BG64198B1 - Пречистване на днк чрез образуване на тройна спирала с имобилизиран олигонуклеотид - Google Patents

Пречистване на днк чрез образуване на тройна спирала с имобилизиран олигонуклеотид Download PDF

Info

Publication number
BG64198B1
BG64198B1 BG101620A BG10162097A BG64198B1 BG 64198 B1 BG64198 B1 BG 64198B1 BG 101620 A BG101620 A BG 101620A BG 10162097 A BG10162097 A BG 10162097A BG 64198 B1 BG64198 B1 BG 64198B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
sequence
dna
oligonucleotide
seq
plasmid
Prior art date
Application number
BG101620A
Other languages
English (en)
Other versions
BG101620A (bg
Inventor
Joel Crouzet
Daniel Scherman
Pierre Wils
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9469865&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG64198(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Publication of BG101620A publication Critical patent/BG101620A/bg
Publication of BG64198B1 publication Critical patent/BG64198B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/924—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis using nanostructure as support of dna analysis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Description

Област на техниката
Изобретението се отнася до нов метод за пречистване на ДНК. Методът съгласно изобретението позволява бързото пречистване на двойноверижната ДНК, с фармакологично приложение. По-точно, методът за пречистване съгласно изобретението използва специфична хибридизация между една последователност на дадената ДНК и един олигонуклеотид.
Техниките на генна и клетъчна терапия са в изключителен подем. Въпреки това тези техники включват възможността да се продуцират значителни количества ДНК с чистота, подходяща за фармацията. Действително при тези нови терапии често лекарственото средство се състои от самата ДНК, при което е съществено да може да се произвежда в подходящи количества, да се изолира и да се пречиства по начин, подходящ за използване за терапия на хора.
Изобретението се отнася до опростен и изключително ефикасен метод за пречистване на ДНК, който позволява да се постигне много висока чистота при високи добиви.
Методът съгласно изобретението се основава на специфично взаимодействие между една последователност, инсерирана в ДНК за пречистване, и един олигонуклеотид, съставен от естествено съществуващи в природата или модифицирани бази.
Предшестващо състояние на техниката
Отскоро е известно, че някои олигинуклеотиди са способни да реагират специфично в голямата бразда на двойната спирала на ДНК, за да образуват локално тройни спирали, като по този начин довеждат до инхибиране транскрипцията на гените-мишени (Helene et Toulme, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Тези олигонуклеотиди селективно разпознават двойната спирала на ДНК на ниво олигопуринови.олигопиримидинови последователности, което означава на нивото на последователности, притежаващи олигопуринова последователност на едната от веригите и една олигопири мидинова последователност на комплементарната верига, като локално образуват тройна спирала. Базите от третата верига (олигонуклеотида) образуват водородни връзки (Hoogsteen връзки или обратни Hoogsteen) с пурините от базовите двойки на Watson-Crick.
В нивото на техниката е описано използване на този тип взаимодействие за изолиране на плазмид. Ito et al., (PNAS 89 (1992) 495) описват използването на биотинилирани олигонуклеотиди, способни да разпознаят една определена последователност на един плазмид и да образуват с нея тройна спирала. Така образуваните комплекси се поставят в контакт с магнитни топчета с покритие от стрептавидин. Взаимодействието между биотина и стрептавидина позволява тогава да се изолира плазмидът чрез магнитно разделяне на топчетата с последваща елюация. Този метод има следните недостатъци. Необходими са две последователни специфични взаимодействия, първото между олигонуклеотида и плазмида, а второто между биотинилирания комплекс и топчетата със стрептавидин. Освен това крайният разтвор може да бъде заразен с биотинилирания олигонуклеотид, който не може да се използва при фармацевтичен състав.
Техническа същност на изобретението
Изобретението се отнася до нов подобрен метод за пречистване на ДНК, при който се използва този тип взаимодействие. Методът съгласно изобретението използва по-точно олигонуклеотиди, ковалентно свързани към носител. Методът е изключително бърз и води до особено висок добив и степен на чистота. Освен това позволява да се пречисти ДНК от комплексни смеси, съдържащи по-точно други нуклеинови киселини, протеини, ендотоксини (като липополизахариди), нуклеази и др. Използваните носители могат освен това да бъдат лесно рециклирани, а получените ДНК имат подобрени способности на фармацевтична сигурност. Методът включва един единствен етап, за разлика от предшестващото състояние на техниката.
Една от целите на изобретението се състои в метод за пречистване на двойноверижна ДНК, съгласно който разтвор, съдържащ дадената ДНК в смес с други съставки, се нанася върху носител, върху който по ковалентен начин е прикрепен олигонуклеотид, способен да образува чрез хибридизация тройна спирала със специфичната последователност на посочената ДНК. Специфичната последователност може да е последователност, естествено съществуваща в двойноверижната ДНК или синтетична последователност, изкуствено включена в нея. Използваните в изобретението олигонуклеотиди представляват олигонуклеотиди, които хибридизират директно с двойноверижната ДНК. Тези олигонуклеотиди могат да съдържат следните бази:
- тимидин (Т), който е способен да образува триплети с двойките А.Т на двойноверижната ДНК (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859);
- аденин (A), който е способен да образува триплети с двойките А.Т на двойноверижната ДНК;
- гуанин (G), който е способен да образува триплети с двойките G.C на двойноверижната ДНК (Rajagopal et al., Biovhem 28 (1989) 7859);
- протониран цитозин (C+), който е способен да образува триплети с двойките G.C на двойноверижната ДНК (Rajagopal et al., посочен по-горе;
- урацил (U), който е способен да образува триплети с двойките A. U или А. Т.
За предпочитане използваният олигонуклеотид включва хомопиримидинова последователност, богата на цитозин, а специфичната последователност, присъстваща в ДНК е хомопуринова-хомопиримидинова последователност. Присъствието на цитозин позволява да се достигне до тройна спирала, стабилна при кисело pH, при което цитозините са протонирани и дестабилизирана при алкално pH, при което цитозините са неутрализирани.
За да се позволи образуването на тройна спирала чрез хибридизация е важно олигонуклеотидът и специфичната последователност, присъстваща в ДНК, да бъдат комплементарни. В това отношение, за да се достигнат найдобрите добиви и селективност, в метода съгласно изобретението се използват абсолютно комплементарни алигонукелотид и специфична последователност. В частност може да става въпрос за поли-СТТ олигонуклеотид и за специфична последователност поли-GAA. Като пример може да се цитира олигонуклеотид с последователност
5’-ОАС(ЮТТСТГСТТСПТСТТСТТСТТ-3’ (GAGG(CTT),;
(SEQ ID No 1), при който базите GAGG не образуват тройна спирала, не позволяват олигонуклеотида да се дистанцира от рамото на свързване. Също така може да се цитира последователността (СТТ)7 (SEQ ID No 26). Тези олигонуклеотиди са способни да образуват тройна спирала със специфична последователност, включваща комплементарни мотиви (GAA). Може да се отнася в частност до участък, включващ 7, 14 или 17 мотива GAA, както е посочено в примерите.
Една друга последователност със специфично значение е последователността:
5’-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’ (SEQ ID No 5).
Тази последователност образува тройно спирала с олигонуклеотидите
5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’ (SEQ ID No 6) или
5’-TTGGTGTGGTGGGTGGGT-3’ (SEQ ID No 7).
При този случай олигонуклеотидът се фиксира в антипарерална ориентация по отношение на полипуриновата верига. Тези тройни спирали са стабилни само в присъствие на Mg2* (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal er Dervan, 1991, 251, 1360-1363).
