が促進され、そのことにより精製収率の改善がもたらされる。従って、(CCT)、(CT)、もしくは(CTT)モチーフのn回反復物を含むオリゴヌクレオチドのためには、少なくともn回の相補的モチーフ、および好ましくはn+1回の相補的モチーフを含むDNA配列を用いることが好ましい。従ってn+1回の相補的モチーフを保持する配列により、そのオリゴヌクレオチドとの2つのハイブリダイゼーションの位置が提供される。このDNA配列が最高11までのハイブリダイゼーションの位置、すなわちn+10回の相補的モチーフを含むことが有利である。
ドとの間の相互作用が促進され、そのことにより精製収率の改善がもたらされる。従って、(CCT)、(CT)、もしくは(CTT)モチーフのn回反復物を含むオリゴヌクレオチドのためには、少なくともn回の相補的モチーフ、および好ましくはn+1回の相補的モチーフを含むDNA配列を用いることが好ましい。従ってn+1回の相補的モチーフを保持する配列により、そのオリゴヌクレオチドとの2つのハイブリダイゼーションの位置が提供される。このDNA配列が最高11までのハイブリダイゼーションの位置、すなわちn+10回の相補的モチーフを含むことが有利である。
本発明に従う方法を用いていずれかの種類の二本鎖DNAを精製することができる。後者の一例は環状DNAであり、それは例えば、プラスミドであり、これは一般的には一つもしくは複数の治療学的に有用な遺伝子を保持する。このプラスミドは更に、一つの複製起点および一つのマーカー遺伝子などを保持することがあってよい。本発明の方法を細胞溶解に直接適用してよい。この態様では、形質転換およびその後の細胞培養により増幅されたプラスミドは、その細胞の溶解の後に直接精製される。本発明の方法は更に、透明な溶解物、すなわち細胞溶解物の中和および遠心分離の後に取得される上清に応用されてもよい。この方法を既知の方法により精製された溶液にも応用してよいことは極めて明瞭である。この方法により更に、重要な配列を保持する直線状もしくは環状のDNAを様々な配列のDNAを含む混合物から精製することが可能となる。本発明に従う方法は二本鎖DNAの精製にも用いることができる。
細胞溶解物は原核生物もしくは真核生物の細胞の溶解物であることができる。
原核生物細胞に関しては、細菌である大腸菌(E.coli)、B.スブチリス(B.subtilis)、S.チフィムリウム(S.typhimurium)、もしくはストレプトミセス(Streptomyces)を例として挙げることができる。真核生物細胞に関しては、動物細胞、イースト、および真菌類などを挙げることができ、そして一層特別にはクルイベロミセス(Kluyveromyces)もしくはサッカロミセス(Saccharomyces)属のイースト、あるいはCOS、CHO、C127、およびNIH3T3などの細胞を挙げることができる。
本発明の方法は特に有利であり、なぜならこの方法により非常に純度の高いプラスミドDNAを迅速かつ簡便に取得することが可能となるためである。具体的には実施例に説明されるように、この方法により問題のプラスミドDNAを混入性構成成分(例えば、分画化された染色体DNA、エンドトキシン、蛋白質、およびヌクレアーゼなど)から効率良く分離することが可能となる。より特別には本発明の方法により、0.5%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を有する二本鎖DNA、具体的にはプラスミド起源のものを取得することが可能となる。取得されるDNA精製物が0.2%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を有することが更に一層好ましい。従って本発明は薬剤学的、特に遺伝子療法もしくは細胞療法に用いることができるプラスミドDNAを含む組成物を記載する。これに関係して、本発明の主題は更に、先に記載される方法に従って調製される二本鎖DNA(直鎖状もしくはプラスミド起源もの)を含む薬剤学的組成物でもある。
本発明は更に、0.5%を下回るかもしくはそれに等しい、好ましくは0.2%を下回るかもしくはそれに等しい、そして更に一層好ましくは0.1%を下回るかそれに等しい染色体DNA含有量を有するプラスミドDNA調製物にも関する。
「裸のまま」であるかもしくは輸送用担体(例えば、リポソーム、ナノパーティクル、カチオン性脂質、ポリマー、および組換えウイルスもしくは蛋白質など)と組み合わせられているプラスミドDNAを含むことができる。
本出願人は以下に続く実施例により一層詳細に記載されるであろうし、その実施例は説明としておよび非制限として見なされるべきものである。
クローニングおよび分子生物学の一般的技術
例えば制限酵素での消化、ゲル電気泳動、大腸菌(E.coli)内での形質転換、および核酸の沈殿などのような分子生物学の通常の方法は刊行物に記載されている(Maniatis et al.、T.、E.F.Fritsch、and J.Sambrook、1989。Molecular cloning:a laboratory manual、second edition。Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory
Press、New York;Ausubel F.M.、R.Brent、R.E.Kinston、D.D.Moore、J.A.Smith、J.G.Seidman
and K.Struhl。1987。Current protocols in molecular biology 1987−1988。John Willey and Sons、New York.)。ヌクレオチド配列は既に公開されているプロトコール(Ausubel et al.、1987)に従う鎖停止方法により決定された。
例えば制限酵素での消化、ゲル電気泳動、大腸菌(E.coli)内での形質転換、および核酸の沈殿などのような分子生物学の通常の方法は刊行物に記載されている(Maniatis et al.、T.、E.F.Fritsch、and J.Sambrook、1989。Molecular cloning:a laboratory manual、second edition。Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory
Press、New York;Ausubel F.M.、R.Brent、R.E.Kinston、D.D.Moore、J.A.Smith、J.G.Seidman
and K.Struhl。1987。Current protocols in molecular biology 1987−1988。John Willey and Sons、New York.)。ヌクレオチド配列は既に公開されているプロトコール(Ausubel et al.、1987)に従う鎖停止方法により決定された。
制限酵素はNew England Biolabs社、Beverly、MA(Biolabs)により供給された。
連結を実施するためには、DNA断片をファージT4 DNAリガーゼ(Biolabs社)の存在下、50mM トリス(Tris)−HCl、pH7.0、10mM MgCl2、10mM DTT、2mM ATPを含む緩衝液中でインキュベートする。
オリゴヌクレオチドは、Biosearch 8600自動DNA合成機で、製造業者の推奨条件を用い、シアノエチル基によりβ位で保護されるホスホルアミデートを用いるホスホルアミデート化学合成法を用いて合成される(Sinha,N.D.、J.Biernat,J. McManus and H.Koester、1984。Polymer support oligonucleotide synthesis、XVIII:Use of β−cyanoethyl−N,N−dialkylamino−/N−morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product。Nucl.Acids Res.、12、4539−4557:Giles,J.W. 1985。Advances in automated DNA synthesis。Am.Biotechnol.、Nov./Dec.)。
形質転換の効率について検査される予定の連結DNAもしくはDNAを用いてコンピテントにさせてある以下の株を形質転換させた:
大腸菌(E.coli)DH5α[F/endAl,hsdR17,supE44,thi−1,recA1,gyrA96,relA1,Δ(lacZYA−argF)U169,deoR,Φ80dlac(lacZΔM15)]。
大腸菌(E.coli)DH5α[F/endAl,hsdR17,supE44,thi−1,recA1,gyrA96,relA1,Δ(lacZYA−argF)U169,deoR,Φ80dlac(lacZΔM15)]。
プラスミドDNAのミニ調製物はKleinら、1980、のプロトコールに従って作製される。
LB培養培地が大腸菌株(E.coli)の成長用に用いられる(Maniatis
et al.、1982)。株は37℃下でインキュベートする。細菌を適切な抗生物質を補足してあるLB培地のディッシュ上でプレート培養する。
et al.、1982)。株は37℃下でインキュベートする。細菌を適切な抗生物質を補足してあるLB培地のディッシュ上でプレート培養する。
1.1. カラムの調製
装置
