DE69529842T2 - Reinigung einer triple helix bildung mit einem verankerten oligonukleotid - Google Patents
Reinigung einer triple helix bildung mit einem verankerten oligonukleotidInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung von DNA. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die rasche Reinigung von doppelsträngiger zirkulärer DNA, die pharmakologisch verwendbar ist. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren mit einer spezifischen Hybridisierung zwischen einer DNA-Sequenz und einem Oligonukleotid verbunden.
- Die Techniken der Gentherapie und Zelltherapie erleben gegenwärtig eine außergewöhnliche Entwicklung. Nichtsdestotrotz sind diese Techniken mit der Möglichkeit, große Mengen an DNA in pharmazeutischer Reinheit zu produzieren, verbunden. In der Tat, in diesen neuen Therapien besteht das Medikament oft aus der DNA selbst und es ist wesentlich, diese in angepassten Mengen herzustellen, zu isolieren und in geeigneter Weise für die therapeutische Verwendung beim Menschen zu reinigen.
- Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues einfaches und besonders wirksames Verfahren zur Reinigung von zirkulärer DNA. Es erlaubt insbesondere den Erhalt von besonders hohen Reinheiten und erhöhten Ausbeuten.
- Das erfindungsgemäße Verfahren beruht im Wesentlichen auf einer spezifischen Interaktion zwischen einer Sequenz, die in die zu reinigende DNA insertiert ist, und einem Oligonukleotid, das aus natürlichen oder modifizierten Basen zusammengesetzt ist.
- Es wurde jüngst gezeigt, dass bestimmte Oligonukleotide spezifisch mit der großen Furche der DNA-Doppel-Helix wechselwirken können, um lokal Tripel-Helices zu bilden, was zu einer Hemmung der Transkription der Zielgene führt (Hélène und Toulmé, Biochem. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Diese Oligonukleotide erkennen selektiv die DNA- Doppel-Helix auf der Ebene der Oligopurin.Oligopyrimidin- Sequenzen, d. h. auf der Ebene der Regionen, die eine Oligopurin-Sequenz auf einem Strang und eine Oligopyrimidin-Sequenz auf dem Komplementärstrang besitzen, und bilden dort lokal eine Tripel-Helix. Die Basen des dritten Strangs (das Oligonukleotid) bilden die Wasserstoffbindungen (Hoogsteen-Bindungen oder Hoggsteeninvers) mit den Purinen von Watson-Crick-Basenpaaren.
- Eine Verwendung dieses Typs von Wechselwirkung zur Isolierung eines Plasmids wurde im Stand der Technik beschrieben. So beschreiben Ito et al. (PNAS 89 (1992) 495) die Verwendung von biotinylierten Oligonukleotiden, die eine Sequenz, die von einem Plasmid begrenzt ist, erkennen können und damit eine Tripel-Helix bilden können. Die so gebildeten Komplexe werden anschließend mit mit Streptavidin beschichteten Magnetkügelchen in Kontakt gebracht. Die Wechselwirkung zwischen dem Biotin und dem Streptavidin erlaubt nun die Isolierung des Plasmids durch magnetische Abtrennung der Kügelchen, dann Elution. Trotzdem besitzt dieses Verfahren bestimmte Nachteile. Insbesondere sind zwei spezifische sukzessive Wechselwirkungen notwendig, die erste zwischen dem Oligonukleotid und dem Plasmid, die zweite zwischen dem biotinylierten Komplex und den Streptavidinkügelchen. Außerdem kann die Endlösung durch biotinyliertes Oligonukleotid kontaminiert sein, was in einer pharmazeutischen Zusammensetzung nicht verwendet werden kann.
- Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues verbessertes Verfahren zur Reinigung von DNA, das auf diesen Wechselwirkungstyp Bezug nimmt. Insbesondere werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren an einen Träger covalent gekoppelte Oligonukleotide eingesetzt. Dieses Verfahren ist besonders rasch und es führt zu Ausbeuten und zu Reinheitsgraden, die besonders erhöht sind.
- Außerdem erlaubt es die Reinigung von zirkulärer DNA aus komplexen Gemischen, die insbesondere andere Nukleinsäure, Proteine, Endotoxine (wie Lipopolysaccharide), Nukleasen etc. umfassen. Die verwendeten Träger können außerdem leicht rezykliert werden und die erhaltenen DNAs besitzen verbesserte Eigenschaften hinsichtlich der pharmazeutischen Sicherheit. Schließlich ist dieses Verfahren nur mit einer Stufe im Gegensatz zum Stand der Technik verbunden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft nun in erster Linie ein Verfahren zur Reinigung von doppelsträngiger zirkulärer DNA, gemäß dem man eine Lösung, die die DNA im Gemisch mit anderen Bestandteilen enthält, über einen Träger leitet, auf dem kovalent ein Oligonukleotid gekoppelt ist, das durch Hybridisierung eine Tripel-Helix mit einer spezifisch auf der DNA vorhandenen Sequenz bilden kann. Die spezifische Sequenz kann eine natürlicherweise auf der doppelsträngigen DNA vorhandene Sequenz oder eine künstlich in diese eingeführte Sequenz sein.
- Die erfindungsgemäß verwendeten Oligonukleotide sind Oligonukleotide, die direkt mit der DNA im Doppelstrang hybridisieren. Diese Oligonukleotide können die folgenden Basen enthalten:
- - Thymidin (T), das Triplets mit den Dublets A.T der doppelsträngigen DNA bilden kann (Rajagopal et al., Biochem. 28 (1989) 7859);
- - Adenin (A), das Triplets mit den Dublets A.T der doppelsträngigen DNA bilden kann;
- - Guanin (G), das Triplets mit den Dublets G.C der doppelsträngigen DNA bilden kann;
- - protoniertes Cytosin (C+), das Triplets mit den Dublets G.C der doppelsträngigen DNA bilden kann (Rajagopal et al., a. a. O.);
- - Uracil (U), das Triplet mit den Basenpaaren A.U oder A.T bilden kann.
- Bevorzugt umfasst das verwendete Oligonukleotid eine Homopyrimidin-Sequenz, die cytosinreich ist, und die spezifisch auf der DNA vorhandene Sequenz ist eine Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz. Die Anwesenheit von Cytosinen erlaubt den Erhalt einer Tripel-Helix, die bei saurem pH stabil ist, bei dem die Cytosine protoniert sind und bei alkalischem pH destabilisiert ist, bei dem die Cytosine neutralisiert sind.
- Um die Bildung einer Tripel-Helix durch Hybridisierung zu gestatten, ist es wichtig, dass das Oligonukleotid und die Sequenz, die spezifisch auf der DNA vorhanden ist, komplementär sind. In dieser Hinsicht werden zum Erhalt besserer Ausbeuten und der besseren Selektivität in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Oligonukleotid und eine spezifische perfekte komplementäre Sequenz verwendet. Es kann sich insbesondere um ein poly-CTT-Oligonukleotid und eine spezifische poly-GAA-Sequenz handeln. Als Beispiel kann das Oligonukleotid der Sequenz 5'- GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)&sub7;; (SEQ ID NO: 1) genannt werden, worin die Basen GAGG keine Tripel-Helix bilden, aber die räumliche Trennung des Oligonukleotids des Kopplungsarmes erlauben; man kann auch die Sequenz (CTT)&sub7; (SEQ ID NO: 26) nennen. Diese Oligonukleotide können eine Tripel-Helix mit einer spezifischen Sequenz bilden, die komplementäre Motive (GAA) trägt. Es kann sich insbesondere um eine Region handeln, die 7, 14 oder 17 GAA-Motive, wie in den Beispielen beschrieben, enthält.
- Eine andere Sequenz von spezifischem Interesse ist die Sequenz:
- Diese Sequenz bildet eine Tripel-Helix mit den Oligonukleotiden
- In diesem Fall bindet sich das Oligonukleotid in einer antiparallelen Orientierung zu dem Polypurinstrang. Diese Tripel-Helices sind nur in Gegenwart von Mg2+ stabil (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal und Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
- Wie vorstehend angegeben kann die spezifische Sequenz eine in natürlicher Weise auf der doppelsträngigen DNA vorhandene Sequenz oder eine künstlich in diese eingeführte synthetische Sequenz sein. Es ist besonders wichtig, ein Oligonukleotid zu verwenden, das eine Tripel- Helix mit einer in natürlicher Weise auf der doppelsträngigen DNA vorhandenen Sequenz bilden kann, beispielsweise im Replikationsorigin eines Plasmids oder in einem Markergen. In dieser Hinsicht hat die Anmelderin Sequenzanalysen von Plasmiden durchgeführt und zeigen können, dass bestimmte Regionen dieser DNA, insbesondere im Replikationsorigin Homopurin-Homopyrimidin-Regionen besitzen können. Die Synthese von Oligonukleotiden, die Tripel-Helices mit natürlichen Homopurin-Homopyrimidin- Regionen bilden können, erlaubt vorteilhafterweise die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf nicht- modifizierte Plasmide, insbesondere kommerzielle Plasmide vom Typ pUC, pBR322, pSV etc. Unter den natürlicherweise auf einer doppelsträngigen DNA vorhandenen Homopurin- Homopyrimidin-Sequenzen kann man eine Sequenz nennen, die die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz 5'- CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID NO: 2), die im Replikationsorigin ColE1 von E. coli vorhanden ist, umfasst. In diesem Fall besitzt das Oligonukleotid, das die Tripel-Helix bildet, die Sequenz: 5'- GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ ID NO: 3) und bindet sich alternativ an die zwei Stränge der Doppel-Helix, wie von Beal und Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) und Jayasend und Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288) beschrieben. Man kann auch die Sequenz 5'- GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 4) des β-Lactamasegens des Plasmids gBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 189, 504-508) nennen. Die Verwendung eines Oligonukleotids mit der Fähigkeit, eine Tripel-Helix mit einer in einem Replikationsorigin oder einem Markergen vorhandenen Sequenz zu bilden, ist besonders vorteilhaft, da sie mit dem gleichen Oligonukleotid die Reinigung der gesamten DNA, die den Replikationsorigin oder das Markergen enthält, erlaubt. Es ist nun nicht notwendig, das Plasmid oder die doppelsträngige DNA zu modifizieren um in diese eine spezifische künstliche Sequenz einzubauen.
- Obwohl perfekt komplementäre Sequenzen bevorzugt sind, ist es jedoch zu verstehen, dass bestimmte Mismatches zwischen der Sequenz des Oligonukleotids und der auf der DNA vorhandenen Sequenz toleriert werden können, insoweit als sie nicht zu einem zu großen Affinitätsverlust führen. Man kann die Sequenz 5'-AAAAAAGGGAA AAGGG-3' (SEQ ID NO: 8) nennen, die in dem β-Lactamasegen von E. coli vorhanden ist. In diesem Fall kann das Thymin, das die Polypurin- Sequenz unterbricht, von einem Guanin des dritten Strangs erkannt werden, wodurch so ein Triplet ATG gebildet wird, das stabil ist, da es durch zwei Triplets TAT eingeschlossen ist (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
- Gemäß einer speziellen Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Oligonukleotide die Sequenz (CCT)n, die Sequenz (CT)n oder die Sequenz (CTT)n, worin n in eine ganze Zahl zwischen 1 und 15 eingeschlossen ist. Es ist besonders vorteilhaft, Sequenzen vom Typ (CT)n oder (CTT)n zu verwenden. Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass die Ausbeute der Reinigung durch die Affinität von C in dem Oligonukleotid beeinflusst wird. Insbesondere, wie in Beispiel 7 angegeben, steigt die Ausbeute der Reinigung an, wenn das Oligonukleotid weniger Cytosine umfasst. Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Oligonukleotide auch die Motive (CCT), (CT) oder (CTT) kombinieren können.
- Das verwendete Oligonukleotid kann natürlich (zusammengesetzt aus natürlichen, nicht-modifizierten Basen) oder chemisch, modifiziert sein. Insbesondere kann das Oligonukleotid vorteilhafterweise bestimmte chemischen Modifikationen besitzen, die die Erhöhung seines Widerstands oder seines Schutzes gegen Nukleasen oder seiner Affinität gegenüber der spezifischen Sequenz erlauben.
- Erfindungsgemäß wird auch unter Oligonukleotid jede Nukleosidkette verstanden, die eine Skelett-Modifikation mit dem Ziel erhalten hat, es gegenüber Nukleasen resistenter zu machen. Unter den möglichen Modifikationen können genannt werden die Oligonukleotide Phosphorothioate, die Tripel-Helices mit DNA bilden können (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330) sowie die Oligonukleotide die Formacetal- oder Methylphosphonat- Grundgerüste besitzen (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768). Man kann auch die mit α- Anomeren von Nukleotiden snythetisierten Oligonukleotide verwenden, die auch Tripel-Helices mit DNA bilden (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7764). Eine andere Modifikation des Grundgerüsts ist die Phosphoramidatbindung. Man kann beispielsweis die Internukleotidbindung N3'-P5'-Phosphoramidat nennen, die von Gryaznov und Chen beschrieben ist, die Oligonukleotide ergibt, die mit DNA besonders stabile Tripel-Helices bilden (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144). Unter den anderen Modifikationen des Grundgerüsts kann auch die Verwendung von Ribonukleotiden, 2'-O-Methylribose, Phosphordiester, ... (Sun und Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144) genannt werden. Die phosphorylierte Sequenz kann schließlich durch eine Polyamidsequenzfolge wie in PNA (Peptid-Nukleinsäure) ersetzt sein, die auch Tripel-Helices bilden kann (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481) oder durch eine Sequenzfolge auf der Basis von Guanin ersetzt sein, wie in DNG (Desoxyribonuklein-Guanidin, Proc. Natl, Acad. Bei. USA, 1995, 92, 6097-6101), polykationische Analoga von DNA, die auch Tripel-Helices bilden.
- Das Thymin des dritten Stranges kann auch durch ein 5- Bromuracil ersetzt sein, das die Affinität des Oligonukleotids für die DNA erhöht (Povsic und Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). Der dritte Strang kann auch nicht-natürliche Basen enthalten, unter denen 7- Deaza-2'-desoxyxanthosin (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-Desoxy-β-D-ribofuranosyl)- 3-methyl-5-amino-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-on (Koh und Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8- Oxoadenin, 2-Aminopurin, 2'-O-Methylpseudoisocytidin oder jede andere Modifikation, die einem Fachmann bekannt ist, genannt werden (bezüglich einer Übersicht vergleiche Sun und Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345- 356).
- Ein anderer Typ von Modifikation des Oligonukleotids hat besonders bevorzugt zum Ziel, die Interaktion und/oder die Affinität zwischen dem Oligonukleotid und der spezifischen Sequenz zu verbessern. Insbesondere besteht eine völlig vorteilhafte erfindungsgemäße Modifikation aus der Methylierung der Cytosine des Oligonukleotids (vergleiche Beispiel 5). Das so methylierte Oligonukleotid besitzt die beachtliche Eigenschaft, eine stabile Tripel-Helix mit der spezifischen Sequenz in den pH-Zonen, die am nächsten zur Neutralität sind (≥5), zu bilden. Dies erlaubt somit das Arbeiten bei höheren pH-Werten als die Oligonukleotide aus dem Stand der Technik, d. h. bei pH-Werten, bei denen die Abbaurisiken der Plasmid-DNA geringer sind.
- Die Länge des in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Oligonukleotids beträgt mindestens 3 Basen und umfasst bevorzugt 5 bis 30. Es wird vorteilhafterweise ein Oligonukleotid mit einer Länge von größer als 10 Basen verwendet. Die Länge kann je nach Fall vom Fachmann als Funktion der Selektivität und der Stabilität der gewünschten Wechselwirkung angepasst werden.
- Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können durch jede bekannte Technik synthetisiert werden. Insbesondere können sie mit Nukleinsäure-Synthesegeräten hergestellt werden. Jedes andere Verfahren, das einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, kann offensichtlich auch verwendet werden.
- Um die covalente Kopplung mit den Trägern zu erlauben, wird das Oligonukleotid im Allgemeinen funktionalisiert. So kann es durch eine terminale Thiol-, Amin- oder Carboxylgruppe in Position 5' oder 3' modifiziert werden. Insbesondere erlaubt die Hinzufügung einer Thiol-, Amin- oder Carboxylgruppe beispielsweise die Kopplung des Oligonukleotids an einen Träger, der Disulfid-, Maleimid-, Amin-, Carboxyl-, Ester-, Epoxid-, Bromid-, Cyanid- oder Aldehyd-Funktionen trägt. Diese Kopplungen erfolgen durch Etablieren von Thiosulfid-, Thioether-, Ester-, Amid- oder Amin-Bindungen zwischen dem Oligonukleotid und dem Träger. Jedes andere Verfahren, das einem Fachmann bekannt ist, kann verwendet werden, wie bifunktionelle Kopplungsreagentien beispielsweise.
- Außerdem kann es zur Verbesserung der Hybridisierung mit dem gekoppelten Oligonukleotid vorteilhaft sein, dass das Oligonukleotid einen Arm und eine Basensequenz als Spacer enthält. Die Verwendung eines Arms erlaubt in der Tat die Fixierung des Oligonukleotids in einer Entfernung, ausgewählt zwischen dem Träger, der die Verbesserung seiner Interaktionsbedingungen mit der DNA erlaubt. Der Arm besteht vorteilhafterweise aus einer linearen Kohlenstoffkette, umfassend 1 bis 18 und bevorzugt 6 oder 12 Gruppen (CH2), und einem Amin, das die Bindung an die Säule erlaubt. Der Arm wird an ein Phosphat des Oligonukleotids oder an einen Spacer, bestehend aus Basen, die nicht mit der Hybridisierung wechselwirken, gebunden. So kann der Spacer Purinbasen umfassen. Als Beispiel kann der Spacer die Sequenz GAGG umfasesn. Der Arm besteht vorteilhafterweise aus einer linearen Kohlenstoffkette, umfassend 6 oder 12 Kohlenstoffatome.
- Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung können verschiedene Trägertypen verwendet werden. Es kann sich um derivatisierte Chromatograpieträger in loser Form oder in der Säule prä-konditioniert, derivatisierte Kunststoff- Oberflächen oder magnetische oder nicht-magnetische derivatisierte Latexkügelchen handeln. Es handelt sich bevorzugt um chromatographische Träger. Als Beispiel können die verwendeten chromatographischen Träger Agarose, Acrylamid oder Dextran sowie ihre Derivate (wie Sephadex, Sepharose, Superose, ...), Polymere, wie Poly(styroldivinybenzol) oder gepfropftes oder nicht-gepfropftes Kieselgel beispielsweise angeführt werden. Dis Chromatographiesäulen können durch Diffusions- oder Perfusionsmodus funktionieren.
- Um bessere Reinigungsausbeuten zu erhalten, ist es besonders vorteilhaft, auf dem Plasmid eine Sequenz zu verwenden, die mehrere Hybridisierungspositionen mit dem Oligonukleotid umfasst. Die Anwesenheit mehrerer Hybridisierungspositionen begünstigt in der Tat die Wechselwirkung zwischen der Sequenz und dem Oligonukleotid, was zu einer Verbesserung der Reinigungsausbeuten führt. So ist es für ein Oligonukleotid, das n Wiederholungen der Motive (CCT), (CT) oder (CTT) umfasst, bevorzugt, eine DNA-Sequenz zu verwenden, die mindestens n komplementäre Motive und bevorzugt n + 1 komplementäre Motive verwendet. Eine Sequenz, die n + 1 komplementäre Motive trägt, bietet so zwei Hybridisierungspositionen dem Oligonukleotid an. Vorteilhafterweise umfasst die DNA-Sequenz bis zu 11 Hybridisierungspositionen, d. h. n + 10 komplementäre Motive.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Reinigung jedes Typs von doppelsträngiger DNA verwendet werden. Es kann sich beispielsweise um zirkuläre DNA handeln wie ein Plasmid, das allgemein ein oder mehrere Gene von therapeutischem Interesse trägt. Dieses Plasmid kann auch einen Replikationsorigin, ein Markergen etc. tragen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann direkt auf ein zelluläres Lysat angewendet werden. Bei dieser Ausführungsform wird das durch Transformation, dann durch Zellkultur amplifizierte Plasmid direkt nach der Lyse der Zellen gereinigt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf ein klares Lysat angewendet werden, d. h. auf den Überstand, der nach der Neutralisation und Zentrifugation des zellulären Lysats erhalten wird. Es kann auch offensichtlich auf eine Lösung angewendet werden, die zuvor nach bekannten Verfahren gereinigt worden ist. Dieses Verfahren erlaubt auch die Reinigung von linearer oder zirkulärer DNA, die eine Sequenz von Interesse trägt, ausgehend von einem Gemisch, das DNA von verschiedenen Sequenzen umfasst.
- Das zelluläre Lysat kann ein Lysat von prokaryontischen und eukaryontischen Zellen sein.
- Wenn es sich um prokaryontische Zellen handelt, können die Bakterien E. coli, B. subtilis, S. typhimurium oder Streptomyces genannt werden. Wenn es sich um eukaryontische Zellen handelt, können tierische Zellen, Hefezellen, Pilze etc. und ganz besonders die Hefen Kluyveromyces oder Saccharomyces oder die Zellen COS, CHO, C127, NIH3T3 etc. genannt werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft, da es den raschen und einfachen Erhalt von Plasmid-DNA mit hoher Reinheit erlaubt. Insbesondere erlaubt dieses Verfahren, wie in den Beispielen gezeigt, die wirksame Abtrennung von Plasmid-DNA, die als verunreinigende Bestandteile gelten, wie fragmentierte chromosomale DNA, Endotoxine, Proteine, Nukleasen etc. Ganz besonders erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren den Erhalt von doppelsträngigen DNA-Präparationen, insbesondere Plasmid- Präparationen, mit einem Gehalt an chromosomaler DNA von kleiner oder gleich 0,5%. Noch bevorzugter besitzen die erhaltenen DNA-Präparationen einen Gehalt an chromosomaler DNA von kleiner oder gleich 0,2%. Die vorliegende Erfindung beschreibt nun Zusammensetzungen, die Plasmid- DNA umfassen, die insbesondere in der Gentherapie oder Zelltherapie verwendbar sind. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend doppelsträngige lineare oder Plasmid-DNA, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
- Die Erfindung betrifft auch Plasmid-DNA-Präparate mit einem Gehalt an chromosomaler DNA von kleiner oder gleich 0,5%, bevorzugt 0,2%, noch bevorzugter 0,1%.
- Die Zusammensetzungen können nackte Plasmid-DNA oder Plasmid-DNA in Assoziation mit Transportvektoren, wie Liposomen, Nanopartikel, kationische Lipide, Polymere, Proteine oder rekombinante Viren etc., enthalten.
- Die vorliegende Anmeldung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben, die als Erläuterungen und nicht als Begrenzungen gelten sollen.
- Die klassischen Methoden der Molekularbiologie, wie die Spaltungen mit Restriktionsenzymen, die Gelelektrophorese, die Transformation in E. coli, die Fällung von Nukleinsäuren etc. sind in der Literatur beschrieben (Maniatis et al., T.1, E. F. Fritsch und J. Sambrook. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman und K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987- 1988, John Willey and Sons, New York). Die Nukleotidsequenzen wurden nach dem Kettenabbruchverfahren gemäß dem bereits vorgestellten Protokoll bestimmt (Ausubel et al., 1987).
- Die Restriktionsenzyme wurden von New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs) bereitgestellt.
- Für Ligaturen werden die DNA-Fragmente in einen Puffer aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP in Gegenwart von DNA-Ligase des T4-Phagen (Biolabs) inkubiert.
- Die Oligonukleotide werden unter Verwendung der Chemie der Phosphoramidite, die in β durch eine Cyanoethylgruppe geschützt sind (Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus und H. Köster. 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidit of deoxynucleosides for the synthesis oder DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557; Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA.synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dez.) mit dem automatischen Synthesegerät Biosearch 8600 unter Verwendung der Empfehlungen des Herstellers synthetisiert.
- Die ligierte oder die auf ihre Transformationseffizienz zu testende DNA werden zur Transformation des kompetent gemachten Stamms: E. coli DH5α [F'/endA1, hsdR17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, Φ80dlac(lacZΔM15)] verwendet.
- Die plasmidischen DNA-Minipräparationen werden gemäß dem Protokoll von Klein et al., 1980 hergestellt.
- Das Medium der LB-Kultur wird zum Wachstum der E. coli- Stämme (Maniatis et al., 1982) verwendet. Die Stämme werden bei 37ºC inkubiert. Die Bakterien werden in Schalen in LB-Medium, das mit geeigneten Antibiotika supplementiert ist, ausgebracht.
- Die verwendete Säule ist eine HiTrap-Säule, die mit NHS (N-Hydroxysuccinimid, Pharmacia) aktiviert ist, zu 1 ml, die mit einer peristaltischen Pumpe (Durchflussmenge < 1 ml/min) verbunden ist. Das spezifisch verwendete Oligonukleotid besitzt eine NH&sub2;-Gruppierung in 5'. Dessen Sequenz ist die folgende:
- Die in diesem Beispiel verwendeten Puffer sind die folgenden:
- Kopplungspuffer: NaHCO&sub3; 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3.
- Puffer A: Ethanolamin 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3.
- Puffer B: Acetat 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4.
- Die Säule wird mit 6 ml 1 mM HCl gewaschen, dann wird das in Kopplungspuffer (50 nmol in 1 ml) aufgelöste Oligonukleotid auf die Säule aufgebracht und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur belassen. Die Säule wird 3mal hintereinander mit 6 ml Puffer A, dann 6 ml Puffer B gewaschen. Das Oligonukleotid wird so covalent an die Säule durch eine CONH-Bindung gebunden. Die Säule wird bei 4ºC in 0,1% PBS-NaN&sub3; gelagert und kann mindestens viermal verwendet werden.
- Die zwei folgenden Oligonukleotide wurden synthetisiert:
- Oligonukleotid 4817:
- Oligonukleotid 4818:
- Diese Oligonukleotide dringen, sobald sie hybridisiert und in ein Plasmid cloniert sind, in das entsprechende Plasmid mit einer Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz (GAA)&sub1;&sub7;, wie vorstehend beschrieben, ein.
- Die diesen zwei hybridisierten Oligonukleotiden entsprechende Sequenz wurde an Mehrfach-Clonierungsstellen des Plasmids pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA) cloniert, das ein Ampicillinresistenzgen trägt. Dafür wurden die Oligonukleotide wie folgt hybridisiert. Ein ug dieser zwei Oligonukleotide wurde zusammen in 40 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;-Endpuffer gegeben. Dieses Gemisch wurde auf 95ºC erhitzt, dann bei Umgebungstemperatur so gehalten, dass die Temperatur langsam sinkt. Zehn mg des Gemisches der hybridisierten Oligonukleotide wurden mit 200 mg des Plasmids pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), das durch BamHI und EcoRI gespalten worden war, in 30 ul Endlösung ligiert. Nach Ligierung wurde ein Aliquot in DH5α transformiert. Die Transformationsgemische wurden auf L-Medium, das mit Ampicillin (50 mg/l) und X-gal (20 mg/l) supplementiert war, aufgebracht. Die rekombinanten Clone müssen eine Abwesenheit von blauer Färbung auf dem Medium im Gegensatz zum Elternplasmid (pBKS+) zeigen, was die α- Komplementierung des ω-Fragments der β-Galactosidase von E. coli erlaubt. Nach Minipräparation der Plasmid-DNA von 6 Clonen zeigten sie alle das Verschwinden der PstI- Spaltstelle, die zwischen den EcoRI- und BamHI- Spaltstellen von pBKS+ situiert ist, sowie eine Erhöhung des Molekulargewichts der PvuII-Bande von 448 bp, die eine Mehrfach-Clonierungsstelle enthält. Ein Clon wurde zurückgehalten und das entsprechende Plasmid wurde als pXL2563 bezeichnet. Die clonierte Sequenz wurde durch die Sequenz verifiziert, wobei der Primer -20 (5'- TGACCGGCAGCAAAATG-3' (SEQ ID NO: 11)) (Viera J. und J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268) des Plasmids pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA)) verwendet wurde.
- Das Plasmid pXL2563 wurde gemäß dem Kit Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) gereinigt, wobei den Empfehlungen des Herstellers gefolgt wurde. Diese Plasmid- DNA-Präparation wurde anschließend in den nachstehenden Beispielen verwendet.
- Das Plasmid pXL2563 (beschrieben in 1.2) wurde über die HiTrap-Säule, die an das in 1.1. beschriebene Oligonukleotid gekoppelt ist, ausgehend von einer Lösung, die auch das Plasmid pBKS+ enthält, gereinigt. Die während dieser Reinigung verwendeten Puffer sind die folgenden:
- Puffer F: 2 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 4,5 bis 5.
- Puffer E: 1 M Tris, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
- Die Säule wird mit 6 ml Puffer F gewaschen, dann werden die Plasmide (20 ug pXL2563 und 20 ug pBSK+ in 400 ul des Puffers F) auf die Säule aufgebracht und zwei Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Säule wird mit 10 ml Puffer F gewaschen, dann erfolgt die Elution mit dem Puffer E. Die Plasmide werden nach Elektrophorese über 1% Agarosegel und Anfärbung mit Ethidiumbromid detektiert. Der Anteil der Plasmide in den Lösungen wird durch Messung ihrer transformierenden Aktivität auf E. coli abgeschätzt.
- Unter Verteilung eines Gemisches, das 30% pXL2563 und 70% pBKS+ enthält, wird am Ausgang der Säule eine Lösung zu 100% pXL2563 wiederaufgenommen. Die Reinheit, die durch das Verhältnis der O.D. bei 260 und bei 280 nm abgeschätzt wurde, steigt von 1,9 auf 2,5, was zeigt, dass man die kontaminierenden Proteine durch dieses Verfahren entfernt.
- 2.1 - Dieses Beispiel beschreibt ein Reinigungsexperiment für Plasmid-DNA. Die Kopplung des Oligonukleotids (5'- GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1)) an die Säule wird, wie in Beispiel 1 angegeben, durchgeführt. Für die Kopplung wird das Oligonukleotid am 5'-Ende durch eine an das Phosphat des Spacers mit einem Arm, der 6 Kohlenstoffatome enthält, gebundene Amingruppierung modifiziert (modifiziertes Oligonukleotid Eurogentec SA Belgien). Das Plasmid pXL2563 wurde mit Hilfe des Kits Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers gereinigt. Die in diesem Beispiel verwendeten Puffer sind die folgenden:
- Puffer F: 0 bis 2 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 4,5 bis 5.
- Puffer E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
- Die Säule wird mit 6 ml Puffer F gewaschen, dann werden 100 ug de Plasmids pXL2563, verdünnt in 400 ul Puffer F, auf die Säule aufgebracht und zwei Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Säule wird mit 10 ml Puffer F gewaschen, dann erfolgt die Elution mit Puffer E. Das Plasmid wird durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm gemessen. In diesem Beispiel wird die Bindung in einem Puffer durchgeführt, dessen NaCl-Molarität von 0 bis 2 M (Puffer F) variiert. Die Ausbeute der Reinigung vermindert sich, wenn die NaCl-Molarität abnimmt. Der pH- Wert des Fixierungspuffers kann von 4,5 bis 5 variieren, wobei die Reinigungsausbeute besser als 4,5 ist. Man kann auch einen anderen Elutionspuffer mit einem basischen pH- Wert verwenden. So wurde die Elution mit einem 50 mM Boratpuffer, pH 9, 0,5 mM EDTA durchgeführt.
- 2.2 - Es wird mit dem Oligonukleotid gekoppelt:
- (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1) auf die Säule, wie in Beispiel 1 angegeben. Das Plasmid pXh12563 wurde mit Hilfe des Kits Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison) unter Befolgungen der Empfehlungen des Herstellers gereinigt. Die in diesem Beispiel verwendeten Puffer sind die folgenden:
- Puffer F: 0,1 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 5.
- Puffer E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
- Die Säule wird mit 6 ml Puffer F gewaschen, dann werden 100 ug des Plasmids pXh2563, verdünnt in 400 ul Puffer F, auf die Säule aufgebracht und eine Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Säule wird mit 10 ml Puffer F gewaschen, dann erfolgt die Elution mit Puffer E. Es wird der Gehalt an genomischer oder chromosomaler DNA von E. coli, der in den Proben des Plasmids vor und nach der Passage über die Oligonukleotidsäule vorhanden ist, gemessen. Diese genomische DNA wird mittels PCR unter Verwendung von Primern in dem Gen galK von E. coli bestimmt. Gemäß dem folgenden Protokoll: Die Sequenz dieser Primer ist von Debouck et al. (Nucleic Acids Res., 1985, 13, 1841-1853) beschrieben:
- Das Reaktionsmedium umfasst in 25 ul PCR-Puffer (Promega Frankreich, Charbonnières): 1,5 mM MgCl&sub2;; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 um an Primer; 20 E/ml Taq- Polymerase (Promega). Die Reaktion wird gemäß der folgenden Sequenz durchgeführt:
- - 5 min bei 95ºC
- - 30 Zyklen zu 10 s bei 95ºC
- 30 s bei 60ºC
- 1 min bei 78ºC
- - 10 min bei 78ºC.
- Das amplifizierte DNA-Fragment mit einer Länge von 124 Basenpaaren wird durch Elektrophorese über 3% Agarosegel in Gegenwart von SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA) abgetrennt, dann unter Bezugnahme auf einen Standard an genomischer DNA Ultrapur von E. coli, Stamm B quantitativ bestimmt (Sigma, réf. D4889).
- Es wird 1% chromosomale DNA in der auf die Säule aufgetragenen Probe und 0,2% in der über die Oligonukleotidsäule gereinigten Probe erhalten.
- Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung der Plasmid-DNA, ausgehend von einem klaren Lysat der Bakterienkultur, mit der sogenannten "miniprep"-Leiter: 1,5 ml einer Nachtkultur von DH5α-Stämmen, die das Plasmid pXL2563 enthalten, werden zentrifugiert und der Bodensatz wird in 100 ul 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA resuspendiert. Es werden 200 ul 0,2 M NaOH, 1% SDS hinzugefügt und die Röhrchen werden durch Umkehren geschüttelt, dann werden 150 ul 3 M Kaliumacetat, pH 5, hinzugefügt und die Röhrchen werden durch Umkehren geschüttelt. Nach Zentrifugation wird der Überstand wiedergewonnen und auf die Oligonukleotidsäule, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, geladen. Die Fixierung, die Waschungen und die Elution sind identisch mit denen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Es werden etwa 1 ug Plasmid aus 1,5 ml Kultur erhalten. Das erhaltene Plasmid, das durch Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung analysiert wurde, liegt in Form einer einzigen Bande "super coil"-zirkulärer DNA vor.
- Keine Spur von DNA mit hohem Molekulargewicht (chromosomal) noch von RNA ist in dem nach diesem Verfahren gereinigten Plasmid nachweisbar. Das Verhältnis der optischen Dichten bei 260 und 280 nm liegt über 2.
- 4.1: Dieses Beispiel beschreibt einen Reinigungsversuch von Plasmid-DNA, der unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 durchgeführt wurde, ausgehend von 20 ml Bakterienkultur der Stämme DH5α, die das Plasmid pXL2563 enthalten. Der zelluläre Bodensatz wird in 1,5 ml 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA aufgenommen. Die Lyse erfolgt durch 2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS und die Neutralisation durch 1,5 ml 3 M Kaliumacetat, pH 5. Die DNA wird anschließend durch 3 ml 2-Propanol gefällt, der Bodensatz wird mit 0,5 ml 0,2 M Natriumacetat, pH 5, 0,1 M NaCl aufgenommen und auf die wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltene Oligonukleotidsäule geladen. Die Fixierung, die Waschung der Säule und die Elution erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgenommen, dass die Molarität des Waschpuffers an NaCl 0,1 M beträgt. Es werden etwa 16 ug Plasmid-DNA erhalten. Das erhaltene Plasmid, das durch Elektrophorese über Agarosegel und Anfärbung mit Ethidiumbromid analysiert wird, liegt in Form einer einzigen "super coil"-zirkulären DNA-Bande vor. Keine Spur von DNA mit hohem Molekulargewicht (chromosomal) noch von RNA ist in dem gereinigten Plasmid nachweisbar. Die Spaltung des Plasmids mit einem Restriktionsenzym ergibt eine einzige Bande mit einem erwarteten Molekulargewicht von 3 Kilobasen. Die Proteinkonzentration in den Proben reicht von 125 ug/ml in dem klaren Lysat bis weniger als 1 ug/ml in dem gereinigten Plasmid (Bestimmung Micro-BCA, Pierce). Die Konzentration an Endotoxinen, abgeschätzt durch die Bestimmung von LAL (Biosepra), teilt sich um einen Faktor über 10 in dem gereinigten Plasmid, bezogen auf das klare Ausgangslysat.
- 4.2: Das verwendete Plasmid umfasst eine Kassette, die den Promotor des Cytomegalievirus, das Gen, das Luziferase codiert, und die Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz (GAA)17 aus dem Plasmid pXL2563 enthält. Der Stamm DH1 (Maniatis et al., 1989), der dieses Plasmid enthält, wird in einem 7-Liter-Fermenter gezüchtet. Ein klares Lysat wird ausgehend von 200 Gramm Zellen erhalten: der zelluläre Bodensatz wird in 2 Liter 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM Glucose, 10 mM EDTA aufgenommen, denen man 2 Liter 0,2 M NaOH, 1% SDS zusetzt. Das Lysat wird durch Zugabe eines Liters 3 M Kaliumacetat neutralisiert. Nach Diafiltration werden 4 ml dieses Lysats auf einer HiTrap-NHS-Säule zu 5 ml, die an das Oligonukleotid der Sequenz
- 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1) gemäß dem in Beispiel 1.1. beschriebenen Verfahren gekoppelt wurde, aufgebracht. Die Waschung und die Elution erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben. Es werden etwa 400 Mikrogramm Plasmid gewonnen. Der Gehalt an genomischer DNA in dieser Probe, gemessen durch die in Beispiel 2.2 beschriebene Technik, beträgt 0,1%.
- Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung eines Oligonukleotids, das methylierte Cytosine trägt.
- Die verwendete Oligonukleotidsequenz ist die folgende:
- Dieses Oligonukleotid besitzt eine NH&sub2;-Gruppierung in 5'. MeC = 5-Methylcytosin. Dieses Oligonukleotid erlaubt die Reinigung des Plasmids pXL2563 unter den Bedingungen von Beispiel 1 mit einem Bindungspuffer von pH 5 (so wird das Risiko des Plasmidabbaus vermindert).
- In den vorstehenden Beispielen wird das verwendete Oligonukleotid am 5'-terminalen Ende mit einer Amingruppierung, gebunden an Phosphat durch einen Arm, der 6 Kohlenstoffatome enthält, modifiziert: NH&sub2;-(CH&sub2;)&sub6;. In diesem Beispiel ist die Amingruppierung an das Phosphat an 5'-terminalen Ende über einen Arm von 12 Kohlenstoffatomen: NH&sub2;-(CH&sub2;)&sub1;&sub2; gebunden. Die Kopplung des Oligonukleotids und die Passage über die Säule erfolgen wie in Beispiel 2 angegeben, mit Puffer F: 2 M NaCL, 0,25 M Acetat, pH 4,5. Dieses Oligonukleotid erlaubt den Erhalt von besseren Reinigungsausbeuten: es wird eine Ausbeute von 53% erhalten, während mit dem Oligonukleotid mit 6 Kohlenstoffatomen unter den gleichen Bedingungen die Ausbeute im Bereich von 45% liegt.
- Unter Befolgung der in Beispiel 1.2 beschriebenen Clonierungsstrategie wurden zwei andere Plasmide, die Homopurin-Homopyrimidin-Sequenzen tragen, konstruiert: das Plasmid pXh2725, das die Sequenz (GGA)&sub1;&sub5; enthält, und das Plasmid pXh2726, das die Sequenz (GA)&sub2;&sub5; enthält.
- Die Plasmide pXL2725 und pXL2726, die dem Plasmid pXh2563 analog sind, wurden gemäß der in Beispiel 1.2 beschriebenen Clonierungsstrategie unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidpaare konstruiert:
- Das Paar Oligonukleotide 5986 und 5987 wurde zur Konstruktion des Plasmids pXL2726 verwendet, indem die Oligonukleotide in die BamHI- und EcoRI-Spaltstellen von pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) cloniert wurden, während die Oligonukleotide 5981 und 5982 zur Konstruktion des Plasmids pXL2725 verwendet wurden. Die gleichen experimentellen Bedingungen wie für die Konstruktion des Plasmids pXL2563 wurden verwendet, und nur die Paare der Oligonukleotide wurden verändert. Ebenso wurden die clonierten Sequenzen durch Sequenzierung an den Plasmiden bestätigt. Dies erlaubte zu sehen, dass das Plasmid pXh2725 eine Modifikation bezogen auf die erwartete Sequenz anstelle der 17fach repetierten Sequenz GAA enthält, d. h. GGAGA(GGA)&sub1;&sub5; (SEQ ID NO: 17).
- Die Oligonukleotide, die die Tripel-Helices mit diesen Homopurin-Sequenzen bilden, wurden an HiTrap-Säulen nach der in Beispiel 1.1 beschriebenen Technik gekoppelt. Es handelt sich um das Oligonukleotid der Sequenz
- 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (SEQ ID NO: 18) zur Reinigung des Plasmids pXL2725 und das Oligonukleotid der Sequenz
- 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEQ ID NO: 19) zur Reinigung des Plasmids pXL2726.
- Die zwei so erhaltenen Säulen erlaubten die Reinigung der entsprechenden Plasmide gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Technik, mit den folgenden Puffern:
- Puffer F: 2 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 4,5.
- Puffer E: 1 M Tris, HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
- Die erhaltenen Ausbeuten betragen 23% und 31% für pXL2725 bzw. pXL2726.
- Dieses Beispiel erläutert den Einfluss der Länge der spezifischen Sequenz, die auf dem Plasmid vorhanden ist, auf die Reinigungsausbeuten.
- Das in diesen Experimenten verwendete Reportergen zum Nachweis der Aktivität der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist das Gen, das Luziferase codiert (Luc).
- Das Plasmid pXL2621 umfasst eine Kassette, die den Promotor des Cytomegalievirus (CMV) von 661 bp, extrahiert aus pcDNA3 (Invitrogen, Corp., San Diego, CA) durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen MluI und HindIII enthält, die stromaufwärts des Gens, das Luziferase codiert, an die Spaltstellen MluI und HindIII in den Basisvektor pGL (Promega Corp., Madisson, WI) cloniert worden war. Dieses Plasmid wurde unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert.
- Die Plasmide pXL2727-1 und pXL2727-2 wurden wie folgt konstruiert.
- Zwei Mikrogramm des Plasmids pXL2621 wurden durch BamHI linearisiert; das Enzym wurde durch eine 10minütige Behandlung bei 65ºC inaktiviert; parallel wurden die Oligonukleotide 6006 und 6008 wie für die Konstruktion des Plasmids pXL2563 beschrieben hybridisert.
- Dieses Hybridisierungsgemisch wurde an die BamHI-Enden des Plasmids pXL2621 cloniert und nach Transformation in DH5α wurden rekombinante Clone durch Analyse durch enzymatische Restriktionsspaltung mit PstI markiert, dann wurden die Oligonukleotide an eine PstI-Stelle eingeschleust. Zwei Clone wurden erhalten und die Nukleotidsequenz des clonierten Fragments wurde unter Verwendung des Primers (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACT-3' (SEQ ID NO: 22)) als Starter der Reaktion der Sequenz bestätigt (Viera J. und J. Messing, 1982. The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19: 259-268).
- Der erste Clon (pXL2727-1) enthält die 10fach repetierte GAA-Sequenz. Der zweite (pXL2727-2) enthält die Sequenz 5'- GAAGAAGAG(GAA)&sub7;GGAAGAGAA-3' (SEQ ID NO: 23).
- Es wird eine Säule wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet und diese wird an das Oligonukleotid 5'- GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1) gekoppelt.
- Das Plasmid pXL2727-1 enthält 14 Repetitionen der GAA- Sequenz. Das vorstehend beschriebene Oligonukleotid, das nur 7 Repetitionen der entsprechenden Hybridisierungssequenz CTT enthält, kann nun mit dem Plasmid in 8 verschiedenen Positionen hybridisieren. Das Plasmid pXL2727-2 im Gegensatz dazu besitzt eine hybridisierende Sequenz (GAA) der gleichen Länge, wie diejenige des an die Säule gebundenen Oligonukleotids. Dieses Oligonukleotid kann nun nur an einer Position auf pXL2727-2 hybridisieren.
- Das Experiment ist identisch mit demjenigen, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, mit den folgenden Puffern:
- Puffer F: 2 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 4,5.
- Puffer E: 1 M Tris, HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
- Die Reinigungsausbeute beträgt 29% mit dem Plasmid pXL2727-1 und 19% mit dem Plasmid pXL2727-2.
- Die verwendeten Zellen sind NIH-3T3-Zellen, die am Vorabend des Experiments in Mikrotiterplatten zu 24 Kavitäten in einer Menge von 50.000 Zellen/Kavitäten ausgesät wurden. Das Plasmid wird in 150 mM NaCl verdünnt und mit dem Lipofektant RPR115335 vermischt. Es wird ein Verhältnis von positiven Ladungen an Lipofektant/negative Ladungen der DNA von gleich 6 verwendet. Das Gemisch wird verwirbelt, 10 Minuten bei Umgebungstemperatur belassen, in einem Medium ohne fötales Kälberserum verdünnt, dann den Zellen in einer Menge von 1 ug/DNA pro Vertiefung zugesetzt. Nach zwei Stunden bei 37ºC werden 10% Volumen- zu-Volumen fötales Kälberserum hinzugefügt und die Zellen werden 48 Stunden bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und die Luziferase-Aktivität wird gemäß dem beschriebenen Protokoll (Kit Promega, Promega Corp. Madison, WI) mit einem Luminometer LB9501 (EG und G Berthold, Evry) gemessen. Das Plasmid pXL2727-1, das wie in Beispiel 8.2 beschrieben gereinigt wurde, ergibt Transfektionsausbeuten, die zweimal so hoch sind wie diejenigen, die mit dem gleichen Plasmid, das mit dem Kit Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI) gereinigt wurde, erhalten wurden.
- (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: RHONE POULENC RORER
- (B) STRASSE: 20 AVENUE RAYMOND ARON
- (C) ORT: ANTONY CEDEX
- (E) LAND: FRANKREICH
- (F) POSTLEITZAHL: 92165
- (G) TELEFON: 40.91.69.22
- (H) TELEFAX: 40.91.72.91
- (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: REINIGUNG VON DNA DURCH BILDUNG EINER TRIPEL-HELIX MIT EINEM IMMOBILISIERTEN NUKLEOTID
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 25
- (iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
- (A) DATENTRÄGER: Diskette
- (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0,
- Version #1.30 (OEB)
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE; 19 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 3:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 13 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 4:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 19 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 5:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 19 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 6:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 19 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 7:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 8:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 58 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 9:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 58 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 10:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
- (ix) MERKMAL:
- (D) SONSTIGE ANGABEN: alle Cytosine C der Sequenz sind methyliert. (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 12:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 58 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 13:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 58 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 14:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN;
- (A) LÄNGE: 58 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 15:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 58 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 16:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 50 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 17:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 18:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 26 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 19:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 66 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS; cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 20:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 66 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 21:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 22:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 39 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 23:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 27 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 24:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 27 Basenpaare
- (B) ART: Nukleotid
- (G) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 25:
Claims (30)
1. Verfahren zur Herstellung eines Medikaments auf der
Basis einer zirkulären doppelsträngigen DNA, dadurch
gekennzeichnet, dass es mindestens eine Stufe
der Reinigung umfasst, in der man eine Lösung, die diese
DNA im Gemisch mit anderen Bestandteilen enthält, über
einen chromatographischen Träger leitet, an den covalent
ein Oligonukleotid gekoppelt ist, das durch Hybridisierung
eine Tripel-Helix mit einer spezifischen
Homopurin/Homopyrimidin-Sequenz, die auf der DNA vorhanden ist, bilden
kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass die Lösung, die die DNA enthält,
ein zelluläres Lysat ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, dass das zelluläre Lysat ein klares
Lysat ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass die doppelsträngige DNA
vorgereinigt ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische
Sequenz künstlich in die doppelsträngige DNA eingeführt
wurde.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid eine poly-CTT-
Sequenz umfasst und die spezifische Sequenz, die auf der
DNA vorhanden ist, eine poly-GAA-Sequenz ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid die Sequenz
GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID NO: 1) besitzt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid die Sequenz
(CTT)&sub7; (SEQ ID NO: 26) besitzt.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische Sequenz,
die auf der DNA vorhanden ist, die Sequenz (GAA)&sub7;, (GAA)&sub1;&sub4;
oder (GAA)&sub1;&sub7; umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische Sequenz, die auf
der DNA vorhanden ist, die Sequenz SEQ ID NO: 5 umfasst
und das Oligonukleotid die Sequenz SEQ ID NO: 6 oder SEQ
ID NO: 7 umfasst.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische Sequenz, die auf
der DNA vorhanden ist, die Sequenz SEQ ID NO: 17 umfasst
und das Oligonukleotid die SEQ ID NO: 18 umfasst.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische Sequenz, die auf
der DNA vorhanden ist, die Sequenz (GA)&sub2;&sub5; umfasst und das
Oligonukleotid die Sequenz SEQ ID NO: 19 umfasst.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische
Sequenz eine spezifische Sequenz ist, die natürlicherweise
auf der doppelsträngigen DNA vorhanden ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch
gekennzeichnet, dass die natürlicherweise auf der DNA
vorhandene spezifische Sequenz eine Homopurin-
Homopyrimidin-Sequenz ist, die im Replikationsorigin eines
Plasmids vorhanden ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische DNA ganz oder
teilweise die Sequenz SEQ ID NO: 2 umfasst, die im
Replikationsorigin ColE1 von E. coli enthalten ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid die Sequenz SEQ
ID NO: 3 umfasst.
17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische DNA-Sequenz die
ganz oder teilweise die Sequenz SEQ ID NO: 4 oder die
Sequenz SEQ ID NO: 8 umfasst, die in dem β-Lactamasegen
des Plasmids pBR322 enthalten sind.
18. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das
Oligonukleotid an den chromatographischen Träger durch
Disulfid-, Thioether-, Ester-, Amid- oder Amin-Bindung
gekoppelt ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch
gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid an dem
chromatographischen Träger über einen Spacer, bestehend
aus einer Kohlenstoffkette (CH2)n, angebracht ist, worin n
eine ganze Zahl zwischen 1 und 18 einschließlich ist,
wobei der Spacer an das Oligonukleotid durch ein Phosphat
und an die Säule durch eine Amidbindung gebunden ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch
gekennzeichnet, dass der Spacer aus einer linearen
Kohlenstoffkette mit 6 Kohlenstoffatomen besteht.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch
gekennzeichnet, dass der Spacer aus einer linearen
Kohlenstoffkette mit 12 Kohlenstoffatomen besteht.
22. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das
Oligonukleotid mindestens eine chemische Modifikation
zeigt, die es gegenüber Nukleasen resistent macht oder
davor schützt, oder dessen Affinität für die spezifische
Sequenz erhöht.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch
gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid eine
Homopyrimidin-Sequenz umfasst, worin mindestens eines der
Cytosine methyliert ist.
24. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die DNA
weiterhin eine oder mehrere Sequenz(en) von
therapeutischem Interesse umfasst.
25. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die
doppelsträngige DNA eine zirkuläre DNA, wie ein Plasmid,
ist.
26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass die spezifische Sequenz, die auf
der doppelsträngigen DNA vorhanden ist, mehrere
Hybridisierungspositionen mit dem Oligonukleotid umfasst.
27. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass das Medikament einen Gehalt an
chromosomaler DNA von kleiner oder gleich 0,5% besitzt.
28. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch
gekennzeichnet, dass das Medikament einen Gehalt an
chromosomaler DNA von kleiner oder gleich 0,2% besitzt.
29. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch
gekennzeichnet, dass das Medikament einen Gehalt an
chromosomaler DNA von kleiner oder gleich 0,1% besitzt.
30. Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA, dadurch
gekennzeichnet, dass es mindestens eine
Stufe umfasst, bei der man eine Lösung, die die DNA im
Gemisch mit anderen Bestandteilen enthält, über einen
chromatographischen Träger leitet, auf den covalent ein
Oligonukleotid gekoppelt ist, das die Hybridisierung eines
Tripel-Helix mit einer spezifischen
Homopurin/Homopyrimidin-Sequenz bilden kann, die auf der DNA vorhanden
ist.
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