Специфичната последователност, както е посочено по-горе, може да е последователност, естествено присъстваща в двойноверижната ДНК или синтетична последователност, изкуствено въведена в ДНК. От изключителен интерес е да се използва олигонуклеотид, способен да образува тройна спирала с последователност, присъстваща в двойноверижната ДНК, например в началото на репликация на един плазмид или в маркиращ ген. В това отношение заявителят е използвал секвенционни анализи на плазмиди, като по този начин показва, че някои участъци на тези ДНК, а конкретно при началото на репликация, могат да имат хомопуринови-хомопиримидинови участъци. Синтезът на олигонуклеотиди, способни да образуват тройни спирали с естествени хомопуринови-хомопиримидинови участъци, има предимството да се прилага методът съгласно изобретението, на немодифицирани плазмиди, а по-точно на търговски плазмиди от тип pUC, pBR322, pSV и др. Между естествените хпомопуринови-хомопиримидинови участъци, присъст ващи на двойноверижната ДНК, може да се посочи една последователност, притежаваща цялата или част от последователността 5’-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’ (SEQ
ID No 2), присъстваща в началото на репли- 5 кация ColEl на E.coli. При този случай олигонуклеотидът, образуващ тройната спирала, има последователност: 5’-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3’ (SEQ ID No 3) и последователно се фиксира 10 върху двете вериги на двойната спирала, както е описано от Beal et Dervan (J.Am.Chem. Soc. 1992,114-4976-4982) et Jayasens et Johnoston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Също така може да се посочи и последователността 15 5’-GAAAAAGGAAGAG-3’ ( SEQ ID No 4) от гена на β-лактамазата на плазмид pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508). Използването на олигонуклеотид, способен да образува тройна спи- 20 рала с последователност, присъстваща в начало на репликация или в маркиращ ген, е с изключително предимство, тъй като позволява със същия олигонуклеотид да се пречиства всяка ДНК, съдържаща посоченото начало на pen- 25 ликация или посочения маркиращ ген. По този начин отпада необходимостта да се модифицира плазмидът или двойноверижната ДНК, за да се инкорпорира синтетична специфична последователност. 30
Въпреки че се предпочитат абсолютно комплементарните последователности, се разбира, че могат да се толерират някои несъответствия между последователността на олигонуклеотида и присъстващата в ДНК последо- 35 вателност, при положение, че не водят до много голяма загуба на афинитет.
Може да се цитира последователността 5’-AAAAAAGGGAATAAGGG-3’ (SEQ ID No 8), присъстваща в гена на β-лактамазата 40 на E.coli. При този случай тиминът, който прекъсва полипуриновата последователност, може да бъде разпознат от гуанин от третата верига, като по този начин се образува един триплет ATG, който е стабилен, когато е об- 45 граден от два триплета TAT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
Според един вариант за реализация на изобретението олигонуклеотидите съгласно изобретението включват последователността 50 (ССТ)п, последователността (СТ)п или последователността (СТТ)п, при която η е цяло чис64198 ло от 1 до 15 включително. Изключително предимство представлява използването на последователности от типа (СТ)п или (СТТ)п. Заявителят действително е показал, че добивът на пречистването се влияе от количеството С в олигонуклеотида. По-точно, както се посочва в пример 7, добивът на пречистването нараства, когато олигонуклеотидът включва по-малко от един цитозин. Разбира се, че олигонуклеотидите съгласно изобретението могат също така да комбинират мотиви (ССТ), (СТ) или (СТТ).
Използваният олигонуклеотид може да бъде естествен (съставен от естествено срещащи се в природата немодифицирани бази) или химически модифициран. В частност олигонуклеотидът може да включва, като предимство, някои химични модификации, позволяващи да се увеличи неговата резистентност или неговото предпазно действие по отношение на нуклеазите или на специфичната последователност.
Съгласно изобретението под термина олигонуклеотид се разбира също така и всяка последователност от нуклеозиди, която е претърпяла модификация на скелета на веригата, с цел да стане по-резистентна на нуклеазите. Между възможните модификации могат да се посочат фосфоротионатните олигонуклеотиди, които са способни да образуват тройнг спирали с ДНК (Xodo et al., Nucleic Acids Res, 1994, 22, 3322-2220), както и олигонуклеотиди, притежаващи формацетатен или метилфосфонатен скелет (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7767-7768). Могат да се използват също така олигонуклеотиди, синтезирани с нуклеотидни α-аномери, които образуват също така тройни спирали с ДНК (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Друга модификщация на скелета е фосфороамидатната връзка. Може да се цитира например междунуклеотидната фосфороамидната N3’-P5’ връзка, описана от Gryaznov et Chen, която дава олигонуклеотиди, образуващи с ДНК изключително стабилни тройни спирали (J.Am. Chem.Sos., 1994, 116, 3143-3144). Сред другите модификации на скелета може да се цитира също така и използването на рибонуклеотиди, на 2’-О-метилрибоза, на фосфодиестер,... (Sun et Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 31433144). Фосфорният скелет може най-после да се замести с полиамиден скелет както при PNA (Peptide Nucleic Acid), които също могат да са съставени от тройни спирали (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am.Chem.Soc., 1993, 115-6477-6481)), или да бъде заместен от скелет на основата на гуанидин, както при DHG (дезоксирибонуклеинов гуанидин, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), поликатионови аналози на ДНК, които образуват също така тройни спирали.
Тиминът от третата верига също може да бъде заместен с 5-бромурацил, което води до нарастване на афинитета на олигонуклеотида към ДНК (Povsic et Dervan, J.Am.Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3-61). Третата верига може също така да съдържа неестествени бази, измежду които могат да се цитират 7—деаза2’-дезоксиксантозин (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-дезокси-РD-рибофуланозил) -З-метил-5-амино-1 Н-пиразоло [4,Зч1]пиримидин-7-он (Koh et Dervan, J. Am.Chem.Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-okcoaденин, 2-аминопурин, 2’-О-метил-псевдоизоцистидин или която и да е друга модификация, известна на специалиста в областта (вж Sun et Helene, Curr. Opinion Struct.Biol., 1993-3,345-356).
Друг вид модификация на олигонуклеотида се състои по-специално в подобряване на взаимодействието и/или афинитета между олигонуклеотида и специфичната последователност. По-специално, една модификация с изключителни предимства съгласно изобретението се състои в метилиране на цитозините в олигонуклеотида (пример 5). Така метилираният олигонуклеотид представя свойството да образува стабилна тройна спирала със специфичната последователност в зони с pH поблизко до неутралното (5). Това позволява съответно да се работи при по-високи стойности на pH, в сравнение с олигонуклеотидите от предшестващото ниво на техниката, т.е. при стойности на pH, при които рисковете от разграждане на плазмидната ДНК са значително по-малки.
Дължината на използвания в метода на изобретението олигонуклеотид е най-малко три бази, а за предпочитане се включва между 5 и 30. Предимство е използването на олигонуклеотид с дължина, надвишаваща 10 бази. Дължината може да се адаптира според съответния случай от специалиста в областта, по отношение на селективността и стабилността на желаното взаимодействие.
Олигонуклеотидите съгласно изобретението могат да бъдат синтезирани по която и да е известна техника. По-специално, те могат да бъдат синтезирани с помощта на синтезатор на нуклеинови киселини. Разбира се, може да се използва и която и да е друга техника, известна на специалиста в областта.
За да се позволи ковалентното му свързване върху матрицата, в олигонуклеотида обикновено се вкарва функционална група. По този начин той може да бъде модифицирлан с тиолова, амино или карбоксилна крайна група, в 5’или 3’ позиция. По-специално, прибавянето на тиолова, амино или карбоксилна група позволява например да се захване олигонуклеотидът към носител, притежаващ следните функционални групи: дисулфидни, малеимидни, амино, карбоксилни, естерни, епоксидни, цианобромидни или алдехидни. Това закрепване се осъществява чрез образуването на дисулфидни, тиоестерни, естерни, амидни или аминни връзки между олигонуклеотида и носителя. Може да се използва и който и да е друг метод, известен на специалиста в областта, например бифункционалните закрепващи реактиви.
