CZ295474B6

CZ295474B6 - Způsob přípravy léčiva na bázi dvouřetězcové DNA, způsob čištění dvouřetězcové RNA a způsob čištění plazmidové DNA

Info

Publication number: CZ295474B6
Application number: CZ19971858A
Authority: CZ
Inventors: Joël Crouzet; Daniel Scherman; Pierre Wils
Original assignee: Centelion
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 2005-08-17
Also published as: KR100431163B1; BG64198B1; ZA9510756B; US6287762B1; AU715630B2; RU2174125C2; NO320428B1; IL171488A; UA72421C2; ES2197928T3; DE69529842D1; FI120836B; CA2208245A1; CZ185897A3; ATE233825T1; PL320697A1; WO1996018744A3; EP1281774A3; IL116398A; SK75697A3

Abstract

Způsob přípravy léčiva na bázi dvouřetězcové DNA, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje alespoň jeden čisticí stupeň, ve kterém se roztok obsahující dvouřetězcovou DNA ve směsi s ostatními složkami vede přes nosič, na kterém je kovalentně kopulován oligonukleotid schopný tvořit hybridizací trojnou šroubovici se specifickou sekvencí, kterou je sekvence, která je přirozeně přítomna ve dvoušrobovici DNA, nebo syntetická sekvence, která byla do dvoušroubovice DNA zavedena uměle. Vynález se rovněž týká způsobu čištění dvouřetězcové RNA a způsobu čištění plazmidové DNA, které se provádějí stejným způsobem.ŕ

Description

Způsob přípravy léčiva na bázi dvouřetězcové DNA, způsob čištění dvouřetězcové RNA a způsob čištění plazmidové DNA

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy léčiva na bázi dvouřetězcové DNA, způsob čištění dvouřetězcové RNA a způsobu čištění plazmidové DNA.

Dosavadní stav techniky

Techniky genové a celulámí terapie prožívají v současné době mimořádný rozvoj. Nicméně pro tyto techniky je nezbytná nutnost produkovat velká množství DNA farmaceutické čistoty. Ve skutečnosti se při těchto nových terapiích používá jako léčivo mnohdy samotná DNA a je proto důležité moci vyrábět tuto DNA v potřebných množstvích, izolovat jí a čistit jí tak, aby byla použitelná pro terapeutické účely v humánní medicíně.

Vynález poskytuje nový jednoduchý a obzvláště účinný způsob čištění DNA. Tento vynález zejména umožňuje získat DNA v obzvláště vysoké čistotě a ve vysokých výtěžcích.

Podstata vynálezu

Způsob podle vynálezu v podstatě spočívá ve specifické interakci mezi sekvencí vloženou do DNA, která má být čištěna, a oligonukleotidem tvořeným přírodními nebo modifikovanými bázemi.

V nedávné době bylo prokázáno, že některé oligonukleotidy jsou schopné specifické interakce ve velké drážce dvoušroubovice DNA za lokálního vzniku trojné šroubovice vedoucí k inhibici transkripce cílených genů (Heléne et Toulmé, Biochim.Biophys. Acta 1049 (1990)99). Tyto oligonukleotidy selektivně rozpoznají dvoušroubovici DNA v úrovni sekvence oligopurin.oligopyrimidin, tj. v úrovni oblastí majících oligopyrimidovou sekvenci na komplementárním řetězci, a tvoří tam lokálně trojnou šroubovici. Báze třetího řetězce (1'oligonukleotid) tvoří vodíkové vazby (vazby Hoogsteen nebo inverzní Hoogsteen) s puriny párů Watson-Crickových bází.

Použití tohoto typu interakce pro izolování plazmidů bylo popsáno v rámci dosavadního stavu techniky. V tomto smyslu Ito a kol. (PNAS 89(1992)495) popisují použití biotinlovaných oligonukleotidů schopných rozpoznat určenou sekvenci plazmidů a vytvořit s touto sekvencí trojnou šroubovici. Takto vytvořené komplexy jsou potom uvedeny do styku s magnetickými kuličkami ovrstvenými streptavidinem. Interakce mezi biotinem a streptavidinem umožňuje potom izolovat plazmid magnetickou separací a potom eluci. Nicméně tento způsob má některé nedostatky. Zejména je zde zapotřebí dvou následných specifických interakcí, přičemž první interakce probíhá mezi oligonukleotidem a plazmidem a druhá interakce probíhá mezi biotinylovaným komplexem a kuličkami streptavidinu. Kromě toho může být finální roztok kontaminován biotinylovaným oligonukleotidem, který nemůže být použit ve farmaceutické kompozici.

Způsob podle vynálezu představuje zlepšený způsob čištění DNA, který využívá uvedený typ interakce. Konkrétně způsob podle vynálezu využívá oligonukleotidy, které jsou kopulovány kovalentní vazbou k nosiči. Tento způsob je mimořádně rychlý a dosahují se při něm vysoké míry čistoty a zejména vysokých výtěžků. Jinak způsob podle vynálezu umožňuje čistit DNA z komplexních směsí obsahujících zejména další nukleové kyseliny, proteiny, endotoxiny (jako lipopolysacharidy), nukleázy, atd. Použité nosiče mohou být navíc snadno recyklovány a získané DNA mají zlepšenou farmaceutickou bezpečnost. Navíc se způsob podle vynálezu realizuje pouze v jediném stupni na rozdíl od způsobů dosavadního stavu techniky.

- 1 CZ 295474 B6

První předmět vynálezu tedy spočívá ve způsobu čištění dvoušroubovicové DNA, jehož podstata spočívá v tom, že se roztok obsahující uvedenou DNA ve směsi s ostatními složkami zavede na nosič, ke kterému je kovalentně kopulován oligonukleotid schopný vytvořit hybridizací trojnou šroubovici se specifickou sekvencí přítomnou v uvedené DNA. Uvedenou specifickou sekvencí může být sekvence, která je přirozeně přítomna ve dvoušroubovici DNA, nebo syntetická sekvence, která byla do dvoušroubovice DNA zavedena uměle.

Oligonukleotidy, které se používají v rámci vynálezu, jsou oligonukleotidy přímo hybridizující s DNA ve dvoušroubovici. Tyto oligonukleotidy mohou obsahovat následující báze:

- thymidin (T), který je schopen tvořit triplety s dublety A. T dvoušroubovice DNA (Rajagopal a kol., Biochem 28 (1989)7859),

- adanin (A), který je schopen tvoři triplety s dublety A. T dvoušroubovice DNA,

- guanin (G), který je schopen tvořit triplety s dublety G. C dvoušroubovice DNA,

- protonovaný cytosin (C+), který je schopen tvořit triplety s dublety G. C dvoušroubovice DNA (Rajagopal a kol, citovaný výše),

- uráčil (U), který je schopen tvořit triplety s páry bází A. U. nebo A.T.

Použitý oligonukleotid výhodně obsahuje homopyrimidinovou sekvenci bohatou na cytosin a specifickou sekvencí přítomnou v DNA je homopurinová-homopyrimidinová sekvence. Přítomnost cytosinu umožňuje mít stabilní trojnou šroubovici při kyselém pH, kdy jsou cytosiny protonované, a destabilizovanou trojnou šroubovici při alkalickém pH, kde jsou cytosiny neutralizovány.