用いられるカラムは扇動ポンプ(出力<1 ml/分)に連結させてある、NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド、Pharmacia社)で活性化させた1 mlのHiTrapカラムである。用いられる特異的オリゴヌクレオチドは5’末端にNH2基を保持し、その配列は以下のとおりである:
5′−GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(配列番号1)。
この実施例に用いられる緩衝液は以下のとおりである:
カップリング用緩衝液:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3。
緩衝液A:0.5M エタノールアミン、0.5M NaCl、pH8.3。
緩衝液B:0.1M 酢酸塩、0.5M NaCl、pH4。
装置
用いられるカラムは扇動ポンプ(出力<1 ml/分)に連結させてある、NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド、Pharmacia社)で活性化させた1 mlのHiTrapカラムである。用いられる特異的オリゴヌクレオチドは5’末端にNH2基を保持し、その配列は以下のとおりである:
5′−GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(配列番号1)。
この実施例に用いられる緩衝液は以下のとおりである:
カップリング用緩衝液:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3。
緩衝液A:0.5M エタノールアミン、0.5M NaCl、pH8.3。
緩衝液B:0.1M 酢酸塩、0.5M NaCl、pH4。
方法:
カラムを6mlの1mM HClで洗浄し、そしてカップリング用緩衝液中に希釈されるオリゴヌクレオチド(1ml中の50nモル)をその後にそのカラムにかけ、そして室温に30分間放置する。そのカラムを6mlの緩衝液Aで3回連続洗浄し、そしてその後に6mlの緩衝液Bで洗浄した。オリゴヌクレオチドはこのようにして共有結合により、CONH結合を通してカラムに連結させる。このカラムをPBS、0.1% NaN3中、4℃で保存し、そして少なくとも4回は使用されてよい。
カラムを6mlの1mM HClで洗浄し、そしてカップリング用緩衝液中に希釈されるオリゴヌクレオチド(1ml中の50nモル)をその後にそのカラムにかけ、そして室温に30分間放置する。そのカラムを6mlの緩衝液Aで3回連続洗浄し、そしてその後に6mlの緩衝液Bで洗浄した。オリゴヌクレオチドはこのようにして共有結合により、CONH結合を通してカラムに連結させる。このカラムをPBS、0.1% NaN3中、4℃で保存し、そして少なくとも4回は使用されてよい。
1.2. プラスミドの構築
以下の2本のオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチド 4817:
5’−
GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG−3’(配列番号9)
オリゴヌクレオチド 4818:
5’−
AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG−3’(配列番号10)。
以下の2本のオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチド 4817:
5’−
GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG−3’(配列番号9)
オリゴヌクレオチド 4818:
5’−
AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG−3’(配列番号10)。
これらのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズさせ、そしてプラスミド内にクローン化させた場合には、ホモプリン−ホモピリミジン配列(GAA)17を先に記載される要領で対応プラスミド内に組み込ませる。
ハイブリダイズさせたこれら2本のオリゴヌクレオチドに対応する配列をプラスミドpBKS+(Stratagene Cloning System社、La Jolla
CA)(このプラスミドはアンピリシン耐性遺伝子を保持している)の多重クローニング部位でクローニングさせた。この目的のためには、このオリゴヌクレオチドを以下の様式でハイブリダイズさせた:1 μgのこれら2本のオリゴヌクレオチドを、50mMのトリス(Tris)−HCl pH7.4、10mM MgCl2を含む40mlの最終緩衝液内に一緒に入れた。この混合物を95℃に加熱し、そしてその後に室温に置いたため温度はゆっくりと下降したはずである。ハイブリダイズさせた10ngのオリゴヌクレチドを30μlの最終容量中に含まれる、BamHIおよびEcoRIで消化させた200ngのプラスミドpBKS+(Stratagene Cloning System
社、La Jolla CA)と連結させた。連結後、アリコートをDH5a内に形質転換させた。この形質転換混合物をアンピリシン(50mg/l)およびX−gal(20mg/l)を補足してあるL培地上でプレート培養した。組換えクローンは、大腸菌(E.coli)のβ−ガラクトシダーゼの断片ωのα−相補性を可能にさせる親プラスミド(pBKS+)と反してこの培地上では青色着色の非存在を呈するはずである。6つのクローンからのプラスミドDNAのミニ精製の後にはそれらは全て、pBKS+のEcoRIおよびBamHI部位の間に位置するPstI部位の消失、ならびに多重クローニング部位を含む448−bpのPvuIIバンドの分子量の増加を呈する。一つのクローンを選択し、そして対応プラスミドをpXL2563と表示した。クローン化された配列は、プラスミドpBKS+(Stratagene Cloning System社、La
Jolla CA)のためのプライマー−20(5′−TGACCGGCAGCAAAATG−3′(配列番号11))(Viera J. and J.Messing。1982。The pUC plasmids,an M13mp7−derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers。Gene、19、259−268)を用いる配列決定により確認した。プラスミドpXL2563はWizard Megaprepキット(Promega Corp.社、Madison、WI)に従い、供給会社の推奨事項に従って精製した。その後には、このプラスミドDNA調製物を以下に記載される実施例に用いた。
CA)(このプラスミドはアンピリシン耐性遺伝子を保持している)の多重クローニング部位でクローニングさせた。この目的のためには、このオリゴヌクレオチドを以下の様式でハイブリダイズさせた:1 μgのこれら2本のオリゴヌクレオチドを、50mMのトリス(Tris)−HCl pH7.4、10mM MgCl2を含む40mlの最終緩衝液内に一緒に入れた。この混合物を95℃に加熱し、そしてその後に室温に置いたため温度はゆっくりと下降したはずである。ハイブリダイズさせた10ngのオリゴヌクレチドを30μlの最終容量中に含まれる、BamHIおよびEcoRIで消化させた200ngのプラスミドpBKS+(Stratagene Cloning System
社、La Jolla CA)と連結させた。連結後、アリコートをDH5a内に形質転換させた。この形質転換混合物をアンピリシン(50mg/l)およびX−gal(20mg/l)を補足してあるL培地上でプレート培養した。組換えクローンは、大腸菌(E.coli)のβ−ガラクトシダーゼの断片ωのα−相補性を可能にさせる親プラスミド(pBKS+)と反してこの培地上では青色着色の非存在を呈するはずである。6つのクローンからのプラスミドDNAのミニ精製の後にはそれらは全て、pBKS+のEcoRIおよびBamHI部位の間に位置するPstI部位の消失、ならびに多重クローニング部位を含む448−bpのPvuIIバンドの分子量の増加を呈する。一つのクローンを選択し、そして対応プラスミドをpXL2563と表示した。クローン化された配列は、プラスミドpBKS+(Stratagene Cloning System社、La
Jolla CA)のためのプライマー−20(5′−TGACCGGCAGCAAAATG−3′(配列番号11))(Viera J. and J.Messing。1982。The pUC plasmids,an M13mp7−derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers。Gene、19、259−268)を用いる配列決定により確認した。プラスミドpXL2563はWizard Megaprepキット(Promega Corp.社、Madison、WI)に従い、供給会社の推奨事項に従って精製した。その後には、このプラスミドDNA調製物を以下に記載される実施例に用いた。
1.3. プラスミドの精製
装置:
プラスミドpXL2563(1.2に記載される)をオリゴヌクレオチドに連結させてあるHiTrapカラム(1.1.に記載される)上で、プラスミドpBKS+を含む溶液からも精製した。この精製に用いた緩衝液は以下のとおりである:
緩衝液F:2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5〜5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA。
装置:
プラスミドpXL2563(1.2に記載される)をオリゴヌクレオチドに連結させてあるHiTrapカラム(1.1.に記載される)上で、プラスミドpBKS+を含む溶液からも精製した。この精製に用いた緩衝液は以下のとおりである:
緩衝液F:2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5〜5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA。
方法:
このカラムを6mlの緩衝液Fで洗浄し、そしてプラスミド(400μlの緩衝液F中の20μgのpXL2563および20μgのpBKS+)をそのカラムにかけ、そして2時間室温でインキュベートした。このカラムを10mlの緩衝液Fで洗浄し、そしてその後に緩衝液Eでの溶離を実施する。プラスミドは1%アガロースゲル上での電気泳動および臭化エチジウム染色の後に検出される。溶液中のプラスミドの比率は大腸菌(E.coli)におけるそれらの形質転換性活性を測定することにより推測される。
このカラムを6mlの緩衝液Fで洗浄し、そしてプラスミド(400μlの緩衝液F中の20μgのpXL2563および20μgのpBKS+)をそのカラムにかけ、そして2時間室温でインキュベートした。このカラムを10mlの緩衝液Fで洗浄し、そしてその後に緩衝液Eでの溶離を実施する。プラスミドは1%アガロースゲル上での電気泳動および臭化エチジウム染色の後に検出される。溶液中のプラスミドの比率は大腸菌(E.coli)におけるそれらの形質転換性活性を測定することにより推測される。
結果:
30%のpXL2563および70%のpBKS+を含む混合物から出発し、100%のpXL2563を含む溶液をカラムの出口で回収する。260nmおよび280nmでのOD比率により推測される純度は1.9から2.5へと上昇し、このことにより混入性蛋白質がこの方法により除去されたことが示される。
30%のpXL2563および70%のpBKS+を含む混合物から出発し、100%のpXL2563を含む溶液をカラムの出口で回収する。260nmおよび280nmでのOD比率により推測される純度は1.9から2.5へと上昇し、このことにより混入性蛋白質がこの方法により除去されたことが示される。
2.1. − この実施例はプラスミドDNAの精製実験を記載する。オリゴヌクレオチド(5′−GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(配列番号1))のカラムへの連結は実施例1に記載される要領で実施される。この連結のためにはオリゴヌクレオチドは、6つの炭素原子を含むアーム(Modified oligonucleotide Eurogentec SA、Belgium)によりスペーサーのリン酸に連結されたアミン基で5’末端が改変される。プラスミドpXL2563を、Wizard Megaprepキット(Promega Corp.社、Madison
、WI)を用い、供給会社の推奨事項に従って精製した。この実施例に用いられた緩衝液は以下のとおりである:
緩衝液F:0〜2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5〜5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA。
、WI)を用い、供給会社の推奨事項に従って精製した。この実施例に用いられた緩衝液は以下のとおりである:
緩衝液F:0〜2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5〜5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA。
このカラムを6mlの緩衝液Fで洗浄し、そして400μlの緩衝液F中に稀釈された100μgのプラスミドpXL2563をその後にそのカラムにかけ、そして室温で2時間インキュベートする。そのカラムを10mlの緩衝液Fで洗浄し、そしてその後に緩衝液Eでの溶離を実施する。プラスミドは260nmでの光学密度を測定することにより定量する。この実施例では結合は、NaClに関するモル濃度が0〜2Mに変化する緩衝液(緩衝液F)中で実施される。精製収率はNaClのモル濃度が下がる場合には減少する。結合用緩衝液のpHは4.5〜5に変化することができ、精製収率は4.5の時に一層良くなる。塩基性pHのもう一つの溶離用緩衝液を用いることも可能であり:従って溶離は、50mMのホウ酸塩、pH9、0.5mM EDTAを含む緩衝液で実施された。
2.2. − このカラムへのオリゴヌクレオチド(5′−GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(配列番号1))の連結は実施例1に記載される要領で実施される。プラスミドpXL2563を、Wizard Megaprepキット(Promega Corp.社、Madison、WI)を用い、供給会社の推奨事項に従って精製した。この実施例に用いられる緩衝液は以下のとおりである:
緩衝液F:0.1M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA。
緩衝液F:0.1M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA。
このカラムを6mlの緩衝液Fで洗浄し、そして400μlの緩衝液F中に稀釈された100μgのプラスミドをその後にそのカラムにかけ、そして室温で1時間インキュベートする。そのカラムを10mlの緩衝液Fで洗浄し、そしてその後に緩衝液Eでの溶離を実施する。そのオリゴヌクレオチドカラムを通す過程前および後にプラスミド試料中に存在する大腸菌(E.coli)のゲノムDNAもしくは染色体DNAの含有量を測定する。このゲノムDNAは大腸菌(E.coli)galK遺伝子内のプライマーを用いることでPCRにより定量される。以下のプロトコールに従い:これらのプライマーの配列がDebouckら(Nucleic Acids Res. 1985、13、1814−1853)により記載される:
5′−CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC−3′(配列番号24)、および5′−CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT−3′(配列番号25)。この反応用培地は、25μlのPCR用緩衝液(Promega France社、Charbonni res)中に:1.5mM MgCl2;0.2mM dXTP(Pharmacia社、Orsay);0.5μM プライマー;20U/ml Taq ポリメラーゼ(Promega社)を含む。この反応は以下の順番:
− 95℃で5分
− 95℃で10秒
60℃で30秒
78℃で1分、を30周期
− 78℃で10分
に従って実施される。増幅された124塩基対分の長さのDNA断片をSybrGreen I(Molecular Probes社、Eugene、USA)の存在下、3%アガロースゲル上での電気泳動により分離させ、そしてその後に大腸菌(E.coli)株B(Sigma社、ref D4889)からのUltrapur ゲノムDNAに照合させることにより定量する。
5′−CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC−3′(配列番号24)、および5′−CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT−3′(配列番号25)。この反応用培地は、25μlのPCR用緩衝液(Promega France社、Charbonni res)中に:1.5mM MgCl2;0.2mM dXTP(Pharmacia社、Orsay);0.5μM プライマー;20U/ml Taq ポリメラーゼ(Promega社)を含む。この反応は以下の順番:
− 95℃で5分
− 95℃で10秒
60℃で30秒
78℃で1分、を30周期
− 78℃で10分
に従って実施される。増幅された124塩基対分の長さのDNA断片をSybrGreen I(Molecular Probes社、Eugene、USA)の存在下、3%アガロースゲル上での電気泳動により分離させ、そしてその後に大腸菌(E.coli)株B(Sigma社、ref D4889)からのUltrapur ゲノムDNAに照合させることにより定量する。
そのカラムにかけた試料中には1%の染色体DNAが存在し、そしてその試料の内の0.2%がオリゴヌクレオチドカラム上で精製される。
透明溶菌物についての実験