За да се подобри хибридизацията с прикрепения олигонуклеотид, може да бъде полезно, ако олигонуклеотидът съдържа едно “рамо” и една последователност от бази за “разстояние”. Използването на ръка позволява действително олигонуклеотидът да се фиксира на избрано разстояние от носителя, като по този начин се позволява подобряването на неговите взаимодействия с ДНК. Предимство е, че рамото се състои от линейна въглеродна верига, съдържаща от 1 до 18, а за предпочитане 6 или 12 групи (СН2) и от един амин, който позволява да се осъществи свързването към колоната. Рамото е свързано към един фосфат от олигунклеотида или с раздалечавания елемент, съставен от бази, които не участват при хибридизацията. По този начин раздалечаващият елемент може да включва пуринови бази. Като пример раздалечаващият елемент може да включва последователността GAGG. Предимство е, че рамото се състои от права въглеродна верига, съдържаща от 6 до 12 въглеродни атома.
За осъществяване на изобретението могат да се използват различни видове носители. Може да става въпрос за активирани хроматографски носители, в безпорядък или пред5 варително калибрирани в колона, за активирани пластмасови повърхности или за латексови топчета, магнитни или не. За предпочитане става въпрос за хроматографски носители. Например хроматографските носители, които могат да се използват, са агароза, акриламид или Dextran, както и техните производни (като Sephadex, Sepharose, Superose,..), полимери като поли(стирендивинилбензол) или например прикрепен или неприкрепен силициев двуокис. Хроматографските колони могат да действат по дифузионен или по перфузионен начин.
Изключително благоприятно, за да се постигнат по-добри добиви при пречистването, е да се използва върху плазмида последователност, включваща няколко позиции на хибридизация с олигоинуклеотида. Наличието на няколко позиции за хибридизация благоприятства взаимодействията между посочената последователност и олигинуклеотида, което подобрява добивите от пречистването. И така, че един олигонуклеотид, съдържащ η повторени мотиви (ССТ), (СТ) или (СТТ), за предпочитане е да се използва последователност на ДНК, съдържаща най-малко и комплементарни мотива и за предпочитане п+1 комплементарни мотива. Последователност, носеща η + 1 комплементарни мотива, предлага по този начин две позиции за хибридизация на олигонуклеотида. Като предимство, ДНК последователността съдържа до 11 хибридизационни позиции, което означава п+10 комплементарни мотива.
Методът съгласно изобретението може да се използва за пречистване на всякакъв тип двойноверижна ДНК. Може да става въпрос например за кръгова ДНК, като плазмид, носещ обикновено един или повече гени, представляващи терапевтичен интерес. Този плазмид може да носи освен това начало на репликация, маркиращ ген и т.н. Методът съгласно изобретението може директно да бъде приложен върху клетъчен лизат. При този начин за осъществяване плазмидът, амплифициран чрез трансформация с последващо клетъчно култивиране, се пречиства директно след лизис на клетките. Методът съгласно изобретението може също така да се приложи на бистър лизат, т.е. на супернатантата, получена вследствие на неутрализиране и центрофугиране на клетъчния лизат. Методът също така може да се приложи върху разтвор, предварително пречистен по известни методи. Методът позволява също така да се пречиства ДНК, линейна или кръгова, носеща последователност, представляваща интерес, от изходна смес, съдържаща ДНК-и от различни последователности. Методът съгласно изобретението също така може да се използва за пречистване на двойноверижна РНК.
Клетъчният лизат може да бъде лизат от прокариотни или еукариотни клетки.
В случай че се отнася до прокариотни клетки, могат да се посочат например бактериите E.coli, B.subtilis, S.typhimurium или Streptomyces. Когато става въпрос за еукариотни клетки, могат да се цитират животински клетки, дрожди, фунги и т.н. по-специално дрождите Kluveromyces или Saccharomyces или SOS, СНО, С127, NIH3T3 и други.
Методът съгласно изобретението е много подходящ, защото позволява да се получи по опростен и бърз начин високопречистена плазмидна ДНК, в по-специално, както се илюстрира от примерното описание, методът позволява ефикасно да се отдели плазмидната ДНК от онечиствания, например фрагментирана хромозомална ДНК, ендотоксини, протеини, нуклеази и др. По точно методът съгласно изобретението позволява да се получат препарати от двойноверижна ДНК, по-специално плазмидна със съдържание на хромозомална ДНК, по-ниско или равно на 0,5%, за предпочитане, получените ДНК-ови препарати със съдържание на хромозомална ДНК, по-ниско или равно на 0,2%. В изобретението са описани следователно състави, съдържащи плазмидна ДНК, която намира фармацевтично приложение по-специално при генна или клетъчна терапия. В това отношение изобретението се отнася и до фармацевтичен състав, съдържащ двойноверижна ДНК, линейна или плазмидна, получена по описания метод.
Изобретението се отнася също така до препарати на плазмидна ДНК със съдържание на хромозомална ДНК, по-ниско или равно на 0,5%, за предпочитане 0,2%, още по-предпочитано 0,1%.
Съставите могат да включват “гола” плазмидна ДНК или асоциирана към транспортни вектори, като липозоми, наночастици, катионни липиди, полимери, протеини или рекомбинатни вируси и други.
Изобретението по-подробно е описано с помощта на следващите примери, които трябва да се считат за илюстративни, а не за ограничителни.
Примери за изпълнение на изобретението
Общи техники за клониране и молекулярна биология
Класическите методи на молекулярната биология, като смилане с рестрикционни ензими, гелна електрофореза, трансформиране в E.coli, утаяване на нуклеиновите киселини и други, са описани в литературата (Maniatis et al., Т., Ε. F. Fritsch, и Sambrook. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hatrbor Laboratory Press, New York; Ausubel F.M., R.Brent, R.E.Kinston, D.D. Mooreq J.A. Smith. J.G. Seideman and K.Struhl. 1987. Current Protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York). Нуклеотидните последователности са определени чрез метода на терминация на веригите, като е следван вече представеният протокол (Ausubel et al., 1987).
Рестрикционните ензими са доставени от New-England Biolabs, Beverly, МА (Biolabs).
За свързването (лигатурите) ДНК фрагментите се инкубират в 50 тМ Трис-HCl буфер при pH 7,4, MgCl2 10 mM, DTT 10 тМ, ATP 2 тМ, в присъствие на ДНК-лигаза от фаг Т4 (Biolabs).
Олигонуклеотидите се синтезират при използване на химията на фосфороамидите, защитени в β-позиция с цианоетилна група (Sinha, N D., J.Biernat, J. McManus and H.Koster. 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of |3-cyanoethyl-N,N,-dialkylamino-N-morpholino phosphoroamidite of deoxynucleosides for the synthesis of DHA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557; Giles, J. W. 1985. Advances in automated ONA syntesis. Am. Biotechnol., Nov./ Dec.) c автоматичен ДНК синтезатор на Biosearch 8600, при спазване на инструкциите на производителя.
Свързаните ДНК или за тестване на тяхната трансформираща ефективност се използват за трансфомиране на щама, направен компетентен: E.coli DH5 a [F/endAl, hsdR17, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, Δ (lacZYAargF)U169, deoR, <D80dlac(lacZ Δ M15)].
Миниподготовката на плазмиданта ДНК се осъществява съгласно протокола на Klein et al., 1980.
За развитието на щамовете на E.coli се използва LB културална среда (Maniatis et al., 1982). Щамовете се инкубират при 37°С. Бактериите се посяват върху петрита с LB среда с добавяне на подходящи антибиотици.
Пример 1.
