UA72421C2 - A process for dna purifying by formation of triple helix with immobilized oligonucleotides (variants) - Google Patents
A process for dna purifying by formation of triple helix with immobilized oligonucleotides (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- UA72421C2 UA72421C2 UA97062835A UA97062835A UA72421C2 UA 72421 C2 UA72421 C2 UA 72421C2 UA 97062835 A UA97062835 A UA 97062835A UA 97062835 A UA97062835 A UA 97062835A UA 72421 C2 UA72421 C2 UA 72421C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- sequence
- fact
- dna
- oligonucleotide
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 102
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 15
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 10
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 3
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 30
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 2
- -1 amino- Chemical class 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 2
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N (3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolane-2,4-diol Chemical compound CO[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXCOIQLTGGBRJE-XLPZGREQSA-N 7-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2C=C1 NXCOIQLTGGBRJE-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100346154 Caenorhabditis elegans oma-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- FUHMZYWBSHTEDZ-UHFFFAOYSA-M bispyribac-sodium Chemical compound [Na+].COC1=CC(OC)=NC(OC=2C(=C(OC=3N=C(OC)C=C(OC)N=3)C=CC=2)C([O-])=O)=N1 FUHMZYWBSHTEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical group CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 229940096913 pseudoisocytidine Drugs 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/924—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis using nanostructure as support of dna analysis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Description
Настоящее изобретение относится к новому способу очистки ДНК. Способ согласно изобретению позволяет бьістро очищать двунитевую ДНК, используемую в фармакологии. Более конкретно, в способе очистки согласно изобретению используют специфическую гибридизацию между последовательностью ДНК и олигонуклеотидом.
Методь генной и клеточной терапии в настоящее время получили широкое развитие. Однако, для зтих методов необходимо располагать возможностью получения значительньїх количеств ДНК фармацевтической чистотьі. В самом деле, в случає зтих новьїх видов терапии лекарственное средство часто образовано самой
ДНК, и необходимо иметь возможность получать, в соответствующих количествах, вьіделять и очищать соответствующим образом ДНК для целей терапевтического использования в случає человека.
В настоящем изобретениий описьввается новьій простой и особенно зффективньій способ очистки ДНК.
Зтот способ в особенности позволяет достигать найболееє вьісокой чистоть при вьісоких вьходах.
Способ согласно изобретению базируется главньм образом на специфическом взаймодействиий между включенной в очищаеємую ДНК последовательностью и олигонуклеотидом, состоящим из природньїх или модифицированньйх оснований.
Недавно бьло показано, что некоторне олигонуклеотидь! способньї специфически взаймодействовать в большом просвете двойной спирали ДНК с образованием локально тройньхх спиралей, приводящих к ингибированию транскрипции генов-мишеней (Неїепе и Тоціте, Віоспет- Віорпуз. Асіа, 1049, 99, (1990)). Зти олигонуклеотидьії селективно распознают двойную спираль ДНК на уровне олигопуриновой- олигопиримидиновой последовательностей, то есть на уровне сайтов, обладающих олигопуриновой последовательностью на нити и олигопиримидиновой последовательностью на комплементарной нити, и образуют там локально тройную спираль. Основания третьей нити (олигонуклеотид) образуют водороднье связи (связи Ноодзієеп или противоположно Ноодвіееп) с пуринами пар оснований Уотсон-Крика.
Использование зтого типа взаймодействия для вьіделения плазмидь описьваєтся в уровне техники. Так,
Ко и др. (РМАБ, 89, 495 (1992)) описьявают использование биотинилированньх олигонуклеотидов, способньх распознавать определенную последовательность плазмидь! и образовьвать с ней тройную спираль. Таким образом полученнье комплексь! затем вводят в контакт с магнитньіми шариками, покрьітьїми стрептавидином.
Взаймодействие между биотином и стрептавидином тогда позволяет вьіделить плазмиду путем отделения с помощью магнита шариков, затем злюирования. Однако, зтот способ обладаєт некоторьми недостатками. В частности, необходимь! два специфических последовательньїх взаймодействия: опервое - между олигонуклеотидом и плазмидой, второе - между биотинилированньм комплексом и шариками со стрептавидином. Кроме того, конечньій раствор может бьть загрязнен биотинилированньм олигонуклеотидом, которьй не может бьіть использован в фармацевтической композиции.
В настоящем изобретенийи описьівается новьій улучшенньій способ очистки ДНК, в котором прибегают к зтому типу взаймодействия. Более конкретно, в способе согласно изобретению используют олигонуклеотидь,, ковалентно связанньсе с носителем. Зтот способ является особенно бьістрь!м и приводит к особенно вьісокКим вьіїходам и особенно вьісоким степеням чистотьі. С другой стороньі, он позволяет очищать ДНК, исходя из сложньїх смесей, включающих, в частности, другие нуклеийновье кислоть, протеинь, зндотоксинь! (такие, как липополисахаридь!), нуклеазьй и т.д... Мспользуемье носители, кроме того, могут бьть легко повторно использованьі, и полученнье ДНК обладают улучшенньми свойствами фармацевтической безопасности.
Наконец, для зтого способа, в противоположность уровню техники, требуется одна стадия.
Первьім обьектом изобретения, следовательно, является способ очистки двунитевой ДНК, согласно которому раствор, содержащий вьишеуказанную ДНК в смеси с другими компонентами, пропускают через носитель, с которьм ковалентно связан олигонуклеотид, способньй образовьвать путем гибридизации тройную спираль со специфической последовательностью, имеющейся в вьшеуказанной ДНК.
Специфической последовательностью может бьіть последовательность, имеющаяся по своей природе в двунитевой ДНК, или синтетическая последовательность, искусственно введенная в двунитевую ДНК.
Используемьми в настоящем изобретений олигонуклеотидами являются олигонуклеотидь, гибридизующиеся непосредственно с ДНК в виде двойной нити. Зти олигонуклеотидьі могут содержать следующие основания: - тимидин (Т), которьій способен образовьвать триплеть! с дублетами АТ двунитевой ДНК (На)адораї и др., Віоспет., 28, 7859 (1989)); - аденин (А), которьй способен образовьівать триплеть с дублетами А.Т. двунитевой ДНК; - гуанин (С), которьй способен образовьвать триплеть : с дублетами 2.С двунитевой ДНК; - протонированньй цитозин, (С -), которьій способен образовьшвать триплетьь с дублетами (с. двунитевой ДНК (На)адораї и др., см. вьіше); - урацил (и), которьій способен образовьвать триплеть с парами оснований А.Ш или А.Т.
Предпочтительно, используемьй олигонуклеотид включаєт обогащенную цитозинами гомопиримидиновую последовательность, а специфическая последовательность имеющаяся в ДНК, представляет собой гомопуриновую-гомопиримидиновую последовательность. Присутствие цитозинов позволяет иметь тройную спираль, стабильную при кислом значений рН, где цитозинь! протонировань, и дестабилизированную при щелочном значении рн, где цитозиньі нейтрализовань!.
Для того, чтобьї могло произойти образование тройной спирали путем гибридизации, важнь!м является то, чтобьї олигонук-леотид и специфическая последовательность, имеющаяся в ДНК, бьли комплементарньми. В зтом отношений, для достижения найлучших вьіїходов и найлучшей селективности, в способе согласно изобретению используют обязательно комплементарнье олигонук-леотид и специфическую последовательность. Речь может идти, в частности, об олигонуклеотиде поли-СТТ и специфической последовательности поли-САА. В качестве примера можно назвать олигонуклеотид с последовательностью 5в-адсасттоттсоттотсттоттстт-З3|ЇаАСа (СТТ);7; последовательность Мо 1)|, в котором основания СОДОС не образуют тройной спирали, но позволяют отделять промежутком олигонуклеотид от плеча связьівания; можно также назвать последовательность (СТТ)7 (последовательность Ме26). Зти олигонуклеотидь! способнь образовьшвать тройную спираль со специфической последовательностью, включающей комплементарнье злементь! (ЖАА). В частности, речь может идти о сайте, включающем 7, 14 или 17 злементов САА, как описьіваєтся в примерах.
Другой, представляющий интерес, специфической последовательностью является последовательность: 5Б-ААдсспАас,сапсАасАпАсаАА - 3' (последовательность Ме 5).
Зта последовательность образует тройную спираль с олигонуклеотидами: - ААССАСА;аСОСАспапАсОааАА - 3' (последовательность Ме б) или 5- пастатастасатоасватт - 3 (последовательность Мо7).
В зтом случає олигонуклеотид фиксируется в антипараллельном направлений на полипуриновой нити.
Зти тройнье спирали устойчивь! только в присутствиий Мд?" (Маздие? и др., Віоспетівігу, Зж, 7243-7251 (1995);
Веаї и Оєгуап, 5сієпсе, 251, 1360-1363 (1991)).