この実施例は、いわゆる「ミニプレップ」スケールでの細菌培養物の透明溶菌物からのプラスミドDNA精製を記載する:プラスミドpXL2563を含む1.5mlのDH5α株の一晩培養物を遠心分離にかけ、そしてそのペレットを100μlの50mM グルコース、25mM トリス(Tris)−HCl、pH8、10mM EDTA中に再懸濁させる。その後に200μlの0.2M NaOH、1% SDSを添加し、その試験管を反転させて混合させ、150μlの3M 酢酸カリウム、pH5、をその後に添加し、そしてその試験管を反転させて混合させる。遠心分離後、その上清を回収し、そして実施例1に記載される要領で取得されるオリゴヌクレオチドカラムにかける。結合、洗浄、および溶離は実施例1に記載されるものと同一である。約1μgのプラスミドが1.5mlの培養物から回収される。取得され、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により分析されたプラスミドは「超コイル状の」環状DNAのシングルバンドの形態をとる。高分子量の(染色体)DNAもしくはRNAの痕跡はこの方法により精製されたプラスミド中には全く検出されない。260nmおよび280nmでの光学密度の比率は2を上回る。
この実施例は、いわゆる「ミニプレップ」スケールでの細菌培養物の透明溶菌物からのプラスミドDNA精製を記載する:プラスミドpXL2563を含む1.5mlのDH5α株の一晩培養物を遠心分離にかけ、そしてそのペレットを100μlの50mM グルコース、25mM トリス(Tris)−HCl、pH8、10mM EDTA中に再懸濁させる。その後に200μlの0.2M NaOH、1% SDSを添加し、その試験管を反転させて混合させ、150μlの3M 酢酸カリウム、pH5、をその後に添加し、そしてその試験管を反転させて混合させる。遠心分離後、その上清を回収し、そして実施例1に記載される要領で取得されるオリゴヌクレオチドカラムにかける。結合、洗浄、および溶離は実施例1に記載されるものと同一である。約1μgのプラスミドが1.5mlの培養物から回収される。取得され、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により分析されたプラスミドは「超コイル状の」環状DNAのシングルバンドの形態をとる。高分子量の(染色体)DNAもしくはRNAの痕跡はこの方法により精製されたプラスミド中には全く検出されない。260nmおよび280nmでの光学密度の比率は2を上回る。
4.1:この実施例は、プラスミドpXL2563を含むDH5α株の20mlの細菌培養物から出発して実施例3と同一の条件下で実施されるプラスミドDNA精製実験を記載する。細胞ペレットを1.5mlの50mM グルコース、25mM トリス(Tris)−HCl、pH8、10mM EDTA中に溶かす。溶菌は2mlの0.2M NaOH、1% SDSで実施し、そして中和は1.5mlの3M 酢酸カリウム、pH5、で実施する。その後にこのDNAを3mlの2−プロプラノロールで沈殿させ、そしてそのペレットを0.5mlの0.2M 酢酸ナトリウム、pH5、0.1M NaCl中に溶かし、そして実施例1に記載される要領で取得されるオリゴヌクレオチドカラムにかける。結合、カラムの洗浄、および溶離は実施例1に記載される要領で実施されるが、例外は洗浄用緩衝液であり、NaClに関するモル濃度は0.1Mである。約16μgのプラスミドDNAが取得される。取得され、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により分析されるプラスミドは「超コイル状の」環状DNAのシングルバンドの形態をとる。高分子量の(染色体)DNAもしくはRNAの痕跡は精製されたプラスミド中には全く検出されない。制限酵素でのプラスミドの消化により3キロベースの予想分子量にシングルバンドが生じる。試料中の蛋白質濃度は、透明溶菌物中の125μg/mlから精製されたプラスミド(Micro−BCA assay、Pierce社)中1μg/mlを下回る濃度へと減少する。LALアッセイ(Biosepra社)により予測されるエンドトキシン濃度は、出発透明溶菌物に比例し、精製されたプラスミドでは10を上回る因子で割り算される。
4.2:用いられるプラスミドは、サイトメガロウイルスプロモーター、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、およびプラスミドpXL2563に由来するホモプリン−ホモピリミジン配列(GAA)17を含むカセットを含む。このプラスミドを含む株DH1(Maniatis et al.、1989)を7リットル用発酵器内で培養する。透明溶菌物が200グラムの細胞から調製され:その細胞ペレットを2リットルの25mM トリス(Tris)、pH6.8、50mM グルコース、10mM EDTAに溶かし、これに2リットルの0.2M NaOH、1% SDSを添加する。この溶菌物を、1リットルの3Mの酢酸カリウムを添加することにより中和させる。ダイアフィルトレーションの後に4mlのこの溶菌物を、実施例1.1.に記載される方法に従い配列5′−GA
GGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(配列番号1)のオリゴヌクレオチドに連結される5mlのHiTrap−NHSカラムにかける。洗浄および溶離は実施例1に記載される要領で実施する。約400マイクログラムのプラスミドが回収される。実施例2.2に記載される技術により測定されるこの試料中のゲノムDNAのレベルは0.1%である。
GGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(配列番号1)のオリゴヌクレオチドに連結される5mlのHiTrap−NHSカラムにかける。洗浄および溶離は実施例1に記載される要領で実施する。約400マイクログラムのプラスミドが回収される。実施例2.2に記載される技術により測定されるこの試料中のゲノムDNAのレベルは0.1%である。
改変させたオリゴヌクレオチドの使用
この実施例はメチル化させたシトシンを保持するオリゴヌクレオチドの使用を記載する。用いられるオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである:5’−GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT−3’(配列番号12)。
この実施例はメチル化させたシトシンを保持するオリゴヌクレオチドの使用を記載する。用いられるオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである:5’−GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT−3’(配列番号12)。
このオリゴヌクレオチドは5’末端にNH2基を保持する。MeC=5−メチルシトシン。このオリゴヌクレオチドによりプラスミドpXL2563を実施例1の条件下、pH5の結合用緩衝液で精製することが可能となる(プラスミドの変性の危険性はこのことにより減少する)。
先の実施例では、用いられるオリゴヌクレオチドは、6つの炭素原子を含むアーム:NH2−(CH2)6を通してリン酸に連結されるアミン基で5’末端が改変される。この実施例ではアミン基は、12の炭素原子を含むアーム:NH2−(CH2)12を通して5’末端のリン酸に連結される。オリゴヌクレオチドのカップリングおよびカラムを通す過程は、緩衝液F:2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5、を用い、実施例2に記載される要領で実施される。このオリゴヌクレオチドによりより良い精製収率を得ることが可能となる:53%の収率が観察される一方で、6つの炭素原子を含むオリゴヌクレオチドを用いると、この収率は同一条件下で45%のオーダーとなる。
実施例1.2に記載されるクローニング手法に従い、ホモプリン−ホモピリミジン配列を保持する他の2つのプラスミド:配列(GAA)16を含むプラスミドpXL2725、および配列(GA)25を含むプラスミドpXL2726、を構築した。
実施例7.1:プラスミドの構築
プラスミドpXL2563に類似するプラスミドpXL2725およびpXL2726を、実施例1.2に記載されるクローニング手法に従い、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて構築した:
5986:5′−GATCC(GA)25GGG−3′(配列番号13)
5987:5′−AATTCCC(TC)25G−3′(配列番号14)
5981:5′−GATCC(GGA)17GG−3′(配列番号15)
5982:5′−AATT(CCT)17CCG−3′(配列番号16)。
プラスミドpXL2563に類似するプラスミドpXL2725およびpXL2726を、実施例1.2に記載されるクローニング手法に従い、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて構築した:
5986:5′−GATCC(GA)25GGG−3′(配列番号13)
5987:5′−AATTCCC(TC)25G−3′(配列番号14)
5981:5′−GATCC(GGA)17GG−3′(配列番号15)
5982:5′−AATT(CCT)17CCG−3′(配列番号16)。
オリゴヌクレオチド対5986および5987を用い、pBKS+(Stratagene Cloning System社、La Jolla CA)のBamHIおよびEcoRI部位にそのオリゴヌクレオチドをクローニングすることによりプラスミドpXL2726を構築した一方で、オリゴヌクレオチド5981および5982を、プラスミドpXL2725の構築用に用いた。プラスミドpXL2563の構築用のものと同一の実験条件を用い、かつオリゴヌクレオチド対のみが違っていた。同様に、クローン化された配列はそのプラスミドにおける配列決定により確認した。このことにより、プラスミドpXL2725が予想配列に関連する改変を保持する、つまり:17回反復される配列G
GAの代わりにGGAGA(GGA)15(配列番号17)が存在するという所見を得ることが可能となる。
GAの代わりにGGAGA(GGA)15(配列番号17)が存在するという所見を得ることが可能となる。
実施例7.2:カラムの調製および精製
これらのホモプリン配列と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを、実施例1.1に記載される技術に従いHiTrapカラムに連結させた。配列5′−AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT−3′(配列番号18)のオリゴヌクレオチドをプラスミドpXL2725の精製用に用い、そして配列5′−AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT−3′(配列番号19)のオリゴヌクレオチドをプラスミドpXL2726の精製に用いた。
これらのホモプリン配列と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを、実施例1.1に記載される技術に従いHiTrapカラムに連結させた。配列5′−AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT−3′(配列番号18)のオリゴヌクレオチドをプラスミドpXL2725の精製用に用い、そして配列5′−AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT−3′(配列番号19)のオリゴヌクレオチドをプラスミドpXL2726の精製に用いた。
このことにより取得された2本のカラムにより、以下の緩衝液:
緩衝液F:2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA
を用い、実施例2に記載される技術に従い対応プラスミドを精製することが可能となる。得られる収率は、pXL2725およびpXL2726につき、各々23%および31%である。
緩衝液F:2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA
を用い、実施例2に記載される技術に従い対応プラスミドを精製することが可能となる。得られる収率は、pXL2725およびpXL2726につき、各々23%および31%である。
この実施例は、精製収率における、プラスミド内に存在する特定の配列の長さの影響を説明する。
実施例8.1:プラスミドの構築
本発明の組成物の活性を証明するためにこれらの実施例で用いられるレポーター遺伝子はルシフェラーゼ(Luc)をコードする遺伝子である。
本発明の組成物の活性を証明するためにこれらの実施例で用いられるレポーター遺伝子はルシフェラーゼ(Luc)をコードする遺伝子である。
プラスミドpXL2621は制限酵素MluIおよびHindIIIでの開裂によりpcDNA3(Invitrogen Corp.社、San Diego、CA)から抽出された661−bpのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含むカセット(これは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流のMluIおよびHindIII部位でベクターpGL塩基性Vector(Promega Corp.社、Madison、WI)内にクローン化されている)を含む。このプラスミドは分子生物学の標準的技術を用いて構築された。
プラスミドpXL2727−1およびpXL2727−2は以下の様式で構築した:
2マイクログラムのプラスミドpXL2621をBamHIで直線化し;その酵素を65℃、10分間の処理により不活化させ;同時にオリゴヌクレオチド6006および6008をプラスミドpXL2563の構築について記載される要領でハイブリダイズさせた。
6006:5′−GATCT(GAA)17CTGCAGATCT−3′(配列番号20)
6008:5′−GATCAGATCTGCAG(TTC)17A−3′(配列番号21)。
2マイクログラムのプラスミドpXL2621をBamHIで直線化し;その酵素を65℃、10分間の処理により不活化させ;同時にオリゴヌクレオチド6006および6008をプラスミドpXL2563の構築について記載される要領でハイブリダイズさせた。
6006:5′−GATCT(GAA)17CTGCAGATCT−3′(配列番号20)
6008:5′−GATCAGATCTGCAG(TTC)17A−3′(配列番号21)。
このハイブリダイゼーション混合物をプラスミドpXL2621のBamHI末端でクローン化し、そしてDH5a内への形質転換の後に組換えクローンをPstI酵素による制限分析により同定したが、なぜならこのオリゴヌクレオチドによりPstI部位が導入されるためである。2つのクローンを選択し、そしてクローン化断片のヌクレオチド配列を、配列決定反応用のプライマーとしてのプライマー(6282、5′−ACAGTCATAAGTGCGGCGACG−3′(配列番号22))(Viera J. and
J.Messing、1982。The pUC plasmids an M13mp7−derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers。Gene 19:259−268)を用いて確認した。
J.Messing、1982。The pUC plasmids an M13mp7−derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers。Gene 19:259−268)を用いて確認した。
第一クローン(pXL2727−1)は10回反復される配列GAAを含む。第二クローン(pXL2727−2)は配列5′−GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA−3′(配列番号23)を含む。
実施例8.2:カラムの調製および精製
例えば実施例1に記載されるもののようなカラムであって、かつオリゴヌクレオチド5′−GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(配列番号1)に連結されるカラムが用いられる。
例えば実施例1に記載されるもののようなカラムであって、かつオリゴヌクレオチド5′−GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT−3′(配列番号1)に連結されるカラムが用いられる。
プラスミドpXL2727−1は14回分の配列GAAを含む。従って、わずか7回分の対応ハイブリダイゼーション配列CTTを含み、先に記載されるオリゴヌクレオチドは、8つの異なる位置でこのプラスミドとハイブリダイズすることができる。それとは対照的にプラスミドpXL2727−2は、そのカラムに結合するオリゴヌクレオチドのものと同一の長さのハイブリダイズ用配列(GAA)7を保持する。従って、このオリゴヌクレオチドはpXL2727−2上の唯一の位置でのみハイブリダイズすることができる。
この実験は実施例2に記載されるものと同一であり、以下の緩衝液が用いられる:
緩衝液F:2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA。
精製収率はプラスミドpXL2727−1に関しては29%、そしてpXL2727−2に関しては19%である。
緩衝液F:2M NaCl、0.2M 酢酸塩、pH4.5。
緩衝液E:1M トリス(Tris)−HCl、pH9、0.5mM EDTA。
精製収率はプラスミドpXL2727−1に関しては29%、そしてpXL2727−2に関しては19%である。
実施例8.3:哺乳類細胞のインビトロトランスフェクション
用いられる細胞はNIH 3T3細胞であり、これを実験前日に50,000細胞/ウエルを基に24ウエル培養プレート内に撒種する。このプラスミドを150mMのNaCl中に希釈し、そしてリポフェクション用作用物質RPR115335と混合する。6に等しいリポフェクション用作用物質陽性荷電/DNA陰性荷電比率を用いる。この混合物をボルテックスミキサーにかけ、室温に10分間放置し、ウシ胎仔血清非含有性培地で希釈し、そしてその後に、培養用ウエルあたり1μgのDNAの比率で細胞に添加する。37℃で2時間置いた後、10%容量/容量のウシ胎仔血清を添加し、そしてその細胞を37℃で48時間、5%のCO2の存在下でインキュベートする。その細胞を2度PBSで洗浄し、そしてルシフェラーゼ活性を記載されるプロトコールに従い(Promegaキット、Promega Corp.社、Madison、WI)、Lumat LB9501ルミノメーター(EG and G Berthold社、Evry)において測定する。実施例8.2に記載される要領で精製されるプラスミドpXL2727−1により、Wizard Megaprepキット(Promega Corp.社、Madison、WI)を用いて精製される同一のプラスミドで取得されるものの2倍ものトランスフェクション収率が得られる。