Pro umožnění tvorby trojné šroubovice hybridizací je důležité, aby oligonukleotid a specifická sekvence přítomná v DNA byly komplementární. V tomto ohledu se za účelem dosažení nejlepších výsledků a nej lepší selektivity používá při způsobu podle vynálezu oligonukleotid a specifická sekvence, která jsou dokonale komplementární. Zejména se může jednat o oligonukleotid poly-CTT a o specifickou sekvenci poly-GAA. Jakožto příklad lze uvést oligonukleotid se sekvencí 5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)₇, (SEQ ID n°l), ve kterém báze GAGG netvoří trojnou šroubovici ale umožňují odděliti oligonukleotid od kopulačního ramene. Rovněž je možné uvést sekvenci (CTT)₇(SEQ ID n°26). Tyto oligonukleotidy jsou schopné vytvořit trojnou šroubovici se specifickou sekvencí obsahující komplementární motivy (GAA). Může se zejména jednat o oblast obsahující 7, 14 nebo 17 motivů GAA, jak je to popsáno v příkladové části.

Další zajímavou specifickou sekvencí je sekvence:

*-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’ (SEQ ID n°5).

Tato sekvence tvoří trojnou šroubovici s oligonukleotidy 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID n°6) nebo

5'-TTGGTGTGGTGGGTGGTT-3'-3' (SEQ ID n°7).

V tomto případě se oligonukleotid fixuje v antiparalelní orientaci vůči polypurinovému řetězci. Tyto trojné šroubovice jsou stabilní pouze v přítomnosti Mg²⁺ (Vasquuez a kol., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251, Beal a Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).

Jak již bylo uvedeno výše, může být specifickou sekvencí sekvence, která je ve dvoušroubovici DNA přítomna přirozeným způsobem, nebo sekvence syntetická, která je do dvoušroubovice DNA zavedena uměle. Je obzvláště zajímavé použít oligonukleotid schopný vytvořit trojnou

- 2 CZ 295474 B6 šroubovici se specifickou sekvencí, která je přirozeně přítomna ve dvoušroubovici DNA, například původem z replikace plazmidu nebo ve značkovacím genu. V tomto ohledu přihlašovatel provedl sekvenční analýzy plazmidů a mohl takto prokázat, že některé oblasti těchto DNA, jsoucí zejména replikačního původu, mohou obsahovat homopurinové-homopyrimidinové oblasti. Syntéza oligonukleotidů schopných vytvořit trojné šroubovice s těmito homopurinovými homopyrimidinovými oblastmi přirozeného původu výhodně umožňuje aplikovat způsob podle vynálezu na nemodifikované plazmidy, zejména na komerční plazmidy typu pUC, pBR322, pSV, atd. Z homopurinových-homopyrimidinových sekvencí, které jsou přirozeně přítomné ve dvoušroubovici DNA, lze uvést sekvenci obsahující celek nebo část sekvence 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID n°2), která je přítomna vreplikačním počátku ColEl zEscherichia coli. V tomto případě má oligonukleotid tvořící trojnou šroubovici sekvenci:

5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ ID n°3) a fixuje se alternativně na oba řetězce dvoušroubovice, jak je to popsáno Bealem a Dervanem (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) a Jayasenaem a Johnstonem (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Rovněž lze uvést sekvenci:

5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID n°4) genu beta-laktamázy plazmidu pBR322 (Duvan-Valestin a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508). Použití oligonukleotidu schopného vytvořit trojnou šroubovici se sekvencí přítomnou v replikačním počátku nebo ve značkovacím genu je obzvláště výhodné, neboť umožňuje stejným oligonukleotidem čistit libovolnou DNA obsahující uvedený replikační počátek nebo uvedený značkovací gen. Není tudíž nezbytné modifikovat plazmid nebo dvoušroubovici DNA za účelem umělé inkorporace specifické sekvence.

Jakkoliv jsou dokonale komplementární sekvence výhodné v rámci způsobu podle vynálezu, je samozřejmé, že je možné tolerovat určité nedokonalé zpárování mezi sekvencí oligonukleotidu a sekvencí přítomnou v DNA v případě, že tyto nedokonalosti v párování nevedou k příliš veliké ztrátě afinity mezi oligonukleotidem a sekvencí přítomnou v DNA. Takto lze uvést sekvenci 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID n°8) přítomnou v genu beta-laktamázy do Escherichia coli. V tomto případě může být thymin přerušující polypurinovou sekvenci rozpoznám guaninem třetího řetězce tvoříce takto triplet ATG, kteiý je stabilní, když je zarámován dvěma triplety TAT (Kiessling a kol., Biochemistry, 1992,31,2828-2834).

V rámci specifické formy provedení vynálezu obsahují oligonukleotidy podle vynálezu sekvenci (CCT)_n, sekvenci (CT)_n nebo sekvenci (CTT)„, ve které n znamená celé číslo od 1 do 15. Je obzvláště výhodné použít sekvence typu (CT)_n nebo (CTT)_n. Přihlašovatel ve skutečnosti prokázal, že výtěžek čištění je ovlivněn množstvím C v oligonukleotidu. Jak je to uvedeno v příkladu 7, vzrůstá výtěžek čištění v případech, kdy oligonukleotid obsahuje méně cytosinů. Je samozřejmé, že oligonukleotidy podle vynálezu mohou být rovněž kombinované s motivy (CCT), (CT) nebo (CTT).

Použitým oligonukleotidem může být přírodní oligonukleotid (tvořený přirozenými nemodifikovanými bázemi) nebo chemicky modifikovaný oligonukleotid. Použitý oligonukleotid může výhodně obsahovat některé chemické modifikace umožňující zvýšit jeho odolnost nebo ochranu vůči nukleázám nebo jeho afinitu ke specifické sekvenci.

Pod pojmem oligonukleotid se v rámci vynálezu rozumí libovolný řetězec nukleosidů, který podstoupil modifikaci skeletu za účelem zvýšení jeho rezistance vůči nukleázám. Z možných modifikací lze uvést oligonukleotido-fosforothioáty, které jsou schopné vytvořit trojné šroubovice s DNA (Xodo a kol., Nucleic Acids Res. 1994, 22, 3322-3330), stejně jako oligonukleotidy mající formacetálový nebo methylfosfonátový skelet (Matteucci a kol., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768). Rovněž je možné použít oligonukleotidy syntetizované s aftaanomery nukleoti

- 3 CZ 295474 B6 dů, které rovněž tvoří trojné šroubovice s DNA (Le Doan a kol., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Další modifikaci skeletu představuje fosforamidátová vazba. Lze například uvést intemukleotidovou vazbu N3'-P5'-fosforoamidátového typu popsanou Gryaznovem a Chenem, která poskytuje oligonulkeotidy tvořící sDNA obzvláště stabilní trojné šroubovice (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144). Z ostatních modifikací skeletu lze rovněž uvést použití ribonukleotidů, 2-O-methylribosy, fosfodiesteru, ... (Sun a Hélěne, Cur. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Fosforovaný skelet může být konečně nahrazen polyamidovým skeletem, jako je tomu v PNA (peptid-nukleové kyseliny), které mohou rovněž tvořit trojné šroubovice (Nielsen a kol., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim a kol., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481), nebo skeletem na bázi guanidinu, jako je tomu v DNG (deoxyribonukleo-guanidin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), a polykationtovými analogy DNA, které rovněž tvoří trojné šroubovice.

Thymin třetího řetězce může být také nahrazen 5-bromuracilem, což zvětšuje afinitu oligonukleotidu kDNA (Povsic a Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). Třetí řetězec může rovněž obsahovat nepřírodní báze, mezi kterými lze uvést 7-deaza-2'-deoxyxanthosin (Milligan a kol., Nucleic Acids Res., 1993,21, 327-333), l-(2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-3methyl-5-amino-177-pyrazolo/4,3-d/pyrimidin-7- (Koh a Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenin, 2-aminopurin, 2'-O-methyl-pseudoisocytidin, nebo libovolnou jinou známou modifikaci (viz revue Sun a Hélěne, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993,3,345-356).

Další typ modifikace oligonukleotidů má zejména za úkol zlepšit interakci nebo/a afinitu mezi oligonukleotidem a specifickou sekvencí. V tomto ohledu spočívá obzvláště výhodná modifikace podle vynálezu v tom, že se methylují cytosiny oligonukleotidů (viz příklad 5). Takto methylovaný oligonukleotid má pozoruhodnou vlastnost tvořit stabilní trojnou šroubovici se specifickou sekvencí v oblastech pH bližších neutrální reakci (pH vyšší nebo rovné 5). Tato modifikace takto umožňuje pracovat při vyšších hodnotách pH, než je tomu v případě oligonukleotidů spadajících do rozsahu stávajícího stavu techniky, tj. při hodnotách pH, při kterých je výrazně nižší riziko degradace plazmidové DNA.

Délka oligonukleotidů použitého v rámci způsobu podle vynálezu je rovna alespoň 3 bázím a výhodně se pohybuje v rozmezí od 5 do 30 bází. Výhodně se použije oligonukleotid mající délku vyšší než 10 bází. Délka oligonukleotidů může být samotným odborníkem vdaném oboru přizpůsobena selektivitě a stabilitě požadované pro uvedenou interakci.

Oligonukleotidy použité v rámci vynálezu mohou být syntetizovány libovolnou známou technikou. Zejména mohou být připraveny za použití syntetizátorů nukleových kyselin. Je nicméně zřejmé, že k tomuto účelu může být použita i jakákoliv jiná známá metoda.

Za účelem dosažení kovalentni kopulace oligonukleotidů s nosičem je oligonukleotid obecně funkcionalizován. Takto může být nukleotid modifikován koncovou thiolovou skupinou, aminovou nebo karboxylovou skupinou v poloze 5' nebo 3'. Zavedení thiolové, aminové nebo karboxylové skupiny umožňuje například kopulaci oligonukleotidů s nosičem nesoucím disulfidové, maleimidové, aminové, karboxylové, esterové, epoxidové, bromidové a aldehydové skupiny a kyanoskupiny. Tyto kopulace se realizují vytvořením disulfidové, thioetherové, esterové, amidové nebo aminové vazby mezi oligonukleotidem a nosičem. Rovněž může být použita i jakákoliv jiná metoda, jako například metoda spočívající v použití bifunkčních kopulačních reakčních činidel.

Jinak může být pro zlepšení hybridizace s kopulovaným oligonukleotidem výhodné, aby oligonukleotid obsahoval „rameno“ a „distanční sekvenci bází“. Použití uvedeného ramene umožňuje ve skutečnosti fixovat oligonukleotid ve zvolené vzdálenosti od nosiče, což zase umožňuje zlepšení podmínek interakce s DNA. Uvedené rameno je výhodně tvořeno lineárním uhlíkatým řetězcem obsahujícím 1 až 18, výhodně 6 nebo 12 skupin (CH₂), a aminem, který umožňuje vazbu k nosiči. Rameno je spojeno s fosfátem oligonukleotidů nebo „distanční sekvencí bází“

- 4 CZ 295474 B6 tvořenou bázemi, které neinterferují s hybridizací. Uvedená „distanční sekvence bází“ může obsahovat purinové báze. Tak například „distanční sekvence bází“ může obsahovat sekvenci GAGG. Uvedené rameno je výhodně tvořeno lineárním uhlíkatým řetězcem obsahujícím 6 nebo 12 uhlíkových atomů.

V rámci vynálezu mohou být použity různé typy nosičů. Může se jedna o funkcionalizované chromatografícké nosiče, a to volně sypané nebo prekoncionované v koloně, funkcionalizované povrchy plastických hmot nebo o funkcionalizované latexové kuličky s magnetickým nebo nemagnetickým charakterem. Výhodně se jedná o chromatografícké nosiče. Jako příklady takových nosičů lze z chromatografických nosičů uvést agarózu, akry lamin nebo Dextran, stejně jako jejich deriváty (jako Sephadex, Sepharose, Superose), polymery, jako poly(styrendivinylbenzen) nebo roubovaný nebo neroubovaný oxid křemičitý (silika). Použité chromatografícké kolony mohou být provozovány na principu difúze nebo perfuze.

Za účelem dosažení lepších výsledků čištění je obzvláště výhodně použít na plazmidů sekvenci obsahující několik poloh hybridizace s oligonukleotidem. Přítomnost několika hybridizačních poloh příznivě ovlivňuje a upřednostňuje interakce mezi uvedenou sekvencí a oligonukleotidem, což zase vede ke zlepšení výtěžku čištění.Takto je pro oligonukleotid obsahující n repetici motivů (CCT), (CT) nebo (CTT) výhodné použít sekvenci DNA obsahující alespoň n komplementárních motivů, výhodně η + 1 komplementárních motivů. Sekvence nesoucí η + 1 komplementárních motivů takto nabízí oligonukleotidu dvě hybridizační polohy. Výhodně sekvence DNA obsahuje až 11 hybridizačních poloh, tj. n + 10 komplementárních motivů.

Způsob podle vynálezu může být použít pro čištění libovolné dvoušroubovicové DNA. Jedná se například o cyklickou DNA, jakou je plazmid nesoucí obecně jeden nebo několik terapeuticky zainteresovaných genů. Takový plazmid může rovněž nést replikační počátek, značkovací gen, atd. Způsob podle vynálezu může být také aplikován přímo na buněčný lyzát. Při tomto způsobu provedení vynálezu se plazmid amplifíkovaný transformací a potom buněčnou kulturou čistí přímo po lyži buněk. Způsob podle vynálezu může být rovněž použit na čirý lyzát, tj. supematant získaný po neutralizaci a odstředění buněčného lyzátu. Způsob podle vynálezu může být zcela zřejmě aplikován na roztok předběžně čištěný známými metodami. Způsob podle vynálezu rovněž umožňuje čistit lineární nebo cyklickou DNA nesoucí zainteresovanou sekvenci ze směsi obsahující DNA různých sekvencí. Způsob podle vynálezu může být rovněž použit pro čištění dvoušroubovicové RNA.

Buněčným lyzátem může být lyzát prokaryotických nebo eukaryotčkých buněk.

V případě prokaryotických buněk lze například uvést bakterie Escherichia coli, B. subtilis, S. typhimurium nebo Streptomyces. V případě eukaryotických buněk lze uvést zvířecí buňky, kvasinky, houby, atd. a zejména kvasinky Kluyveromyces nebo Saccharomyces nebo buňky COS, CHO, C127, NIHT3, atd..

Způsob podle vynálezu je obzvláště výhodný vzhledem k tomu, že umožňuje získat rychlým a jednoduchým způsobem plazmidovou DNA velmi vysoké čistoty. Zejména tento způsob umožňuje, což je ostatně ilustrováno v případech, účinně oddělit uvažovanou plazmidovou DNA od kontaminujících složek, jakými jsou fragmentovaná chromosomální DNA, endotoxiny, proteiny, nukleázy, atd. Způsob podle vynálezu zejména umožňuje získat preparáty dvoušroubovicové DNA, a to zejména plazmidové DNA mající obsah chromosomální DNA nižší nebo rovný 0,5 %. Ještě výhodněji mají příznaky DNA získané za použití způsobu podle vynálezu obsah chromosomální DNA nižší nebo rovný 0,2 %. Způsob podle vynálezu tudíž poskytuje kompozici obsahující plazmidovou DNA použitelné zejména v genové nebo buněčné terapii. Vzhledem k tomu je předmětem vynálezu rovněž farmaceutická kompozice obsahující lineární nebo plazmidovou dvoušroubovicovou DNA připravenou výše popsaným způsobem.

- 5 CZ 295474 B6

Vynález se rovněž týká preparátů plazmidové DNA mající obsah chromosomální DNA nižší nebo rovný 0,5 %, výhodně rovný 0,2 % a ještě výhodněji rovný 0,1 %.

Uvedené kompozice mohou obsahovat samotnou plazmidovou DNA nebo DNA sdruženou s transportními vektory, jakými jsou liposomy, nanočástice, kationtové lipidy, polymery, proteiny, rekombinantní viry, atd.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob čištění dvouřetězcové RNA, který probíhá stejným mechanismem jako čištění dvouřetězcové DNA a jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje alespoň jeden stupeň, ve které se roztok obsahující uvedenou RNA ve směsi s ostatními složkami vede přes nosič, a které je kovalentně kopulován oligonukleotid schopný tvořit hybridizací trojnou šroubovici se specifickou sekvencí přítomnou v uvedené RNA.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí příkladů jeho konkrétního provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

Obecné techniky klonování a molekulární biologie

Obecné metody molekulární biologie, jakými jsou digesce restrikčními enzymy, elektroforéza na gelu, transformace v Escherichia coli, precipitace nukleových kyselin, atd., jsou popsané v literatuře (Maniatis a kol., T.E.F. Fritsch a J. Sambrook, 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D.D.-Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman a K. Struhl. 1987, Current protocols in molecular biology 1987-1988, John Willey and Sons, New York). Nukleotidové sekvence byly stanoveny metodou terminace řetězce podle již uvedeného protokolu (Ausubel a kol., 1987.

Restrikční enzymy byly poskytnuty firmou New-England, Beverly, Ma (Biolabs).

Za účelem ligací se fragmenty DNA inkubují v Tris-HCl-pufru s pH 7,4, 50 mM, MgCl₂10 mM, DTT, 10 mM, ATP 2 mM, v přítomnosti DNA ligázy fagu T4 (Biolabs.).

Oligonukleotidy se syntetizují za použití chemie fosforamiditů chráněných v beta kyanoethylovou skupinou (Sinha, N.D.J.Biemat, J. McManus a H. Koster, 1984, Polymer support oligonucleotide synthesis, XVII: Use of beta-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragment simplifying deprotection and Isolation of the finál product, Nuvl. Acids Res., 12, 4539-4557; Giles, J.W. 1985., Advances in automated DNA synthesis, Am. Biotechnol., Nov./Dec.) s využitím automatického syntetizátoru DNA Biosearch 8600 a podle doporučení výrobce.

Ligo váné DNA nebo DNA k testování jejich transformační účinnosti se použijí pro transformování kompetentního kmene: E. coli DH5alfa/F/ endAl, hsdR17, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, delta(lacZYA-argF)U169, deoR, 08Odlac(lacZdeltaM15)/.

Minipreparáty plazmidové DNA se získají podle protokolu Klein-a a kol., 1980.

Pro nárůst kmene Escherichia coli se použije kultivační prostředí LB (Maniatis a kol., 1982). Kmeny se inkubují při teplotě 37 °C. Bakterie se nanesou na misky s kultivačním prostředím LB obohaceným příslušnými antibiotiky.

- 6 CZ 295474 B6

Příklad 1

1.1 Příprava kolony

Materiál:

Použitou kolonou je kolona HITrap, aktivovaná 1 ml NHS (A-hydroxysukcinimid, Pharmacia) a připojená k peristaltickému čerpadlu (průtok menší než 1 ml/min.). Použitý specifický oligonukleotid má skupinu NH₂ v poloze 5'. Má následující sekvenci: 5'-GAGGCTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID n°1)

V tomto příkladu jsou použity následující pufry:

kopulační pufr: NaHCO₃ 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3, pufr A: ethanolamin 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3, pufr B: acetát 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4.

Metoda:

Kolona se promyje 6 ml 1 mM HC1, načež se do kolony zavede oligonukleotid zředěný kopulačním pufrem (50 mmol v 1 ml), kde se ponechá po dobu 30 minut při okolní teplotě. Kolona se potom 3 krát po sobě promyje 6 ml pufru A a potom 6 ml pufru B. Oligonukleotid je takto kovalentně vázán k náplni kolony vazbou CONH. Kolona se potom uloží při teplotě 4°C do PBS 0,1 % NaN₃ a může být použita alespoň čtyřikrát.

1.2 Konstrukce plazmidů

Byly syntetizovány následující dva oligonukleotidy:

oligonukleotid 4817:

5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG

AAGG-3' (SEQ ID n°9), oligonukleotid 4818:

5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTC TTCG-3' (SEQ ID n°10).

Tyto oligonulkeotidy po hybridizaci a klonování na plazmidu přináší na odpovídající plazmid homopurinovou-sekvenci (GAA)i₇, která byl popsána výše.

Sekvence odpovídající těmto dvěma hybridizovaným oligonukleotidům byla klonována v multimístu klonování plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning Systém, La Jolla CA), nesoucím gen rezistentní na ampicillin. Za tímto účelem se oligonukleotidy hybridizují následujícím způsobem. Jeden mikrogram těchto dvou oligonukleotidů se smísí ve 40 ml finálního pufru 50 mM TrisHCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂. Získaná směs se zahřívá na teplotu 95 °C, načež se teplota sníží na okolní teplotu, přičemž se dodržuje pozvolné snižování teploty. 10 nanogramů směsi hybridizovaných oligonukleotidů se liguje 200 ng plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning Systém La Jolla CA) digerovaného BamHi a EcoRI ve 20 μΐ finálního pufru. Po ligaci byl alikvot transformován v DH5alfa. Transfekční směsi byly zavedeny na prostředí L obohacené ampicillinem (50 mg/1) a X-gal (20 mg/1). Rekombinantní klony musí vykazovat absenci modrého zbarvení na uvedeném prostředí na rozdíl od mateřského plazmidu (pBKS+), který umožňuje alfa-komplementování fragmentu omega beta-galaktosidázy zE. coli. Po minipřípravě 6 klonů plazmidové DNA všechny klony vykazovaly vymizení místa Pstl, situovaného mezi místy EcoRI a BamHi plazmidu pBKS+, a zvýšení molekulové hmotnosti pásu PvuII s 448 pb zahrnujícího klonovací multi-místo. Klon byl zadržen a odpovídající plazmid byl označen jako pXL2563. Klonovaná sekvence byla verifikována za použití primeru -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (SEQ ID

- 7 CZ 295474 B6 n°ll)) (Viera J. a J. Messing. 1982, The pUC plasmids, an M13mp7-devived systém for insertion mutagenesis and sequencing with syntetic universal primers, Gene, 19, 259-268) plazmidů pBKS+ (Stratagene Cloning, La Jolla CA). Plazmid pXL2563 byl purifíkován za použití soupravy Wazird Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) a podle doporučení dodáváte5 le. Tento preparát plazmidové DNA byl potom použit v dále popsaných příkladech.

1.3 Purifíkace plazmidů

Materiál:

Plazmid PXL2563 (popsaný v odstavci 1.2.) byl purifíkován na koloně HiTrap, jejíž náplň je ío kopulována s oligonukleotidem popsaným v 1.1. z roztoku rovněž obsahujících pBKS+.

V průběhu této purifíkace byly použity následující pufry:

pufř F: NaCl 2M, acetát 0,2 M, pH 4,5 až 5, pufr E: Tris 1 M, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.

Metoda:

Kolona byla promyta 6 ml pufru F, načež se do kolony zavedou plazmidy (20 pg pXL2563 a 20 pg pBKS+ ve 400 pl pufru F), kde se inkubují dvě hodiny při okolní teplotě. Kolona se promyje 10 ml pufru F, načež se provede eluce pufrem E. Plazmidy se detekují po elektroforéze na agarózovém gelu a vybarvení ethidiumbromidem. Množství plazmidů v roztocích se stanoví 20 na základě jejich transformační aktivity na E. coli.

Výsledek:

Jestliže se vycházelo ze směsi obsahující 30 % pXL2563 a 70 % pBKS+, potom se na výstupu z kolony získá 100% roztok pXL2563. Čistota vyjádřená vztahem optické hustoty při 260 a 25 280 nm přechází z 1,9 na 2,5, což znamená, že se uvedenou metodou eliminují kontaminující proteiny.

Příklad 2

2.1 V tomto příkladu se popisuje purifíkační experiment, při kterém se purifíkuje plazmidová

DNA. Kopulace oligonukleotidu (5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID n°l)) s náplní kolony byla provedena způsobem popsaným v příkladu 1. Pro tuto kopulaci je oligonukleotid modifikován na konci 5' aminovou skupinou vázanou k distanční sekvenci bází ramenem obsahujícím 6 uhlíkových atomů (modifikovaný oligonukleotid Eurogentec SA Belgique).

Plazmid pXL2563 byl purifíkován pomocí kitu Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) podle doporučení dodavatele. V tomto příkladu byly použity následující pufry:

pufr F: NaCl 0.2M, acetát 0,2 M, pH 4,5-5, pufr E: Tris 1 M, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.

Kolona se promyje 6 ml pufru F a potom se do kolony zavede 100 pg plazmidů pXL2563 zředěného 400 pl pufru F, kde se provede inkubace po dobu dvou hodin při okolní teplotě. Kolona se promyje 10 ml pufru F, načež se provede eluce pufrem E. Plazmid se potom kvantifikuje stanovením optické hustoty při 260 nm. V tomto příkladu se provede fixace v pufru, jehož molarita NaCl se mění od 0 do 2M (pufr F). Výtěžek purifíkace klesá s klesající molaritou NaCl.

pH fixačního pufru se může pohybovat od 4,5 do 5, přičemž nejlepšího výtěžku purifíkace se dosáhne při pH 4,5. Rovněž je možné použít jiný eluční pufr s bazickým pH: takto se eluce provádí za použití borátového pufru 50 mM, pH 9, EDTA 0,5 mM.

2.2 V následujícím stupni se přistoupí ke kopulaci oligonukleotidu:

(5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID η^υ1) ke koloně způsobem, který byl popsán v příkladu 1. Plazmid PXL2563 byl purifíkován za použití soupravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) při respektování pokynů dodavatele.

V tomto příkladu byly použity následující pufry:

pufr F: NaCl O,1M, acetát 0,2 M, pH 5, pufr E: Tris 1 M, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.

Kolona se promyje 6 ml pufru F a potom se na kolonu zavede 100 pg plazmidu pXL2563 zředěného ve 400 μΐ pufru F, načež se provede inkubace po dobu jedné hodiny při okolní teplotě. Kolona se potom promyje 10 ml pufru F, načež se provede eluce pufrem E. Stanoví se obsah genomové nebo chromosomální DNA z E. coli přítomné ve vzorcích plazmidu před a po zavedení oligonukleotidu na kolonu. Tato genomová DNA se kvantifikuje prostřednictvím PCR za použití zárodků v genu galK E. Coli. Postupuje se podle následujícího protokolu: Sekvence a uvedené zárodky jsou popsány Debouckem a kol. (Nucleic Acids Res., 1985, 13, 1841-1855):

5'-CCGATTTCTGGGGACCAAAGCAGTTTC“3' (SEQ ID n°24) a 5^z-CCAAGGTTCACTGTTCACGACGGGTGT~3' (SEQ ID n°25).

Reakční prostředí obsahuje ve 25 μΐ pufru PCR (Promega France, Charbonniěres): 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 μΜ v zárodku; 20 U/ml Taq polymeráza (Promega). Reakce se provede v následující časové a teplotní sekvenci:

- 5 min při 95 °C,

-30 cyklů po 10 s při teplotě 95 °C,

- 30 s při teplotě 60 °C,

- 1 minuta při teplotě 78 °C,

- 10 minut při teplotě 78 °C.

Fragment amplifikované DNA o délce 124 párů bází se separuje elektroforézou na 3% agarózovém gelu v přítomnosti SybrGreen I (Molecular probes, Eugene, USA) a potom kvantifikuje porovnání se stupnicí genomové DNA Ultrapur E. Coli, kmen B (Sigma, ref. D4889). Obsah chromosomální DNA činí ve vzorku přivedeném na kolonu 1 %, zatímco ve vzorku purifikovaném na oligonukleotidové koloně činí tento obsah 0,2 %.