Как указано вьіше, специфическая последовательность может представлять собой, присутствующую по своей природе (естественно) в двунитевой ДНК, или синтетическую последовательность, введенную искусственно в двунитевую ДНК. Особьй интерес представляет использование олигонуклеотида, способного образовьшвать тройную спираль с последовательностью, присутствующей по своей природе в двунитевой
ДНК, например, в сайте репликации плазмидьй или в гене-маркере. В зтом отношении заявитель проанализировал последовательности плазмид и смог показать, что некоторье сайть! (области) зтих ДНК, особенно в исходном пункте репликации, могут содержать гомопуриновьне-гомопирими-диновье участки.:
Синтез олигонуклеотидов, способньх образовьшвать тройнье спирали с о зтими естественньіми гомопуриновьіми-гомопиримидиновьмми участками, позволяєт предпочтительно применять способ согласно изобретению к немодифицированньім плазмидам, особенно к имеющимся в продаже плазмидам типа рис, рВАЗ22, рОМ, и т.д. Из гомопуриновьх-гомопиримидиновьїх последовательностей, присутствующих естественно в двунитевой ДНК, можно назвать последовательность, включающую всю или часть после- довательности 5- СТ СССОААдасаАаАААссО-З'їЇпоследовательность Ме2), имеющуюся в исходном пункте репликации СоїЕЇ Е.соїї. В зтом случає нуклеотид, образующий тройную спираль, имеет последовательность: вБ-ЯАдАдс;саттсттссСсСстТотТттоо-3 (последовательность Ме 3) и альтернативно фиксируется на двух нитях двойной спирали, как описьівают Веаї и Оегуап (д.Ат.СПпет.5ос., 114, 4976-4982 (1992)) и дауазепа и доппвіоп (Мисієїс Асідз Вев:/ 20 г 5279-5288 (1992)). Также можно назвать последовательность 5-ААААдаадАаАс-
З (последовательность Ме 4) гена р-лактамазьї плазмидьії рВАЗ22 (рима!-Маїіепійп и др., Ргос- Маї). Асад. 5сі-
ОБА, 89, 504-508 (1992)). Использование олигонуклеотида, способного образовьшать тройную спираль с последовательностью, )имеющейся в исходном пункте репликации или гене-маркере, особенно предпочтительно, так как она позволяєт, с помощью одного и того же олигонуклеотида, очищать любую ДНК, содержащую вьпшеуказанньй сайт репликации или вьшеуказанньй ген-маркер. Следовательно, нет необходимости модифицировать плазмиду или двунитевую ДНК для встраийвания в нее специфической искусственной последовательности.
Хотя предпочтительньі полностью комплементарнье последовательности, однако, следует иметь в виду, что могут бьть допустимь! некоторье коньюгации между последовательностью ; олигонуклеотида и присутствующей в ДНК последовательностью того момента, как только они не приводят к слишком большой потере сродства. Можно назвать последовательность 5-АААААДасСОаААТАдОСаИ-3! (последовательность Мо 8) имеющуюся в гене р-лактамазьй Е.соїї. В зтом случае тимин, прерьвающий полипуриновую последовательность, может распознаваться гуанином третьей нити, образующим таким образом триплет
АТ.С, которьй стабилен, когда он вставлен между двумя триплетами ТАТ (Кіеввіїпд и др. , Віоспетівігу, 31, 2829-2834 (1992)).
Согласно особому варианту осуществления, олигонуклеотидьі согласно изобретению включают последовательность (ССТ)пП, последовательность (СТ)и или последовательность (СТТ)»,, в которой "п" означает целое число от 1 до 15 включительно. Особенно предпочтительно использовать последовательности типа (СТ)п или (СТТ)п. Заявитель в самом деле показал, что на зффективность очистки влияет количество С в олигонуклеотиде. В частности, как указано в примере 7, зффективность очистки повьишается, когда олигонуклеотид включаеєт меньше цитозинов. Само собой разумеется, что олигонуклеотидь!ї согласно изобретению также могут сочетать в себе злементь! (СТТ), (СТ) или (СТТ).
Используемьй олигонуклеотид может бьіть природньїм (состоящим из природньїх, немодифицированньйх оснований) или химически модифицированньім. В частности, олигонуклеотид предпочтительно может бьть подвергнут некоторьм химическим модификациям, позволяющим повьішать его резистентность или его защиту по отношению к нуклеазам или его сродство по отношению к специфической последовательности.
Согласно настоящему изобретению под олигонуклеотидом также понимают любую последовательность нуклеозидов, претерпевших модификацию скелета с целью придания большей устойчивости по отношению к нуклеазам. Из возможньїх модификаций можно назвать фосфоротиоатнье олигонуклеотидь!і, которье спо- собнь!ї образовьзвать тройнье спирали с ДНК (Ходо и др., Мисієїс Асіаз Вев., 2 2, 3322-3330 (1994)), точно также, как олигонуклеотидьї, обладающие формацетальньм или метилфосфонатньім скелетами (Майеиссі и др. , У. Ат. Спет. бос, 113, 7767-7768 (1991)) . Также можно использовать олигонуклеотидь, син- тезированнье с р-аномерами нуклеотидов, которне также образуют тройньіе спирали с ДНК (Ге Ооапи др.,
Мисієїс Асіає Нев., 15, 7-749-7760 (1987)). Другой модификацией скелета являєтся фосфорамидатная связь.
Можно назвать, например, межнуклеотидную фосфорамидатную МУ -Р5' связь, описанную Стгуагпом и Спеп, которая дает олигонуклеотидьі, образующие с ДНК особенно стабильнье тройньсе спирали (У. Ат. Спет. бос, 116, 3143-3144 (1994). Мз других модификаций скелета можно также назвать использование рибонуклеотидов, 2'-О-метилрибозьі, сложньїх фосфодизфиров ... (Зип и НеїЇєпе, Ситт. Оріпіоп Бігисі.Віо! ., 116, 3143-3144). Содержащий фосфор скелет, наконец, может бить заменен полиамидньм скелетом, как в ПНК (пептидньіе нуклеиновье кислоть!), которне также могут образовьшвать тройнье спирали (Мієїзєп и др.,
Зсієпсе, 254, 1497-1500 (1991); Кіт и др., у. Ат. Спет. бос, 115, 6477-6481 (1993)), или скелетом на основе гуанидина, как в ДНГ (дезоксирибонуклеиновье гуанидинь!; Ргос.Маї!. Асад. 5сі. ОБА, 927 6097-6101 (1995), :
аналогичньїх поликатионньїх ДНК, которье также образуют тройнье спирали.
Тимин третьей нити также может бьіть заменен 5-бромураци-лом, в результате чего повьішаєтся сродство олигонуклеотида к ДНК (Роузіс и Оегуап, У. Ат. Спет. бос, 111, 3059-3061 (1989)). Третья нить также может содержать неприродного происхождения основания, из которьїх можно назвать 7-деаза-2'--дезоксиксантозин (Міпідап и др., Мисієїс Асіаз Нев., 21, 327-333 (1993)), 1-(2-дезокси-р-ЮО-рибофуранозил)-3-метил-5-амино-1Н- пиразоло/4,3-д/пиримидин-7-он (Копй и Оег/ап, дУ.Ат. Спет, бос, Ох, 1470-1478 (1992)), 8-оксоаденин, 2- аминопурин, 2'-0-метил-псевдоизоцитидин, или любую другую модификацию, известную специалисту (см. обзор Зип и НеІепе, Сшит. Оріпіоп 5ігисі. Віої. 3, 345-356 (1993)).
Целью другого типа модификации олигонуклеотида предпочтительно является улучшение взаймодействия и/или сродства между олигонуклеотидом и специфической последовательностью. В частности, самая предпочтительная модификация согласно изобретению заключаеєтся в метилирований цитозинов олигонуклеотида (см. пример 5). Таким образом метилированньй олигонуклеотид обладаєт замечательньм свойством образовьшать стабильную тройную спираль со специфической последовательностью в более близких к нейтральному (25) значениях рН. Следовательно, зтот тип модификации позволяет работать при более вьісоких значениях рН, чем в случає олигонуклеотидов уровня техники, то есть при значениях рн, где очень снижень! опасности разрушения плазмидной ДНК.
Длина используемого в способе согласно изобретению олиго-; нуклеотида составляет по крайней мере З основания и предпочтительно от 5 до 30 оснований. Предпочтительно используют олигонуклеотид длиной вьше 10 оснований. Длина может бьіть вибрана специалистом в зависимости от искомьїх селективности и стабильности взаймодействия.
Олигонуклеотидьії согласно изобретению могут бьть синтезированьї любьм известньм способом. В частности, они могут бьіть : полученьї с помощью синтезаторов нуклеиновьїх кислот. Естественно, также может бьіть использован любой другой способ, известньій специалисту.
Для его ковалентного связьшания с носителем олигонуклеотид обьічно функционализируют. Так, он может бьть модифицирован концевой тиольной группой, аминогруппой или карбоксильной группой в положении 5' или 3". В частности, добавление тиольной, амино- или карбоксильной группь! позволяет, напри- мер, связьшвать олигонуклеотид с носителем, которьій содержит дисульфидную, малеиймидную, амино-, карбоксильную, сложнозфирную, зпоксидную, бромциановую или альдегидную функции. Зти сочетания происходят путем образования дисульфидной, простой тиозфирной, сложнозфирной, амидной или аминной связей между олигонуклеотидом и носителем. Может бьть использован любой другой, известньй специалисту метод, такой, как, например, применение бифункциональньх реагентов сочетания.