1.1. Подготовка на колоната
Материали: Използваната колона е HiTrap колона с NHS (N-хидроксисукцинимид, Pharmacia) с обем 1 ml, свързана за перисталтична помпа (дебит < 1 ml/min). Използваният специфичен олигонуклеотид има NH2 в 5’. Последователността е следната:
5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT3’ (SEQ ID No 1)
Използваните в този пример буфери са следните:
Свързващ буфер: NaHCO3 0,2М, NaCl 0,5 М, pH 8.3.
Буфер А: етаноламин 0,5 М, NaCl 0,5 М, pH 8.3.
Буфер В: ацетат 0,1 М, NaCl 0,5 М, pH 4.
Метод. Колоната се промива с 6 ml НС1 1 mM, след което върху колоната се нанася разреденият в свързващия буфер олигонуклеотид (50 nmol в 1 ml) и се оставя в продължение на 30 min при стайна температура. Колоната се промива три последователни пъти с 6 ml от буфер А, а след това с буфера В. По този начин олигонуклеотидът се свързва ковалентно към колоната чрез CONH връзка. Колоната се съхранява при 4°С в PBS 0,1 % NaN3 и може да се използва най-малко четири пъти.
1.2. Конструиране на плазмиди
Синтезирани са следните два олитгонуклеотида.
Олигонуклеотид 4817:
GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA GAAGAAGAAGAAGAAGAA GAAGAAGG-3’ (SEQ ID No9)
Олигонуклеотид 4818:
5’ААТТСС1Чи,Г1'СГГС,Г1С'Г1СГ1СГ1С'Г1СГ1СТ ТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТ TCG-3’ (SEQ ID No 10)
Тези олигонуклеотиди, след като вече са хибридизирани и клонирани върху плазмид, пренасят върху съответния плазмид хомопу7 ринова-хомопиримидинова последователност (GAA)17, както е описано по-горе.
Последователността, съответстваща на двата хибридизирани олигонуклеотида, се клонира чрез многосайтово клониране върху плазмид pBKS+ (Stratagene Cloning SyStem, La Jolla CA), който носи ген за устойчивост на ампицилин. За тази цел олигонуклеотидите са хибридизирани по следния начин. По 1 pg от всеки от тези два олигонуклеотида се поставят заедно в 40 ml краен буфер 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 тМ MgCl2. Сместа се нагрява до 95°С, след което се оставя на стайна температура, с цел температурата да спадне бавно. 10 ng от сместа на хибридизираните олигонуклеотиди се лигират с 200 ng от плазмид pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla СА), смилат се c BamHI и EcoRI в крайни 30 μΐ. След лигирането една аликвотна част се трансформира в DH5a. Сместа на трансформацията се нанася върху L среда с добавка на ампицилин (50 mg/ί) и X-gal (20 mg/1). Рекомбинантните клонове трябва да представляват липса на синьо оцветяване върху тази среда, за разлика от родителския плазмид (pBKS+), която позволява α-комплементацията на фрагмент ω на β-галактозидазата на E.coli. След минипрепарация на плазмидната ДНК на 6 клона, всички те представят изчезване на сайт PstI, разположен между сайтове EcoRI и BamHI на pBKS+, както и увеличаване на молекулното тегло 448 pb на PvuII ивицата, съдържаща мултисайта на клониране. Запазва се един клон и съответният плазмид е наречен pXL2563. Клонираната последователност се проверява по секвенции, като се използва праймерът -20 (5’TGACCGGGCAGCAAAATG-3’ (SEQ ID No 11) (Viera J.and J.Messing 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derved system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19,259-268) на плазмид pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA). Плазмид pXL2563 се пречиства в съответствие c комплект (kum) Wisard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI), като се следва инструкцията на производителя. Този препарат на плазмидна ДНК се използва по-нататък в описаните примери.
1.3. Пречистване на плазмида
Материали.Плазмид pXL2563 (описан в
1.2.) се пречиства върху HiTrap колона с прикрепен олигонуклеотид, описана в 1.1., из разтвор, съдържащ също така плазмид. pBKS+. Използ ваните буфери за това пречистване са следните:
Буфер F: NaCl 2 М, ацетат 0,2 М, pH 4,5 до 5.
Буфер Е: Трие 1 М, HCI pH 9, EDTA
0,5 тМ.
Метод. Колоната се промива с 6 ml от буфер F, след което върху колоната се прилагат плазмидите (20 μg pXL2563 и 20 pg pBKS + 10 в 400 μΐ буфер F) и се инкубират в продължение на 2 h при стайна температура. Колоната се промива с 10 ml буфер F, след което елюирането се осъществява с буфер Е. Плазмидите се проявяват след електрофореза върху 1% 15 агарозен гел и оцветяване с етидиев бромид. Съдържанието на плазмидите в разтворите се установява чрез измерване на тяхната трансформираща активност спрямо E.coli.
Резултати. Изхождайки от смес, съдър20 жаща 30% pXL2563 и 70% pBKS+, се получава при изтичане от колоната разтвор със 100% съдържание на pXL2563. Чистотата, изчислена чрез съотношението на D.O. при 260 nm и D.O. при 280 nm, се изменя от 1,9 на 2,5, 25 което означава, че по този метод са елиминирани белтъчните онечиствания.
Пример 2.
2.1. В този пример е описан експеримент на пречистване на плазмидна ДНК. Прикреп30 ването на олигонуклеотида (5’-GAGGCTTCT ТСТТСТТСТТСТТСТТ-3’ (SEQ ID No 1) към колоната се осъществява, както е описано в пример 1. За прикрепването олигонуклеотидът се модифицира в 5’ края с аминогрупа, свър35 зана към фосфата на раздалечаващия чрез рамо, включващо 6 въглеродни атома (Oligonucleotide modifie Eurogentec SA Belgique). Плазмид pXL2563 се пречиства c помощта на комплект Wizard Megaprep (Promega Corp.
Madison, WI), като се следват инструкциите на производителя. Използваните буфери в този пример са следните:
Буфер F: NaCl 0-2 М, ацетат 0,2 М, pH 4,5 до 5.
Буфер Е: Трие 1 М, HCI pH 9, EDTA
0,5 тМ.
Колоната се промива с 6 ml от буфер F, след което върху колоната се нанасят 100 μg от плазмид pXL2563, разреден в 400 μΐ от бу50 фер F, и се инкубира в продължение на 2 h при стайна температура. Колоната се пробива с 10 ml буфер F, след което елюирането се осъществява с буфер Е. Плазмидът се определя количествено чрез измерване на оптическата плътност при 260 пт. В този пример фиксацията се осъществява в буфер, чиято моларност на NaCl се изменя от 0 до 2 М (буфер F). Добивът на пречистването спада, когато намалява моларността на NaCl. pH на буфера за фиксиране може да варира от 4,5 до 5, като добивът на пречистване е по-добър при 4,5. Може да се използва също така и друг буфер за елюиране с основно pH; така елюирането се осъществява с боратен буфер 50 mM, pH 9, EDTA 0,5 тМ.
2.2. Осъществява се прикрепването на олигонуклеотид:
5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID No 1) към колоната, както е посочено в пример 1. Плазмид pXL2563 се пречиства с помощта на комплект Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI), като се следват инструкциите на производителя.
Използваните буфери в този пример са следните:
Буфер F: NaCl 0,1 М, ацетат 0,2 М, pH 5.
Буфер Е: Трие 1 М, HCI pH 9, EDTA 0,5 шМ.
