FI120836B

FI120836B - Kolmoiskierremuodosteen puhdistus immobilisoidulla oligonukleotidilla

Info

Publication number: FI120836B
Application number: FI972526A
Authority: FI
Inventors: Joel Crouzet; Daniel Scherman; Pierre Wils
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2010-03-31
Also published as: NO972710D0; CN100591776C; PT797682E; CY1110372T1; AU4178996A; JP2009045070A; NO972710L; SK51042008A3; EP1281774B1; EP1281774A2; SK75697A3; ZA9510756B; CA2208245C; MX9703670A; DE69529842T2; WO1996018744A2; PL320697A1; SK286956B6; UA72421C2; EP0797682B1

Description

Kolmoiskierremuodosteen puhdistus immobilisoidulla oligo-nukleotidilla

Esillä olevan keksinnön kohteena on uusi menetelmä 5 DNA:n puhdistamiseksi. Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan puhdistaa nopeasti farmakologisesti käyttökelpoista kaksijuosteista DNA:ta. Erityisemmin keksinnön mukaisessa puhdistusmenetelmässä käytetään hyväksi DNA-sekvenssin ja erään oligonukleotidin välistä spesifistä hybridi-10 säätiötä.

Geeni- ja soluterapiaan liittyvissä tekniikoissa tapahtuu tällä hetkellä valtavaa kehitystä. Näiden tekniikoiden edellytyksenä on kuitenkin, että kyetään tuottamaan suuria määriä farmaseuttisesti puhdasta DNA:ta. Näissä 15 uusissa hoitomuodoissa lääkkeenä käytetään usein itse DNA:ta ja olennaista on kyetä valmistamaan sitä sopivina määrinä, eristämään ja puhdistamaan se asianmukaisella tavalla ajatellen sen käyttöä ihmiseen kohdistetuissa hoi-tosovellutuksissa.

20 Esillä olevassa keksinnössä kuvataan uusi, yksin kertainen ja erityisen tehokas menetelmä DNA:n puhdistamiseksi. Tällä menetelmällä päästään etenkin erityisen suuriin puhtauksiin ja suuriin saantoihin.

Keksinnön mukainen menetelmä perustuu olennaisesti 25 puhdistettavaan DNA:hän istutetun sekvenssin ja erään, luonnollisista tai muokatuista emäksistä koostuvan oligonukleotidin väliseen spesifiseen vuorovaikutukseen.

Alalla on osoitettu jokin aika sitten, että tietyillä oligonukleotideillä on spesifistä vuorovaikutusta 30 DNA-kaksoiskierteen suuressa urassa siten, että syntyy paikallisia kolmoiskierteitä, jotka johtavat kyseisten geenien kopioitumisen estymiseen [Helene ja Toulme, Bio-chim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99]. Nämä oligonukleotidit tunnistavat selektiivisesti DNA-kaksoiskierteen oligopu-35 riini.oligopyrimidiini-sekvenssien kohdalta, eli niissä 2 alueissa, joissa yksi juoste käsittää oiigopuriinisekvenssin ja sitä täydentävä vastinjuoste käsittää oligopyrimi-diinisekvenssin, ja ne muodostavat tässä alueessa paikallisesti kolmoiskierteen. Tämän kolmannen juosteen (oligo-5 nukleotidin) emäkset muodostavat vetysidoksia (Hoogsteen-sidoksia tai käänteisiä Hoogsteen-sidoksia) Watson-Crick-emäsparien puriinien kanssa.

Tämäntyyppisen vuorovaikutuksen hyväksikäyttö plas-midin eristämiseksi on kuvattu jo alalla. Niinpä julkai-10 sussa Ito et ai., PNAS 89 (1992), 495, on kuvattu sellaisten biotinyloitujen oligonukleotidien käyttö, jotka oligo-nukleotidit kykenevät tunnistamaan plasmidista määrätyn sekvenssin ja muodostamaan sen kanssa kolmoiskierteen. Täten muodostuneet kompleksit saatetaan sitten kosketuk-15 seen streptavidiinilla pinnoitettujen magneettikuulien kanssa. Sitten tämä plasmidi voidaan eristää biotiinin ja streptavidiinin välisen vuorovaikutuksen avulla erottamalla kuulat magneettisesti ja eluoimalla. Tähän menetelmään liittyy kuitenkin tiettyjä haittoja. Erityisesti siinä 20 tarvitaan kahdenlaisia spesifisiä peräkkäisiä vuorovaiku tuksia, ensin oligonukleotidin ja plasmidin välillä ja sitten biotinyloidun kompleksin ja streptavidiinikuulien välillä. Edelleen lopullinen liuos voi olla kontaminoitunut biotinyloidulla oligonukleotidillä, jota ei voida 25 käyttää farmaseuttisessa koostumuksessa.

Esillä olevassa keksinnössä kuvataan uusi parannettu menetelmä DNA:n puhdistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään hyväksi tämäntyyppistä vuorovaikutusta. Erityisemmin keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään kanta-30 jaan kovalenttisesti sidottuja oligonukleotideja. Tämä menetelmä on erityisen nopea ja sillä päästään erityisen suuriin saantoihin ja erityisen suuriin puhtauksiin. Lisäksi sen avulla voidaan puhdistaa DNA:ta monimutkaisista seoksista, jotka käsittävät erityisesti muita nukleiini-35 happoja, proteiineja, endotoksiineja (kuten lipopolysakka- 3 rideja), nukleaaseja ja muita vastaavia. Käytettyjä kantajia voidaan lisäksi kierrättää helposti ja saatujen DNA: molekyylien farmaseuttiseen turvallisuuteen liittyvät ominaisuudet ovat parantuneet. Lisäksi tässä menetelmässä 5 tarvitaan vain yksi vaihe, toisin kuin tekniikan nykytason mukaisissa menetelmissä.

Näin ollen esillä olevan keksinnön ensimmäisenä kohteena on menetelmä kaksijuosteisen DNA:n puhdistamiseksi, jossa menetelmässä liuos, joka sisältää mainittua 10 DNA:ta sekoittuneena muihin komponentteihin, johdetaan kantajan läpi, johon kantajaan on sidottu kovalenttisesti sellainen oligonukleotidi, joka kykenee muodostamaan hyb-ridisaation avulla kolmoiskierteen mainitussa DNA:ssa läsnä olevan erityisen sekvenssin kanssa. Tämä erityinen sek-15 venssi voi olla tässä kaksijuosteisessa DNA:ssa luontaisesti läsnä oleva sekvenssi tai siihen keinotekoisesti liitetty synteettinen sekvenssi.

Esillä olevassa keksinnössä käytetyt oligonukleoti-dit ovat sellaisia oligonukleotideja, jotka hybridisoitu-20 vat suoraan tämän kaksijuosteisen DNA:n kanssa. Nämä oligonukleotidi t voivat sisältää seuraavia emäksiä: - tymidiiniä (T), joka kykenee muodostamaan trip-lettejä kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä olevien dublettien A.T kanssa [Rajagopal et ai., Biochem. 28 (1989) 7859]; 25 - adeniinia (A) , joka kykenee muodostamaan triplet- tejä kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä olevien dublettien A.T kanssa; - guaniinia (G) , joka kykenee muodostamaan triplet-tejä kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä olevien dublettien 30 G.C kanssa; - protonoitua sytosiinia (C+), joka kykenee muodostamaan triplettejä kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä olevien dublettien G.C kanssa (Rajagopal et ai., mainittu edellä) ,- - urasiilia (U), joka kykenee muodostamaan triplet- 35 tejä emäsparien A.U tai A.T kanssa.

4

Edullista on se, että käytetyllä oligonukleotidilla on runsaasti sytosiinejä sisältävä homopyrimidiinisekvenssi ja että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi on ho-mopuriini-homopyrimidiini-sekvenssi. Sytosiinien läsnäolon 5 ansiosta saadaan aikaan kolmoiskierre, joka on pysyvä hap-pamissa pH-arvoissa, jolloin sytosiinit ovat protonoitu-neet, ja pysymätön aikalisissä pH-arvoissa, jolloin sytosiinit ovat neutraloituneet.

Kolmoiskierteen muodostumiselle hybridisaation seulo rauksena tärkeää on se, että oligonukleotidi ja DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi ovat toisiaan täydentäviä vastinsekvenssejä ("komplementtisekvenssejä"). Niinpä mahdollisimman suuriin saantoihin ja hyvään selektii-visyyteen pääsemiseksi keksinnön mukaisessa menetelmässä 15 käytetään oligonukleotidia ja erityistä sekvenssiä, jotka ovat toisiaan täydellisesti vastaavia komplementteja. Kysymyksessä voi olla erityisesti oligonukleotidina poly-CTT ja erityisenä sekvenssinä poly-GAA. Eräänä esimerkkinä voidaan mainita oligonukleotidi, jolla on sekvenssi 20 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' [GAGG(CTT)7] (sekvenssi nro 1) , jossa emäkset GAGG eivät muodosta kolmoiskierrettä, vaan joiden avulla oligonukleotidi saadaan kauemmaksi si-doshaarasta; samoin voidaan mainita sekvenssi (CTT)7 (sekvenssi nro 26). Nämä oligonukleotidit kykenevät muodosta-25 maan kolmoiskierteen komplementtiryhmiä (GAA) käsittävän erityisen sekvenssin kanssa. Kysymyksessä voi olla erityisesti alue, joka käsittää 7, 14 tai 17 GAA-ryhmää, kuten esimerkeissä on kuvattu.

Eräs toinen mielenkiintoinen erityinen sekvenssi on 30 seuraava: 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (sekvenssi nro 5) Tämä sekvenssi muodostaa kolmoiskierteen oligonuk-leotidin 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (sekvenssi nro 6) tai 35 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (sekvenssi nro 7) kanssa.

5 Tässä tapauksessa oligonukleotidi kiinnittyy vasta-suuntaisesti suuntautuneena polypuriinijuosteeseen. Nämä kolmoisjuosteet eivät ole pysyviä kuin ionien Mg2+ läsnä ollessa (Vasques et ai., Biochemistry, 1995, 34, 7243 - 5 7251; Beal et Dervan, Science, 1991, 251, 1360 - 1363).

Kuten edellä on esitetty, erityinen sekvenssi voi olla DNA-kaksoisjuosteessa luontaisesti läsnä oleva sekvenssi, tai siihen keinotekoisesti istutettu synteettinen sekvenssi. Erityisen mielenkiintoista on käyttää sellais-10 ta oligonukleotidia, joka kykenee muodostamaan kolmois-kierteen DNA-kaksoisjuosteessa, esimerkiksi plasmidin rep-likaation alkamiskohdassa tai merkkigeenissä luontaisesti läsnä olevan sekvenssin kanssa. Tätä silmällä pitäen hakija on analysoinut plasmidien sekvenssejä ja hän on 15 kyennyt osoittamaan, että näiden DNA-molekyylien tietyissä alueissa, erityisesti replikaation alkamiskohdassa, voi esiintyä homopuriini-homopyrimidiini-alueita. Syntetisoimalla sellaisia oligonukleotideja, jotka kykenevät muodostamaan kolmoiskierteitä luonnollisten homopuriini-20 homopyrimidiini-alueiden kanssa, keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa edullisesti muokkaamattomiin plasmideihin, erityisesti tyyppiä pUC, pBR322, pSV jne., oleviin kaupallisiin plasmideihin. Näistä DNA-kaksoisjuosteessa luontaisesti läsnä olevista homopuriini-homo-25 pyrimidiini-sekvensseistä voidaan mainita sekvenssi, joka käsittää kokonaisuudessaan tai osittain sekvenssin 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (sekvenss i nro 2) , j oka esiintyy E. colin replikaation alkamiskohdassa ColEl. Tässä tapauksessa kolmoiskierteen muodostavalla oligonukleotidilla on 30 sekvenssi: 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (sekvenssi nro 3) ja se kiinnittyy vaihtoehtoisesti kaksoisjuosteen jompaankumpaan kahteen juosteeseen, kuten Beal ja Dervan ovat kuvanneet (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976 - 4982), samoin kuin Jayasena et Johnston (Nucleic Acids Res., 1992, 20, 35 5279 - 5288) . Samoin voidaan mainita plasmidin pBR322 β- 6 laktamaasin geenin sekvenssi 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (sekvenssi nro 4) (Duval-Valentin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA, 1992, 89, 504 - 508). Sellaisen oligonukleotidin, joka kykenee muodostamaan kolmoiskierteen merkkigeenin 5 replikaation alkamiskohdassa läsnä olevan sekvenssin kanssa, käyttö on erityisen edullista, koska tällöin tämän saman oligonukleotidin avulla voidaan puhdistaa kaikki sellainen DNA, joka sisältää tällaisen replikaation alkamiskohdan tai mainitun merkkigeenin. Tällöin ei ole siis 10 välttämätöntä muokata tätä plasmidia tai DNA-kaksoisjuos-tetta istuttamalla siihen erityinen keinotekoinen sekvenssi.

Vaikka edullisia ovatkin toisiaan täydellisesti vastaavat komplementtisekvenssit, niin kuitenkin selvää 15 on, että tiettyjä oligonukleotidin ja DNA:ssa läsnä olevan sekvenssin välisiä yhteensopimattomuuksia voidaan sietää, kunhan ne vain eivät johda affiniteetin liian suureen häviöön. Esimerkkinä voidaan mainita E. colin β-laktamaasin geenissä läsnä oleva sekevnssi 5'-ÄAAAAAGGGAATAAGGG-3' 2 0 (sekvenssi nro 8) . Tässä tapauksessa kolmannen juosteen guaniini voi tunnistaa tämän polypuriinisekvenssin katkaisevan tymiinin, jolloin muodostuu siis tripletti ATG, joka on pysyvä, kun sitä reunustaa kaksi TAT-triplettiä (Kiess-ling et ai., Biochemistry, 1992, 31, 2829 - 2834).

25 Erään erityisen suoritusmuodon mukaan keksinnön mu kaiset oligonukleotidit käsittävät sekvenssin (CCT)nf sekvenssin (CT)n tai sekvenssin (CTT)n, missä n on alueella 1-15, rajat mukaan lukien, oleva kokonaisluku. Erityisen edullista on käyttää tyyppiä (CT)n tai (CTT)n olevia sek-30 venssejä. Hakija on osoittanut, että oligonukleotidissä läsnä oleva C-määrä vaikuttaa puhdistuksen saantoon. Erityisesti, kuten esimerkissä 7 on esitetty, puhdistuksen saanto kasvaa mitä vähemmän oligonukleotidissä on sytosii-nejä. On selvää, että keksinnön mukaisissa oligonukleoti-35 deissa voidaan myös yhdistää ryhmiä (CCT), (CT) tai (CTT).

: 7 Käytetty oligonukleotidi voi olla luonnollinen (joka koostuu luonnollisista, muokkautumattomista emäksistä) tai sitä on voitu muokata kemiallisesti. Erityisesti tässä oligonukleotidissa voi olla läsnä edullisesti tiettyjä ke-5 miallisia muokkauksia, jotka parantavat sen kykyä kestää nukleaaseja tai suojautumista niitä vastaan, tai parantavat sen affiniteettia erityisen sekvenssin suhteen.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti oligonukleoti-dilla tarkoitetaan myös kaikkia sellaisia nukleosidiketju-10 ja, joiden runkoa on muokattu siksi, että ne saadaan kestämään paremmin nukleaaseja. Mahdollisista muokkauksista voidaan mainita fosforotioaattioligonukleotidit, jotka kykenevät muodostamaan kolmoiskierteitä DNA:n kanssa (Xodo et ai., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322 - 3330), samoin 15 kuin formasetaali- tai metyylifosfonaattirungon käsittävät oligonukleotidit (Matteucci et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1991, 113, 7767 - 7768). Samoin voidaan käyttää oligonuk-leotideja, jotka on syntetisoitu nukleotidien a-anomeereja käyttäen, ja jotka muodostavat samoin kolmoiskierteitä 20 DNA:n kanssa (Le Doan et ai., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749 - 7760). Eräs muu rungon muokkaus on fosforami- daattisidos. Esimerkkinä voidaan mainita esimerkiksi Gryaznovin ja Ohenin kuvaama nukleotidien välinen fosfor-amidaattisidos N3'-P5', joiden avulla aikaan saadut oligo-25 nukleotidit muodostavat DNA:n kanssa erityisen pysyviä kolmoiskierteitä (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143 - 3144). Rungon muista muokkauksista voidaan mainita samoin ribonukleotidien, 2'-O-metyyliriboosin, fosfodiesterin ja muiden vastaavien käyttö (Sun ja Helene, Curr. Opinion 30 Struct. Biol., 116, 3143 - 3144). Fosforoitu runko voidaan lopulta korvata polyamidirungolla, kuten asianlaita on PNArssa (peptidinukleiinihappo), joka voi myös muodostaa kolmoiskierteitä [Nielsen et ai., Science, 1991, 254, 1497 - 1500; Kim et ai., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 35 6477 - 6481)] tai guanidiiniin perustuvalla rungolla, ku- 8 ten asianlaita on DNG-molekyyleissä (deoksiribonukleiini-guanidiini; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097 - 6101), jotka ovat myös kolmoiskierteitä muodostavia poly-kationisia DNA-analogeja.

5 Kolmannen juosteen tymidiini voidaan korvata myös 5-bromiurasiililla, mikä parantaa oligonukleotidin affiniteettia DNA:n suhteen (Povsic et Derven, J. Am. Che. Soc., 1989, 111, 3059 - 3061). Tämä kolmas juoste voi myös sisältää epäluonnollisia emäksiä, joista voidaan mainita 10 7-deatsa-2'-deoksiksantosiini (Milligan et ai., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327 - 333), 1-(2-deoksi-E-D-ribofu-ranosyyli) -3-metyyli-5-amino-lH-pyratsolo [4,3-d] -pyrimi-diini-7-oni (Koh ja Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470 - 1478), 8-oksoadeniini, 2-aminopuriini, 2'-0-metyy-15 li-pseudoisosytidiini tai mikä tahansa muu, alan asiantuntijalle tuttu muokkaus (yleiskatsaus esitetty julkaisussa Sun ja Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345 -356) .

Erään toista tyyppiä olevan oligonukleotidimuok-20 kauksen tavoitteena on erityisemmin parantaa oligonukleotidin ja erityisen sekvenssin välistä vuorovaikutusta ja/ tai affiiniteettia. Erityisesti eräässä keksinnön mukaisessa, hyvin edullisessa muokkauksessa oligonukleotidin sytosiinit metyloidaan (vrt. esimerkki 5). Täten metyloi-25 dulla oligonukleotidilla on se hyvin huomattava ominaisuus, että se muodostaa pysyvän kolmoiskierteen erityisen sekvenssin kanssa lähes neutraaleissa pH-arvoissa (>5) . Sen avulla voidaan siis työskennellä suuremmissa pH-ar-voissa kuin tekniikan nykytason mukaisilla oligonukleo-30 tideilla, toisin sanoen sellaisissa pH-arvoissa, joissa plasmidi-DNA:n hajoamisen vaara on paljon pienempi.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyn oligonukleotidin pituus on vähintään 3 emästä ja edullisesti 5-30 emästä. Edullisesti käytetään oligonukleotidia, jo-35 ka on pitempi kuin 10 emästä. Alan asiantuntija voi muut- 9 taa tätä pituutta tapauskohtaisesti vuorovaikutuksen tavoitellusta selektiivisyydestä ja pysyvyydestä riippuen.

Keksinnön mukaiset oligonukleotidit voidaan syntetisoida millä tahansa tunnetulla tekniikalla. Ne voidaan 5 erityisesti valmistaa nukleiinihapposyntetisaattoreilla. Myös mitä tahansa muuta, alan asiantuntijalle käyttökelpoista menetelmää voidaan käyttää.

Oligonukleotidi muutetaan yleensä funktionaaliseen muotoon sen kovalenttiseksi kytkemiseksi kantajaan. Niinpä 10 sitä voidaan muokata päättävällä, joko 5'- tai 3'-aseman tioli-, amiini- tai karboksyyliryhmällä. Erityisesti esimerkiksi tioli-, amiini- tai karboksyyliryhmän lisääminen tekee mahdolliseksi oligonukleotidin kytkemisen kantajaan, jossa on funktionaalinen disulfidi-, maleimidi-, amiini-, 15 karboksyyli-, esteri-, epoksidi-, syaanigeenibromidi- tai aldehydiryhmä. Nämä sidokset muodostuvat, kun oligonukleotidin ja kantajan välille syntyy disulfidi-, tioesteri-, esteri-, amidi- tai amiinisidos. Käyttökelpoinen on myös mikä tahansa muu, alan asiantuntijalle tuttu menetelmä, 20 kuten esimerkiksi bifunktionaalisiin sidosreagensseihin perustuva menetelmä.

Lisäksi kytketyn oligonukleotidin kanssa tapahtuvan hybridisaation parantamiseksi saattaa olla edullista, että oligonukleotidi käsittää "sivuhaaran" sekä "väliemäs"-sek-25 venssin. Sivuhaaran käyttö tekee mahdolliseksi oligonukleotidin kiinnittämisen valitulle etäisyydelle kantajasta, mikä parantaa niitä olosuhteita, joissa vuorovaikutus DNA:n kanssa tapahtuu. Tämä sivuhaara muodostuu edullisesti suorasta hiiliketjusta, joka käsittää 1-18, edulli-30 sesti 6 tai 12 CH2-ryhmää, sekä amiinista, joka tekee mahdolliseksi kytkeytymisen pylvääseen. Tämä sivuhaara liittyy oligonukleotidin fosfaattiin tai "väliryhmään", joka koostuu sellaisista emäksistä, jotka eivät häiritse hybridisaatiota. Niinpä tämä "väliryhmä" voi käsittää puriini-35 emäksiä. "Väliryhmä" voi käsittää esimerkiksi sekvenssin 10 GAGG. Sivuhaara koostuu edullisesti 6 tai 12 hiiliatomia käsittävästä suorasta hiiliketjusta.

Erityyppisiä kantajia voidaan käyttää esillä olevan keksinnön toteuttamiseksi. Kysymykseen voivat tulla toi-5 minnalliseen muotoon saatetut kromatografiset kantajat, jotka ovat joko vapaana tai jotka ovat edeltä käsin vakioidussa muodossa pylväässä, funktionaaliseen muotoon saatetut muovipinnat tai funktionaliseen muotoon saatetut lateksihelmet, jotka voivat olla magneettisia, mikä ei ole 10 kuitenkaan välttämätöntä. Kysymykseen tulevat edullisesti kromatografiset kantajat. Esimerkkeinä käyttökelpoisista kromatografisista kantajista voidaan mainita agaroosi, ak-ryyliamidi tai dekstraani sekä niiden johdannaiset (kuten Sephadex, Sepharose, Superose, ...), sellaiset polymeerit, 15 kuten poly(styreenidivinyylibentseeni) tai oksastettu tai oksastamaton piidioksidi. Kromatografiapylväiden toiminta voi perustua diffuusioon tai perfuusioon.

Erityisen edullisella tavalla, puhdistuksessa parempiin saantoihin pääsemiseksi, plasmidissa käytetään 20 sellaista sekvenssiä, joka käsittää lukuisia oligonukleo-tidin kanssa hybridisoituvia asemia. Lukuisten hybridisaa-tioasemien läsnäolo on todellakin edullista mainitun sekvenssin ja oligonukleotidin välisiä vuorovaikutuksia ajatellen, mikä johtaa puhdistuksen saantojen paranemiseen. 25 Niinpä sellaisen oligonukleotidin, joka käsittää n kertaa toistuvan ryhmän (CCT) , (CT) tai (CTT), tapauksessa on edullista käyttää sellaista DNA-sekvenssiä, joka käsittää vähintään n kappaletta täydentäviä vastinryhmiä ja edullisesti n+1 täydentävää vastinryhmää. Niinpä n+1 täydentävää 30 vastinryhmää käsittävässä sekvenssissä on kaksi sellaista asemaa, johon oligonukleotidi voi hybridisoitua. Edullisessa tapauksessa tämä DNA-sekvenssi käsittää jopa 11 hyb-ridisaatioasemaa, toisin sanoen n+10 täydentävää vastinryhmää .

11

Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää mitä tahansa tyyppiä olevan kaksijuosteisen DNA:n puhdistamiseksi. Kysymyksessä voi olla esimerkiksi rengasmainen DNA, kuten plasmidi, joka käsittää yleensä yhden 5 tai useamman terapeuttisesti mielenkiintoisen geenin. Tämä plasmidi voi käsittää samoin replikaation alkamiskohdan, merkkigeenin, jne... Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa suoraan soluhajotteeseen. Tässä suoritusmuodossa plasmidi, jota on monistettu ensin transformoimalla soluja 10 ja sitten viljelemällä niitä, puhdistetaan suoraan solujen hajottamisen jälkeen. Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa myös kirkkaaseen hajotteeseen, toisin sanoen supernatanttiin, joka on saatu soluhajotteen neutraloinnin ja sentrifugoinnin jälkeen. Tätä menetelmää voidaan luon-15 nollisestikin soveltaa myös liuokseen, joka on puhdistettu edeltäkäsin tunnetuilla menetelmillä. Tämän menetelmän avulla voidaan myös puhdistaa mielenkiinnon kohteena olevan sekvenssin käsittävä lineaarinen tai rengasmainen DNA lähtemällä erilaisten DNA-sekvenssien seoksesta. Keksinnön 20 mukaista menetelmää voidaan samoin käyttää kaksijuosteisen RNA:n puhdistamiseksi.

Soluhajote voi olla prokariootti- tai eukariootti-solujen hajote.

Prokarioottisoluj en tapauksessa esimerkkinä voidaan 25 mainita bakteerit E. coli, B. subtilis, S. typhimurium tai Streptomvces. Eukarioottisolujen tapauksessa voidaan mainita eläinsolut, hiivat, sienet jne. ja erityisemmin hiivat Kluvveromvces tai Saccharomvces tai COS-, CHO-, C127-, NIH3T3-solut ja vastaavat.

30 Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on eri tyisen edullinen, koska sen avulla saadaan nopealla ja yksinkertaisella tavalla hyvin puhdasta plasmidi-DNA:ta. Erityisesti, kuten esimerkeissä on esitetty, tämän menetelmän avulla voidaan erottaa tehokkaasti mielenkiinnon 35 kohteena oleva plasmidi-DNA kontaminoivista komponenteis- 12 ta, kuten kromosomaalisista DNA-kappaleista, endotoksii-neista, proteiineista, nukleaaseista ja muista vastaavista. Erityisemmin keksinnön mukaisen menetelmän avulla voidaan saada kaksijuosteiseen DNA:hän perustuva valmiste, 5 erityisesti plasmidi-DNA-valmiste, jossa kromosomaalisen DNA:n pitoisuus on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,5 %. Vieläkin edullisemmin saaduissa DNA-valmisteissa kromosomaalisen DNA:n pitoisuus on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,2 %. Niinpä esillä olevassa keksinnössä on kuvattu far-10 maseuttisesti, erityisesti geeni- tai soluterapiassa käyt tökelpoiset, plasmidi-DNA:ta sisältävät koostumukset. Näin ollen keksinnön kohteena on myös joko lineaarista tai plasmidista kaksijuosteista DNA:ta käsittävä farmaseuttinen koostumus, joka on valmistettu edellä kuvatulla mene-15 telmällä.

Keksinnön kohteena ovat myös plasmidi-DNA-valmis-teet, joissa kromosomaalisen DNA:n pitoisuus on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,5 %, edullisesti 0,2 % ja edullisemmin 0,1 %.

20 Nämä koostumukset voivat käsittää "paljasta" plas- midi-DNA:ta tai tämä plasmidi-DNA voi olla liittyneenä kuljetinvektoreihin, kuten liposomeihin, nanohiukkasiin, kationisiin lipideihin, polymeereihin, proteiineihin, yh-distelmä-DNA-teknisiin viruksiin tai muihin vastaaviin.

25 Oheinen hakemus kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin seuraavien, keksintöä havainnollistavien, ei kuitenkaan rajoittavien esimerkkien avulla.

Yleisiä kloonaus- ja molekyylibiologisia tekniikoita 30 Perinteisiä molekyylibiologian menetelmiä, kuten pilkkominen restriktioentsyymeillä, elektroforeesi geelillä, transformointi E. coli -bakteeriin, nukleiinihappojen saostus ja muita vastaavia on kuvattu kirjallisuudessa (Maniatis et ai., T., E.F. Fritsch ja J. Sambrook, 1989, 35 Molecular Cloning: a laboratory manual, toinen painos, 13

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F.M., R.Brent, R.E. Kinston, D. D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman ja K. Struhl, 1987,

Current protocols in molecular biology, 1987 - 1988, John 5 Wiley and Sons, New York). Nukleotidisekvenssit on määritetty ketjujen päättymiseen perustuvalla menetelmällä alalla jo kuvatulla tavalla (Ausubel et ai., 1987).

Restriktioentsyym.it on saatu yhtiöstä New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).

10 Ligatointia varten DNA-kappaleita inkuboidaan 59 mM

Tris-HCl-puskurissa, pH 7,4, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, T4-faagin DNA-ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa.

Oligonukleotidit syntetisoidaan käyttäen β-asemas-taan syaanietyyliryhmällä suojattuihin fosforamidiitteihin 15 perustuvaa kemiaa (Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus ja H. Köster, 1984, Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino/N-morpho-lino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of 20 the final product (Polymeerin kannattama oligonukleotidi-synteesi, XVIII: deoksinukleosidien β-syaanietyyli-N,N-di-alkyyliamino/N-morfolino-fosforamidiitin käyttö DNA-kappa-leiden syntetitoimiseksi, joka käyttö helpottaa suojaavien ryhmien poistamista lopputuotteesta ja tuotteen eristämis-25 tä). Nucl. Acids Res., 12, 4539 - 4557; Giles, J.W. 1985.

Advances in automated DNA-synthesis. Am. Biotechnol.,

Nov./Dec.) automaattisella DNA-syntetisaattorilla Biosearch 8600, valmistajan suositusten mukaisesti.

Ligatoitujen DNA-molekyylien tai sellaisten DNA-30 molekyylien, joiden transformointikyky haluttiin selvittää, avulla transformoitiin vastaanottokykyiseksi tehty E. coli DH5o!-kanta: [F' / endAl. hsdR17, supE44 . thi-1, recAl, gyrA96, relAl. ό (lacZYA-araF) U169. deoR, <£80dlac- :j (lacZ6M15) 1 | -;f 14

Plasmidi-DNA:n minipreparaatit tehdään tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Klein et ai., 1980.

LB-elatusalustaa käytetään E, coli -kantojen viljelemiseksi (Maniatis et ai., 1982). Näitä kantoja inkuboi-5 daan 37 °C:ssa. Bakteerit levitetään LB-alustaa, jota on täydennetty asianmukaisilla antibiooteilla, käsittäville maljoille.

Esimerkki 1 1.1. Pylvään valmistaminen 10 Materiaalit: Käytetty pylväs on HiTrap-pylväs, jota on aktivoitu 1 ml :11a N-hydroksisukkinimidiä (NHS, Pharmacia), ja joka on liitetty peristalttiseen pumppuun (virtausnopeus alle 1 ml/min) . Käytetty erityinen oligonukleotidi käsittää NH2-15 ryhmän 5'-asemassa. Sillä on seuraava sekvenssi: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvenssi nro 1) Tässä esimerkissä käytettiin seuraavia puskureita:

Kytkemispuskuri: NaHC03 0,2 M; NaCl 0,5 M, pH 8,3.

A-puskuri: etanoliamiini 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3. 20 B-puskuri: asetaatti 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4.

Menetelmä:

Pylväs pestään 6 ml :11a 1 mM HCl-liuosta, sitten pylvääseen laitetaan kytkentäpuskurilla laimennettua oli-gonukleotidia (50 nanomoolia 1 ml:ssa) ja jätetään siihen 25 30 minuutiksi ympäristön lämpötilassa. Pylväs pestään pe räkkäin 3 kertaa 6 ml :11a A-puskuria ja sitten 6 ml :11a B-puskuria. Tällä tavalla oligonukleotidi saadaan kytkeytymään kovalenttisesti pylvääseen CONH-sidoksella. Pylvästä säilytetään 4 °C:ssa PBS-puskurissa, 0,1 % NaN3, ja sitä 30 voidaan käyttää vähintään neljä kertaa.

1.2. Plasmidien muodostus

Seuraavat kaksi oligonukleotidia syntetisoitiin. Oligonukleotidi 4817: 5' -GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA 35 GAAGAAGG-3' (sekvenssi nro 9) 15

Oligonukleotidi 4818: 5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT CTTCG-3' (sekvenssi nro 10)

Sen jälkeen kun nämä oligonukleotid.it on hybridi-5 soitu ja kloonattu plasmidiin, ne saavat aikaan vastaavassa plasmidissa edellä kuvatun homopuriini-homopyrimidiini-sekvenssin (GAA)17.

Näitä kahta hybridisoitua oligonukleotidia vastaava sekvenssi on kloonattu plasmidin pBKS+ (Stratagene Cloning 10 System, La Jolla CA) moninkertaiseen kloonauskohtaan, jossa on ampisilliinin vastustuskyvyn geeni. Tätä tarkoitusta varten oligonukleotidit hybridisoitiin seuraavalla tavalla. Yksi μg näitä kahta oligonukleotidiä yhdistettiin 40 ml:ssa viimeistä puskuria 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM

15 MgCl2. Tämä seos kuumennettiin 95 °C:n lämpötilaan, sitten sitä pidettiin ympäristön lämpötilassa siten, että lämpötila laski hitaasti. 10 ng näiden hybridisoitujen oligo-nukleotidien seosta ligatoitiin 200 ng:aan pBKS+-plasmidia (Stratagene Cloning System, La Jolla CÄ) , joka oli pilkot-20 tu entsyymeillä BamHI ja EcoRI 30 μΐ-.ssa lopullista viimeistä puskuria. Ligatoinnin jälkeen pieni määrä transformoitiin DH5224-kantaan. Transformointiseos levitettin L-alustalle, jota oli täydennetty ampisilliinilla (50 mg/1) ja X-gal:lla (20 mg/1). Yhdistelmä-DNA-teknisistä 25 klooneista täytyy puuttua sininen väri tällä alustalla toisin kuin lähtöplasmidista (pBKS+), jossa E. coli:n β-galaktosidaasin omega-kappaleen «-täydentäminen on mahdollista. Sen jälkeen kun pieni määrä plasmidi-DNA:ta oli preparoitu 6 kloonista, niissä kaikissa todettiin plasmi-30 dissa pBKS+ kohtien EcoRI ja BamI välissä sijainneen Pstl-kohdan katoaminen sekä moninkertaisen kloonauskohdan sisältävän, 448 emäsparia käsittävän PvuII-vyöhykkeen mole-kyylipainon suureneminen. Yksi klooni otettiin talteen ja vastaavasta plasmidista käytettiin merkintää pXL2563. 35 Kloonattu sekvenssi varmistettiin sekvenssimäärityksellä 16 käyttäen plasmidin pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) aluketta -20 [5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (sekvenssi nro 11)] (Viera J. ja J. Messing, 1982, The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and 5 sequencing with synthetic universal primers; pUC-plasmi-dit, M13mp7-peräinen järjestelmä istutusmutageneesin aikaansaamiseksi ja sekvenssin määrittämiseksi synteettisillä yleisalukkeilla). Gene, 19, 259 - 268). Tämä plasmidi pXL2563 puhdistettiin reagenssipakkauksella Wizard Mega-10 prep (Promega Corp., Madison, WI) valmistajan suositusten mukaisesti. Tätä plasmidi-DNA-valmistetta käytettiin sitten jäljempänä kuvatuissa esimerkeissä.

1.3. Plasmidin puhdistus

Materiaalit: 15 Plasmidi pXL2563 (kuvattu kohdassa 1.2) puhdistet tiin myös plasmidia pBKS+ sisältävästä liuoksesta HiTrap-pylväällä, johon oli sidottu kohdassa 1.1 kuvattua oligo-nukleotidia. Tässä puhdistuksessa käytettiin seuraavia puskureita: 20 F-puskuri: NaCl 2M, asetaatti 0,2 M, pH 4,5 - 5.

E-puskuri: Tris IM, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.

Menetelmä:

Pylväs pestiin 6 ml :11a F-puskuria, sitten plasmi-dit (20 μg pXL2563 ja 20 μg pBKS+ 400 μΐ-.ssa F-puskuria) 25 laitettiin pylvääseen ja inkuboitiin kaksi tuntia ympäristön lämpötilassa. Pylväs pestiin 10 ml:11a F-puskuria ja sitten sitä eluoitiin E-puskurilla. Plasmidit ilmaistiin toteuttamalla elektroforeesi l-%:isella agaroosigeelillä ja värjäämällä etidiumbromidilla. Plasmidien osuus liuok-30 sissa arvioidaan määrittämällä niiden transformoiva aktiivisuus E. colin avulla.

Tulokset:

Kun lähdetään sellaisesta seoksesta, joka sisältää 30 % plasmidia pXL2563 ja 70 % plasmidia pBKS+, niin pyl-35 vään ulostulosta saadaan tällöin talteen liuos, joka si- 17 sältää 100 % plasmidia pXL2563. Puhtaus, joka arvioidaan optiselle tiheydelle aallonpituuksilla 260 ja 280 nm mitattujen arvojen välisen suhteen avulla, muuttuu arvosta 1,9 arvoon 2,5, mikä osoittaa, että tällä menetelmällä 5 päästään eroon kontaminoivista proteiineista.

Esimerkki 2 2.1. Tässä esimerkissä kuvataan plasmidi-DNA:n puhdistus. Oligonukleotidin [5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvenssi nro 1)] kytkeminen pylvääseen tehdään esimer- 10 kissä 1 kuvatulla tavalla. Tätä kytkemistä varten oligo-nukleotidia muokataan 5'-päästä amiiniryhmällä, joka on sidottu välikappaleen fosfaattiin 6 hiiliatomia sisältävän sivuryhmän avulla (Oligonucleotide modifie Eurogentec SA Belgia). Plasmidi pXL2563 on puhdistettu reagenssipakkauk-15 sella Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) valmistajan suositusten mukaisesti. Tässä esimerkissä käytettiin seuraavia puskureita: F-puskuri: NaCl 0-2M, asetaatti 0,2 M, pH 4,5 - 5.

E-puskuri: Tris IM, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.

20 Pylväs pestiin 6 ml :11a F-puskuria, sitten 100 μg plasmidia pXL2563 laimennettuna 400 μΐ-.lla. F-puskuria laitettiin pylvääseen ja inkuboitiin kaksi tuntia ympäristön lämpötilassa. Pylväs pestiin 10 ml :11a F-puskuria ja sitten sitä eluoitiin E-puskurilla. Plasmidin määrä määritet-25 tiin mittaamalla optinen tiheys aallonpituudella 260 nm. Tässä esimerkissä kiinnitys toteutettiin puskurissa, jonka NaCl-molaarisuus vaihteli alueella 0 - 2 M (F-puskuri). Puhdistuksen saanto pienenee NaCl-molaarisuuden pienentyessä. Kiinnityspuskurin pH voi vaihdella alueella 4,5 -5 30 puhdistuksen saannon ollessa paras pH-arvossa 4,5. Menetelmässä voidaan myös käyttää jotakin muuta eluointipus-kuria, jolla on emäksinen pH: tällöin eluointi toteutetaan 50 mM boraattipuskurilla, pH 9, EDTA 0,5 mM.

2.2. Oligonukleotidi 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT- 35 3' (sekvenssi nro 1) kytketään pylvääseen esimerkissä 1 18 kuvatulla tavalla. Plasmidi pXL2563 on puhdistettu rea-genssipakkauksella Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) valmistajan suositusten mukaisesti. Tässä esimerkissä käytettiin seuraavia puskureita: 5 F-puskuri: NaCl 0,1 M, asetaatti 0,2 M, pH 5.

E-puskuri: Tris IM, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.

Pylväs pestiin 6 ml :11a F-puskuria, sitten 100 μg plasmidia pXL2563 laimennettuna 400 μΐ-.lla F-puskuria laitettiin pylvääseen ja inkuboitiin yksi tunti ympäristön 10 lämpötilassa. Pylväs pestiin 10 ml :11a F-puskuria ja sitten sitä eluoitiin E-puskurilla. Plasmidinäytteissä läsnä olevan, E. colin perimästä tai kromosomeista peräisin olevan DNA:n osuus määritetään ennen oligonukleotidipylvään läpi johtamista ja pylvään jälkeen. Tämän perimä-DNA:n 15 määrä määritetään PCR-reaktiolla käyttäen käynnistimiä E.

colin galK-geenissä. Tällöin meneteltiin seuraavasti: Näiden käynnistimien sekvenssi on kuvattu julkaisussa Debouck et ai., Nucleic Acids Res., 1985, 13, 1841 - 1853: 5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (sekvenssi nro 20 24) sekä 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (sekvenssi nro 25) .

Reaktioseos käsittää 25 μΐ-.ssa PCR-puskuria (Prome-25 ga France, Charbonnieres) : 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay) ; 0,5 μΜ käynnistintä; 20 U/ml Taq-polymeraa-sia (Promega). Reaktio toteutettiin seuraavissa vaiheissa: 5 minuuttia 92 °C:ssa 30 jaksoa 10 sekuntia 95 °C:ssa 30 30 sekuntia 60 °C:ssa 1 minuutti 78 °C:ssa 10 minuuttia 78 °C:ssa.

124 emäsparin pituinen monistettu DNA-kappale erotettiin elektroforeesilla käyttäen 3-%:ista agaroosigee-35 liä, SybrGreen I -koettimen (Molecular Probes, Eugene, 19 USA) läsnä ollessa, minkä jälkeen sen määrä määritettiin vertaamalla E. coli B -kannan (Sigma, viite D4889) perimästä saatuihin Ultrapur-DNA-molekyyleihin.

Näyte sisältää 1 % kromosomaalista DNA:ta ennen 5 pylvästä ja oligonukleotidipylvään avulla puhdistettu näyte sisältää sitä 0,2 %.

Esimerkki 3

Koe kirkasta hajotetta käyttäen Tässä esimerkissä kuvataan plasmidi-DNA:n puhdistus 10 bakteeriviljelmän kirkkaasta hajotteesta "miniprep" -mitassa: 1,5 ml yön aikana saatua, plasmidin pXL2563 sisältävien DH5af-kantojen viljelmää sentrifugoitiin ja kasauma suspendoitiin uudestaan 100 μΐ-.aan liuosta, jonka koostumus oli: glukoosi 50 mM, Tris 25 mM HCl pH 8, EDTA 10 mM. 15 Sitten lisätään 200 μΐ 0,2 M NaOH-liuosta, 1 % SDS, putkia sekoitetaan kääntämällä ylösalaisin, sitten lisätään 150 μΐ 3 M kaliumasetaattia, pH 5, ja putkia sekoitettiin kääntämällä ylösalaisin. Sentrifugoinnin jälkeen superna-tantti otetaan talteen ja laitetaan esimerkissä 1 kuvatul-20 la tavalla saatuun oligonukleotidipylvääseen. Kiinnitys, pesut ja eluutio toteutetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1. Tällä tavalla saadaan noin 1 jiig plasmidia lähtemällä 1,5 ml:sta viljelmää. Saatu plasmidi analysoitiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä ja värjättiin eti-25 diumbromidilla, minkä perusteella se esiintyy vain yhtenä "ylirullautuneen" rengasmaisen DNA:n vyöhykkeenä. Tällä menetelmällä puhdistetussa plasmidissa ei todettu lainkaan sellaista DNA:ta, jolla on suuri molekyylipaino (kromoso-maalinen DNA), eikä RNA:ta. Aallonpituuksilla 260 ja 280 30 nm mitattujen optisten tiheyksien välinen suhde on 2.

Esimerkki 4 4.1. Tässä esimerkissä kuvataan plasmidi-DNA:n puhdistus esimerkissä 3 kuvatuissa olosuhteissa lähtemällä 20 ml:sta plasmidin pXL2563 sisältävien DH5o;-kantojen viljel-35 mää. Solukasauma sekoitetaan 1,5 ml:aan liuosta, jonka 20 koostumus oli: glukoosi 50 mM, Tris 25 mM HC1 pH 8, EDTA 10 mM. Hajottaminen toteutetaan 2 ml:11a 0,2 M NaOH-liuos-ta, 1 % SDS, ja neutralointi 1,5 ml :11a 3M kaliumasetaat-tia, pH 5. Sitten DNA saostetaan 3 ml :11a 3 ml 2-propano-5 lolia, kasauma sekoitetaan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, joka sisältää 0,2 M natriumasetaattia, pH 5, 0,1 M NaCl, ja laitetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla saatuun oli-gonukleotidipylvääseen. Kiinnitys, pylvään pesu ja eluutio toteutetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1 lukuun ot-10 tamatta pesupuskuria, jossa NaCl-molaarisuus on 0,1 M.

Tällöin saadaan noin 16 μg plasmidi-DNA:ta. Saatu plasmidi analysoitiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä ja värjättiin etidiumbromidilla, minkä perusteella se esiintyy vain yhtenä "ylirullautuneen" rengasmaisen DNA:n vyöhyk-15 keenä. Puhdistetussa plasmidissa ei todettu lainkaan sellaista DNA:ta, jolla on suuri molekyylipaino (kromosomaa-linen DNA), eikä RNA:ta. Tämän plasmidin pilkkominen rest-riktioentsyymillä tuottaa vain yhden 3 kiloemäksen suuruisen vyöhykkeen, jolla on odotettu molekyylipaino. Näyttei-20 den proteiinipitoisuus muuttuu kirkkaan hajotteen arvosta 125 μg/ml pienemmäksi kuin 1 μg/ml puhdistetussa plasmidissa (Micro-BCA-analyysi, Pierce). Endotoksiinien pitoisuus LAL-analyysillä arvioiden (Biosepra) pienenee alle 10-osaan puhdistetussa plasmidissa verrattuna lähtöaineena 25 toimineeseen kirkkaaseen hajotteeseen.

4.2. Käytetty plasmidi käsittää kasetin, joka sisältää sytomegaloviruksen promoottorin, lusiferaasia koo-daavan geenin sekä homopuriini-homopyrimidiini-sekvenssin (GAA) 17 plasmidista pXL2563. Tämän plasmidin sisältävää 30 DHl-kantaa (Maniatis et ai., 1989) viljellään 7 litran fermentorissa. Kirkas hajote valmistetaan 200 grammasta soluja: solukasauma sekoitetaan uudestaan 2 litraan liuosta, jonka koostumus on Tris 25 mM, pH 6,8, glukoosi 50 mM, j EDTA 10 mM, mihin lisätään 2 litraa 0,2 M NaOH-liuosta,

35 1 % SDS. Hajote neutraloidaan lisäämällä yksi litra 3M

21 kaliumasetaattia. Diasuodatuksen jälkeen 4 ml hajotetta laitetaan 5 ml:n suuruiseen HiTrap-NHS-pylvääseen, johon on kytketty esimerkissä 1.1 kuvatulla menetelmällä oligo-nukleotidi, jolla on sekvenssi 5 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvenssi nro 1)

Pesu ja eluointi toteutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Talteen saadaan noin 400 μg plasmidia. Perimä-DNA:n osuus tässä näytteessä on 0,1 % mitattuna esimerkissä 2.2. kuvatulla tekniikalla.

10 Esimerkki 5

Muokatun oligonukleotidin käyttö Tässä esimerkissä kuvataan metyloituja sytosiinejä sisältävän oligonukleotidin käyttö.

Käytetyllä oligonukleotidilla on seraava sekvenssi: 15 5, _GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT_3, (sekvenssi nro 1) Tämän oligonukleotidin 5'-päässä on NH2-ryhmä. MeC = 5-metyylisytosiini. Tämän oligonukleotidin avulla voidaan puhdistaa plasmidi pXL2563 esimerkin 1 olosuhteissa käyttäen kiinnityspuskuria, jonka pH on 5 (tällä tavalla pie-20 nennetään plasmidin hajoamisen vaaraa).

Esimerkki 6

Edellisissä esimerkeissä käytettyä oligonukleoti-dia on muokattu 5'-päästä fosfaattiin sitoutuneella amii-niryhmällä 6 hiiliatomia sisältävän sivuryhmän avulla: NH2-25 (CH2)6. Tässä esimerkissä amiiniryhmä on sidottu 5'-päät teen fosfaattiin 12 hiiliatomia käsittävän sivuryhmän välityksellä: NH2- (CH2) 12 . Oligonukleotidin kytkeminen pylvääseen ja näytteen johtaminen pylvään läpi toteutetaan esimerkissä 2 kuvatulla tavalla käyttäen F-puskuria: 2 M 30 NaCl, 0,2 M asetaatti, pH 4,5. Tämän oligonukleotidin avulla puhdistuksessa päästään parempiin saantoihin: saannoksi saavutetaan 53 %, kun taas 6 hiiliatomia käsittävän oligonukleotidin tapauksessa tämä saanto on noin 45 %, muuten samoissa olosuhteissa.

22

Esimerkki 7

Esimerkissä 1.2. kuvattua kloonausstrategiaa noudattaen muodostettiin kaksi muuta plasmidia, joissa on ho-mopuriini-homopyridimiini-sekvenssi: eli plasmidi pXL2725, 5 joka sisältää sekvenssin (GGA) 15, sekä plasmidi pXL2726, joka sisältää sekvenssin (GA)^.

Esimerkki 7.1.

Plasmidien muodostaminen

Plasmidit pXL2725 ja pXL2726 muodostettiin analogi-10 sella tavalla plasmidiin pXL2563 nähden esimerkissä 1.2. kuvatulla kloonaustekniikalla käyttäen seuraavista oligo-nukleotideistä muodostettuja pareja: 5986: 5' -GATCC (GA) 25GGG- 3 ' (sekvenssi nro 13) 5987: 5' -AATTCCC (TC) 2gG-3 ' (sekvenssi nro 14) 15 5981: 5' -GATCC (GGA) 17-3 ' (sekvenssi nro 15) 5982: 5' -AATT (CCT) 17CCG-3' (sekvenssi nro 16) i

Oligonukleotidien 5986 ja 5987 paria käytettiin plasmidin pXL2726 muodostamiseksi kloonaamalla nämä oligo-nukleotidit plasmidissa pBKS+ (Stratagene Cloning System, 2 0 La Jolla CA) BamHI- ja EcoRI-kohtiin, kun taas olgonuk- leotideja 5981 ja 5982 käytettiin plasmidin pXL2725 muodostamiseksi. Tässä käytettiin samoja koeolosuhteita kuin plasmidin pXL2563 muodostamiseksi, ainoastaan oligonukleo-tidiparit on vaihdettu. Samoin kloonatut sekvenssit on 25 varmistettu määrittämällä näiden plasmidien sekvenssit.

Tällöin nähdään, että plasmidi pXL2725 käsittää muokkauksen odotettuun sekvenssiin nähden, 17 kertaan toistuvan GGA-sekvenssin sijasta siinä esiintyy GGAGA(GGA)15 (sekvenssi nro 17).

3 0 Esimerkki 7.2.

Pylväiden valmistus ja puhdistus Näiden homopuriinisekvenssien kanssa kolmoiskier-teitä muodostavat oligonukleotidit on kytketty HiTrap-pyl-väisiin esimerkissä 1.1. kuvatulla tavalla. Kysymyksessä 35 on oligonukleotidi, jolla on sekvenssi 23 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (sekvenssi nro 18) plasmi-din pXL2725 puhdistamiseksi, sekä oligonukleotidi, jolla on sekvenssi 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (sekvenssi nro 19) plas-5 midin pXL2726 puhdistamiseksi.

Näillä kahdella tällä tavalla saadulla pylväällä on voitu puhdistaa vastaavia plasmideja esimerkissä 2 kuvatulla tekniikalla käyttäen seuraavia puskureita: F-puskuri: 2M NaCl, 0,2 M asetaatti, pH 4,5.

10 E-puskuri: IM Tris, HC1 pH 9, 0,5 mM EDTA.

Plasmidien pXL2725 ja pXL2726 tapauksessa päästiin vastaavasti saantoihin 23 % ja 31 %.

Esimerkki 8 Tämä esimerkki havainnollistaa plasmidissa läsnä 15 olevan erityisen sekvenssin pituuden vaikutusta puhdistuk sen saantoihin.

Esimerkki 8.1.

Plasmidien muodostus Näissä kokeissa käytetty havaintogeeni keksinnön 20 mukaisten koostumusten aktiivisuuden osoittamiseksi on lusiferaasia koodaava geeni (Luc).

Plasmidi pXL2621 käsittää kasetin, joka sisältää 661 emäsparin suuruisen sytomegaloviruksen (CMVj promoottorin, joka on saatu muodosteesta pcDNA3 (Invitrogen, 25 Corp., San Diego, CA) pilkkomalla restriktioentsyymeillä

MluI ja HindiII, ja joka on kloonattu ennen lusiferaasia koodaavaa geeniä pGL-vektorin MluI- ja HindiII-kohtiin (pGL basic Vector; Promega Corp., Madison, WI) . Tämä plasmidi on muodostettu käyttäen molekyylibiologian standardi-30 tekniikoita.

Plasmidit pXL2727-l ja pXL2727-2 on muodostettu seuraavalla tavalla.

2 μg plasmidia pXL2621 on tehty lineaariseksi entsyymillä BamHI; entsyymi inaktivoitiin käsittelemällä 10 j 35 minuuttia 65 °C:ssa; samanaikaisesti oligonukleotidit 6006 24 ja 6008 hybridisoitiin tavalla, joka on kuvattu plasmidin pXL2563 muodostuksen yhteydessä.

6006: 5 ' -GATCT (GAA) 17CTGAGATCT-3 ' (sekvenssi nro 20) 6008: 5' -GATCAGATCTGCAG (TTC) 17A- 3 ' (sekvenssi nro 21) 5 Tämä hybridisaatioseos kloonattiin plasmidin pXL2621 BamHI-päihin ja DH5of-soluihin transformoinnin jälkeen yhdistelmä-DNA-tekniset kloonit on määritetty analysoimalla restriktioentsyymin PstI avulla, koska nämä oligonukleotidit saavat aikaan PstI-kohdan. Kaksi 10 kloonia otettiin talteen ja kloonatun kappaleen nukleo-tidisekvenssi varmistettiin alukkeen avulla [6282, 5'- ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (sekvenssi nro 22)], joka aluke toimi sekvenssireaktion käynnistäjänä (Viera J. ja J. Messing, 1982, The pUC plasmids, an Ml3mp7-derived system for 15 insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers; pUC-plasmidit, M13mp7-peräinen järjestelmä istutusmutageneesin aikaansaamiseksi ja sekvenssin määrittämiseksi synteettisillä yleisalukkeilla). Gene, 19, 259 -268) .

20 Ensimmäinen klooni (pXL2727-l) sisältää 10 kertaan toistuvan sekvenssin GAA. Toinen klooni (pXL2727-2) sisältää sekvenssin 5 '-GAAGAAGAG (GAA) 7GGAAGAGAA-3 ' (sekvenssi nro 23).

Esimerkki 8.2.

25 Pylväiden valmistus ja puhdistus Tässä käytetään esimerkissä 1 kuvatun kaltaista pylvästä, johon on kytketty oligonukleotidi 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvenssi nro 1).

Plasmidissa pXL2727-l käsittää 14 kertaa toistuvan 30 GAA-sekvenssin. Niinpä edellä kuvattu oligonukleotidi, joka käsittää vain t kertaa toistuvan vastaavan CTT-hybri-disaatiosekvenssin, voi hybridisoitua tähän plasmidiin 8:ssa eri kohdassa. Sitä vastoin plasmidin pXL2727-2 käsittämä hybridi soi tuva (GAA) 7-sekvenssi on yhtä pitkä kuin 35 pylvääseen kiinnitetty oligonukleotidi. Tämä oligonukleo- 25 tidi voi siis hybridisoitua plasmidissa pXL2727-2 vain yhteen asemaan.

Tämä koe on samanlainen kuin esimerkissä kuvattu koe, ja siinä käytettiin seuraavia puskureita: 5 F-puskuri: 2M NaCl, 0,2 M asetaatti, pH 4,5.

E-puskuri: IM Tris, HC1 pH 9, 0,5 mM EDTA.

Puhdistuksen saanto on 29 % plasmidilla pXL2727-l ja 19 % plasmidilla pXL2727-2.

Esimerkki 8.3.

10 Nisäkässolujen in vitro -transfektio Käytetyt solut ovat NIH 3T3-soluja, joita siirros-tetaan koetta edeltävänä päivänä 24 kuoppaa käsittäville viljelylevyille määränä 50 000 solua/kuoppa. Plasmidi laimennetaan 150 mM NaCl-liuoksella ja siihen sekoitetaan 15 RPR115335-lipofektanttia. Lipofektantin positiivisten va rausten ja DNA:n negatiivisten varausten välinen suhde asetetaan arvoon 6. Seosta sekoitetaan pyörittämällä, sen annetaan seisoa 10 minuuttia ympäristön lämpötilassa, se laimennetaan viljelyalustalla, joka ei sisällä sikiövasi-20 kan seerumia, sitten sitä lisätään soluihin määränä, joka on 1 μg DNA:ta viljelykuoppia kohden. Viljelmää pidetään kaksi tuntia 37 °C:ssa, minkä jälkeen siihen lisätään 10 % til./til. sikiövasikan seerumia ja soluja inkuboidaan 48 tuntia 37 °C:ssa olosuhteissa, joissa on läsnä 5 % C02:ta. 25 Solut pestään kahteen kertaan PBS-liuoksella ja lusiferaa-sin aktiivisuus määritetään kuvatulla menetelmällä (rea-genssipakkaus Promega, Promega Corp. Madison, WI) käyttäen luminometriä Lumat LB9501 (EG ja G Berthold, Evry). Esimerkissä 8.2. kuvatulla tavalla puhdistetulla plasmidilla 30 pXL2727-l saavutetut transfektiosaannot ovat kaksi kertaa suurempia kuin saannot, joihin päästään tällä samalla plasmidilla, joka on puhdistettu reagenssipakkauksella Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI).

(1) YLEISET TIEDOT: 26

Sekvenssi1istaus (i) HAKIJA:

(A) NIMI: RHONE-POULENCE RORER

(B) KATU: 20 AVENUE RAYMOND ARON

(C) KAUPUNKI: ANTONY CEDEX

(E) MAA: RANSKA

(F) POSTINUMERO: 92165 (G) PUHELINNUMERO: 40.91.69.22 (H) TELEFAX: 40.91.72.91 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Kolmoiskierremuodosteen puhdistus ixnmobilisoidulla oligonukleotidilla (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 25 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Versio #1.30 (OEB) (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: GA.GGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

: 27 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 19 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 13 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: GAAAAAGGAA GAG 13 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5: AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19 (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 28

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6: AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19 (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19 (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: AAAAAAGGGA ATAAGGG 17 (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9: GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: 29 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: AA.TTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 11: TGACCGGCAG CAAAATG 17 (2) SEKVENSSIN NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(ix) OMINAISPIIRTEET: (D) MUUT TIEDOT: sekvenssin kaikki sytosiinit C ovat metyloituneet (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 12: GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25 (2) SEKVENSSIN NRO 13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: 1ineaarinen 30

(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 13: GATCCGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGGG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 14: AATTCCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 15: GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 16: AATTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 17 TIEDOT: 31 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 17: GGAGAGGAGG AGGAGGAGGÄ GGAGGAGGÄG GAGGAGGÄGG AGGAGGA.GGA 50 (2) SEKVENSSIN NRO 18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 18: AATGCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCT 25 (2) SEKVENSSIN NRO 19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 19: AGTGCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCT 26 (2) SEKVENSSIN NRO 20 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 66 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

32 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 20: GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAACTGC 60 AGATCT 66 (2) SEKVENSSIN NRO 21 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 66 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 21: GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT 60 TCTTCA 66 (2) SEKVENSSIN NRO 22 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 22: ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G 21 (2) SEKVENSSIN NRO 23 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 23: GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA 39 (2) SEKVENSSIN NRO 24 TIEDOT: 33 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 24: CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27 (2) SEKVENSSIN NRO 25 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 25: CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT 27

Claims

1. Menetelmä rengasmaiseen kaksijuosteiseen DNA:han perustuvan lääkkeen valmistamiseksi, tunnettu siitä, et- 5 tä se käsittää vähintään yhden sellaisen puhdistusvaiheen, jossa liuos, joka sisältää tätä DNA:ta muihin komponentteihin sekoittuneena, johdetaan kromatografisen kantajan läpi, johon kantajaan on kytketty kovalenttisesti oligonukleotidi, joka kykenee muodostamaan hybridisaation avulla kolmoiskier- 10 teen tässä DNArssa läsnä olevan erityisen homopuriini/homo-pyrimidiini-sekvenssin kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua DNA:ta sisältävä liuos on so-luhajote.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että soluhajote on kirkas hajote.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tämä kaksijuosteinen DNA on puhdistettu alustavasti.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että erityinen sekvenssi on istutettu keinotekoisesti kaksijuosteiseen DNA:han.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidi käsittää poly-CTT- 25 sekvenssin ja DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi on poly- GAA-sekvenssi.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidilla on sekvenssi GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (sekvenssi nro 1).

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että oligonukleotidilla on sekvenssi (CTT)7 (sekvenssi nro 26).

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sek- 35 venssi käsittää sekvenssin (GAA) 7, (GAA) i4 tai (GAA)l7. j

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi käsittää sekvenssin nro 5 ja oligonukleotidi käsittää sekvenssin nro 6 tai sekvenssin nro 7.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi käsittää sekvenssin nro 17 ja oligonukleotidi käsittää sekvenssin nro 18.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun- 10 nettu siitä, että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi käsittää sekvenssin (GA)25 ja oligonukleotidi käsittää sekvenssin nro 19.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erityinen sekvenssi on kak- 15 sijuosteisessa DNA:ssa luontaisesti läsnä oleva erityinen sekvenssi.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA:ssa luontaisesti läsnä oleva erityinen sekvenssi on plasmidin replikaation alkamiskohdassa 20 läsnä oleva homopuriini-homopyrimidiini-sekvenssi.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erityinen DNA-sekvenssi käsittää kokonaisuudessaan E. coli ColEl:n replikaation alkamiskohdassa sijaitsevan sekvenssin nro 2 tai sen osan.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että oligonukleotidi käsittää sekvenssin nro 3.

17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erityinen DNA-sekvenssi käsittää koko- 30 naisuudessaan plasmidin pBR322 β-laktamaasigeenissä sijait sevan sekvenssin nro 4 tai sekvenssin nro 8, tai sen osan.

18. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidi on kytketty kromatografiseen kantajaan disulfidi-, tioeette- 35 ri-, esteri-, amidi- tai amiinisidoksella.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidi on kiinnitetty kromatografiseen kantajaan hiiliketjusta (CH2)n, missä n on alueella 1 - 18 oleva kokonaisluku, rajat mukaan lukien, koostuvan 5 sivuryhmän välityksellä, ja että tämä sivuryhmä liittyy oli-gonukleotidiin fosfaatin välityksellä ja pylvääseen ami-disidoksella.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sivuryhmä koostuu 6 hiiliatomia käsit- 10 tävästä lineaarisesta hiiliketjusta.

21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sivuryhmä koostuu 12 hiiliatomia käsittävästä lineaarisesta hiiliketjusta.

22. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mu- 15 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidis- sa on vähintään yksi kemiallinen muokkaus, jonka saa tässä oligonukleotidissa aikaan nukleaasien vastustuskyvyn tai joka suojaa oligonukleotidia nukleaaseilta tai parantaa sen affiniteettia erityisen sekvenssin suhteen.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että oligonukleotidi käsittää homopyrimi-diinisekvenssin, jossa vähintään yksi sytosiineistä on mety-loitunut.

24. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mu- 25 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA käsittää li säksi yhden tai useamman terapeuttisesti mielenkiintoisen sekvenssin.

25. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaksi juos teinen

26. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi käsittää lukuisia asemia oligonukleoti-diin hybridisoitumiseksi. \

27. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromosomaalisen DNA:n pitoisuus lääkkeessä on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,5 %.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, tun-5 nettu siitä, että kromosomaalisen DNA:n pitoisuus lääkkeessä on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,2 %.

29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromosomaalisen DNA:n pitoisuus lääkkeessä on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,1 %.

30. Menetelmä kaksijuosteisen ENA:n puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden sellaisen vaiheen, jossa liuos, joka sisältää tätä RNA:ta muihin komponentteihin sekoittuneena, johdetaan kromatografisen kantajan läpi, johon kantajaan on kytketty kovalenttisesti 15 oligonukleotidi, joka kykenee muodostamaan hybridisaation avulla kolmoiskierteen tässä RNA:ssa läsnä olevan erityisen sekvenssin kanssa.

30 DNA on rengasmainen DNA, kuten plasmidi.

31. Menetelmä plasmidi-DNA:n puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden sellaisen 20 vaiheen, jossa liuos, joka sisältää tätä DNA:ta muihin komponentteihin sekoittuneena, johdetaan kromatografisen kantajan läpi, johon kantajaan on kytketty kovalenttisesti oligonukleotidi, joka kykenee muodostamaan hybridisaation avulla kolmoiskierteen tässä DNA:ssa läsnä olevan erityisen homopu-25 riini/homopyrimidiini-sekvenssin kanssa.