Кроме того, для улучшения гибридизации со связанньм олигонуклеотидом, может бьть предпочтительньім, чтобьї олигонуклеотид содержал "плечо" и "спейсер" - последовательность оснований. использование плеча на деле позволяет фиксировать олигонуклеотид на вьібранном расстояний от носителя, позволяющем улучшать условия его взаймодействия с ДНК. Плечо предпочтительно образовано линейной углеводородной цепью, включающей 1-18 и предпочтительно 6 или 12 СНе-групп, и амином, способствующим связьіванию с носителем в колонке. Плечо связано с фосфатом олигонуклеотида или "спейсера", состоящего из оснований, не интерферирующих с гибридизацией. Так, "спейсер" может включать пуриновье основания. В качестве примера, "спейсер" может представлять собой последовательность САС. Плечо предпочтительно образовано линейной углеводородной цепью с б или 12 атомами углерода.
Для осуществления настоящего изобретения могут бьіть использовань! различнье типь! носителей. Речь может идти о функционализированньїх носителях, используемьх в хроматографии, в насьпном состояний или предварительно "упакованньїх" в колонку, функционализированньїх пластмассовьх поверхностях или функционализированньхх шариках из латекса, магнитньїх или нет. Речь идет предпочтительно об используемьх в хроматографии носителях. В качестве примера, применяемьми в хроматографий носителями, которье могут бьіть использованьї, являются агаро-за, акриламид или декстран, также, как их производньюе (такиє, как сефадекс, сефароза, супероза, ...), полимерьі), такие, как сополимер стирола с дивинилбензолом, или графт-сополимеризованньій или нет диоксид кремния. Хроматографические колонки могут функционировать по методу диффузии или перфузии.
Для достижения найлучшей зффективности очистки, особенно предпочтительно использовать, в плазмиде, последовательность, включающую несколько положений гибридизации с олиго-нуклеотидом.
Наличие нескольких положений (участков) гибридизации в самом деле благоприятствует взаимодействиям между вьишеуказанной последовательностью и олигонуклеотидом, что приводит Кк улучшению зффективностей очистки. Так, для олиго-нуклеотида, содержащего "п" повторений злементов (ССТ), (СТ) или (СТТ), предпочтительно использовать последовательность ДНК, включающую по крайней мере "п" комплементарньх злементов и предпочтительно (пі-1) комплементарньхх злементов. Содержащая (п--1) комплементарньїх злементов последовательность таким образом имеет два положения гибридизации с олигонуклеотидом. Предпочтительно, последовательность ДНК овключаєт вплоть до 11 положений гибридизации, то есть (п410) комплементарньйх злементов.
Способ согласно изобретению может бьіть использован для очистки любого типа двунитевой ДНК. Речь идет, например, о кольцевой ДНК, такой, как плазмида, включающая обьчно один или несколько генов, представляющих интерес с точки зрения терапиий. Зта плазмида может содержать также источник репли- кации, ген-маркер, и т.д. ... Способ изобретения может бьіть применим непосредственно к клеточному лизату.
При зтом варианте осуществления, плазмиду, амплифицированную путем трансформации, затем клеточной культурой, очищают непосредственно после лизиса клеток. Способ согласно изобретению также может бьть применим к осветленному лизату, то есть к супернатанту, полученному после нейтрализации и центрифугирования клеточного лизата. Зтот способ очевидно также может бьіть применим к предварительно очищенному известньми способами раствору. Зтот способ также позволяет очищать линейную или кольцевую ДНК, включающую представляющую интерес последовательность, исходя из смеси, содержащей
ДНК с различньіми последовательностями. Способ согласно изобретению также может бьіть использован для очистки двунитевой РНК.
Клеточньй лизат может представлять собой лизат прокари-отньїх или зукариотньх клеток.
Что касается прокариотньїх клеток, то можно назвать, например, бактерии Е.соїї, В.5ЦиБНв5, 5уУрпітипйт или 5ігер-ютусез. Что касаєтся зукариотньїх клеток, то можно назвать животнье клетки, дрожжи, грибь и т.д. -... и особенно дрожжи Кіпумеготусез или Засспаготусев или клетки СО5, СНО, С127, МІНЗТЗ, и т.д. ...
Способ согласно изобретению является особенно предпочтительньм, так как он позволяєт бьістро и просто получать плаз-мидную ДНК очень вьісокой степени чистотьі. В частности, как проиллюстрировано в примерах, зтот способ позволяет зффективно отделять рассматриваемую плазмидную ДНК от загрязняющих компонентов, таких, как фрагментированная хромосомная ДНК, зндотоксинь, протеинь, нуклеазь, и т.д. ...
Более предпочтительно, способ согласно изобретению позволяет получать препарат двунитевой ДНК, особенно плазмидной, содержащий хромосомную ДНК в количестве ниже или равном 0,595. Еще более предпочтительно, препарать! ДНК, которне получают, имеют содержание хромососной ДНК ниже или равное 0,295. Следовательно, настоящее изобретение относится к содержащим плазмидную ДНК композициям, используемьмм в фармацевтике, особенно в генной или клеточной терапий. В зтом отношений, обьектом изобретения является также фармацевтическая композиция, содержащая линейную или плазмидную двунитевую ДНК, полученную согласно вьиішеуказанному способу.
Изобретение также относится к препаратам плазмидньїх ДНК с содержанием хромосомной ДНК ниже или равном 0,595, предпочтительно 0,295 и еще более предпочтительно 0,195.
Композиции могут содержать "голую" плазмидную ДНК или плазмидную ДНК, ассоциированную с транспортньїми векторами, такими, как липосомь, наночастиць, катионнье липидь, полимерь, протеинь! или рекомбинантньсє вирусь, и т.д.
Настоящее изобретение описьшваєется далее подробно в нижеследующих примерах, которне нужно рассматривать как иллюстративньсе и не ограничивающие обьема охрань! изобретения.
Общие методь клонирования и молекулярной биологий
Классические методьй молекулярной биологии, такие, как переваривание с помощью ферментов рестрикции, злектрофорез на геле, превращение в Е.соїї, преципитация нуклеиновьїх кислот, и т.д., описань в литературе (Мапіаїйів и др., Т., Е.Р. Епівси, и у).Затбгоок, 1989. "Молекулярное клонирование: пособие для лабораторньх работ", второе издание; Соїй 5ргіпд Наротг І арогаюгу, Соїа бргіпд Натог І арогаюгу Ргев5, Нью-
Йорк; Аизибе!- Е.М., Вгепі В., Кіпвіоп В.Е., Мооге 0.0., Зтіт .А., Зеідтап у... и БІ! К., 1987: "Современнье методики в молекулярной биологии 1987-1988 гг" изд. Чдопп УМіеу и опе, Нью-Йорк). Нуклеотиднье последовательности определяют по методу терминизации цепей согласно уже описанной методике (А!йзибеї и др., 1987).
Ферменть рестрикции бьіли предоставленьї фирмой Меж-Епдіапа Віоїабв, МА (Віоїабзв).
Для лигирований, фрагментьї ДНК инкубируют в буфере из 50 ммоль ТРИС-НС1 с рн-7,4, 10 ммоль хлорида магния, 10 ммоль дитиотреитола, 2 ммоль аденозин-5'--трифосфата (АТФ), в присутствии ДНК-лигазь! фага тТ4 (Віоіарв).
Олигонуклеотидьі синтезируют, используя химию фосфорами-дитов, защищенньїх в положений цианозтильной группой (біп-па М.О., Вієгпаї 9У., МеМапиз 9. и Козієг Н., 1984. Роїутег зиррогї оїїдописієоїйає вупійевії, ХМ: Мспользование Д-цианозтил-М,М-диалкиламино-М-морфолино-фосфоримидита /- де- зоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК с легким снятием защить и вьіделение конечного продукта. мисі. Асіаз Вев., 12, 4539-4557; СіІе5 УЛМУ. 1985. Успехи в автоматизированном синтезе ДНК. Ат. Віогесппої., ноябрь/декабрь), с помощью автоматического синтезатора ДНК Віозеагсі 8600 при использований рекомендаций изготовителя.
Лигированньсе или испьітаннье на их зффективность в отношений трансформации ДНК используют для трансформации продуцирующего компетентного штамма: Е.соїї ОН5 о Е"епа АЇ., пзан1і?, зирЕ44, (І-І, гесАЇї, дугАЗб, геїіАІ, А (ас А-аг9Е)и169, деой, Фвоаїас (ас АМІ15) |.
Минипрепарать! плазмидной ДНК получают согласно методике Ківєїп и др., 1980.
Культуральную среду ІВ используют для вьиіращивания штаммов БЕ.соїї (Мапіаїйів и др., 1982). Штаммь инкубируют при 37"С. Бактерии наносят тонким слоем в чашки со средой ІВ, куда добавлень соответствующие антибиотики.