Колоната се промива с 6 ml от буфер F, след което върху колоната се нанасят 100 pg от плазмид pXL2563, разреден в 400 μΐ от буфер F и се инкубира в продължение на 1 h при стайна температура. Колоната се промива с 10 ml буфер F, след което елюирането се осъществява с буфер Е. Измерва се процентното съдържание на геномна или хромозомална ДНК на E.coli, присъстваща в плазмидните проби, преди и след преминаването през колоната с олигонуклеотид. Тази геномна ДНК се определя количествено чрез PCR, като се използва началото на репликация за ген galK на E.coli. Следва протоколът: последователността на началото е описана от Debouk et al., (Nucleic Acids Res., 1985, 13, 184101853):
5’-CCG AAT TCT GGG GAG CAA AGC AGT TTC-3’ (SEQ ID No 24) и
5’-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3’ (SEQ ID No 25)
Реакционната смес съдържа в 25 μΐ буфер PCR (Promega France, Chardonnieres): 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 μΜ като зародиш; 20 U/ml Taq полимераза (Promega). Реакцията протича по следния начин: 5 min при 95°С, 30 цикъла по 10 s при 95°С, 30 s при 60°С, 1 min при 78°С, 10 min при 78°С.
Амплифицираният ДНК фрагмент с дължина 124 базови двойки се отделя чрез електрофореза върху 3% агарозен гел, в присъствие на SybrGreen 1 (Molecular Probes, Eugene, USA), след което се определя количествено спрямо една гама геномни ДНК Ultrapur на Е. coli щам В (Sigma, ref. D4889).
Получава се 1 % геномна ДНК в пробата, пропусната през колоната, и 2% в пробата, пречистена през колоната с олигонуклеотид.
Пример 3.
3. Изследване на бистър лизат
В този пример е описан експеримент на пречистване на плазмидна ДНК от бистър лизат на бактериална култура, на т.нар. ниво “минипреп”: 1,5 ml нощна култура на щамове DH5 , съдържаща плазмид pXL2563, се центрофугират, а плътната утайка се връща към суспензията в 100 1 глюкоза 50 тМ, Трие 25 тМ HCI pH 8, 10 тМ EDTA. Прибавят се 200 μΐ NaOH 0,2 М, SDS 1 %, епруветките се разклащат чрез обръщане, след което се прибавят 150 μΐ калиев ацетат 3 М, pH 5 и епруветките се разклащат чрез обръщане. След центрофугиране се отделя надутаечната течност и се пропуска през колоната с олионуклеотид, приготвена, както е описано в пример 1. Фиксирането, промиването и елюирането са идентични на тези, описани в пример 1. От 1,5 ml култура се получава около 1 g плазмид. Полученият плазмид, анализиран чрез електрофореза върху агарозен гел с етидиев бромид, е представен като една единствена ивица “свръхспирализирана” кръгова ДНК. В плазмида, пречистен по този метод, не се установява нито следа от високомолекулна ДНК (хромозомална) , нито от РНК. Отношението на оптическите плътности при 260 пт и 280 пт надвишава 2.
Пример 4.
4.1. В този пример е описан експеримент на пречистване на плазмидна ДНК, който се осъществява при същите условия както в пример 3, от 20 ml бактериална култура на щамове DH5a, съдържаща плазмид pXL2563. Към клетъчната утайка се прибавят 1.5 ml глюкоза 50 тМ, Трие 25 тМ HCI pH 8, 10 тМ EDTA. Лизистът се осъществява с 2 ml NaOH 0,2 Μ, SDS 1%, а неутрализацията c 1,5 ml калиев ацетат 3 M, pH 5. След това ДНК се утаява с 3 ml пропанолол-2, към утайката се прибавят
0,5 ml калиев ацетат 0,2 М pH 5, NaCl 0,1 M и се зарежда върху колоната с олигонуклеотид, приготвена, както е описано в пример 1. Фиксирането, промиването и елюирането са идентични на тези, описани в пример 1, с из- 5 ключение на промивния буфер, чиято моларност на NaCl е 0,1 М. Получават се около 16 gg плазмидна ДНК. Полученият плазмид, анализиран чрез електрофореза върху агарозен гел и оцветяване с етидиев бромид, е представен 10 като една единствена ивица “свръхспирализирана” кръгова ДНК. В плазмида, пречистен по този метод, не се установява нито следа от високомолекулна ДНК (хромозомолна), нито от РНК. Смилането на плазмида с рестрикци- 15 онен ензим дава една единствена ивица с очаквано молекулно тегло от 3 килобази. Концентрацията на белтъците в пробата намалява от 125 g в бистрия лизат, до 1 g/ml в пречистения плазмид (дозиране MicroBCA, Pierce). Кон- 20 центрацията на ендотоксините, определена чрез дозатор LAL (Biosepra), се разделя на един фактор, по-голям от 10, пречистения плазмид, спрямо изходния бистър лизат.
4.2. Използваният плазмид съдържа ка- 25 сета, включваща промотора на Cytomegalovirus, генът, кодиращ луциферазата и хомопуринова-хомопиримидиновата последователност (GAA)17 получена от pXL2563. Щам DH1 (Maniatis et al., 1989), съдържащ този плаз- 30 мид, се култивира във ферментатор с обем 7 1. Изготвя се бистър лизат от 200 g клетки: клетъчната утайка се прехвърля в 2 1 Трие 25 mM, pH 6,8, глюкоза 50 mM, EDTA 10 тМ, към които се добавят 2 1 NaOH 0,2 М, SDS 35 1%. Лизатьт се неутрализира чрез добавяне на 1 1 калиев ацетат 3 М. След диафилтрация 4 ml от лизата се пропускат на HiTrap-MHS с обем 5 ml, с прикрепен олигонуклеотид с последователност: 40
5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT3’ (SEQ ID No 1), съгласно метода, описан в пример 1.1. Промиването и елюирането се извършват, както е описано в пример 1. Получават се около 400 gg 45 плазмид. Процентното съдържание на геномна ДНК в тази проба, установено чрез описаната в пример 2.2. техника, 1 0,1%.
Пример 5.
5. Използване на модифициран олиго- 50 нуклеотид
В този пример е описано използването на олигонуклеотид, носител на метилирани цитозини.
Последователността на използвания олигонуклеотид е следната:
GAGGMcCTTMcCTT'^TI^
3’ (SEQ ID No 12)
Този олигонуклеотид има NH2Drpyna 5’.МеС-5 метил цитозин. Този нукелотид позволява да се пречисти плазмид pXL2563 при условията на пример 1, с буфер за фиксиране с pH 5 (по този начин се намалява рискът от разграждане на плазмида).
Пример 6. В предхождащите примери използваният олигонуклеотид се модифицира в 5’-края с аминогрупа, свързана към фосфата чрез “рамо”, съдържащо 6 въглеродни атома: NH2-(CH2)6. В този пример аминогрупата е свързана към фосфата от 5’-края чрез “рамо” от дванадесет въглеродни атома: NH2(СН2)12.Прикрепването на олигонуклеотида и преминаването през колоната се извършва, както е описано в пример 2 с буфер F: NaCl 2 М, 0,2 М, рН4,5. Този олигонуклеотид позволява постигането на по-добри добиви при пречистването: постига се добив от 53%, докато с олигонуклеотида с 6 въглеродни атома, при същите условия, добивът е от порядъка на 45%.
Пример 7. Следвайки стратегията на клониране, описана в пример 1.2, се построяват два други плазмида, носещи хомопуринови-хомопиримидинови последователности: плазмид pXL2725, който съдържа последователността (GGA)]S, и плазмид pXL2726, който съдържа последователността (GA)^.