用いられる細胞はNIH 3T3細胞であり、これを実験前日に50,000細胞/ウエルを基に24ウエル培養プレート内に撒種する。このプラスミドを150mMのNaCl中に希釈し、そしてリポフェクション用作用物質RPR115335と混合する。6に等しいリポフェクション用作用物質陽性荷電/DNA陰性荷電比率を用いる。この混合物をボルテックスミキサーにかけ、室温に10分間放置し、ウシ胎仔血清非含有性培地で希釈し、そしてその後に、培養用ウエルあたり1μgのDNAの比率で細胞に添加する。37℃で2時間置いた後、10%容量/容量のウシ胎仔血清を添加し、そしてその細胞を37℃で48時間、5%のCO2の存在下でインキュベートする。その細胞を2度PBSで洗浄し、そしてルシフェラーゼ活性を記載されるプロトコールに従い(Promegaキット、Promega Corp.社、Madison、WI)、Lumat LB9501ルミノメーター(EG and G Berthold社、Evry)において測定する。実施例8.2に記載される要領で精製されるプラスミドpXL2727−1により、Wizard Megaprepキット(Promega Corp.社、Madison、WI)を用いて精製される同一のプラスミドで取得されるものの2倍ものトランスフェクション収率が得られる。
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
1. 他の構成成分と混ざっている二本鎖DNAを含む溶液を、前記DNA中に存在する特定の配列とのハイブリダイゼーションにより三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドが共有結合した支持体を通す少なくとも一つの段階を含むことを特徴とする二本鎖DNAの精製方法。
2. 前記DNAを含む溶液が細胞溶解物であることを特徴とする、上記1に記載の方法。
3. 細胞溶解物が透明溶解物であることを特徴とする、上記2に記載の方法。
4. 二本鎖DNAが予め精製されることを特徴とする、上記1に記載の方法。
5. DNA中に存在する特定の配列がホモプリン−ホモピリミジン配列を含み、かつ前記オリゴヌクレオチドがそのホモプリン−ホモピリミジン配列と三重らせんを形成する配列を含むことを特徴とする、上記1に記載の方法。
6. 特定の配列が二本鎖DNA内に人工的に組み込まれていることを特徴とする、上記1〜5の内の一つに記載の方法。
7. オリゴヌクレオチドがポリ(CTT)配列を含み、かつそのDNA内に存在する特定の配列がポリ(GAA)配列であることを特徴とする、上記5に記載の方法。
8. オリゴヌクレオチドが配列GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(配列番号1)を保持することを特徴とする、上記5に記載の方法。
9. オリゴヌクレオチドが配列(CTT)7(配列番号26)を保持することを特徴とする、上記5に記載の方法。
10. 前記DNA中に存在する特定の配列が配列(GAA)7、(GAA)14、もしくは(GAA)17を含むことを特徴とする、上記8もしくは9に記載の方法。
11. 前記DNA中に存在する特定の配列が配列番号5の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号6もしくは配列番号7の配列を含むことを特徴とする、上記5に記載の方法。
12. 前記DNA中に存在する特定の配列が配列番号17の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号18の配列を含むことを特徴とする、上記5に記載の方法。
13. 前記DNA中に存在する特定の配列が配列(GA)25を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号19の配列を含むことを特徴とする、上記5に記載の方法。
14. 特定の配列が二本鎖DNA中に天然に存在する特定の配列であることを特徴とする、上記1〜5の内の一つに記載の方法。
15. 前記DNA内に天然に存在する特定の配列が、プラスミドの複製起点内に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列であることを特徴とする、上記14に記載の方法。
16. 特定のDNA配列が、大腸菌(E.coli)の複製起点ColE1内に存在する配列番号2の配列の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、上記15に記載の方法。
17. オリゴヌクレオチドが配列番号3の配列を含むことを特徴とする、上記16の方法。
18. 特定のDNA配列が、プラスミドpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子内に存在する配列番号4の配列もしくは配列番号8の配列の内の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、上記14に記載の方法。
19. オリゴヌクレオチドが、ジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、もしくはアミン結合を通して支持体に連結されることを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
20. オリゴヌクレオチドが炭素鎖(CH2)n[式中、nは1〜18までの間の整数である]からなるアームを介してカラムに連結され、前記アームがリン酸を通してオリゴヌクレオチドに、次いではアミド結合を通してカラムに連結することを特徴とする、上記19に記載の方法。
21. アームが6つの炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、上
記20に記載の方法。
22. アームが12の炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、上記20に記載の方法。
23. オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの化学的改変を保持し、そのことによりそのオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して耐性となるか、もしくはヌクレアーゼに対して保護されるか、または特定の配列に対する親和性を増加させることとなることを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
24. オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのシトシンがメチル化されている、ホモピリミジン配列を保持することを特徴とする、上記23に記載の方法。
25. DNAが更に一つもしくは複数の治療学的に重要な配列を含むことを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
26. 二本鎖DNAが例えばプラスミドのような環状DNAであることを特徴とする、前述の上記の内のいずれか一つに記載の方法。
27. 二本鎖DNA内に存在する特定の配列がオリゴヌクレオチドとのハイブリダーゼーションのための数々の位置を含むことを特徴とする、上記1に記載の方法。
28. 支持体が、機能化させたクロマトグラフー用支持体、機能化させたプラスチック表面、および機能化させたラテックスビーズから選択されることを特徴とする、上記1に記載の方法。
29. 支持体がクロマトグラフィー用支持体であることを特徴とする、上記28に記載の方法。
30. 上記1〜29の内の一つに記載される方法により取得されるDNAを含む薬剤学的組成物。
31. 0.5%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドDNAの調製物。
32. 0.2%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドDNAの調製物。
33. 0.1%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドDNAの調製物。
34. 二本鎖RNAの精製のための、上記1に記載の方法。
2. 前記DNAを含む溶液が細胞溶解物であることを特徴とする、上記1に記載の方法。
3. 細胞溶解物が透明溶解物であることを特徴とする、上記2に記載の方法。
4. 二本鎖DNAが予め精製されることを特徴とする、上記1に記載の方法。
5. DNA中に存在する特定の配列がホモプリン−ホモピリミジン配列を含み、かつ前記オリゴヌクレオチドがそのホモプリン−ホモピリミジン配列と三重らせんを形成する配列を含むことを特徴とする、上記1に記載の方法。
6. 特定の配列が二本鎖DNA内に人工的に組み込まれていることを特徴とする、上記1〜5の内の一つに記載の方法。
7. オリゴヌクレオチドがポリ(CTT)配列を含み、かつそのDNA内に存在する特定の配列がポリ(GAA)配列であることを特徴とする、上記5に記載の方法。
8. オリゴヌクレオチドが配列GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(配列番号1)を保持することを特徴とする、上記5に記載の方法。
9. オリゴヌクレオチドが配列(CTT)7(配列番号26)を保持することを特徴とする、上記5に記載の方法。
10. 前記DNA中に存在する特定の配列が配列(GAA)7、(GAA)14、もしくは(GAA)17を含むことを特徴とする、上記8もしくは9に記載の方法。
11. 前記DNA中に存在する特定の配列が配列番号5の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号6もしくは配列番号7の配列を含むことを特徴とする、上記5に記載の方法。
12. 前記DNA中に存在する特定の配列が配列番号17の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号18の配列を含むことを特徴とする、上記5に記載の方法。
13. 前記DNA中に存在する特定の配列が配列(GA)25を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号19の配列を含むことを特徴とする、上記5に記載の方法。
14. 特定の配列が二本鎖DNA中に天然に存在する特定の配列であることを特徴とする、上記1〜5の内の一つに記載の方法。
15. 前記DNA内に天然に存在する特定の配列が、プラスミドの複製起点内に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列であることを特徴とする、上記14に記載の方法。
16. 特定のDNA配列が、大腸菌(E.coli)の複製起点ColE1内に存在する配列番号2の配列の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、上記15に記載の方法。
17. オリゴヌクレオチドが配列番号3の配列を含むことを特徴とする、上記16の方法。
18. 特定のDNA配列が、プラスミドpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子内に存在する配列番号4の配列もしくは配列番号8の配列の内の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、上記14に記載の方法。
19. オリゴヌクレオチドが、ジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、もしくはアミン結合を通して支持体に連結されることを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
20. オリゴヌクレオチドが炭素鎖(CH2)n[式中、nは1〜18までの間の整数である]からなるアームを介してカラムに連結され、前記アームがリン酸を通してオリゴヌクレオチドに、次いではアミド結合を通してカラムに連結することを特徴とする、上記19に記載の方法。
21. アームが6つの炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、上
記20に記載の方法。
22. アームが12の炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、上記20に記載の方法。
23. オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの化学的改変を保持し、そのことによりそのオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して耐性となるか、もしくはヌクレアーゼに対して保護されるか、または特定の配列に対する親和性を増加させることとなることを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
24. オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのシトシンがメチル化されている、ホモピリミジン配列を保持することを特徴とする、上記23に記載の方法。
25. DNAが更に一つもしくは複数の治療学的に重要な配列を含むことを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
26. 二本鎖DNAが例えばプラスミドのような環状DNAであることを特徴とする、前述の上記の内のいずれか一つに記載の方法。
27. 二本鎖DNA内に存在する特定の配列がオリゴヌクレオチドとのハイブリダーゼーションのための数々の位置を含むことを特徴とする、上記1に記載の方法。
28. 支持体が、機能化させたクロマトグラフー用支持体、機能化させたプラスチック表面、および機能化させたラテックスビーズから選択されることを特徴とする、上記1に記載の方法。
29. 支持体がクロマトグラフィー用支持体であることを特徴とする、上記28に記載の方法。
30. 上記1〜29の内の一つに記載される方法により取得されるDNAを含む薬剤学的組成物。
31. 0.5%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドDNAの調製物。
32. 0.2%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドDNAの調製物。
33. 0.1%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドDNAの調製物。
34. 二本鎖RNAの精製のための、上記1に記載の方法。
Claims (40)
- 他の構成成分と混ざっている環状二本鎖DNAを含む溶液を、前記DNA中に存在する特定のホモプリン/ホモピリミジン配列とのハイブリダイゼーションにより三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドが共有結合したクロマトグラフィー用支持体に通す少なくとも一つの精製段階を含み、前記オリゴヌクレオチドが10と30の間の長さを有することを特徴とする、環状二本鎖DNAに基づく医薬の製造方法。
- 前記DNAを含む溶液が細胞溶解物であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 細胞溶解物が透明溶解物であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 二本鎖DNAが予め精製されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 特定の配列が二本鎖DNA内に人工的に組み込まれていることを特徴とする、請求項1〜4の内の一つに記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがポリ(CTT)配列を含み、かつDNA中に存在する特定の配列がポリ(GAA)配列であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが配列GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(配列番号1)を保持することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが配列(CTT)7(配列番号26)を保持することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA中に存在する特定の配列が配列(GAA)7、(GAA)14、もしくは(GAA)17を含むことを特徴とする、請求項7もしくは8に記載の方法。
- 前記DNA中に存在する特定の配列が配列番号5の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号6もしくは配列番号7の配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA中に存在する特定の配列が配列番号17の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号18の配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA中に存在する特定の配列が配列(GA)25を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号19の配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 特定の配列が二本鎖DNA中に天然に存在する特定の配列であることを特徴とする、請求項1〜4の内の一つに記載の方法。
- 前記DNA内に天然に存在する特定の配列が、プラスミドの複製起点内に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 特定のDNA配列が、大腸菌(E.coli)の複製起点ColE1内に存在する配列番号2の配列の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが配列番号3の配列を含むことを特徴とする、請求項15の方法。
- 特定のDNA配列が、プラスミドpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子内に存在する配列番号4の配列もしくは配列番号8の配列の内の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、ジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、もしくはアミン結合を通してクロマトグラフィー用支持体に連結されることを特徴とする、請求項1から17のいずれか一つに記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが炭素鎖(CH2)n[式中、nは1〜18までの間の整数である]からなるアームを介してクロマトグラフィー用支持体に連結され、前記アームがリン酸を通してオリゴヌクレオチドに、次いでアミド結合を通してカラムに連結することを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- アームが6つの炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- アームが12の炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの化学的改変を保持し、そのことによりそのオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して耐性となるか、もしくはヌクレアーゼに対して保護されるか、または特定の配列に対する親和性を増加させることとなることを特徴とする、請求項1から21のいずれか一つに記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのシトシンがメチル化されているホモピリミジン配列を保持することを特徴とする、請求項22に記載の方法。
- DNAが更に一つもしくは複数の導入遺伝子を含むことを特徴とする、請求項1から23のいずれか一つに記載の方法。
- 二本鎖DNAが例えばプラスミドのような環状DNAであることを特徴とする、請求項1から24のいずれか一つに記載の方法。
- 二本鎖DNA内に存在する特定の配列がオリゴヌクレオチドとのハイブリダーゼーションのための数々の位置を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 医薬が、0.5%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 医薬が、0.2%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を有することを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 医薬が、0.1%を下回るかもしくはそれに等しい染色体DNA含有量を有することを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 他の構成成分と混ざっているプラスミドDNAを含む溶液を、前記DNAに存在する特定のホモプリン/ホモピリミジン配列とのハイブリダイゼーションにより三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドが共有結合したクロマトグラフィー用支持体に通す少なくとも一つの段階を含み、前記オリゴヌクレオチドが10から30の間の長さを有することを特徴とする、プラスミドDNAの精製方法。
- 共有結合されたオリゴヌクレオチドを含む、二本鎖DNAを精製するための支持体であって、前記オリゴヌクレオチドが前記二本鎖DNA中のホモプリン/ホモピリミジン配列と三重らせんを形成するピリミジンに富む配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが前記支持体にジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミドまたはアミン結合を通して連結し、そして前記支持体が官能化されたクロマトグラフィー支持体、官能化されたプラスチック表面または官能化されたラテックスビーズであり、前記オリゴヌクレオチドが10から30の間の長さを有する、上記支持体。
- オリゴヌクレオチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号10、配列番号18、配列番号19および配列番号26から選択される配列を含む、請求項31に記載の支持体。
- オリゴヌクレオチドが、直鎖状炭素鎖(CH2)n[式中、nは1〜18までの間の整数である]を含むアームを介して支持体に連結され、前記アームがオリゴヌクレオチドに至るリン酸を通してスペーサーを介してオリゴヌクレオチドに連結する、請求項31または32に記載の支持体。
- 二本鎖DNAを精製するための支持体を作る方法であって、オリゴヌクレオチドを支持体に共有結合することを含み、ここで前記オリゴヌクレオチドはピリミジンに富む配列を含み且つ二本鎖DNAと三重らせんを形成し、ここで前記オリゴヌクレオチドはジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミドまたはアミン結合を通して支持体に共有結合し、そして前記支持体は官能化されたクロマトグラフィー支持体、官能化されたプラスチック表面または官能化されたラテックスビーズであり、前記オリゴヌクレオチドが10から30の間の長さを有する、上記方法。
- オリゴヌクレオチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号10、配列番号18、配列番号19および配列番号26から選択される配列を含む、請求項34に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、直鎖状炭素鎖(CH2)n[式中、nは1〜18までの間の整数である]を含むアームを介して支持体に連結され、前記アームがオリゴヌクレオチドに至るリン酸を通してスペーサーを介してオリゴヌクレオチドに連結する、請求項34または35に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの支持体への共有結合が、以下の段階、
a) 支持体の残基を活性化すること;そして
b) 活性化された支持体の残基をオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと支持体の残基との間に共有結合をさせること、
を含んでなり、
ここで、前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖DNA中のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることによって該二本鎖DNAと三重らせんを形成するピリミジンに富む配列を含む、
請求項34から36のいずれか一つに記載の方法。 - 支持体が、N−ヒドロキシスクシンイミドでエステル化することにより活性化されるヒドロキシル残基を含む樹脂を含み、そしてここで、前記活性化された残基をオリゴヌクレオチドと接触させることでオリゴヌクレオチドと支持体の残基との間に共有アミド(CONH)結合が作り出される、請求項34から37のいずれか一に記載の方法。
- クロマトグラフィー用支持体が、アガロース、デキストラン、セファデックスまたはシリカから作られる、請求項34から38のいずれかに記載の方法。
- 請求項34から39のいずれか一つに記載の方法によって得られる、二本鎖DNAを精製するための支持体。
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---|---|---|---|---|
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AU9094991A (en) * | 1990-11-23 | 1992-06-25 | Gilead Sciences, Inc. | Triplex-forming oligomers containing modified bases |
WO1992011390A1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-07-09 | Idexx Laboratories, Inc. | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation |
WO1992013963A1 (en) | 1991-01-30 | 1992-08-20 | Hyman Edward D | Method for preparation of closed circular dna |
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Cited By (3)
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JP2020511149A (ja) * | 2017-03-24 | 2020-04-16 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | パラインフルエンザウイルスを検出または定量化するための組成物および方法 |
JP2022132598A (ja) * | 2017-03-24 | 2022-09-08 | ジェン-プローブ・インコーポレーテッド | パラインフルエンザウイルスを検出または定量化するための組成物および方法 |
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