Пример 1 1.1. Подготовка колонки:
Материал:
Используемая колонка представляєт собой колонку с НіТгар, активированньім М-гидроксисукцинимидом (Фармация) в количестве 1 мл, соединенную с перистальтическим насосом (расход « 1 мл/мин).
Используемьй специфический олигонуклеотид содержит группу МН2 в положений 5". Его последовательность следующая: 5- а«падовасттстстстТтстТтестТтотТт-3 (последовательность Ме1).
Используемьми в зтом примере буферами являются следующие: буфер для реакции связьтвания: 0,2 М гидрокарбоната натрия, 0,5 М хлорида натрия, рн-8,3; буфер А: 0,5 М зтаноламина, 0,5 М хлорида натрия, рН-8,3; буфер Б: 0,1 М ацетата, 0,5 М хлорида натрия, рн--4.
Методика:
Колонку промьівают с помощью б мл Її мМ соляной кислотьї, затем в колонку вносят олигонуклеотид, разбавленньій буфером для реакции связьівания (50 нмоль в 1 мл), и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Колонку промьівают три последовательньх раза с помощью б мл буфера А, затем 6 мл буфера
Б. Олигонуклеотид таким образом связьввается с носителем в колонке за счет связи СОМН. Колонку хранят при температуре 4"С в ЗФР (забуференньй фосфатом физиологический раствор) с 0,195 азида натрия (Мама) и ее можно использовать по крайней мере четьіре раза. 1.2. Конструирование плазмид
Синтезируют два следующих олигонуклеотида: олигонуклеотид 4817: висо сп елучепучелучетучспуепучепучетучепуспутелучелучелуепутев уче (последовательность Ме9); олигонуклеотид 4818: 5Б-ААТТОСТТСТтСтСтСтСТтттттттсттсттсттсттсттсттсттоттоа-3 (последовательность Ме 10)
Зти олигонуклеотидьі, один раз гибридизированнье и клонированнье в плазмиде, вносят в соответствующую плазмиду гомо-пуриновую-гомопиримидиновую последовательность (САА)", как : описано вьіше.
Соответствующую зтим двум гибридизованньм олигонуклеоти-дам последовательность клонируют в многочисленньїх сайтах клонирования плазмидь! рВкКе" (стратагенная система клонирования; Га іфоа С.А.), которая содержит ген устойчивости к ампициллину. Для осуществления зтого, олигонуклеотидь! гиб-; ридизируют следующим образом:
По 1 мкг зтих олигонуклеотидов вместе вносят в 40мл конечного буфера из 50 мМ ТРИС-НСІ, рн-7,4, и 10
ММ хлорида магния. Зту смесь нагревают до 95"С, затем доводят до комнатной температурь! так, чтобь температура понижалась медленно. 10 нг смеси гибридизованньїх олигонуклеотидов лигируют с 200 нг плазмидь! рвВкКО- (стратагенная система клонирования; І а доїа СА), переваривают с помощью Ватні и ЕсоВі в конечном обьеме 30 мкл. После лигирования одну аликвоту превращают в ОН5бо. Смеси после трансформации наносят тонким слоем на среду І, дополненную ампициллином (50 мг/л) и Х-даї! (20 мг/л). У рекомбинантньхх клонов должно отсутствовать синее окрашиваниеє в зтой среде в противоположность родственной плазмиде (рвке"), что допускает о-комплементацию м-фрагмента р-галактозидазь Е.соїї. После минипрепарирования плазмидной ДНК из б клонов, у всех у них исчезаєт сайт РвіїЇ, расположенньій между сайтами ЕсоВіІ и Ватні в рВК5", наблюдается повьішение молекулярной массь! полосьі! РмуціЇ из 448 п.о., содержащей мультисайт клонирования. Получают клон и соответствующую плазмиду назьшвают рхі 2563.
Клонированную последовательность подтверждают последовательностью, используя праймер - 20 (5- тадссоасСАасСААААТа-З3' (последовательность Ме 11)) (Міега У. и Меззіпд 9., 19827 рус - Плазмидь! в производимой от М1Зтр7 системе для инсерционного мутагенеза и секвенирования с помощью синтетических универсальньїх праймеров". Сепе, 19, 259-268) плазмидьі рВКе" (стратагенная система клонирования; Га
Чоа СА). Плазмиду рХІ 2563 очищают при помощи набора М/ігага Медаргер (Промега Корп., Мздисон, УМ), следуя рекомендациям поставщика. тот препарат плазмидной ДНК оиспользуют впоследствиий в нижеописьіваемьх примерах. 1.3. Очистка плазмидь!
Материал:
Плазмиду рХІ 2563 (описана в п. 1.2) очищают на колонке с НіТгар, связанньм с описанньм в п. 1.1. олигонуклеотидом, исходя из раствора, содержащего также плазмиду рВКО". Используемье во время зтой очистки буферь! представляют собой следующие: ; буфер Е: 2М Масі, 0,2 М ацетата, рн. 4,5-5; буфер Д: 1М ТРИС-НСІ, рн--9, 0,05 мм ЗДТК (зтилендиаминтетра-уксусная кислота).
Методика:
Колонку промьтвают с помощью б мл буфера Е, затем плазми-дь (20 мкг рхХІ/ 2563 и 20 мкгрвВКО" в 400 мкл буфера Е) вносят в колонку и инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре. Колонку промьівают с помощью 10 мл буфера Е, затем осуществляют злюирование с помощью буфера Д. Плазмидь! идентифицируют после злектрофореза на 195-ном геле агарозьї и окрашивания зтидиумбромидом. Долю плазмид в растворах определяют путем их трансформантной активности в отношений Е.соїї.
Результат:
Исходя из смеси, содержащей 3095 рхХІ 2563 и 7095 рвко", на вниіходе из колонки получают раствор со 10095 рХІ 2563. Чистота, оцениваємая по соотношению оптических плотностей при 260 и 280 нм, составляєт 1,9-2,5, что указьіваєт на то, что зтим способом удаляют загрязняющие протейньі!.
Пример 2 2.1. - В зтом примере оописьмшвается зксперимент по оочистке плазмидной ДНК. Связьівание олигонуклеотида (5-(ЯАСса7асттстТтстт-сттоттестТтетт-3 (последовательность Мо 1) с носителем в колонке осуществляют как указано в примере 1. Для сочетания (связьівания), олигсонуклеотид модифицируют по концу с помощью аминогруппь), связанной с фосфатом спейсера с помощью плеча, содержащего б атомов углерода (модифицированньй олигонуклеотид; Еигодепівес 5 А, Бельгия). Плазмиду рХ!/ 2563 очищают с помощью набора мігагі Медаргер (Промега Корп., Мздисон, М/І), следуя рекомендациям поставщика.
Используемьми в зтом примере буферами являются следующие: буфер Е: 0-2М Масі; 0, 2М ацетата; рн- 4,5-5; буфер Д: ЇМ ТРИС-НСТ, рн. 9; 0,5 мМ ЗДТК.
Колонку промьшвают с помощью б мл буфера Е, затем 100 мкг плазмидьі рХІ 2563, разбавленнье с помощью 400 мкл буфера Е, вносят в колонку и инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре.
Колонку промьтвают с помощью 10 мл буфера Е, затем осуществляют злюирование с помощью буфера Д.
Плазмиду квантифицируют путем определения оптической плотности при 260 нм.
В зтом примере фиксацию осуществляют в буфере, молярность которого по масі изменяется от 0 до 2 моль (буфер Е). Зффективность очистки снижаєтся, когда молярность Масі увеличиваєтся. рН-Значение буфера для фиксации может изменяться в пределах от 4,5 до 5, причем зффективность очистки лучше при 4,5. Также можно использовать другой 5уфер для злюирования с основньї/м значением рн: так, злюирование осуществляют с помощью буфера из 50 мМ бората, рн-9, и 0,5 мм ЗДТК. 2.2. - Осуществляют связьшвание олигонуклеотида 5-САСОасСтТсСТтІсСТтІСсТтІСстсСтсСт - З (последовательность Ме!) с носителем в колонке как указано в примере 1. Плазмиду рхХіІ-2563 очищают с помощью набора УМігаті Медаргер (Промега Корп., Мздисон, М/!), следуя рекомендациям поставщика.
Используемьми в зтом примере буферами являются следующие: буфер Е: 0,1 М масі, 0,2 М ацетата, рн-5; буфер Д: 1 М ТРИС-НСІ1, рн-9, 0,5 мм ЗДТК.
Колонку промьшают с помощью б мл буфера Е, затем 100 мкг плазмидьі рХІ 2563, разбавленнье с помощью 400 мкл буфера Е, вносят в колонку и инкубируют в течениеє одного часа при комнатной температуре. Колонку промьівают с помощью 10 мл буфера Е, затем осуществляют злюирование с помощью буфера Д. Содержаниеє геномной или хромосомной ДНК Е.соїї, присутствующей в образцах плазмидь, определяют до и после пропускания через колонку олигонуклеотида. Зту геномную ДНК кван-тифицируют с помощью полимеразной цепной реакции, используя праймерь, в гене даїК Е.соїї, согласно следующей методике:
Последовательность праймеров описана Оероиск и др., (Мисієїс Асіаз Нез., 0, 1841-1853 (1985)): 5- ССО ААТ ТСТ пос ЗАС САА ДОС АС ТТ - 3 (последовательность Мо24) и 5- ССА ДОС ТТ АСТ ТТ САС АС аа тат - 3 (последовательность Мо 25).