Пример 7.1. Конструиране на плазмиди
Плазмиди pXL2725 и pXL2726, аналогични на плазмид pXL2563, се конструират съгласно стратегията за клониране, описана в пример 1.2, при използване на следните двойки олигонуклеотиди:
5986 : S’-GATCCiGA)^ GGG-3’ (SEQ ID No 13)
5987 : 5’-ААТТССС(ТС)и G-3’ (SEQ IN No 14)
5981 : 5’-GATCC(GGA)17 GG-3’ (SEQ ID No 15)
5982 : 5’-AATT(CCT)17 CCG-3’ (SEQ ID No 16)
Двойката олигонуклеотиди 5986 и 5987 се използват за конструиране на плазмид pXL2726 чрез клониране на олигонуклеотиди10 те в сайтовете BamHI и EcoRI на pBKS + (Stratagene Cloning System, La Jolla СА), докато олигонуклеотиди 5981 и 5982 се използват за конструиране на плазмид pXL2725. Използват се същите експериментални условия както за конструирането на плазмид pXL2563, като само двойките олигонуклеотиди са променени. Също така клонираните последователности се проверяват чрез секвениране върху плазмидите. Това позволява да се види, че плазмид pXL2725 включва една модификация спрямо очакваната последователност, вместо последователността GGA, повторена 17 пъти, присъства GGAGA(GGA)tJ (SEQ ID No 17).
Пример 7.2. Подготовка на колоните и пречистване
Олигонуклеотидите, образуващи тройни спирали с тези хомопуринови последователности, се куплират (прикрепят) към колони HiTrap съгласно техниката, описана в пример
1.1. Става въпрос за олигонуклеотид с последователност:
5’-AATGCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTT3’ (SEQ ID No 18) за пречистване на плазмид pXL2725, и олигонуклеотид с последователност:
5’-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT3’ (SEQ ID No 19) за пречистване на плазмид pXL2726.
Получените по този начин две колони позволяват пречистването на съответните плазмиди съгласно техниката, описана в пример 2, със следните буфери:
Буфер F: NaCl 2 М, ацетат 0,2 М, pH 4,5. Буфер Е : Трие 1 М, НС1 pH 9, EDTA 0,5 тМ.
Получените добиви са 23% и 31%, съответно за pXL2725 и pXL2726.
Пример 8. Този пример илюстрира влиянието на дължината на специфичната последователност, присъстваща върху плазмида, върху добивите при пречистването.
Пример 8.1. Конструиране на плазмиди Използваният в тези експерименти “рипортер” ген за установяване на активностите на съставите съгласно изобретението е генът, кодиращ за луциферазата (Luc).
Плазмид pXL2621 включва касета, съдържаща промотора на Cytomegalovirus (CMV), състоящ се от 661 Ьр, извлечена от pcDNA3 (Invitrogen, Corp., San Diego, СА) чрез сряз ване с рестрикционните ензими Mlul и Hindlll, клонирана в посока up stream спрямо гена, кодиращ луциферазата, в сайтовете Mlul и Hindlll, във вектор pGL basic Vector (Promega Corp., Madisson, WI). Този плазмид се конструира при използване на стандартните техники на молекулярната биология.
Плазмидите pXL2727-l и pXL2727-2 се конструират по следния начин.
gg от плазмид pXL2621 се линеаризират чрез BamHI; ензимът е инактивиран чрез третиране при 65°С за 10 min; паралелно олигонуклеотидите 6006 и 6008 се хибридизират, както е описано за конструирането на плазмид pXL2563.
6006 5’-GATCT(GAA) CTGCAAGATCT3’ (SEQ ID No 20)
6OO85’-GATCAGATCTGCAG(TTC) A-3’ (SEQ ID No 21)
Тази хибридизационна смес се клонира в BamHI краищата на плазмид pXL2621 и след трансформиране в DH5 се забелязват рекомбинантни клонове чрез анализ с рестрикционни ензими с PstI, тъй като олигонуклеотидите вкарват един PstI сайт. Запазват се два клона и нуклеотидната последователност на клонирания фрагмент се проверява при използване на праймера (6282 5’-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG3’ (SEQ ID No 22) като начало на реакцията за последователността (Viera J. and J. Messing, 1982. The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19:259-268).
Първият клон (pXL2727-l) съдържа последователността GAA, повторена 10 пъти. Вторият (pXL2727-2) съдържа последователността
5’-GAAGAAGAG (GAA) ,GGAAGAGAA-3’ (SEQ ID No 23).
Пример 8.2. Приготвяне на колоните и пречистване
Използва се колона като тази, описана в пример 1, и към която е прикрепен олигонуклеотид
5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT3’ (SEQ ID No 1).
Плазмид pXL2727-l има 14 повтора на последователността GAA. Описаният олигонуклеотид, който съдържа само 7 повтора на съответната последователност на хибридизация СТТ, може следователно да се хибридизира с плазмида в 8 различни позиции. Обратно, плаз11 мид pXL2727-2 има хибридна последователност (GAA)7 със същата дължина като тази на олигонуклеотида, фиксиран на колоната. Следователно, този олигонуклеотид може да се хибридизира единствено в една позиция върху 5 PXL2727-2.
Експериментът е идентичен на този, описан в пример 2, със следните буфери:
Буфер F : NaCl 2 М, ацетат 0,2 М, pH 4,5.
Буфер Е : Трие 1 М, HCl pH 9, EDTA 0,5 тМ. 10
Добивът на пречистването е 29% при плазмид pXL2727-l и 19% при плазмид pXL2727-2.
Пример 8.3. In vitro трансфекция на клетки от бозайници. 15
Използваните клетки са NIH ЗТЗ клетки, които предната нощ са посяти на културални плаки с 24 ямки, с плътност 50,000 клетки/ ямка. Плазмидьт се разрежда в NaCl 150 шМ и се смесва с липофектант RPR115335. Изпол- 20 зва се отношение на положителни заряди на липофектанта / отрицателни заряди на ДНК, равно на 6. Сместа се вортексира (енергично се разклаща на Vortex), оставя се 10 min на стайна температура, разрежда се със среда, 25 лишена от ембрионален телешки серум, след което се прибавя към клетките в обем 1 g ДНК на културална ямка. След престой в продължение на 2 h при 37°С се прибавят 10 % (обем/ обем) ембрионален телешки серум и клетките се инкубират в продължение на 48 h при 37°С в присъствие на 5% СО2. Клетките се промиват двукратно с PBS и се измерва активността на луциферазата съгласно описания протокол (комплект Promega, Promega Corp. Madison, WI), на светломер Lumat LB9501 (EG et G 35 Berthold, Evry). Плазмид pXL2727-l, пречистен съгласно пример 8.2, дава два пъти повисоки добиви на трансфекция в сравнение със същия плазмид, пречистен с комплект Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI). 40
Списък на последователностите (1) Обща информация:
(i) Депозант:
(A) Име: Rhone Poulenc Rorer (B) Улица: 20 Avenue Raymond Aron (C) Град: Antony Cedex (E) Страна: France (F) Пощенски код: 92165 (G) Телефон: 40.91.69.22 (H) Факс: 40.91.72.91 (ii) Заглавие на изобретението: Пречис- 50 тване на ДНК чрез образуване на тройна спирала с имобилизиран олигонуклеотид (iii) Брой на последователностите: 25 (iv) Форма за дешифриране от компютър:
(A) Тип на носителя: лента (B) Компютър: IBM PC съвместим (C) Използвана система: PC-DOS/MS-DOS (D) Софтуер: Patentin Release No 1.0, версия № 1.30 (ОЕВ) (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 1:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 25 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 1:
GAGGCTTCTT СТТСТТСТТС ТТСТТ25 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 21:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 19 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 2:
CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 19 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 3:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 21 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 3:
GAAGGGTTCT ТСССТСТТТС С (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 4:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 13 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 4:
GAAAAAGGAAA GAG 13 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 5:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 19 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК 5 (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 5:
AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 6:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 19 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 6:
AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 7: 20 (1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 19 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна 25 (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 7:
TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 8: 30 (1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 17 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна 35 (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 8:
AAAAAAGGGA ATAAGGG 17 (2) Информация относно последовател- 4θ ност SEQ ID N0: 9:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 58 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ
ID N0: 9:
GATCCAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG AAGAAGAAGAAGAAAGAAGAAGAAGAAGG 58 50 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 10:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 58 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 10:
ААТТССТТСТ ТСТТСТТСТТ
СТТСТТСТТС ТТСТТСТТСТ ТСТТСТТСТТ
CTTCTTCGG 58 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 11:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 17 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 11:
TAGACCGGCAG CAAAATG 17 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 12:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 17 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (ix) Отличителни белези:
(D) Друга информация: всички цитозини С на последователността са метилирани (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 12:
GAGGCTTCTT СТТСТТСТТС ТТСТТ 25 (2) Информация относно последователност SEQ ID N0: 13:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 58 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID N0: 13:
GATTCCGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG
AGAGAGAGAG AGAGAGGG 58 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 14:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 58 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 14:
ААТТСССТСТ СТСТСТСТСТ
СТСТСТСТСТ СТСТСТСТСТ
СТСТСТСТСТ CTCTCTCG 58 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 15:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 58 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 15:
GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG
AGGAGGAGGA GGAGGAGG 58 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 16:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 58 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 16:
ААТТССССТССТ ССТССТССТС СТССТССТСС ТССТССТССТ
ССТССТССТС CTCCTCCG 58 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 17:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 50 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 17:
GGAGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG
AGGAGGAGGA 50 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 18:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 25 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ
ID No: 18:
AATGCCTCCT ССТССТССТС СТССТ25 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 19:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 26 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 19:
AGTGCTCTCT СТСТСТСТСТ СТСТСТ 26 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 20:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 66 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 20:
GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAACTGC60
AGATCT66 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 21:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 66 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфи1урация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 21:
GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT СТТСТТСТТС ТТСТТСТТСТ 60
ТСТТСА66 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 22:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 21 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 22:
ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G 21 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 23:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 39 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (й) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 23:
GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA 39 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 24:
(1) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 27 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 24:
CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27 (2) Информация относно последователност SEQ ID No: 25:
(i) Характеристика на последователността:
(A) Дължина: 27 базови двойки (B) Вид: нуклеотид (C) Брой вериги: единична (D) Конфигурация: линейна (ii) Тип на молекулата: сДНК (xi) Описание на последователност SEQ ID No: 25:
CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT 27

Claims (30)

1. Метод за получаване на лекарствено средство на базата на кръгова двойноверижна ДНК, характеризиращ се с това, че включва най-малко един етап на пречистване, при който разтвор, съдържащ споменатата ДНК в смес с други съединения, се пропуска през хроматографски носител, към който е прикрепен ковалентно олигонуклеотид, способен да образува чрез хибридизация тройна спирала със специфична хомопуринова/хомопиримидинова последователност, присъстваща в споменатата ДНК.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че разтворът, съдържащ споменатата ДНК, е клетъчен лизат.
3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че клетъчният лизат е бистър лизат.
4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че двойноверижната ДНК е предварително пречистена.
5. Метод съгласно една от претенциите от 1 до 4, характеризиращ се с това, че специфичната последователност се въвежда изкуствено в двойноверижната ДНК.
6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидът включва поли(СТТ) последователност и специфичната последователност, присъстваща в ДНК, е поли (GAA) последователност.
7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидът притежава последователността GAGGCTTCT ТСТТСТТСТТСТТСТТ (SEQ ID No 1).
8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидът притежава последователността (СТТ)7 (SEQ ID No. 26).
9. Метод съгласно претенция 7 или 8, характеризиращ се с това, че специфичната последователност, присъстваща в ДНК, включва последователността (GAA)7, (GAA)]4 или (GAA)„.
10. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че специфичната последователност, присъстваща в ДНК, включва последователността SEQ ID No. 5 и олигонуклеотидът включва последователността SEQ ID No. 6 или SEQ ID No. 7.
11. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че специфичната последователност, присъстваща в ДНК, включва последователността SEQ ID No. 17 и олигонуклеотидът включва последователността SEQ ID No. 18.
12. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че специфичната последователност, присъстваща в ДНК, включва последователността (GA)M и олигонуклеотидът включва последователността SEQ ID No. 19.
13. Метод съгласно една от претенциите от 1 до 4, характеризиращ се с това, че специфичната последователност е специфична последователност, естествено присъстваща в двойноверижната ДНК.
14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че специфичната последователност, естествено присъстваща в ДНК, е хомопуринова-хомопиримидинова последователност, присъстваща в началото на репликация на един плазмид.
15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че специфичната ДНК последователност включва цялата или част от последователността SEQ ID No. 2, съдържаща се в началото на репликация ColEl на Е. coli.
16. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидът включва последователността SEQ ID No. 3.
17. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че специфичната ДНК последователност включва цялата или част от последователността SEQ ID No. 4 или от последователността SEQ ID No. 8, включена в βлактамазния ген на плазмид pBR322.
18. Метод съгласно една от предходните претенции, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидът е прикрепен към хроматографския носител чрез дисулфидна, тиоетерна, естерна, амидна или аминна връзка.
19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидът е свързан към хроматографския носител чрез рамо, съставено от въглеродна верига (СН2)п, в която η е цяло число между 1 и 18 включително, като рамото е свързано с олигонуклеотида чрез един фосфат, а към колоната - чрез амидна връзка.
20. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че рамото е съставено от права въглеродна верига, съдържаща 6 въглеродни атома.
21. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че рамото е съставено от права въглеродна верига, съдържаща 12 въглеродни атома.
22. Метод съгласно една от предходните претенции, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидът притежава най-малко една химическа модификация, което го прави резистентен на или защитен по отношение на нуклеазите, или което увеличава афинитета му към специфичната последователност.
23. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидът включва хомопиримидинова последователност, в която поне един от цитозините е метилиран.
24. Метод съгласно една от предходните претенции, характеризиращ се с това, че ДНК включва, освен това, една или повече последователности с терапевтично значение.
25. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че двойноверижната ДНК е кръгова ДНК, например като плазмид.
26. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че специфичната последователност, присъстваща в двойноверижната ДНК, включва няколко позиции за хибридизация с олигонуклеотида.
27. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че лекарството е със съдържание на хромозомална ДНК, по-ниско или равно на 0,5%.
28. Метод съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че лекарството е със съдържание на хромозомална ДНК, по-ниско или равно на 0,2%.
29. Метод съгласно претенция 28, характеризиращ се с това, че лекарството е със съдържание на хромозомална ДНК, по-ниско или равно на 0,1 %.
30. Метод за пречистване на плазмидна ДНК, характеризиращ се с това, че включва най-малко един етап, при който разтвор, съдържащ споменатата ДНК в смес с други компоненти, се пропуска през хроматографски носител, към който е прикрепен ковалентно олигонуклеотид, способен да образува чрез хибридизация тройна спирала със специфична хомопуринова/хомопиридинова последователност, присъстваща в споменатата ДНК.
BG101620A 1994-12-16 1997-06-16 Пречистване на днк чрез образуване на тройна спирала с имобилизиран олигонуклеотид BG64198B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9415162A FR2728264B1 (fr) 1994-12-16 1994-12-16 Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise
PCT/FR1995/001468 WO1996018744A2 (fr) 1994-12-16 1995-11-08 Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG101620A BG101620A (bg) 1998-03-31
BG64198B1 true BG64198B1 (bg) 2004-04-30

Family

ID=9469865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG101620A BG64198B1 (bg) 1994-12-16 1997-06-16 Пречистване на днк чрез образуване на тройна спирала с имобилизиран олигонуклеотид

Country Status (31)

Country Link
US (2) US6287762B1 (bg)
EP (2) EP1281774B1 (bg)
JP (2) JPH10510427A (bg)
KR (1) KR100431163B1 (bg)
CN (1) CN100591776C (bg)
AT (1) ATE233825T1 (bg)
AU (1) AU715630B2 (bg)
BG (1) BG64198B1 (bg)
BR (1) BR9510089A (bg)
CA (1) CA2208245C (bg)
CY (1) CY1110372T1 (bg)
CZ (1) CZ295474B6 (bg)
DE (1) DE69529842T2 (bg)
DK (1) DK0797682T3 (bg)
ES (2) ES2197928T3 (bg)
FI (1) FI120836B (bg)
FR (1) FR2728264B1 (bg)
HU (1) HU221062B1 (bg)
IL (2) IL116398A (bg)
MX (1) MX9703670A (bg)
NO (1) NO320428B1 (bg)
NZ (1) NZ297023A (bg)
PL (1) PL184430B1 (bg)
PT (1) PT797682E (bg)
RO (1) RO116970B1 (bg)
RU (1) RU2174125C2 (bg)
SK (2) SK286956B6 (bg)
TW (1) TW459043B (bg)
UA (1) UA72421C2 (bg)
WO (1) WO1996018744A2 (bg)
ZA (1) ZA9510756B (bg)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7038026B2 (en) 2000-05-26 2006-05-02 Centelion Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
AU6718498A (en) * 1997-02-22 1998-09-09 Universitat Heidelberg Marking of nucleic acids with special probe mixtures
US20030105040A1 (en) * 2001-11-13 2003-06-05 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of inhibitor-kappa B-R expression
JP2002535987A (ja) * 1999-02-04 2002-10-29 インヴィトロゲン・コーポレーション 核酸分子の単離
US7052844B2 (en) * 1999-12-21 2006-05-30 Ingeneus, Inc. Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism
CZ303086B6 (cs) * 2000-05-26 2012-03-28 Aventis Pharma S.A. Zpusob purifikace dvojretezcové DNA užitím imobilizovaného oligonukleotidu
US20060008817A1 (en) 2000-12-08 2006-01-12 Invitrogen Corporation Methods and compositions for generating recombinant nucleic acid molecules
DE10104025B4 (de) * 2001-01-31 2008-07-10 Qiagen North American Holdings, Inc. Verfahren zur Aufreinigung und anschließenden Amplifikation von Doppelstrang-DNA
WO2002077274A2 (fr) * 2001-03-23 2002-10-03 Gencell S.A. Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice.
FR2822476B1 (fr) 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
KR100790764B1 (ko) 2002-11-12 2008-01-03 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코포레이션 조혈세포 집단에서 정지세포를 증대시키는 방법
WO2005100542A1 (en) * 2004-04-19 2005-10-27 Centelion Method for purifying plasmid dna
BRPI0413907A (pt) * 2003-09-17 2006-10-24 Centelion método de preparação de plasmìdeo dna de grau farmacêutico
US7217522B2 (en) 2004-02-12 2007-05-15 Campass Genetics Llc Genetic analysis by sequence-specific sorting
EP1737945B1 (en) 2004-04-19 2011-01-26 Aventis Pharma S.A. Method for purifying plasmid dna
BRPI0515418A (pt) 2004-08-16 2008-07-22 Nature Technology Corp método para a produção de dna de plasmìdio super-enrolado fechado covalentemente e composição de matéria
US7407757B2 (en) * 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
CN105316314B (zh) * 2014-07-29 2018-07-27 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种高纯度的微环dna及其制备方法和应用
EP4279613A3 (en) * 2017-03-24 2024-05-22 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US5166315A (en) * 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4766072A (en) * 1985-07-17 1988-08-23 Promega Corporation Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence
US5665541A (en) 1986-10-28 1997-09-09 The Johns Hopkins University Formation of triple helix complexes for the detection of double stranded DNA sequences using oligomers which comprise an 8-modified purine base
EP0333813A1 (fr) 1987-09-17 1989-09-27 Appligene Procede de fixation et de separation de molecules comportant au moins un fragment d'adn naturel ou synthetique
US5352578A (en) 1989-02-15 1994-10-04 Worcester Foundation For Experimental Biology Method of separating oligonucleotides from a mixture
JP3046837B2 (ja) 1989-03-10 2000-05-29 バイシス・インコーポレーテツド 固定化されたオリゴヌクレオチドのプローブおよびそれらの使用
CA2015515C (en) * 1990-01-03 1999-12-07 Jean-Marie Saint-Remy Pharmaceutical compositions containing antigen-antibody complexes and uses therefor
WO1992009705A1 (en) * 1990-11-23 1992-06-11 Gilead Sciences, Inc. Triplex-forming oligomers containing modified bases
EP0566670A4 (en) * 1990-12-17 1993-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
WO1992013963A1 (en) 1991-01-30 1992-08-20 Hyman Edward D Method for preparation of closed circular dna
EP0533952A4 (en) 1991-04-15 1993-07-07 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Process for separating or extracting nucleic acid from specimen containing the same
ATE192503T1 (de) 1991-12-24 2000-05-15 Tepnel Medical Ltd Manipulation von nukleinsäuresequenzen
AU4544193A (en) 1992-06-25 1994-01-24 Microprobe Corporation Solid supports for nucleic acid hybridization assays
US5401632A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Triple helix purification and sequencing
WO1994017086A1 (en) 1993-01-25 1994-08-04 Apollon, Inc. Gene regulation by targeting putative intramolecular triple helix

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10510427A (ja) 1998-10-13
FR2728264B1 (fr) 1997-01-31
HU221062B1 (hu) 2002-07-29
EP0797682B1 (fr) 2003-03-05
JP2009045070A (ja) 2009-03-05
EP1281774A3 (fr) 2004-02-04
ZA9510756B (en) 1996-05-30
CY1110372T1 (el) 2013-09-04
BG101620A (bg) 1998-03-31
PL320697A1 (en) 1997-10-27
ES2197928T3 (es) 2004-01-16
NO320428B1 (no) 2005-12-05
RU2174125C2 (ru) 2001-09-27
HUT77104A (hu) 1998-03-02
US6287762B1 (en) 2001-09-11
AU4178996A (en) 1996-07-03
PT797682E (pt) 2003-07-31
NZ297023A (en) 2000-01-28
SK75697A3 (en) 1998-02-04
CA2208245C (fr) 2011-04-19
KR100431163B1 (ko) 2004-07-22
ES2446983T3 (es) 2014-03-11
TW459043B (en) 2001-10-11
BR9510089A (pt) 1998-07-14
EP1281774B1 (fr) 2013-12-25
IL116398A (en) 2006-10-31
PL184430B1 (pl) 2002-10-31
ATE233825T1 (de) 2003-03-15
RO116970B1 (ro) 2001-08-30
DK0797682T3 (da) 2003-06-23
DE69529842D1 (de) 2003-04-10
CN1170438A (zh) 1998-01-14
IL116398A0 (en) 1996-03-31
CA2208245A1 (fr) 1996-06-20
FI972526A0 (fi) 1997-06-13
NO972710L (no) 1997-06-12
FI120836B (fi) 2010-03-31
SK51042008A3 (en) 1998-02-04
SK286956B6 (sk) 2009-08-06
AU715630B2 (en) 2000-02-03
IL171488A (en) 2012-01-31
EP0797682A2 (fr) 1997-10-01
CZ295474B6 (cs) 2005-08-17
MX9703670A (es) 1997-08-30
FI972526A (fi) 1997-06-13
US6319672B1 (en) 2001-11-20
WO1996018744A3 (fr) 1996-08-29
CZ185897A3 (en) 1997-09-17
NO972710D0 (no) 1997-06-12
WO1996018744A2 (fr) 1996-06-20
SK288366B6 (sk) 2016-07-01
EP1281774A2 (fr) 2003-02-05
CN100591776C (zh) 2010-02-24
DE69529842T2 (de) 2003-08-28
UA72421C2 (en) 2005-03-15
FR2728264A1 (fr) 1996-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG64198B1 (bg) Пречистване на днк чрез образуване на тройна спирала с имобилизиран олигонуклеотид
US8399636B2 (en) Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide
AU2007202804A1 (en) Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide
IL152860A (en) Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide