ES2197928T3 - Purificacion de una formacion de triple helice con un oligonucleotido inmovilizado. - Google Patents

Purificacion de una formacion de triple helice con un oligonucleotido inmovilizado.

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ES2197928T3 ES95940285T ES95940285T ES2197928T3 ES 2197928 T3 ES2197928 T3 ES 2197928T3 ES 95940285 T ES95940285 T ES 95940285T ES 95940285 T ES95940285 T ES 95940285T ES 2197928 T3 ES2197928 T3 ES 2197928T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA PURIFICAR ADN DE BICATENARIO SEGUN EL CUAL SE HACE PASAR UNA SOLUCION QUE CONTIENE DICHO ADN MEZCLADO CON OTROS COMPONENTES SOBRE UN SOPORTE AL QUE SE HA ACOPLADO DE FORMA COVALENTE UN OLIGONUCLEOTIDO CAPAZ DE FORMAR POR HIBRIDACION UNA TRIPLE HELICE CON UNA SECUENCIA ESPECIFICA PRESENTE EN DICHO ADN.

Description

Purificación de una formación de triple hélice con un oligonucleótido inmovilizado.
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la purificación de ADN. El procedimiento según la invención permite purificar rápidamente el ADN doble hebra circular, utilizable farmacológicamente. De una manera mas particular, el procedimiento de purificación según la invención hace intervenir una hibridación específica entre una secuencia de ADN y un oligonucleótido.
Las técnicas de terapia génica y celular conocen, actualmente, un desarrollo extraordinario. Sin embargo, estas técnicas implican la posibilidad de producir cantidades importantes de ADN de pureza farmacéutica. En efecto, en estas nuevas terapias, el medicamento está constituido, frecuentemente, por el propio ADN, y esencial poderlo fabricar en cantidades adaptadas, aislarlo y purificarlo de manera apropiada para un uso terapéutico en los seres humanos.
La presente invención describe un nuevo procedimiento simple y particularmente eficaz para la purificación de ADN circular. Esta permite, principalmente, obtener purezas particularmente elevadas, con rendimientos elevados.
El procedimiento según la invención se basa, esencialmente, en una interacción específica entre una secuencia insertada sobre el ADN a purificar y un oligonucleótido compuesto por bases naturales o modificadas.
Recientemente se ha observado que ciertos oligonucleótidos son capaces de interactuar específicamente en el gran sillón de la doble hélice de ADN para formar localmente triples hélices, que conducen a una inhibición de la transcripción de genes diana (Hélène et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Estos oligonucleótidos reconocen, selectivamente, la doble hélice de ADN al nivel de la secuencia oligopurina.oligopirimidina, es decir al nivel de regiones que tengan una secuencia oligopúrica sobre una hebra y una secuencia oligopirimídica sobre la hebra complementaria y forman allí, localmente, una triple hélice. Las bases de la tercera hebra (el oligonucleótido) forman enlaces hidrógeno (enlaces de Hoogsteen o de Hoogsteen inverso) con las purinas de pares de bases Watson-Crick.
Una utilización de este tipo de interacción para aislar un plásmido ha sido descrita en el arte anterior. De este modo, Ito et al, (PNAS 89 (1992) 495) describen la utilización de oligonucleótidos biotinilados capaces de reconoce una secuencia determinada de un plásmido y de formar con éste la triple hélice. Los complejos, formados de este modo, se ponen en contacto a continuación con bolas magnéticas revestidas con streptavidina. La interacción entre la biotina y la streptavidina permite, entonces, aislar el plásmido por separación magnética de las bolas tras elusión. Sin embargo, este procedimiento presenta ciertos inconvenientes. En particular, se necesitan dos interacciones específicas sucesivas, la primera entre el oligonucleótido y el plásmido, la segunda entre el complejo biotinilado y las bolas de streptavidina. Además, la solución final puede estar contaminada con oligonucleótido biotinilado, que no puede ser utilizado en una composición farmacéutica.
La presente invención describe un nuevo procedimiento, mejorado, para la purificación de ADN que utiliza este tipo de interacción. De una manera mas particular, el procedimiento de la invención utiliza oligonucleótidos acoplados de manera covalente con un soporte. Este procedimiento es particularmente rápido y conduce a rendimientos y a grados de pureza particularmente elevados. Por otra parte, permite purificar al ADN circular a partir de mezclas complejas que comprendan, principalmente, otros ácidos nucleicos, proteínas, endotoxinas (tales como lipopolisacáridos), nucleasas, etc. ... . Los soportes utilizados pueden ser reciclados además fácilmente, y los ADN obtenidos presentan propiedades mejoradas de seguridad farmacéutica. Finalmente, este procedimiento implica una única etapa en contra de lo que ocurre en el arte anterior.
Un primer objeto de la invención reside, por lo tanto, en un procedimiento para la purificación de ADN de doble hebra circular, según el cual se hace pasar una solución, que contiene el citado ADN en mezcla con otros componentes, sobre un soporte en el que se ha acoplado, de manera covalente, un oligonucleótido capaz de formar, por hibridación, una triple hélice con una secuencia específica presente sobre dicho ADN. La secuencia específica puede ser una secuencia presente, de manera natural, en el ADN de doble hélice, o una secuencia sintética, introducida artificialmente en el mismo.
Los oligonucleótidos utilizados en la presente invención son oligonucleótidos que hibridan directamente con el ADN en doble hebra. Estos oligonucleótidos pueden contener las bases siguientes:
-
timidina (T), que es capaz de formar tripletes con los dobletes AT del ADN de doble hebra (Rajagopal et al, Biochem 28 (1989) 7859);
-
adenina (A), que es capaz de formar tripletes con los dobletes A.T del ADN de doble hebra;
-
guanina (G), que es capaz de formar tripletes con los dobletes G.C del ADN de doble hebra;
-
citosina protonada (C+), que es capaz de formar tripletes con los dobletes G.C del ADN de doble hebra (Rajagopal et al anteriormente citado);
-
uracilo (U), que es capaz de formar tripletes con los pares de bases A.U o A.T.
Preferentemente, el oligonucleótido utilizado comprende una secuencia homopirimídica rica en citosinas y la secuencia específica presente en el ADN es una secuencia homopúrica-homopirimídica. La presencia de citosinas permite tener una triple hélice estable a pH ácido, en el que las citosinas están protonizadas, y desestabilizada a pH alcalino, en el que las citosinas están neutralizadas.
Para permitir la formación de una triple hélice por hibridación, es importante que el oligonucleótido y la secuencia específica, presente en el ADN, sean complementarias. A este respecto, para obtener los mejores rendimientos y la mejor selectividad, se utiliza en el procedimiento de la invención un oligonucleótido y una secuencia específica perfectamente complementarios. Puede tratarse, en particular, de un oligonucleótido poli-CTT y de una secuencia específica poli-GAA. A título de ejemplo, se puede citar el oligonucleótido de secuencia 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTC TT-3'- (GAGG(CCT)_{7}; (SEQ ID Nº 1), en la que las bases GAGG no forman triple hélice sino que permiten espaciar el oligonucleótido del brazo de copulación; igualmente se puede citar la secuencia (CTT)_{7} (SEQ ID Nº 26). Estos oligonucleótidos son capaces de formar una triple hélice con una secuencia específica que comprenda motivos complementarios (GAA). Puede tratarse, en particular, de una región que comprenda 7, 14 o 17 motivos GAA, como se ha descrito en los ejemplos.
Otra secuencia de interés específico es la secuencia:
5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3'(SEQ ID Nº 5).
Estas secuencias forman una triple hélice con los oligonucleótidos
5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'(SEQ ID Nº 6).
5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'(SEQ ID Nº 7).
En este caso, el oligonucleótido se fija en una orientación antiparalela a la hebra polipúrica. Estas triples hélices no son estables mas que en presencia de Mg2+ (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal et Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
Como se ha indicado anteriormente, la secuencia específica puede ser una secuencia presente, de manera natural, sobre el ADN de doble hebra, o una secuencia sintética, introducida artificialmente sobre el mismo. Es particularmente interesante utilizar un oligonucleótido capaz de formar una triple hélice con una secuencia presente, de manera natural, sobre el ADN de doble hebra, por ejemplo en el origen de replicación de un plásmido o en un gen marcador. A este respecto, la solicitante ha efectuado análisis de secuencia de plásmidos y ha podido mostrar que ciertas regiones de estos ADN, principalmente en el origen de replicación, podían tener regiones homopúrica-homopirimídica. La síntesis de oligonucleótidos capaces de formar triples hélices con estas regiones homopúrica-homopirimídicas naturales permite, ventajosamente, aplicar el procedimiento de la invención a plásmidos no modificados, principalmene plásmidos comerciales de tipo pUC, pBR322, pSV, etc. Entre las secuencias homopúricas-homopirimídicas naturalmente presentes sobre un ADN de doble hebra, se pueden citar una secuencia que comprenda la totalidad o una parte de la secuencia 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3'(SEQ ID Nº 2) presente en el origen de replicación ColE1 de E. coli. En este caso, el oligonucleótido que forma la triple hélice tiene la secuencia: 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3'(SEQ ID Nº 3) y se fija, alternativamente, sobre las dos hebras de la doble hélice, como se ha descrito por Beal y Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) y Jayasena y Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). También se puede citar la secuencia 5'-GAAAAAGGAAGAG-3'(SEQ ID Nº 4) del gen de la \beta-lactamasa del plásmido pBR322 (Duval-Valentín et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504- 508). La utilización de un oligonucleótido, capaz de formar una triple hélice con una secuencia presente en un origen de replicación o con un gen marcador, es particularmente ventajosa puesto que permite, con el mismo oligonucleótido, purificar cualquier ADN que contenga dicho origen de replicación dicho gen marcador. Por lo tanto no es necesario modificar el plásmido ni el ADN de doble hebra para incorporarle una secuencia específica artificial.
Aún cuando se prefieran secuencias perfectamente compatibles, es evidente sin embargo que pueden tolerarse algunos apareamientos erróneos entre la secuencia del oligonucleótido y la secuencia presente sobre el ADN, desde el momento en que no conduzcan a una pérdida demasiado grande de afinidad. Se puede citar la secuencia 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3'(SEQ ID Nº 8) presente en el gen de la \beta-lactamasa de E. coli. En este caso, la timina que interrumpe la secuencia polipúrica puede ser reconocida por una guanina de las tercera hebra, formando así un triplete ATG que es estable cuando esté encuadrado por dos tripletes TAT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
Según un modo de realización particular, los oligonucleótidos de la invención comprenden la secuencia (CCT)n, la secuencia (CT)n o la secuencia (CTT)n, en la que n es un número entero comprendido entre 1 y 15 inclusive. Es particularmente ventajoso utilizar secuencias de tipo (CT)n o (CTT)n. La solicitante ha observado, en efecto, que el rendimiento de purificación quedaba influenciado por la cantidad de C en el oligonucleótido. En particular, como se ha indicado en el ejemplo 7, el rendimiento de purificación aumenta cuando el oligonucleótido comprenda menos citosinas. Es evidente que los oligonucleótidos de la invención pueden combinar, igualmente, motivos (CCT), (CT) o (CTT).
El oligonucleótido utilizado puede ser natural (compuesto por bases naturales, no modificadas) o modificado químicamente. En particular, el oligonucleótido puede presentar, ventajosamente, ciertas modificaciones químicas, que permitan aumentar su resistencia o su protección frente a las nucleasas, o su afinidad frente a la secuencia específica.
Según la presente invención se entiende también por oligonucleótido cualquier encadenamiento de nucleósidos que haya sufrido una modificación del esqueleto con el fin de hacerlo mas resistente a las nucleasas. Entre las modificaciones posibles se pueden citar los oligonucleótidos fósforotioatos que son capaces de formar triples hélices con el ADN (Xodo et al, Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), así como los oligonucleótidos que tengan esqueletos formacetal o metilfosfonato (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768). Igualmente se pueden utilizar los oligonucleótidos sintetizados con \alpha-anómeros de nucleótidos, que forman también triples enlaces con el ADN (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749- 7760). Otra modificación del esqueleto consiste en el enlace fósforoamidato. Se puede citar, por ejemplo, el enlace internucleotídico N3'-P5' fósforoamidado descrito por Gryaznov et Chen, que da oligonucleótidos que forman con el ADN triples hélices particularmente estables (J. Am.Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144). Entre las otras modificaciones del esqueleto, se puede citar, igualmente, la utilización de ribonucleótidos, de 2'-O-metilribosa, de fósforodiéster, ... (Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). El esqueleto fosforado puede reemplazarse, finalmente, por un esqueleto poliamida como en los PNA (Peptide Nucleic Acid), que pueden formar, igualmente, triples hélices (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481)) o por un esqueleto a base de guanidina, como en los DNG (déoxyribonucleic guanidine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), análogos policatiónicos del ADN, que forman igualmente triples hélices.
La timina de la tercera hebra puede estar reemplazada también por un 5- bromouracilo, lo que aumenta la afinidad del oligonucleótido para el ADN (Povsic et Dervan, J. Am.Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). La tercera hebra puede contener, igualmente, bases no naturales, entre las cuales se puede citar la 7-deaza-2'-deoxixantosina (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), la 1-(2-deoxi-\beta-D-ribofuranosil)-3-metil-5- amino-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidina-7-ona (Koh et Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), la 8-oxoadenina, la 2-aminopurina, la 2'-O-metil- pseudoisocitidina, o cualquier otra modificación conocida por el técnico en la materia (véase para recopilación Sun et Hélène Curr.Opinión Struct. Biol., 1993, 3, 345-356).
Otro tipo de modificación del oligonucleótido tiene por objeto, de una manera mas particular, mejorar la interacción y/o la afinidad entre el oligonucleótido y la secuencia específica. En particular, una modificación muy ventajosa según la invención consiste en metilar las citosinas del oligonucleótido (véase el ejemplo 5). El oligonucleótido metilado de este modo presenta la propiedad considerable de formar una triple hélice estable con la secuencia específica en zonas del pH mas próximas a la neutralidad (\geq 5). Por lo tanto permite trabajar a valores del pH mas elevados que los oligonucleótidos del arte anterior, es decir a pH en el que los riesgos de degradación del ADN plasmídico son mucho menores.
La longitud del oligonucleótido utilizado en el procedimiento de la invención es al menos de 3 bases, y está comprendida, preferentemente, entre 5 y 30. De manera ventajosa se utiliza un oligonucleótido de longitud mayor que 10 bases. La longitud puede adaptarse en cada caso por el técnico en la materia en función de la selectividad y de la estabilidad de la interacción buscadas.
Los oligonucleótidos según la invención pueden sintetizarse por cualquier técnica conocida. En particular pueden prepararse por medio de sintetizadores de ácidos nucleicos. Evidentemente puede utilizarse cualquier otro método conocido por el técnico en la materia.
Para permitir su copulación covalente sobre el soporte, el oligonucleótido está, generalmente, funcionalizado. De este modo, puede estar modificado por un agrupamiento terminal tiol, amina o carboxilo, en posición 5' o 3'. En particular, la adición de un grupo tiol, amina o carboxilo permite, por ejemplo, copular el oligonucleótido sobre un soporte que porte funciones disulfuro, maleimida, amina, carboxilo, éster, epóxido, bromuro de cianógeno o aldehído. Estas copulaciones se forman por establecimiento de enlaces disulfuro, tioéter, éster, amida o amina entre el oligonucleótido y el soporte. Puede utilizarse cualquier otro método conocido por el técnico en la materia, tal como reactivos de copulación bifuncionales, por ejemplo.
Por otra parte, para mejorar la hibridación con el oligonucleótido copulado, puede ser ventajoso que el oligonucleótido contenga un ``brazo'' y una secuencia de bases ``espaciadora''. La utilización de un brazo permite, en efecto, fijar el oligonucleótido a una distancia elegida del soporte, que permite, mejorar sus condiciones de interacción con el ADN. El brazo está constituido, ventajosamente, por una cadena carbonada lineal, que comprende de 1 a 18, y preferentemente 6 ó 12 grupos (CH_{2}), y por una amina que permite el enlace con la columna. El brazo está unido con un fosfato del oligonucleótido o un ``espaciador'' compuesto por bases que no interfieren con la hibridación. De este modo, ``el espaciador'' puede comprender bases púricas. A título de ejemplo, ``el espaciador'' puede comprender la secuencia GAGG. El brazo está compuesto, ventajosamente, por una cadena carbonada lineal que comprende 6 ó 12 átomos de carbono.
Para la realización de la presente invención, pueden utilizarse diversos tipos de soportes. Puede tratarse de soportes de cromatografía funcionalizados, en cubeta o de acondicionados en columna, de superficies plásticas funcionalizadas o de bolas de látex funcionalizadas, magnéticas o no. Preferentemente se trata de soportes de cromatografía. A título de ejemplo, los soportes de cromatografía, que pueden ser utilizados, son la agarosa, la acrilamida o el dextrano así como sus derivados (tales como Séphadex, Sépharose, Superose,...), los polímeros tales como el poli(estirenodivinilbenceno), o la sílice injertada o no injertada, por ejemplo. Las columnas de cromatografía pueden funcionar en modo de difusión o de perfusión.
Para obtener mejores rendimientos de purificación es particularmente ventajoso utilizar, sobre el plásmido, una secuencia que comprenda varias posiciones de hibridación con el oligonucleótido. La presencia de varias posiciones de hibridación favorece, en efecto, las interacciones entre la citada secuencia y el oligonucleótido, lo que conduce a mejorar los rendimientos de purificación. De este modo, para un oligonucleótido que comprenda n repeticiones de motivos (CCT), (CT) o (CTT), es preferible utilizar una secuencia de ADN que comprenda al menos n motivos complementarios y, preferentemente n+1 motivos complementarios. Una secuencia que porte n+1 motivos complementarios ofrece, de este modo, dos posiciones de hibridación con el oligonucleótido. Ventajosamente, la secuencia de ADN comprende hasta 11 posiciones de hibridación, es decir n+10 motivos complementarios.
El procedimiento según la presente invención puede utilizarse para purificar cualquier tipo de ADN de doble hebra. Se trata, por ejemplo, de ADN circular, tal como un plásmido, que porta generalmente uno o varios genes de interés terapéutico. Este plásmido puede portar, igualmente, un origen de replicación, un gen marcador, etc. ... . El procedimiento de la invención puede aplicarse directamente a un lisado celular. En este modo de realización, el plásmido, amplificado por transformación y a continuación cultivo celular, se purifica directamente tras la lisis de las células. El procedimiento según la invención puede aplicarse, igualmente, a un lisado claro, es decir al sobrenadante obtenido tras neutralización y centrifugado del lisado celular. Evidentemente puede aplicarse también a una solución prepurificada por métodos conocidos. Este procedimiento permite, también, purificar ADN lineal o circular, que porte una secuencia de interés, a partir de una mezcla que comprenda varios ADN de secuencias diferentes.
El lisado celular puede ser un lisado de células procariotas o eucariotas.
Si se trata de células perocariotas, se pueden citar, por ejemplo, las bacterias E. coli, B. subtilis, S. typhimurium o Streptomyces. Si se trata de células eucariotas, se pueden citar las células animales, las levaduras, los hongos, etc. ..., y de una manera mas particular las levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces o las células COS, CHO, CI27, NIH3T3, etc. ... .
El procedimiento de la invención es particularmente ventajoso puesto que permite obtener, de manera rápida y simple, ADN plasmídico y de pureza muy elevada. En particular, como se ha ilustrado en los ejemplos, este procedimiento permite separar eficazmente el ADN plasmídico considerado de los componentes contaminantes, tales como el ADN cromosómico fragmentado, las endotosinas, las proteínas, las nucleasas, etc. ... . De una manera mas particular, el procedimiento de la invención permite obtener preparaciones de ADN de doble hebra, principalmente plasmídico, que tenga un contenido en ADN cromosómico menor o igual que el 0,5%. Todavía, de una maneras mas preferente, las preparaciones de ADN obtenidas tienen un contenido en ADN cromosómico menor o igual que el 0,2%. La presente invención describe, por lo tanto, composiciones que comprenden ADN plasmídico utilizables farmacéuticamente, principalmente, en terapia génica o celular. A este respecto, la invención tiene, igualmente, por objeto una composición farmacéutica que comprende ADN de doble hebra, lineal o plasmídico, preparado según el procedimiento anteriormente descrito.
La invención se refiere, igualmente, a preparaciones de ADN plasmídicos que tienen un contenido en ADN cromosómico menor o igual que 0,5%, preferentemente que el 0,2% y de una manera todavía mas preferente que el 0,1%.
Las composiciones pueden comprender el ADN plasmídico ``desnudo'' o asociado con vectores de transporte tales como los liposomas, las nanopartículas, los lípidos catiónicos, los polímeros, proteínas o virus recombinantes, etc.
La presente solicitud se describirá con mayor detalle por medio de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
Técnicas generales de clonación y de biología molecular.
Los métodos clásicos de biología molecular tales como las digestiones con enzimas de restricción, la electrofóresis sobre gel, la transformación en E. coli, la precipitación de los ácidos nucleicos etc., están descritos en la literatura (Maniatis et al., T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman and K. Struhl, 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York.). Las secuencias nucleotídicas han sido determinadas por el método de terminación de cadenas siguiendo el protocolo ya presentado (Ausubel et al., 1987).
Los enzimas de restricción han sido suministrados por New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).
Para los ligadores, los fragmentos de ADN han sido incubados en un tampón Tris- HCl pH 7,4 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en presencia de ADN ligasa del fago T4 (Biolabs,).
Los oligonucleótidos son sintetizados utilizando la química de los fósforoamiditos protegidos en \beta por un agrupamiento cianoetilo (Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus and H. Köster, 1984, Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of \beta-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N- morpholino phosphoramidite of déoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and Isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557; Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA, synthesis, Am Biotechnol., Nov./Dec.) con el sintetizador automático de ADN Biosearch 8600 utilizando las recomendaciones del fabricante.
Los ADN ligadores o a ser ensayados por su eficacia de transformación son utilizados para transformar la cepa que se ha hecho competente: E. coli DH5_{\alpha} [F' / endA1, hsdR17, supE44, thi-12, recA1, gyrA96, relA1, \Delta(lacZYA-argF) U169, deoR, \phi80dlac lacZ-\DeltaM15)].
Las minipreparaciones de ADN plasmídico se hacen según el protocolo de Klein et al., 1980.
El medio de cultivo LB es utilizado para el crecimiento de las capas de E. coli (Maniatis et al., 1982). Las cepas se incuban a 37ºC. Las bacterias son expuestas sobre cajas del medio LB suplementadas con antibióticos apropiados.
Ejemplo 1 1.1. Preparación de la columna
Material
La columna utilizada es una columna HiTrap activada con NHS (N- hidroxisuccinimida, Pharmacia) de 1 ml, conectada con una bomba peristática (caudal < 1 ml/min). El oligonucleótido especifico utilizado tiene un agrupamiento NH_{2} en 5'. Su secuencia es la siguiente:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(SEQ
ID Nº
1).\cr}
Los tampones utilizados en este ejemplo son los siguientes:
Tampón de copulacion: NaHCO_{3} 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3,
Tampón A: etanolamina 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3.
Tampón B: acetato 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4.
Método
La columna se lava con 6 ml de HCl 1mM, a continuación el oligonucleótido diluido en el tampón de copulación (50 nmoles en 1 ml) se aplica sobre la columna y se deja 30 minutos a temperatura ambiente. La columna se lava 3 veces sucesivas con 6 ml de tampón A y a continuación con 6 ml de tampón B. El oligonucleótido se enlaza, de este modo, de manera covalente, con la columna mediante un enlace CONH. La columna se almacena a 4ºC en PBS 0,1% NaN_{3} y puede utilizarse al menos cuatro veces.
1.2. Construcción de los plásmidos.
Se han sintetizado los dos oligonucleótidos siguientes.
Oligonucleótido 4817:
5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA GAAGAAGAAGAAGG-3'(SEQ ID Nº 9).
Oligonucleótido 4818:
5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTTGG-3'(SEQ ID Nº 10).
Estos oligonucleótidos, una vez hibridados y clonados sobre un plásmido, aportan sobre el plásmido correspondiente una secuencia homopúrica- homopirimídica (GAA)_{17}, como se ha descrito anteriormente.
La secuencia, que corresponde a estos dos oligonucleótidos hibridados, ha sido clonada en el multipunto de clonación del plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), que porta un gen de resistencia a la ampicilina. Para hacer esto, los oligonucleótidos han sido hibridados de la manera siguiente. Se han combinado un \mug de estos dos oligonucleótidos en 40 ml de un tampón final 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl_{2}. Esta mezcla se ha calentado a 95ºC, a continuación se ha colocado a la temperatura ambiente de manera que la temperatura descienda lentamente. Se han ligado diez ng de la mezcla de oligonucleótidos hibridados con 200 ng del plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) digeridos por BamHI y EcoRI en 30 \mul final. Tras la ligación se ha transformado una alícuota en DH5_{\alpha}. Las mezclas de transformación se han extendido sobre medio L suplementado con ampicilina (50 mg/l) y con X-gal (20 mg/l) Los clones recombinantes deben presentar una ausencia de coloración azul sobre este medio, en contra de lo que ocurre con el plásmido emparentado (pBKS+) que permite el \alpha-complementado del fragmento \omega de la \beta-galactosidasa de E. coli. Tras la minipreparación de ADN plasmídico con 6 clones, todos ellos presentan la desaparición del sitio Pstl, situado entre los sitios EcoRI y BamHI de pBKS+, y un aumento de peso molecular de la banda Pvull de 448 pb que contiene el multisitio de clonación. Se ha retenido un clon y el plásmido correspondiente ha sido denominado pXL2563. La secuencia clonada ha sido verificada por secuencia utilizando el iniciador -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3'(SEQ ID Nº 11)) (Viera J. and J.Messing, 1982. The pUC plasmids, and M13mp7-derived system for insertion mutagénesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268), del plásmido pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA). El plásmido pXL2563 ha sido purificado según el estuche Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) según las recomendaciones del suministrador. Esta preparación del ADN plasmídico ha sido utilizada a continuación en los ejemplos descritos seguidamente.
1.3 Purificación del plásmido.
Material
El plásmido PXL2563 (descrito en 1.2) ha sido purificado sobre la columna HiTrap copulada con el oligonucleótido descrito en 1.1., a partir de una solución que contiene igualmente el plásmido pBKS+. Los tampones utilizados durante esta purificación, son los siguientes:
Tampón F: NaCl 2M, acetato 0,2 M, pH 4,5 a 5.
Tampón E: Tris 1 M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
Método
La columna se ha lavado con 6 ml de tampón F, a continuación se aplican los plásmidos (20 \mug de pXL2563 y 20 \mug de pBKS+ en 400 \mul de tampón F) sobre la columna y se incuban dos horas a temperatura ambiente. La columna se lava con 10 ml de tampón F y a continuación se lleva a cabo la elusión con tampón E. Los plásmidos son detectados tras electrofóresis sobre gel de agarosa al 1% y coloración con bromuro de etidium. La proporción de los plásmidos en las soluciones es estimada mediante la medida de su actividad transformante sobre E. coli.
Resultado
Cuando se parte de una mezcla que contiene un 30% de pXL2563 y 70% de pBKS+, se recupera, a la salida de la columna, una solución al 100% de pXL2563. La pureza, estimada por la relación D.O. a 260 y 280 nm, pasa del 1,9 al 2,5, lo que indica que se eliminan proteínas contaminantes según este método.
Ejemplo 2
2.1 - Este ejemplo describe una experiencia de purificación de ADN plasmídico. La copulación del oligonucleótido (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT- 3'(SEQ ID Nº 1)) sobre la columna se ha efectuado como se ha indicado en el ejemplo 1. Para la copulación, el oligonucleótido es modificado en la extremidad 5' por un agrupamiento amina enlazado con el fosfato del espaciador por un brazo que contiene 6 átomos de carbono (oligonucleótido modificado Eurogentec SA Belgica). El plásmido pXL2563 ha sido purificado por medio del estuche Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, Wl) según las recomendaciones del suministrador. Los tampones utilizados en este ejemplo son los siguientes:
Tampón F: NaCl 0-2M, acetato 0,2M, pH 4,5-5.
Tampón E: Tris 1M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
La columna se ha lavado con 6 ml de tampón F, a continuación se han aplicado 100 \mug de plásmido pXL2563 diluidos en 400 \mul de tampón F, sobre la columna y se han incubado dos horas a temperatura ambiente. La columna se ha lavado con 10 ml de tampón F y a continuación se lleva a cabo la elusión con tampón E. El plásmido es cuantificado por medida de la densidad óptica a 260 nm. En este ejemplo, la fijación se ha realizado en un tampón cuya molaridad en NaCl varía desde 0 hasta 2M (tampón F).
El rendimiento de la purificación disminuye cuando decrece la molaridad en NaCl. El pH del tampón de fijación puede variar desde 4,5 hasta 5, siendo mejor el rendimiento de purificación a 4,5. Igualmente se puede utilizar otro tampón de elusión de pH básico: de este modo la elución ha sido realizada con un tampón de borato 50 mM, pH 9, EDTA 0,5 mM.
2.2 - Se procede a la copulación del oligonucleótido:
(5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(SEQ ID Nº 1) sobre la columna como se ha indicado en el ejemplo 1. El plásmido pX2563 ha sido purificado por medio del estuche Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) según las recomendaciones del suministrador. Los tampones utilizados en este ejemplo son los siguientes:
Tampón F: NaCl 0,1M, acetato 0,2 M, pH 5.
Tampón E: Tris 1M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
La columna se ha lavado con 6 ml de tampón F, a continuación se han aplicado 100 \mug de plásmido pXL2563, diluidos en 400 \mul de tampón F sobre la columna y se han incubado durante una hora a temperatura ambiente. La columna se ha lavado con 10 ml de tampón F y a continuación se lleva a cabo la elusión con tampón E. Se mide el grado de ADN genómico o cromosómico de E. coli en las muestras de plásmido antes y después del paso a través de la columna de oligonucleótido. Este ADN genómico se cuantifica mediante PCR utilizando iniciadores en el gen galK de UE, coli. De acuerdo con el protocolo siguiente: la secuencia de estos indicadores está descrita por Debouck et al. (Nucleic Acids Res., 1985, 13, 1841-1853):
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT
TTC-3'(SEQ ID Nº
24)\cr}
y
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG
TGT-3'(SEQ ID Nº
25).\cr}
El medio de la reacción comprende, en 25 \mul de tampón PCR (Promega France, Charbonnières): 1,5 mM MgCl_{2}; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 \muM en cebo; 20 U/ml Taq polymérase (Promega). La reacción se ha efectuado según la secuencia:
-
5 min. a 95ºC
-
30 ciclos de
10 segundos a 95ºC
30 segundos a 60ºC
1 minuto a 78ºC
-
10 minutos a 78ºC.
El fragmento de ADN amplificado, con una longitud de 124 pares de bases, se separa por electrofóresis sobre gel de agarosa al 3% en presencia de SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA), a continuación se cuantifica por referencia con una gama de ADN genómica Ultrapur d´E. coli, souche B (Sigma, réf. D4889).
Se tiene un 1% de ADN cromosómico en la muestra depositada sobre la columna, y un 0,2% en la muestra purificada sobre la columna de oligonucleótido.
Ejemplo 3 Experiencia sobre lisado claro
Este ejemplo describe la purificación de ADN plasmídico a partir de un lisado claro de cultivo bacteriano, a escala denominada ``miniprep'': 1,5 ml de un cultivo de noche, de cepas DH5_{\alpha} que contienen el plásmido pXL2563, se centrifugan y el culote se vuelve a suspender en 100 \mul de glucosa, 50 mM, Tris 25 mM HCl pH 8, EDTA 10 mM. Se añaden 200 \mul de NaOH 0,2 M, SDS 1%, los tubos se agitan por inversión, y a continuación se añaden 150 \mul de acetato de potasio 3M, pH 5 y los tubos se agitan por inversión. Tras centrifugado, el sobrenadante se recupera y se carga sobre la columna de oligonucleótido obtenido como se ha descrito en el ejemplo 1. La fijación, los lavados y la elusión son idénticos a los que se han descrito en el ejemplo 1. Aproximadamente se recupera 1 \mug de plásmido a partir de 1,5 ml de cultivo. El plásmido obtenido, analizado por electrofóresis sobre gel de agarosa y coloración con bromuro de etidium, se presenta en forma de una sola banda de ADN circular ``super enrollada''. No puede detectarse ninguna traza de ADN de elevado peso molecular (cromosómico), ni de ARN en el plásmido purificado por este método. La relación de las densidades ópticas a 260 y 280 nm es mayor que 2.
Ejemplo 4
4.1: Este ejemplo describe una experiencia de purificación de ADN plasmídico realizada en las mismas condiciones que en el ejemplo 3, a partir de 20 ml de cultivo bacteriano de cepas DH5_{\alpha} que contienen el plásmido pXL2563. El culote celular se recoge en 12,5 ml de glucosa 50 mM, Tris 25 mM HCl pH 8, EDTA 10 mM. La lisis se lleva a cabo con 2 ml de NaOH 0,2 M, SDS 1%, y la neutralización con 1,5 ml de acetato de potasio 3M pH 5. El ADN se precipita a continuación con 3 ml de propanol-2, el culote se recoge en 0,5 ml de acetato de sodio 0,2 M pH 5, NaCl 0,1M y se carga sobre la columna de oligonucleótido obtenido como se ha descrito en el ejemplo 1. La fijación, el lavado de la columna y la elusión se hacen como se ha descrito en el ejemplo 1, con excepción del tampón de lavado, cuya molaridad en NaCl es de 0,1M. Se obtienen aproximadamente 16 \mug de ADN plasmídico. El plásmido obtenido, analizado por electrofóresis sobre gel de agarosa y coloración con bromuro de etidium, se presenta en forma de una sola banda de ADN circular ``super enrollada''. No puede detectarse ninguna traza de ADN de elevado peso molecular (cromosómico), ni de ARN en el plásmido purificado. La digestión del plásmido por un enzima de restricción da una sola banda de peso molecular esperado de 3 kilobases. La concentración en proteínas en las muestras pasa de 125 \mug/ml en el lisado claro a menos de 1 \mug/ml en el plásmido purificado (valoración Micro-BCA, Pierce). La concentración en endotoxinas, estimada por la valoración LAL (Biosepra) está dividida entre un factor mayor que 10 en el plásmido purificado, con relación al lisado claro de partida.
4.2: El plásmido utilizado comprende una caja que contiene el promotor del citomegalovirus, el gen que codifica la luciferasa, y la secuencia homopúrica- homopirimídica (GAA)_{17} procedente del plásmido pXL2563. La cepa DH1 (Maniatis et al., 1989), que contiene este plásmido, se cultiva en fermentador de 7 litros. Se prepara un lisado claro a partir de 200 g de células: el culote celular se recoge en 2 litros de Tris 25 mM, pH 6,8, glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, a los que se añaden 2 litros de NaOH 0,2M, SDS 1%. El lisado se neutraliza por adición de un litro de acetato de potasio 3M. Tras diafiltración se depositan 4 ml de este lisado sobre una columna HiTrap-NHS de 5 ml, copulada con el oligonucleótido de secuencia
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'
(SEQ ID Nº
1),\cr}
según el método descrito en el ejemplo 1.1. El lavado y la elusión se hacen como se ha descrito en el ejemplo 1. Se recuperan, aproximadamente, 400 microgramos de plásmido. El grado de ADN genómico en esta muestra, medido por la técnica descrita en el ejemplo 2.2, es del 0,1%.
Ejemplo 5 Utilización de un oligonucleótido modificado
Este ejemplo describe la utilización de un oligonucleótido que porta citosinas metiladas.
La secuencia del oligonucleótido utilizada es la siguiente:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5'-
GAGG ^{Me} CTT ^{Me} CTT ^{Me} CTT ^{Me} CTT ^{Me} CTT ^{Me} CTT ^{Me} CTT-3'
 (SEQ ID Nº
12)\cr}
Este oligonucleótido tiene un agrupamiento NH_{2} en 5'. ^{Me}C = 5 metilcitosina. Este oligonucleótido permite purificar el plásmido pXL2563 en las condiciones del ejemplo 1, con un tampón de fijación de pH 5 (de este modo se disminuye el riesgo de degradación del plásmido).
Ejemplo 6
En los ejemplos anteriores, el oligonucleótido utilizado está modificado en la extremidad 5'-terminal con un agrupamiento amina enlazado con el fosfato a través de un brazo que contiene 6 átomos de carbono: NH_{2}-(CH_{2})_{6}. En este ejemplo, el agrupamiento amina está enlazado con el fosfato de la extremidad 5'-terminal a través de un brazo con 12 átomos de carbono: NH_{2}-(CH_{2})_{12}. La copulacion del oligonucleótido y el paso a través de la columna se hacen como se ha indicado en el ejemplo 2 con un tampón F: NaCl 2M, acetato 0,2 M, pH 4,5. Este oligonucleótido permite tener un mejor rendimiento de purificación: se obtiene un rendimiento del 53%, mientras que, con el oligonucleótido con 6 átomos de carbono, en las mismas condiciones, este rendimiento es del orden del 45%.
Ejemplo 7
Siguiendo la estrategia de clonación descrita en el ejemplo 1.2, se han construido otros dos plásmidos que portan secuencias homopúricas- homopirimídicas: el plásmido pXL2725, que contiene la secuencia (GGA)_{15} y el plásmido pXL2726, que contiene la secuencia (GA)_{25}.
Ejemplo 7.1 Construcción de los plásmidos
Los plásmidos pXL2725 y pXL2726, análogos al plásmido pXL2563, se han construido según la estrategia para la clonación descrita en el ejemplo 1.2, utilizando los pares de oligonucleótidos siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5986: \+
5'-GATCC(GA) _{25} GGG-3'(SEQ
ID Nº 13).\cr  5987: \+
5'-AATTCCC(TC) _{25} G-3'(SEQ
ID Nº 14).\cr  5981: \+
5'-GATCC(GGA) _{17} GG-3'(SEQ
ID Nº 15).\cr  5982: \+
5'-AATT(CCT) _{17} CCG-3'(SEQ
ID Nº
16).\cr}
El par de oligonucleótidos 5986 y 5987 ha sido utilizado para construir el plásmido pXL2726 por clonación de los oligonucleótidos en los sitios BamHI y EcoRI de pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA),mientras que los oligonucleótidos 5981 y 5982 han sido utilizados para la construcción del plásmido pXL2725. Se han utilizado las mismas condiciones experimentales que para la construcción del plásmido pXL2563 y únicamente se han cambiado los pares de oligonucleótidos. Igualmente, las secuencias clonadas han sido verificadas por secuenciado sobre los plásmidos. Esto ha permitido ver que el plásmido pXL2725 tiene una modificación con relación a la secuencia esperada, en lugar de la secuencia GGA repetida 17 veces, está presente la GGAGA(GGA)_{15}(SEQ ID Nº 17).
Ejemplo 7.2 Preparación de las columnas y purificación.
Los oligonucleótidos, que forman las triples hélices con sus secuencias homopúricas, se han copulado con columnas HiTrap según la técnica descrita en el ejemplo 1.1. Se trata del oligonucleótido de secuencia
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3'(SEQ
ID Nº
18)\cr}
para la purificación del plásmido pXL2725, y del oligonucleótido de secuencia
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3'(SEQ
ID Nº
19)\cr}
para la purificación del plásmido pXL2726.
Las dos columnas, obtenidas de este modo, han permitido purificar los plásmidos correspondientes según la técnica descrita en el ejemplo 2, con los tampones siguientes:
Tampón F: NaCl 2M, acetato 0,2M, pH 4,5.
Tampón E: Tris 1M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
Los rendimientos obtenidos son del 23% y del 31% para pXL2725 y pXL2726, respectivamente.
Ejemplo 8
Este ejemplo ilustra la influencia de la longitud de la secuencia específica, presente en el plásmido, sobre los rendimientos de purificación.
Ejemplo 8.1 Construcción de los plásmidos
El gen indicador, utilizado en estas experiencias, para poner en evidencia la actividad de las composiciones de la invención, es el gen que codifica la luciferasa (Luc).
El plásmido pXL2621 comprende una caja, que contiene el promotor del citomegalovirus (CMV) de 661 bp extraído de pcDNA3 (Invitrogen, Corp., San Diego, CA) por corte con los enzimas de restricción Mlul y Hindlll, clonada aguas arriba del gen que codifica la luciferasa, en los sitios Mlul y Hindlll, en el vector pGL basic Vector (Promega Corp., Madisson, WI). Este plásmido ha sido construido utilizando las técnicas establecidas de biología molecular.
Los plásmidos pXL2727-1 y pXL2727-2 han sido construidos de la manera siguiente:
Se han linealizado dos microgramos del plásmido pXL2621 con BamHl; el enzima ha sido inactivado mediante un tratamiento de 10 minutos a 65ºC; paralelamente, los oligonucleótidos 6006 y 6008 han sido hibridados como se ha descrito para la construcción del plásmido pXL2563.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 6006
5'-GATCT(GAA) _{17} CTGCAGATCT-3'(SEQ
ID  Nº 20)\cr  6008
5'-GATCAGATCTGCAG(TTC) _{17} A-3'(SEQ
ID Nº
21).\cr}
Esta mezcla de hibridación ha sido clonada en las extremidades BamHI del plásmido pXL2621 y, después de la transformación en DH5_{\alpha} de los clones recombinantes, se han marcado por análisis mediante restricción enzimática por Pstl puesto que los oligonucleótidos introducen un sitio Pstl. Se han retenido dos clones y la secuencia nucleotídica del fragmento clonado ha sido verificada utilizando el iniciador (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3'(SEQ ID Nº 22)) como comienzo de reacción de secuencia (Viera J. and J. Messing, 1982, The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19:259-268).
El primero clona (pXL2727-1), que contiene la secuencia GAA repetida 10 veces. El segundo (pXL2727-2) contiene la secuencia 5'- GAAGAAGAG(GAA)_{7}GGAAGAGAA-3'(SEQ ID Nº 23).
Ejemplo 8.2 Preparación de las columnas y purificación
Se utiliza una columna tal como la que se ha descrito en el ejemplo 1 y que está copulada con el oligonucleótido
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(SEQ
ID Nº
1).\cr}
El plásmido pXL2727-1 porta 14 repeticiones de la secuencia GAA. El oligonucleótido anteriormente descrito, que no contiene mas que 7 repeticiones de la secuencia de hibridación correspondiente CTT, puede hibridarse, por lo tanto, con el plásmido en 8 posiciones diferentes. El plásmido pXL2727-2, por el contrario, tiene una sola secuencia hibridante (GAA)_{7} de la misma longitud que la del oligonucleótido fijado sobre la columna. Por lo tanto, este oligonucleótido no puede hibridarse mas que en una sola posición sobre el pXL2727-2.
La experiencia es idéntica a la que se ha descrito en el ejemplo 2 con los tampones siguientes:
Tampón F: NaCl 2M, acetato 0,2M, pH 4,5.
Tampón E: Tris 1M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
El rendimiento de purificación es del 29% con el plásmido pXL2727-1 y del 19% con el pXL2727-2.
Ejemplo 8.3 Transfección in vitro de células de mamíferos
Las células utilizadas son células NIH 3T3, sembradas la víspera de la experiencia en placas de cultivo con 24 pocillos, a razón de 50.000 células/pocillo. El plásmido está diluido en 150 mM y mezclado con el lipofectante RPR115335. Se utiliza una relación de cargas positivas del lipofectante/cargas negativas del ADN igual a 6. La mezcla se arremolina, se deja 10 minutos a temperatura ambiente, se diluye en medio desprovisto de suero de vaca fetal, a continuación se añaden a las células, a razón de 1 \mug de ADN por pocillo de cultivo. Al cabo de 2 horas a 37ºC, se añade suero de vaca fetal al 10% volumen en volumen y las células se incuban durante 4 horas a 37ºC en presencia de un 5% de CO_{2}. Las células se lavan dos veces con PBS y se mide la actividad luciferasa según el protocolo descrito (estuche Promega, Promega Corp. Madison, WI), sobre un luminómetro Lumat LB9501 (EG et G Berthold, Evry). El plásmido pXL2727-1, purificado, tal como se ha descrito en el ejemplo 8.2, da rendimientos de transfección dos veces mayores que los se obtienen con el mismo plásmido purificado por medio del estuche Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI).
(1) Informaciones generales:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Depositante:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre: Rhone Poulenc Rorer
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Calle: 20 Avenue Raymond Aron
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Ciudad: Antony Cedex
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
País: Francia
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
Código postal: 92165
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
Teléfono: 40.91.69.22
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
Telefax: 40.91.72.91
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Título de la invención: purificación de ADN por formación de triple hélice con un oligonucleótido inmobilizado
\vskip0.333000\baselineskip
(iii)
Número de secuencias:25
\vskip0.333000\baselineskip
(iv)
Forma leible por ordenador:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Tipo de soporte: cinta
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Ordenador: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Sistema de trabajo: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Programa: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 1:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 1:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 
\hfill
25 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 2:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 19 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNC
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 2:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 
\hfill
19 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 3:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 3:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 
\hfill
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 4:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 13 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 4:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAAAAAGGAA GAG 
\hfill
13 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 5:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 19 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 5:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 
\hfill
19 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 6:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 19 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de moléculas: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 6:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 
\hfill
19 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 7:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 19 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 7:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 
\hfill
19 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 8:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 17 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 8:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AAAAAAGGGA ATAAGGG 
\hfill
17 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 9:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 58 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molècula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 9:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG 
\hfill
58 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 10:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 58 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 10:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG 
\hfill
58 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 11:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 17 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 11:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGACCGGCAG CAAAATG 
\hfill
17 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 12:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 17 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(ix)
Característica:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Otra información: todas las citosinas C de la secuencia están metiladas
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 12:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 
\hfill
25 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 13:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 58 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 13:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCCGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGGG 
\hfill
58 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 14:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 58 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 14:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCG 
\hfill
58 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) informaciones para la Seq Id Nº: 15:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 58 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 15:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGG 
\hfill
58 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 16:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 58 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 16:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCG 
\hfill
58 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 17:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 17:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGAGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA 
\hfill
50 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 18:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 18:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATGCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCT 
\hfill
25 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 19:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 19:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AGTGCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCT 
\hfill
26 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 20:
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 20:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAACTGC 
\hfill
60 
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AGATCT 
\hfill
66 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 21
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 21:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT 
\hfill
60 
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCTTCA 
\hfill
66 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 22
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 22:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G 
\hfill
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 23
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 23:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA 
\hfill
39 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 27 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 24:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 
\hfill
27 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Informaciones para la Seq Id Nº: 25
\vskip0.333000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Longitud: 27 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Número de hebras: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Configuración: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.333000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Seq Id Nº: 25:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT 
\hfill
27

Claims (30)

1. Procedimiento para la preparación de un medicamento a base de ADN de doble hebra circular, caracterizado porque comprende, al menos, una etapa de purificación en la que se hace pasar una solución que contiene dicho ADN, en mezcla con otros componentes, sobre un soporte de cromatografía, sobre el que está copulado, de manera covalente, un oligonucleótido capaz de formar, por hibridación, una triple hélice con una secuencia específica homopúrica/homopirimí-dica presente sobre dicho ADN.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución, que contiene dicho ADN, es un lisado celular.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el lisado celular es un lisado claro.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN de doble hebra está prepurificado.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia específica ha sido introducida artificialmente en el ADN de doble hebra.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido comprende una secuencia poli-CTT y la secuencia específica, presente en el ADN es una secuencia poli-GAA.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido tiene la secuencia GAGGCTT CTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID Nº 1).
8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido tiene la secuencia (CTT)_{7} (SEQ ID Nº 26).
9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la secuencia específica presente sobre el ADN comprende la secuencia (GAA)_{7}, (GAA)_{14} o (GAA)_{17}.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia específica, presente sobre el ADN, comprende la secuencia SEQ ID Nº 5 y el oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID Nº 6 o SEQ ID Nº 7.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia específica, presente sobre el ADN, comprende la secuencia SEQ ID Nº 17 y el oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID Nº 18.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia específica, presente sobre el ADN, comprende la secuencia (GA)_{25} y el oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID Nº 19.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia específica es una secuencia específica presente de manera natural sobre el ADN de doble hebra.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia específica presente de manera natural sobre el ADN es una secuencia homopúrica-homopirimídica presente en el origen de replicación de un plásmido.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de ADN específica comprende la totalidad o una parte de la secuencia SEQ ID Nº 2 comprendida en el origen de replicación ColE1 de E. coli.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID Nº 3.
17. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de ADN específica comprende la totalidad o una parte de la secuencia SEQ ID Nº 4 o de la secuencia SEQ ID Nº 8, comprendidas en el gen \beta- lactamasa del plásmido pBR322.
18. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el oligonucleótido está copulado con el soporte de cromatografía por enlace disulfuro, tioéter, éster, amida o amina.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el oligonucleótido está copulado con el soporte de cromatografía por intermedio de un brazo compuesto por una cadena carbonada (CH_{2})_{n} en la que n es un número entero comprendido entre 1 y 18 inclusive, estando conectado dicho brazo con el oligonucleótido por un fosfato y con la columna a través de un enlace amida.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque el brazo está compuesto por una cadena carbonada lineal que comprende 6 átomos de carbono.
21. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque el brazo está compuesto por una cadena carbonada lineal que comprende 12 átomos de carbono.
22. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el oligonucleótido presenta, al menos, una modificación química que le hace resistente o que le protege frente a las nucleasas, o que aumenta su afinidad para la secuencia específica.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque el oligonucleótido comprende una secuencia homopirimídica, en la que está metilada al menos una de las citosinas.
24. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ADN comprende, además, una o varias secuencias de interés terapéutico.
25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ADN de doble hebra es un ADN circular, tal como un plásmido.
26. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia específica presente sobre el ADN de doble hebra comprende varias posiciones de hibridación con el oligonucleótido.
27. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el medicamento tiene un contenido en ADN cromosómico menor o igual que el 0,5%.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque el medicamento tiene un contenido en ADN cromosómico menor o igual que el 0,2%.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, caracterizado porque el medicamento tiene un contenido en ADN cromosómico menor o igual que el 0,1%.
30. Procedimiento para la purificación de ADN plasmídico caracterizado porque comprende, al menos, una etapa en la que se hace pasar una solución, que contiene dicho ADN, en mezcla con otros componentes, sobre un soporte de cromatografía, sobre el cual se ha copulado de manera covalente un oligonucleótido capaz de formar por hibridación una triple hélice con una secuencia específica homopúrica/homopirimídica presente sobre dicho ADN.
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