Реакционная среда включаєт, в 25 мкл буфера для полимеразной цепьевой реакции (ПЦР) (Промега,
Франция, Шарбоннье): 1,5 мМ Мосіг; 0,2 мМ ахтеР (фармация, Огзау); 0,5 мкмоль прай-мера; 20 ед./мл Тад- полимеразьі (Промега). Реакцию осуществляют согласно -следующей последовательности: - 5 минут при 9576; - 30 циклов: 10 секунд при 9570
ЗО секунд при 60"С 1 минута при 787 - 10 минут при 7870.
Амплифицированньій фрагмент ДНК длиной 124 парьї оснований отделяют путем злектрофореза на 395- ном геле агарозьї в присутствиий бургагеєп | (МоїІесшаг Ргобез5, Епдепе, США), затем квантифицируют по отношению к гамме геномной ДНК ШОпПгариг Е. сої, штамм В (Сигма; обозначение 04889). В образце, введенном в колонку, количество хромосомной ДНК составляло 195, а в образце, очищенном при использований колонки с олигонуклеотидом, оно составляет 0,295.
Пример 3. Зксперимент, проводимьй при использованиий осветленного лизата
В зтом примере описьіваєтся очистка плазмидной ДНК, исходя из осветленного лизата бактериальной культурь, в так назьіваемом "минипреп" масштабе: 1,5 мл Ночной культурь штаммов ОНо5сі, содержащих плазмиду рХ/ 2563, центрифугируют и осадок повторно суспендируют в 10 0 мкл раствора, содержащего 50 мМ глюкозьі, 25 ММ ТРИС-НС1, рн.-8, 10 мМ
ЗДТК. Добавляют 200 мкл 0,2 М раствора Маон с 195 додецилсульфата натрия, содержимое пробирок затем перемешивают путем переворачивания, после чего добавляют 150 мкл ЗМ раствора ацетата калия, рН-5, и содержимое пробирок перемешивают путем переворачивания. После центрифугирования, : супернатант отделяют и вносят в колонку с олигонуклеотидом, подготовленную как описано в примере 1. Фиксация, промьівки и злюирование идентичнь! таковьім, описанньм в примере 1. Из 1,5 мл культурь! получают примерно 1 мкг плазмидьі. Полученная плазмида, проанализированная с помощью злектрофореза на геле агарозьї и окрашивания зтидиумбромидом, находится в виде одной полось! кольцевой "сверхзакрученной"
ДНК. Никаких следов ДНК с вьісокой молекулярной массой (хромосомной), ни РНК не обнаруживают в плазмиде, очищенной зтим методом. Соотношение оптических плотностей при 260 и 280 нм составляет величину вьіше 2.
Пример 4 4.1. В зтом примере описьівается зксперимент по очистке плазмидной ДНК, осуществляемьй в тех же условиях, что и в примере 3, исходя из 20 мл бактериальной культурьї штаммов ОН5 с, содержащих плазмиду рХІ 2563. Осадок клеток обрабатьввают в 1,5 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозьі), 25 мМ ТРИС-НСІ1, рн-в8, 10 мМ ЗДТК. Лизис осуществляют с помощью 2 мл 0,2 М раствора Маон с 195 додецилсульфата натрия, и нейтрализацию реализуют с помощью 1,5 мл З М раствора ацетата калия, рН-5. ДНК затем осаждают с помощью З мл пропан-гола, осадок после центрифугирования обрабатьввают с помощью 0,5 мл раствора, содержащего 0,2 М ацетата натрия, рН-5, 0,1 М хлорида натрия, и загружают в колонку с олигонуклео-тидом, подготовленную как описано в примере 1. Фиксацию, промьівку колонки и злюирование осуществляют как описано в примере 1, за исключением буфера для промьївки, молярность которого по //асі составляет 0,1 М, Получают около 16 мкг плазмидной ДНК. Полученная плазмида, проанализированная путем злектрофореза на геле агарозьй и окрашивания зтидиумбро-мидом, находится в виде одной полось кольцевой "сверхсвернутой" ДНК. Никаких следов ДНК с вьісокой молекулярной массой (хромосомной), ни
РНК в очищенной плазмиде не обнаруживают. Переваривание плазмидьї ферментом рестрикции дает одну полосу с ожидаемой молекулярной массой З т.п.н. (тьісяч пар нук-леотидов). Концентрация протеинов в образцах снижаеєтся от 125 мкг/мл в осветленном лизате до величиньі менее, чем 1 мкг/мл в очищенной плазмиде (анализ Місго-ВСА, Рієгсе). Концентрация зндотоксинов, оцениваеємая путем анализа ГАЇ (Віо- зерга), снижаєтся более, чем в 10 раз в очищенной плазмиде по отношению к исходному осветленному лизату. 4.2. Используемая плазмида включает кассету, содержащую промотор цитомегаловируса, кодирующий люциферазу ген, и гомопуриновую-гомопиримидиновую последовательность (САА):7, происходящую от плазмидь рхХІ 2563. Штамм ЮНІ (Мапіаїї: и др., 1980), содержащий зту плазмиду, культивируют в ферментере емкостью 7 литров. Осветленньй лизат получают из 200 г клеток: осадок клеток обрабатьвают в 2 л раствора, содержащего 25 мМ ТРИС, рН-б,8, 50 мМ глюкозьі, 10 мМ ЗДТК, к которьім добавляют 2 л02 М раствора Маон с 195 додецилсульфата натрия. Лизат нейтрализуют путем добавления 1 л ЗМ раствора ацетата калия. После диафильтрации 4 мл зтого лизата наносят на колонку с 5 мл НіТгар -МН5, связанньм с олигонуклео-тидом с последовательностью 5- СОАСасттсоттсоТттотТтстТтотТтТсотТт-3! (последовательность У 1), согласно методу, описанному в примере 1.1. Промьввку и злюированиє осуществляют как описано в примере 1. Получают около 400 мкг плазмидьі. Содержание геномной ДНК в зтом образце, определенное по методике, описанной в примере 2.2., составляєт 0,195.
Пример 5: Использование модифицированного олигонуклеотида
В зтом примере описьівается использование олигонуклеотида, содержащего метилированнье цитозинь!.
Используемой олигонуклеотидной последовательностью является следующая: 5-адоесместтместтместтМместтМместтмМесттМестт-3' (последовательность Ме12).
Зтот олигонуклеотид содержит аминогруппу в 5'. МеС, т.е. означаєт 5 метилцитозин. Зтот олигонуклеотид позволяет очищать плазмиду рХіІ 2563 в условиях примера 1, с помощью буфера для фиксации, рН-5 (таким образом уменьшают опасность разрушения плазмидьі).
Пример 6:
В предьдущих примерах используемьй олигонуклеотид модифицирован по 5-концу с помощью аминогруппьі, связанной с фосфатом плечом, содержащим 6 атомов углерода: МНе-(СНг)в. В зтом примере аминогруппа связана с фосфатом 5'-конца плечом с количеством атомов углерода, равньм 12: МН»-(СНг)| 12:
Связьівание олигонуклеотида и пропускание через колонку осуществляют как указано в примере 2 с помощью буфера ЕЕ: 2М МасСі, 0,2 М ацетата, рН-4,5. Зтот олигонуклеотид позволяет достигать лучших зффективностей очистки: получают вьіход 5395, тогда как при использований олигонуклеотида с б атомами углерода, в тех же условиях, зтот виіход составляет величину порядка 4595.
Пример 7:
Используя методику клонирования, описанной в примере 1.2.7 конструируют две другие плазмидь, содержащие гомопуриновьіе-гомопиримидиновье последовательности: плазмиду рХі-2725, которая содержит последовательность (С(ЗА))|ї5, и плазмиду рХІ 2726, которая содержит последовательность (СА)г5: 7.1. Конструирование плазмид
Плазмидь рХІ 2725 и рХІ 2726, аналогичнье плазмиде рХІ 2563, конструируют согласно стратегийи клонирования, описанной в примере 1.2., при использованиий следующих пар олигонуклеотидов: 5986: 5-СПАТСОС(С,А)250:0(03-3! (последовательность Мо 13); 5987: 5- ААТТССС(ТС)25(3-3' (последовательность Ме 14); 5981: 5-САТОоС(СИА)170(0-3' (последовательность Ме15); 5982: 5 -ААТТ(ССТ)7СС(-3' (последовательность Ме16).