Příklad 3

Aplikace na čirý lyzát

V tomto příkladu se popisuje purifikace plazmidové DNA z čirého lyzátu bakteriální kultury v měřítku zvaném „miniprep“: 1,5 ml noční kultury kmene DH5alfa obsahující plazmid pXL2563 se odstředí a centrifugační peleta pevného odstředěného podílu se suspenduje ve 100 μΐ glukózy 50 mM, Tris 25 mM HC1 pH 8, EDTA 10 mM. Přidá se 200 μΐ NaOH 0,2 M, SDS 1 % a obsah kyvet se rozmíchá převrácením, načež se přidá 150 μΐ 3M octanu draselného, pH 5 a obsah kyvet se opět míchá obracením. Po odstředění se oddělí supematant, který se zavede na oligonukleotidový sloupec získaný způsobem popsaným v příkladu 1. Fixace, promytí a eluce jsou stejné jako v příkladu 1. Z 1,5 ml kultury se izoluje asi 1 pg plazmidu. Získaný plazmid po analýze elektroforézou na agarozovém gelu a vybarvení ethidiumbromidem prezentuje ve formě jediného pásu cyklické „dobře svinuté“ DNA. V plazmidu purifíkovaném uvedou metodou nebyla detekována žádná stopa jak vysokomolekulární (chromosomální) DNA, tak ani stopa RNA. Poměr optických hustot při 260 a 280 nm byl vyšší než 2.

Příklad 4

4.1: Tento příklad popisuje purifíkaci plazmidové DNA, provedený za stejných podmínek jako v příkladu 3, z 20 ml bakteriální kultury kmene DH5alfa obsahující plazmid pXL2563. Centri

- 9 CZ 295474 B6 fugační peleta se vyjme 1,5 ml glukózy 50 mM, Tris 25 mM HC1, pH 8, EDTA 10 mM. Lyse se provede 2 ml NaOH 0,2 M, SDS 1%, zatímco neutralizace se provede 1,5 ml 3M octanu draselného, pH 5. DNA se potom vysráží 3 ml 2-propanolu a oddělený pevný podíl se vyjme 0,5 ml 0,2M octanu sodného, pH 5, NaCl 0,1 M a směs se zavede na oligonukleotidovou kolonu získanou způsobem popsaným v příkladu 1. Fixace, promytí kolony a eluce se provedou stejně jako v příkladu 1 s výjimkou spočívající v tom, že promývací pufr má molaritu NaCl rovnou 0,1 M. Získá se asi 16 pg plazmidové DNA. Získaný plazmid se po analýze elektrofotézou na agarozovém gelu a vybarvení ethidiumbromidem prezentuje ve formě jediného pásu cyklické „dobře svinuté“ DNA. V puntíkovaném plazmidu nebyla detekována ani stopa vysokomolekulární (chromosomální) DNA, ani stopa RNA. Digesce plazmidu restrikčním enzymem poskytuje jediný pás s očekávanou molekulovou hmotností 3 kilobází. Koncentrace proteinů ve vzorcích se změnila ze 125 pg/ml v čirém lyzátu na méně než 1 pg/ml v puntíkovaném plazmidu (stanovení Micro-BCA, Pierce). Koncentrace endotoxinů, určená stanovením LAL (Biosepra), je více než desetkrát nižší v puntíkovaném plazmidu oproti výchozímu čirému lyzátu.

4.2: Použitý plazmid obsahuje kazetu zahrnující promotor Cytomegaloviru, kterým je gen kódující luciferázu, a homopurinovou-homopyridinovou sekvenci (GAA)i₇ pocházející z plazmidu pXL2563.Kmen DH1 (Maniatis a kol., 1989) obsahující tento plazmid se kultivuje v 7 litrovém fermentoru. Čirý lyzát se připraví z 200 gramů buněk: buněčná peleta se vyjme 2 litry Tris 25 mM, pH 6,8, glukózy 50 mM, EDTA 10 mM, ke kterým se přidají 2 litry NaOH 0,2 M, SDS 1 %. Lyzát se neutralizuje přidáním jednoho litru 3M octanu draselného. Po diafiltraci se 4 ml tohoto lyzátu zavedou na kolonu HiTrapNHS o obsahu 5 ml, jejíž obsah je kopulován s oligonukleotidem majícím sekvenci

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3* (SEQ ID n°1) metodou popsanou v příkladu 1.1. Promytí a eluce se provedou stejně jako v příkladu 1. Izoluje se asi 400 mikrogramů plazmidu. Obsah genomové DNA v tomto vzorku, stanovený technikou popsanou v příkladu 2.2, činí 0,1 %.

Příklad 5

Použití modifikovaného oligonukleotidu

V tomto příkladu se popisuje použití oligonukleotidu nesoucího methylované cytosiny.

Použitý nukleotid má následující sekvenci:

5'-GAGG^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT-3' (SEQ ID n°12).

Tento oligonukleotid obsahuje skupinu NH₂ v poloze 5'. ^MeC=5-methylcytosin. Tento oligonukleotid umožňuje purifíkovat plazmid pXL2563 za podmínek popsaných v příkladu 1 a fixačního pufru s pH 5 (takto se sníží riziko degradace plazmidu).

Příklad 6

V předcházejících příkladech je použitý oligonukleotid modifikován na konci 5' aminovou skupinou vázanou k fosfátu ramenem obsahujícím 6 uhlíkových atomů: NH₂-(CH₂)₆. V tomto příkladu je aminová skupina vázána k fosfátu na konci 5' ramenem obsahujícím 12 uhlíkových atomů: NH₂-(CH₂)i₂. Kopulace oligonukleotidu a zavedení na kolonu se provedou stejně jako v příkladu 2 za použití pufru F: NaCl 2M, acetát 0,2 M, pH 4,5. Tento oligonukleotid umožňuje dosažení lepších purifíkačních výtěžků: dosáhne se výtěžku 53 %, zatímco při použití oligonukleotidu s 6 uhlíkovými atomy se za jinak stejných podmínek dosáhne výtěžku asi 45 %.

-10CZ 295474 B6

Příklad 7

Za použití klonovací strategie popsané v příkladu 1.2 se konstruují dva další plazmidy nesoucí homopurinové homopyrimidinové sekvence: plazmid pXL2725, který obsahuje sekvenci (GGA) 15· a plazmid pXL2726, který obsahuje sekvenci (GA)₂₅.

Příklad 7.1

Konstrukce plazmidů

Plazmidy pXL2725 a pXL2726, které jsou analogické s plazmidem pXL2563, byly konstruovány za použití strategie klonování popsané v příklad 1.2 za použití následujících dvojic oligonukleotidů:

5986:	5 '-GATCC(GA) ₂<-GGG-3' (SEQ ID n°13)
5987:	5'~AATTCCC(TC)₂₅G-3' (SEQ ID n°14)
5981 :	5'-GATCC(GGA)₁₇GG-3' (SEQ ID n°15)
5982:	5'~AATT(CCT)₁₇CCG-3^ř (SEQ ID n°16).

Dvojice oligonukleotidů 5986 a 5987 byla použita pro konstrukci plazmidu pXL2726 klonováním oligonukleotidů v místech BamHI a EcoRI plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning Systém, La Jolla CA), zatímco oligonukleotidy 5981 a 5982 byly použity pro konstrukci plazmidu pXL2725. Byly použity stejné experimentální podmínky jako pro konstrukci plazmidu pXL2563, přičemž byly vyměněny pouze dvojice oligonukleotidů. Stejně tak byly klonované sekvence verifikovány sekvencováním na plazmidy. Toto sekvencování umožnilo prokázat, že plazmid pXL2725 obsahuje modifikaci vzhledem k požadované sekvenci spočívající v tom, že namísto sekvence GGA opakované sedmnáctkrát je zde GGAGA (GGA)_]5 (SEQ ID n°17).

Příklad 7.2

Příprava klon a purifikace

Oligonukleotidy tvořící trojné šroubovice s homopurinovými sekvencemi byly kopulovány s náplní kolon HiTrap metodou popsanou v příkladu 1.1. Jedná se o oligonukleotid mající sekvenci:

5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (SEQ ID n°18) pro purifikaci plazmidu pXL2725 a o oligonukleotid mající sekvenci:

5'-AGTGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCT-3' (SEQ ID n°19) pro purifikaci plazmidu pXL2726.

Obě takto získané kolony umožnily purifikovat odpovídající plazmidy technikou popsanou v příkladu 2 za použití následujících pufrů:

pufr F: NaCl 2M, acetát 0,2 M, pH 45, pufr E: Tris 1 M, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.

Získané výsledky činí 23 % a 31 % pro pXL2725 resp. pXL2726.

Příklad 8

Tento příklad ilustruje vliv délky specifické sekvence přítomné v plazmidu na výtěžek purifikace.

-11CZ 295474 B6

Příklad 8.1: Konstrukce plazmidu

Reportérovým genem použitým při této studii za účelem prokázání účinnosti kompozic podle vynálezu je gen kódující luciferázu (Luc).

Plazmid pXL2621 obsahuje kazetu zahrnující promotor Cytomegaloviru (CMV) o 661 bp extrahovanou z pcDNA3 (Invitrogen, Cor. San Diego, CA) sekcí za použití restrikčních enzymů Mlul a HindlII a klonovanou před genem kódujícím luciferázu v místech Mlul a HindlII do vektoru pGh basic Vector (Promega Corp. Madisson, WI). Tento plazmid byl konstruován za použití standardních technik molekulární biologie.

Plazmidy pXL2727-l a pXL2727-2 byly konstruovány následujícím způsobem.

Dva mikrogramy plazmidu pXL2621 byly linearizovány za použití BamHI. Enzym byl inaktivován tepelným zpracováním při teplotě 65 °C trvajícím 10 minut. Paralelně byly oligonukleotidy 6006 a 6008 hybridizovány způsobem popsaným pro konstrukci plazmidu pXL2563.

6006 5'-GATCT(GAA)₁₇CTGCAGATCT-3' (SEQ ID n°20)

6008 5'-GATCAGATCTGCAG{TTC)₁₇A-3' (SEQ ID n°21).

Tato hybridizační směs byla klonována na koncích BamHI plazmidu pXL2621 a po transformaci vDH5alfa byla rekombinantní klony detekovány analýzou na bázi enzymatické restrikce za použití Pstl, poněvadž oligonukleotidy zavádějí místo Pstl. Dva klony byly zadrženy a nukleotidová sekvence klonovaného fragmentu byla verifikována za použití primerů (6282, 5'-ACA GTCATAAGTGCGGCGACG-3' (SEQ ID n°22) jako reakčního sekvenčního zárodku (Viera J. a J. Messing, 1982, The pUC plasmids an M13mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers, Gene 19:259-268).

První klon (pXL2727-l) obsahuje sekvenci GAA opakovanou desetkrát. Druhý klon (pXL27272) obsahuje sekvenci 5'-GAAGAAGAG(GAA)₇GGAAGAGAA-3' (SEQ INn°23).

Příklad 8.2: Příprava kolon a purifikace

Použije se kolona, která byla popsána v příkladu 1 a jejíž obsah je kopulován s oligonukleotidem: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID n°1).

Plazmid pXL2727-l nese 14 repeticí sekvence GAA. Výše popsaný oligonukleotid, který obsahuje pouze 7 repeticí odpovídající hybridizační sekvence CTT, může se tudíž hybridizovat s plazmidem v 8 různých polohách. Naopak plazmid pXL2727-2 obsahuje hybridizační sekvenci (GAA)₇ mající stejnou délku jako oligonukleotid fixovaný k obsahu kolony. Tento oligonukleotid se tedy může hybridizovat pouze vjediné poloze na pXL2727-2.

Použitá metodika je stejná jako metodika popsaná v příkladu 2, přičemž se použijí následující pufry.

pufr F: NaCL 2M, acetát 0,2 M, pH 4,5, pufr E: Tris 1 M, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.

Výtěžek purifikace je 29 % u plazmidu pXL2727-l a 19 % u plazmidu pXL2727-2.

Příklad 8.3: transfekce in vitro savčích buněk

Použitými buňkami jsou buňky NIH 3T3 zaočkované v předvečer pokusu na 24 jamkové kultivační plotny v množství 50 000 buněk na jamku. Plazmid se zředí vNaCl 150 mM a smísí s lipofekční činidlem RPR115335. Použije poměru pozitivních nábojů lipofekčního činidla k negativním nábojům DNA rovného 6. Směs se rozmíchá, ponechá po dobu 15 minut při okolní

- 12CZ 295474 B6 teplotě, zředí kultivační prostředím bez telecího fetálního séra a potom přidá v množství 1 pg DNA na kultivační jamku. Po dvou hodinách při teplotě 37 °C se přidá 10 obj. % fetálního telecího séra a buňky se inkubují po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C v přítomnosti 5 % oxidu uhličitého. Buňky se potom dvakrát promyjí PBS a stanoví se aktivita luciferázy za použití popsaného protokolu (kit Promega, Promega Corp. Madison, WI) a luminometru Lumat LB9501 (EG a G. Bethold, Evry). Plazmid pXL2727-l, purifikovaný způsobem popsaným v příkladu 8.2, poskytne dvakrát lepší výtěžky transfekace než jsou výtěžky u téhož plazmidu, který byl purifíkován soupravou Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI).

Seznam sekvencí

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 1 délka: počet párů bází 25 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 1 GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 2 délka: počet párů bází 19 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 2

CTTCCCGAAG GGAGAAGG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 3 délka: počet párů bází 21 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 3 GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 4 délka: počet párů bází 13 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 4

GAAAAAGGAA GAG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 5 délka: počet párů bází 19 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 5

-13CZ 295474 B6

AAGGGAGGGA GGAGAGGAA

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 6 délka: počet párů bází 19 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 6

AAGGAGAGGA GGGAGGGAA

Informace o sekvenci SEQ JD n°: 7 délka: počet párů bází 19 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 7

TTGGTGTGGT GGGTGGGTT

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 8 délka: počet párů bází 17 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 8

AAAAAAGGGA ATAAGGG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 9 délka: počet párů bází 58 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 9

GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAHA AGAAGAAGAA GAAGAAGG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 10 délka: počet párů bází 58 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 10

AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 11 délka: počet párů bází 17 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 11

- 14CZ 295474 B6

TfíACCťíňrArt ΓΑδΑδΤί!

JL v«i*Vířx3f *·>«? v*· **»*<r»*· X Víí

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 12 délka: počet párů bází 17 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc další informace: všechny cytosiny C sekvence jsou methylované

Popis sekvence SEQ ID n° 12

GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 13 délka: počet párů bází 58 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 13

GATCCGGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGGG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 14 délka: počet párů bází 58 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 14

AATTCCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 15 délka: počet párů bází 58 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 15

GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 16 délka: počet párů bází 58 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 16

AATTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCG

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 17 délka: počet párů bází 50 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární

-15CZ 295474 B6 molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 17

GGAGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 18 délka: počet párů bází 25 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc Popis sekvence SEQ ID n° 18

AATGCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCT

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 19 délka: počet párů bází 26 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 19

AGTGCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCT

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 20 délka: počet párů bází 66 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 20

GAT CTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAA

GAACTGC AGATCT

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 21 délka: počet párů bází 66 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 21

GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTC

TTCTTCT TCTTCA

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 22 délka: počet párů bází 21 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 22

ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 23 délka: počet párů bází 39

-16CZ 295474 B6 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 24 délka: počet párů bází 27 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 24

CCGAATTCTG GGAACCAAAG CAGTTTC

Informace o sekvenci SEQ ID n°: 25 délka: počet párů bází 27 typ: nukleotid počet řetězců: jediný konfigurace: lineární molekulový typ: DNAc

Popis sekvence SEQ ID n° 25

Claims

1. Způsob přípravy léčiva na bázi dvouřetězcové DNA, vyznačený tím, že zahrnuje alespoň jeden čisticí stupeň, ve kterém se roztok obsahující dvouřetězcovou DNA ve směsi s ostatními složkami vede přes nosič, na kterém je kovalentně kopulován oligonukleotid schopný tvořit hybridizací trojnou šroubovici se specifickou sekvencí, kterou je sekvence, která je přirozeně přítomna ve dvoušroubovici DNA, nebo syntetická sekvence, která byla do dvoušroubovice DNA zavedena uměle.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že roztokem obsahujícím DNA je buněčný lyzát.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že buněčným lyzátem je čirý lyzát.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že dvouřetězcová DNA je předčistěna.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že specifická sekvence přítomná v DNA obsahuje homopurinovou-homopyrimidinovou sekvenci a oligonukleotid obsahuje sekvenci tvořící s touto homopurinovou-homopyrimidinovou sekvencí trojnou šroubovici.

6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačený tím, že specifickou sekvencí je syntetická sekvence, která byla do dvoušroubovice DNA zavedena uměle.

7. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že oligonukleotid obsahuje sekvenci poly-CTT a specifickou sekvenci přítomnou v DNA je sekvence poly-GAA.

-17CZ 295474 B6

8. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že oligonukleotid obsahuje sekvenci GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID n°l).

9. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že oligonukleotid obsahuje sekvenci (CTT)₇ (SEQ ID n°26).

10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačený tím, že specifická sekvence přítomná v DNA obsahuje sekvenci (GAA)₇, (GAA)i₄ nebo (GAA)i₇.

11. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že specifická sekvence přítomná v DNA obsahuje sekvenci SEQ ID n°5 a oligonukleotid obsahuje sekvenci SEQ ID n°6 nebo SEQ ID n°7.

12. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že specifická sekvence přítomná v DNA obsahuje sekvenci SEQ ID n°17 a oligonukleotid obsahuje sekvenci SEQ ID n°18.

13. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že specifická sekvence přítomná v DNA obsahuje sekvenci (GA)₂₅ a oligonukleotid obsahuje sekvenci SEQ ID n°19.

14. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačený tím, že specifická sekvence je ve dvouřetězcové DNA přítomna přirozeně.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačený tím, že specifickou sekvencí přirozeně přítomnou v DNA je homopurinová-homopyrimidinová sekvence přítomná v replikačním počátku plazmidů.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačený tím, že specifická sekvence DNA obsahuje celek nebo část sekvence SEQ ID n°2 obsažené vreplikačním počátku ColEl z E. colu.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačený tím, že oligonukleotid obsahuje sekvenci SEQ IDn°3.

18. Způsob podle nároku 14, vyznačený tím, že specifická sekvence DNA obsahuje celek nebo část sekvence SEQ ID n°4 nebo sekvence SEQ ID n°8, které jsou obsažené v genu beta-laktamázy plazmidů pBR322.

19. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vy z n a č e n ý tím, že oligonukleotid je kopulován s nosičem disulfidovou, thioetherovou, esterovou, amidovou nebo aminovou vazbou.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačený tím, že oligonukleotid je fixován knáplni kolony prostřednictvím ramene tvořeného uhlíkovým řetězcem (CH₂)_n, ve kterém n znamená celé číslo mezi od 1 do 18, přičemž uvedené rameno je vázané k oligonukleotidů fosfátem a k náplni kolony amidovou vazbou.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačený tím, že rameno je tvořeno lineárním uhlíkovým řetězcem obsahujícím 6 uhlíkových atomů.

22. Způsob podle nároku 20, vyznačený tím, že rameno je tvořeno lineárním uhlíkovým řetězcem obsahujícím 12 uhlíkových atomů.

23. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vy z n a č e n ý tím, že oligonukleotid má alespoň jednu chemickou modifikaci, která ho činí rezistentním vůči nukleázám nebo ho chrání proti nukleázám anebo zvyšuje jeho afinitu pro specifickou sekvenci.

-18CZ 295474 B6

24. Způsob podle nároku 23, vyznačený tím, že oligonukleotid obsahuje homopyrimidinovou sekvenci, ve které je alespoň jeden z cytosinů methylován.

25. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že DNA obsahuje navíc jednou nebo několik terapeuticky zainteresovaných sekvencí.

26. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že dvouřetězcovou DNA je cyklická DNA, jakou je plazmid.

27. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že specifická sekvence přítomná ve dvouřetězcové DNA obsahuje několik poloh hybridizace s oligonukleotidem.

28. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že nosíc je zvolen z množiny zahrnující chromatografické nosiče, povrchy plastických hmot a funkcionalizované latexové kuličky.

29. Způsob podle nároku 28, vyznačený

30. Způsob podle nároku 1, vyznačený nižší nebo rovný 0,5 %.

31. Způsob podle nároku 30, vyznačený nižší nebo rovný 0,2 %.

32. Způsob podle nároku 31, vyznačený nižší nebo rovný 0,1 %.

tím, že nosičem je chromatografický nosič.

tím, že léčivo má obsah chromosomální DNA tím, že léčivo má obsah chromosomální DNA tím, že léčivo má obsah chromosomální DNA

33. Způsob čištění dvouřetězcové RNA, vyznačený tím, že zahrnuje alespoň jeden stupeň, ve kterém se roztok obsahující uvedenou RNA ve směsi s ostatními složkami vede přes nosič, na kterém je kovalentně kopulován oligonukleotid schopný tvořit hybridizací trojnou šroubovici se specifickou sekvencí přítomnou v uvedené RNA.

34. Způsob čištění plazmidové DNA, vyznačený tím, že zahrnuje alespoň jeden stupeň, ve kterém se roztok obsahující uvedenou DNA ve směsi s ostatními složkami vede přes nosič, na kterém je kovalentně kopulován oligonukleotid schopný tvořit hybridizací trojnou šroubovici se specifickou sekvencí přítomnou v uvedené DNA.