Пару олигонуклеотидов 5986 и 5987 используют для конструирования плазмидь! рХі 2726, клонируя олигонуклеотидь в сайтах Ватні и ЕсоВіІ рвкКо:" (стратагенная система клонирования; І а доїПа СА), тогда как олигонуклеотидь 5981 и 5982 используют для конструирования плазмидь рхХіІ 2725. Используют те же самье зкспериментальнье условия, что и для конструирования плазмидь рхХі 256 3, и заменяют лишь одни парь олигонуклеотидов. Точно также, клонированнье последовательности анализируют путем секвенирования в плазмидах. Зто позволяет установить, что плазмида рхХі/ 2725 обладает модификацией по отношению к ожидаеємой последовательности: вместо повторяемой 17 раз опоследовательности (С(А имеется последовательность СОСІАСІА(ОСА) і 5 (последовательность Мо 17). 7.2.: Получение колонок и очистка
Олигонуклеотидьі, образующие тройнье спирали с зтими гомопуриновь!ми последовательностями, связьивают с содержащимся НіТгар в колонках согласно способу, описанному в примере 1.1. Речь идет об олигонуклеотиде с последовательностью: 5'-ААТОССТОСтТОСТОоСтТОоСтТоСтТОоСтТ--3' (последовательность Мо 18) для очистки плазмидь рхХі 2725, и об олигонуклеотиде с последовательностью: в-дасеастототстстотостотетТеСтТет-3 (последовательность Ме 19) для очистки плазмидь рхі 2726.
Таким образом полученнье две колонки позволяют очищать соответствующие плазмидь! по методике, описанной в примере 2, при использований следующих буферов: буфер Е: 2 М Масі; 0,2 М ацетата, рн-4,57 буфер Д: 1 М ТРИС-НСІ1, рн-9; 0,5 мм ЗДТК.
Полученньсе вьїхода составляют 23925 и 3195 для рХІ 2725 и рХІ 2726, соответственно.
Пример 8
Зтот пример иллюстрирует влияние длиньй специфической последовательности плазмидь на зффективности очистки. 8.1. Конструирование плазмид
Геном-репортером, используемь!м в зтих зксперимента для вьявления активности композиций согласно изобретению, является ген, кюодирующий люциферазу (І ис).
Плазмида рхІ 26 21 включаєт кассету, содержащую промотор цитомегаловируса (СМУ) длиной 661 пара оснований, вьіделенньій из рсОнкКЗ (Инвитроген Корп., Сан Диего, СА) путем расщепления с помощью ферментов рестрикции Мій І! и Ніпанйі, клонированную вьіше кодирующего люциферазу гена, в сайтах Мій | и
Ніпа Ш, в векторе ра! основного вектора (Промега Корп., Мздисон, УМ). Зту плазмиду конструируют, используя стандартнье методьі! молекулярной биологии.
Плазмидь рХІ 2727-І и рХІ 2727-2 конструируют следующим образом: 2 мкг Плазмидь рхХі 2621 линеаризируют с помощью Ватні; фермент инактивируют путем обработки в течение 10 минут при температуре 65"С; параллельно, олигонуклеотидь! 6006 и 6008 гибридизируют как зто описано для конструирования плазмидь рхі 2563. 6006: 5-ЯАТСТ(САА)І? СТаСАСАТСТ - 3! (последовательность Мо20) 6008: 5-ЛАТСАаАТСТасАс(ТтТс)17А-3' (последовательностью Ме21)
Зту смесь после гибридизации клонируют по концам Ватні плазмидь рхХі 2621 и после трансформации в
ОН5 ох рекомбинантнье клоньї определяют путем анализа с помощью ферментативной рестрикции по Рві і, так как олигонуклеотидьі вводят сайт Рвї І. Получают два клона и нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента контролируют, используя праймер (6282: 5-АегедаТтСАТААДСТОСОаСаАСаИ-з" (последовательность Мо 22)) в качестве праймера реакции последовательности (Мієга 9. и Мезвіпа 9., 1982. "рОобС-Плазмидь в производимой от М1З3 р7 системе для инсерционного мутагенеза и секвенирования с помощью синтетических универсальньх праймеров". Сепе, 19, 259-268).
Первьій клон (рхХІ/2727-Ї) содержит повторяющуюся 10 раз последовательность (3АА. Второй клон (рХІ2727-2) содержит последовательность 5'-СЯААСААСпСАСц(САА)асААСАСАА-З3 (последовательность
Ме23). 8.2. Получение колонок и очистка
Используют колонку, такую, как описанная в примере- 1 и носитель в которой связан с олигонуклеотидом 5в-ада;асттстт-сттоттстТтсттТетт-3 (последовательность Мое1).
В плазмиде рхІ2727-І 14 раз повторяєтся последовательность САА. Вьішеописанньій олигонуклеотид, которьій насчитьшает только 7 повторений последовательности гибридизации, соответствующей СТТ, следовательно, может гибридизироваться с плазмидой в 8 различньїх положения. Плазмида рхХхіІ 2727-2, на- против, имеет гибридизирующую последовательность (САА)ЦД такой же длинь, что и таковая фиксированного в колонке олигонуклеотида. Зтот олигонуклеотид, следовательно, может гибридизироваться только в одном положениий с рХІ 2727-2.
Зксперимент идентичен таковому, описанному в примере 2, при использований следующих буферов: Її буфер Е: 2М масі; 0,2 М ацетата; рн--4,5. буфер Д: 1М ТРИС-НСІ1, рн-9; 0,5 мм ЗДТК.
Вьход после очистки составляєт 2995 с плазмидой рхХІі 2727-І и 1995 с плазмидой рхіІ 2727-2. 8.3. Трансфекийия ин витро клеток млекопитающих Используемьми клетками являются клетки МІН ЗТ3, вьсеяннье накануне зксперимента в культуральнье планшеть! с 24-мя лунками по 50 000 клеток на лунку.
Плазмиду разбавляют в 150 мМ растворе МасСіІ и смешивают с липофектантом ВАРА 115335. Используют соотношение положительньхх зарядов липофектанта к отрицательньм зарядам ДНК, равное б. Смесь интенсивно перемешивают, оставляют на 10 минут при комнатной температуре, разбавляют с помощью средьі без плодной телячьей сьіворотки, затем добавляют к клеткам ДНК в количестве по 1 мкг на лунку с культурой. После вьідерживания в течение двух часов при 37"С добавляют 1095, в расчете на обьем, плодной телячьей сьіворотки клетки инкубируют в течение 48 часов при 37"С в присутствиий 595 диоксида углерода.
Клетки промьшвают два раза с помощью ЗФР (забуференньй фосфатом физиологический раствор) и люциферазную активность определяют по описанной методике (набор Промега Корп., Мздисон, УМІ) на люминометре Гитаї І! В 9501 (ЕС и б ВеппоїіЗд, Ему). Очищенная как описано в примере 8.2. плазмида рХІ2727-І приводит к в два раза более значительньм зффективностям трансфекции, чем таковье, достигаемье при использований такой же плазмидь, очищенной с помощью набора У/ігагі Медаргер (Промега Корп., Мздисон, МІ).
Список последовательностей (1) Общие сведения: (1) Заявитель: (а) фирма: Рон-Пуленк Роре (б) улица: 20 авеню Раймонда Айрона (в) город: Антони Седекс (д) страна: Франция (є) почтовьй индекс: 92165 (ж) телефон: 40.91.69.22 (з) телефакс: 40.91.72.91 (П) Название изобретения: Очистка ДНК путем образования тройной спирали с иммобилизованньм олигонуклеотидом. (Ш) Количество последовательностей: 25 (ТУ) Редактор на компьютере: (а) носитель данньх: дискета (б) компьютер: персональньй компьютер, совместимьй с машинами фирмь! ИБМ (в) операционная система: ПК-ДОС/МО-ДОС (г) программное обеспечениеє: патентная редакция 7 1.0, версия 41.30 (ОЕВ) (2) Сведения о последовательности Ме 1: (1) Характеристики последовательности: (а) длина : 25 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Ме 1.:
САСОоСТТСТтТ СТТСТтТСтТтС ТТСТт 25 (2) Сведения о последовательности Мег2: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 19 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 2:
СТІССССААС ССАСАААСО 19 (2) Сведения о последовательности Ме 3: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 21 пара оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 3:
САдосстТтТотТ ТосстТстТтТо с 21 (2) Сведения о последовательности Ме 4;
(1) Характеристики последовательности: (а) длина: 13 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 4:
САААААССАА САС 13 (2) Сведения о последовательности Ме 5: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 19 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 5:
ААСССАСССА ССАСАССдА 19 (2) Сведения о последовательности Моб: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 19 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 6:
ВАССАСАССА СОСАСССАА 19 (2) Сведения о последовательности Ме 7: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 19 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 7: ттостТстТост бостТосоттТ 19 (2) Сведения о последовательности Ме 8: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 17 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 8:
АААДААСССА АТААсСб 17 (2) Сведения о последовательности Ме 9: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 58 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 9:
САТСССААСА АСААСААСАА СААСААСААС ААСААСААСА АСААСААСАА САдОс-
ААбо 58 (2) Сведения о последовательности МеО: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 58 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 10:
ААТТоСТтТСТтТ ТоТтТСтТтСтТтТ СТТСТТСТТС ТтстТтТстТтТстТ тсттеттотт сТтсттес 58 (2) Сведения о последовательности Ме11: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 17 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Ме 11:
ТСАСССОСАС СААААтТОа 17 (2) Сведения о последовательности Ме12: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 25 пар оснований (б) тип: нуклеотидная
(в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Отличительньй признак: (г) другая информация: каждьй из цитозинов С последовательности метилирован (ХІ) Описание последовательности Ме 12: бсАсостТтотТІ ОСтТтостТтТстТто ТтТсТт 25 (2) Сведения о последовательности Ме13: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 58 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 13:
САТСССАСАС АСАСАСАСАС АСАСАСАСАС АСАСАСАСАС АСАСАСАСАС АСАа- осо 58 (2) Сведения о последовательности Мо 14: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 58 пар оснований; (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 14:
ААТТСССтТСТ СТоТетТСтТСтТ стотТстТетТстТ стстТотТотТстТ СтотТоТстТСтТ ст- стстоес 58 (2) Сведения о последовательности Мо 15: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 58 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 15:
САТССССАСС АССАССАССА ССАССАССАС САССАСсАСо АССАССАССА бСА- ссАсо й 58 (2) Сведения о последовательности Мо 16: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 58 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 16:
ВААТТоСТОоСТ сстТостТостТо стостостос тостТостост сстостосто стос- тосе 8
Зр (2) Сведения о последовательности Ме 17: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 50 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Ме 17:
ССАСАССАСо АССАССАССА ССАССАССАС САССАССАСо АССАСбАССА 50 (2) Сведения о последовательности Ме 18: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 25 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Ме18:
ААТОоССстТоСтТ сстостТостТо стТост 25 (2) Сведения о последовательности Ме 19: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 26 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 19:
АстТоСстТостТСтТ стстТотТстТстТ о стетст 26
(2) Сведения о последовательности Мо 20: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 66 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 20:
САТСТОААСА АСААСААСАА СДАСААСААС ВАСААСААСА АСААСААСАА сАд-
СААСстТос 60
АОоАТСтТ 66 (2) Сведения о последовательности Ме21: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 66 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 21:
САТСАСАТСТ ССАСТТСТтТС ТІСТТСТтТСТ ТСТТІСТТСТтІ СттТстТТСстТто Ттст- тСтІСсТ 60
ТСТТСА 56 (2) Сведения о последовательности Мо 22: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 21 пара оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 22:
АСАСТСАТАА стТоСОбсбАС о 21 (2) Сведения о последовательности Ме23: (1) Характеристики последовательности: (а) длина: 39 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 23:
СААСААСАСС ААСААСААСА АСААСААСАА ОСААСАСАХ 39 (2) Сведения о последовательности Мо 24: (1) Сведения о последовательности: (а) длина: 27 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Ме24:
СССААТІСТО СОСАССАААС САСТТТо 27 (2) Сведения о последовательности Мо 25: (1) Характеристики, последовательности: (а) длина: 27 пар оснований (б) тип: нуклеотидная (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (П) Тип молекуль!: КДНК (ХІ) Описание последовательности Мо 25:
ССААССТТСА ОСТОТТСАСсСА собсТоТ 27
Claims (32)
1. Способ получения лекарственного средства на основе двунитевой ДНК, отличающийся тем, что включаєт по крайней мере одну стадию очистки, где содержащий вьішеуказанную ДНК в смеси с другими компонентами раствор пропускают через носитель, с которьіІмМ оковалентно связан олигонуклеотид, способньйй образовьівать за счет гибридизации тройную спираль со специфической последовательностью, находящейся в вбиішеуказанной ДНК.
2. Способ по п. І, отличающийся тем, что содержащим вьішеуказанную ДНК раствором является клеточньй лизат.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что клеточньім лизатом является осветленньй лизат.
4. Способ по п. І, отличающийся тем, что двунитевую ДНК предварительно очищают.
5. Способ по п. І, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность представляєт собой гомопуриновую-гомопиримидиновую последовательность, а олигонуклеотид включаєт последовательность, образующую тройную спираль с зтой гомопуриновой-гомопиримидиновой последовательностью.
б. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что специфическую последовательность искусственно вводят в двунитевую ДНК.
7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что оолигонуклеотид включаєт последовательность поли-СТТ, а специфической последовательностью, имеющейся в ДНК, является последовательность поли-СсАА.
8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что олигонуклеотид имеет последовательность САСОСТТСТТСТТСТТСТТСтТТСТТ (последовательность Ло 1).
9. Способ по п. 5, отличающийся тем, что олигонуклеотид имеет последовательность (СТ); (последовательность Ло 26).
10. Способ по п. 8 или п. 9, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность представляєт собой последовательность (САА)?/ (САА):4 или (ОСАА)1».
11. Способ по п. 5, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность содержит последовательность Ле 5, а олигонуклеотид включает последовательность Ле б или последовательность Ло 7.
12. Способ по п. 5, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность включаеєт последовательность Ло 17, а олигонуклеотид включаєт последовательность Ло 18.
13. Способ по п. 5, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность включаест последовательность (СА)»з, а олигонуклеотид включаеєт последовательность Лое19.
14. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что специфической последовательностью являеєтся специфическая последовательность, которая обьІчно присутствует в двунитевой ДНК.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что обьічно присутствующей в ДНК специфической последовательностью являстся гомопуриновая-гомопиримидиновая последовательность, имеющаяся в источнике репликации плазмидь.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что специфическая последовательность ДНК включаєт всю или часть последовательности Ло 2, включаємой в Источник репликации СоїЇЕЇ и Е.сой.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что олигонуклеотид включаєт последовательность Ло 3.
18. Способ по п. 14, отличающийся тем, что специфическая последовательность ДНК включаєст всю или часть последовательности Ло 4 или последовательности Ло 8, входящих в ген Г -лактамазьї плазмидь рВЕ. 322.
19. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что олигонуклеотид связБіІваеєтся со о носителем за осчет дисульфидной, простой тиозфирной, сложнозфирной, амидной или аминной связи.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что олигонуклеотид фиксируют в колонке посредством плеча, образованного углерод-содержащей цепью (СН»з)п, в которой "п" означаєт целоє число от І до 18 включительно, причем вьішеуказанноє плечо связБіІваеєтся с олигонуклеотидом за счет фосфата, а с колонкой - за счет амидной связи.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что плечо образовано линейной, содержащей углерод цепью с 6 атомами углерода.
22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что плечо образовано содержащей углерод линейной цепью с 12 атомами углерода.
23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что олигонуклеотид имеет по крайней мере одну химическую модификацию, делающую его устойчивьім к или защищающую от нуклеаз, или повБбішающую его сродство к специфической последовательности.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что олигонуклеотид включает гомопиримидиновую последовательность, в которой по крайней мере один из цитозинов метилирован.
25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что двунитевой ДНК является кольцевая ДНК, такая как плазмида.
26. Способ по п. І, отличающийся тем, что специфическая последовательность, имеющаяся в двунитевой ДНК, включаст несколько положений гибридизации с олигонуклеотидом.
27. Способ по п. І, отличающийся тем, что носитель виібирают среди используеємьсх в хроматографии носителей, пластмассовьїх поверхностей и функционализированньмх латексньїх шариков.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что носителем является используємьй в хроматографии носитель.
29. Способ по п. І, отличающийся тем, что лекарственноє средство содержит хромосомную ДНК в количестве ниже или равном 0,590.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что лекарстенноє средство содержит хромосомную ДНК в количестве ниже или равном 0,290.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что лекарственноє средство содержит хромосомную ДНК в количестве ниже или равном 0,190.
32. Способ очистки плазмидной ДНК, отличающийся тем, что включаст по крайней мере одну стадию, где содержащий вьішеуказанную ДНК в смеси с другими компонентами раствор пропускают через носитель, с которьім ковалентно связан олигонуклеотид, способньій образовьівать путем гибридизации тройную спираль со специфической последовательностью, находящейся в ДНК.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9415162A FR2728264B1 (fr) | 1994-12-16 | 1994-12-16 | Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise |
| PCT/FR1995/001468 WO1996018744A2 (fr) | 1994-12-16 | 1995-11-08 | Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA72421C2 true UA72421C2 (en) | 2005-03-15 |
Family
ID=9469865
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA97062835A UA72421C2 (en) | 1994-12-16 | 1995-08-11 | A process for dna purifying by formation of triple helix with immobilized oligonucleotides (variants) |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6287762B1 (uk) |
| EP (2) | EP0797682B1 (uk) |
| JP (2) | JPH10510427A (uk) |
| KR (1) | KR100431163B1 (uk) |
| CN (1) | CN100591776C (uk) |
| AT (1) | ATE233825T1 (uk) |
| AU (1) | AU715630B2 (uk) |
| BG (1) | BG64198B1 (uk) |
| BR (1) | BR9510089A (uk) |
| CA (1) | CA2208245C (uk) |
| CY (1) | CY1110372T1 (uk) |
| CZ (1) | CZ295474B6 (uk) |
| DE (1) | DE69529842T2 (uk) |
| DK (1) | DK0797682T3 (uk) |
| ES (2) | ES2197928T3 (uk) |
| FI (1) | FI120836B (uk) |
| FR (1) | FR2728264B1 (uk) |
| HU (1) | HU221062B1 (uk) |
| IL (2) | IL116398A (uk) |
| MX (1) | MX9703670A (uk) |
| NO (1) | NO320428B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ297023A (uk) |
| PL (1) | PL184430B1 (uk) |
| PT (1) | PT797682E (uk) |
| RO (1) | RO116970B1 (uk) |
| RU (1) | RU2174125C2 (uk) |
| SK (2) | SK288366B6 (uk) |
| TW (1) | TW459043B (uk) |
| UA (1) | UA72421C2 (uk) |
| WO (1) | WO1996018744A2 (uk) |
| ZA (1) | ZA9510756B (uk) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7038026B2 (en) | 2000-05-26 | 2006-05-02 | Centelion | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide |
| DE19806962B4 (de) * | 1997-02-22 | 2004-08-05 | Universität Heidelberg | Markierung von Nukleinsäuren mit speziellen Probengemischen |
| US20030105040A1 (en) * | 2001-11-13 | 2003-06-05 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of inhibitor-kappa B-R expression |
| WO2000046366A1 (en) * | 1999-02-04 | 2000-08-10 | Invitrogen Corporation | Isolation of nucleic acid molecules |
| US7052844B2 (en) * | 1999-12-21 | 2006-05-30 | Ingeneus, Inc. | Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism |
| CN1446258B (zh) | 2000-05-26 | 2013-01-09 | 艾文蒂斯药品公司 | 用固定化的寡核苷酸纯化三股螺旋体结构 |
| US20060008817A1 (en) | 2000-12-08 | 2006-01-12 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for generating recombinant nucleic acid molecules |
| DE10104025B4 (de) * | 2001-01-31 | 2008-07-10 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Verfahren zur Aufreinigung und anschließenden Amplifikation von Doppelstrang-DNA |
| FR2822476B1 (fr) * | 2001-03-23 | 2004-04-02 | Aventis Pharma Sa | Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice |
| IL158017A0 (en) * | 2001-03-23 | 2004-03-28 | Gencell Sa | Methods for purifying and detecting double stranded dna target sequences by triple helix interaction |
| KR100790764B1 (ko) | 2002-11-12 | 2008-01-03 | 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코포레이션 | 조혈세포 집단에서 정지세포를 증대시키는 방법 |
| BRPI0413907A (pt) * | 2003-09-17 | 2006-10-24 | Centelion | método de preparação de plasmìdeo dna de grau farmacêutico |
| WO2005100542A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-10-27 | Centelion | Method for purifying plasmid dna |
| CA2555377A1 (en) | 2004-02-12 | 2005-09-01 | Compass Genetics, Llc | Genetic analysis by sequence-specific sorting |
| PL1737945T3 (pl) | 2004-04-19 | 2011-07-29 | Aventis Pharma Sa | Sposób oczyszczania plazmidowego DNA |
| BRPI0515418A (pt) | 2004-08-16 | 2008-07-22 | Nature Technology Corp | método para a produção de dna de plasmìdio super-enrolado fechado covalentemente e composição de matéria |
| US7407757B2 (en) * | 2005-02-10 | 2008-08-05 | Population Genetics Technologies | Genetic analysis by sequence-specific sorting |
| CN105316314B (zh) * | 2014-07-29 | 2018-07-27 | 深圳新诺微环生物科技有限公司 | 一种高纯度的微环dna及其制备方法和应用 |
| EP3601617B3 (en) * | 2017-03-24 | 2024-03-20 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2540122B1 (fr) * | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
| US5166315A (en) * | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
| US4766072A (en) * | 1985-07-17 | 1988-08-23 | Promega Corporation | Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence |
| US5665541A (en) | 1986-10-28 | 1997-09-09 | The Johns Hopkins University | Formation of triple helix complexes for the detection of double stranded DNA sequences using oligomers which comprise an 8-modified purine base |
| JPH02501353A (ja) | 1987-09-17 | 1990-05-17 | アプリジン | 少なくとも１つの自然または合成ｄｎａ片を含有する分子の結合または分離法 |
| US5352578A (en) | 1989-02-15 | 1994-10-04 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of separating oligonucleotides from a mixture |
| AU5269590A (en) | 1989-03-10 | 1990-10-09 | Gene-Trak Systems | Immobilized oligonucleotide probes and uses therefor |
| CA2015515C (en) * | 1990-01-03 | 1999-12-07 | Jean-Marie Saint-Remy | Pharmaceutical compositions containing antigen-antibody complexes and uses therefor |
| EP0558634A4 (en) * | 1990-11-23 | 1995-06-28 | Gilead Sciences Inc | Triplex-forming oligomers containing modified bases |
| EP0566670A4 (en) * | 1990-12-17 | 1993-12-08 | Idexx Laboratories, Inc. | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation |
| WO1992013963A1 (en) | 1991-01-30 | 1992-08-20 | Hyman Edward D | Method for preparation of closed circular dna |
| EP0533952A4 (en) | 1991-04-15 | 1993-07-07 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Process for separating or extracting nucleic acid from specimen containing the same |
| WO1993013220A1 (en) | 1991-12-24 | 1993-07-08 | Tepnel Medical Limited | Manipulating nucleic acid sequences |
| AU4544193A (en) | 1992-06-25 | 1994-01-24 | Microprobe Corporation | Solid supports for nucleic acid hybridization assays |
| US5401632A (en) | 1992-07-16 | 1995-03-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Triple helix purification and sequencing |
| WO1994017086A1 (en) * | 1993-01-25 | 1994-08-04 | Apollon, Inc. | Gene regulation by targeting putative intramolecular triple helix |
-
1994
- 1994-12-16 FR FR9415162A patent/FR2728264B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-11 UA UA97062835A patent/UA72421C2/uk unknown
- 1995-11-08 CA CA2208245A patent/CA2208245C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 WO PCT/FR1995/001468 patent/WO1996018744A2/fr active Application Filing
- 1995-11-08 PL PL95320697A patent/PL184430B1/pl unknown
- 1995-11-08 DE DE69529842T patent/DE69529842T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 DK DK95940285T patent/DK0797682T3/da active
- 1995-11-08 AT AT95940285T patent/ATE233825T1/de active
- 1995-11-08 HU HU9701886A patent/HU221062B1/hu unknown
- 1995-11-08 CZ CZ19971858A patent/CZ295474B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 US US08/860,038 patent/US6287762B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 NZ NZ297023A patent/NZ297023A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 AU AU41789/96A patent/AU715630B2/en not_active Expired
- 1995-11-08 EP EP95940285A patent/EP0797682B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 PT PT95940285T patent/PT797682E/pt unknown
- 1995-11-08 BR BR9510089A patent/BR9510089A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-11-08 ES ES95940285T patent/ES2197928T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 MX MX9703670A patent/MX9703670A/es unknown
- 1995-11-08 JP JP8518319A patent/JPH10510427A/ja active Pending
- 1995-11-08 ES ES02012081.2T patent/ES2446983T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 EP EP02012081.2A patent/EP1281774B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 KR KR1019970703997A patent/KR100431163B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 SK SK5104-2008A patent/SK288366B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 RU RU97111878/1497111878/14A patent/RU2174125C2/ru active
- 1995-11-08 RO RO97-01102A patent/RO116970B1/ro unknown
- 1995-11-08 SK SK756-97A patent/SK286956B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 CN CN95196817A patent/CN100591776C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-14 IL IL116398A patent/IL116398A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-12-14 IL IL171488A patent/IL171488A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-12-16 TW TW084113451A patent/TW459043B/zh not_active IP Right Cessation
- 1995-12-18 ZA ZA9510756A patent/ZA9510756B/xx unknown
-
1997
- 1997-06-12 NO NO19972710A patent/NO320428B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-06-13 FI FI972526A patent/FI120836B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-06-16 BG BG101620A patent/BG64198B1/bg unknown
-
2000
- 2000-05-26 US US09/580,923 patent/US6319672B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-03-07 CY CY20081100271T patent/CY1110372T1/el unknown
- 2008-10-16 JP JP2008267538A patent/JP2009045070A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA72421C2 (en) | A process for dna purifying by formation of triple helix with immobilized oligonucleotides (variants) | |
| US6022691A (en) | Determination of oligonucleotides for therapeutics, diagnostics and research reagents | |
| US8399636B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide | |
| US5478731A (en) | Polycos vectors | |
| AU2007202804B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide | |
| NZ528507A (en) | Processes for purifying and for detecting target double-stranded DNA sequences by triple helix interaction | |
| Giacomoni | The origin of DNA: RNA hybridization | |
| US7514218B2 (en) | Processes for purifying and for detecting target double-stranded DNA sequences by triple helix interaction | |
| AU2001263459A1 (en) | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide | |
| IL152860A (en) | Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide |