SK286956B6 - Spôsob čistenia DNA tvorbou trojitej závitnice s imobilizovaným oligonukleotidom - Google Patents

Spôsob čistenia DNA tvorbou trojitej závitnice s imobilizovaným oligonukleotidom Download PDF

Info

Publication number
SK286956B6
SK286956B6 SK756-97A SK75697A SK286956B6 SK 286956 B6 SK286956 B6 SK 286956B6 SK 75697 A SK75697 A SK 75697A SK 286956 B6 SK286956 B6 SK 286956B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
sequence
dna
oligonucleotide
seq
plasmid
Prior art date
Application number
SK756-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK75697A3 (en
Inventor
Jo�L Crouzet
Daniel Scherman
Pierre Wils
Original Assignee
Gencell Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9469865&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK286956(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gencell Sa filed Critical Gencell Sa
Publication of SK75697A3 publication Critical patent/SK75697A3/sk
Publication of SK286956B6 publication Critical patent/SK286956B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/924—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis using nanostructure as support of dna analysis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

Opisuje sa spôsob čistenia dvojvláknovej DNA, pri ktorom sa roztok obsahujúci uvedenú DNA v zmesi s ostatnými zložkami vedie cez nosič, ku ktorému je kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný tvoriť hybridáciou trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou prítomnou v uvedenej DNA.

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nového spôsobu čistenia DNA. Spôsob podľa vynálezu umožňuje rýchlo čistiť dvojvláknovú DNA, ktorá je farmakologicky použiteľná. Spôsob čistenia podľa vynálezu využíva špecifickú hybridi5 záciu medzi sekvenciami DNA a oligonukleotidom.
Doterajší stav techniky
Techniky génovej a bunkovej terapie prežívajú v súčasnom období mimoriadny rozvoj. Ale tieto techniky prinášajú možnosť produkovať veľké množstvá farmaceutický čistej DNA. V skutočnosti pri týchto nových terapiách liečivo často pozostáva zo samotnej DNA, a je dôležité môcť vyrábať túto DNA v zodpovedajúcich množstvách, izolovať ju a čistiť ju spôsobom vhodným na terapeutické účely v humánnej medicíne.
Vynález poskytuje jednoduchý a obzvlášť účinný nový spôsob čistenia DNA. Predovšetkým umožňuje 15 získať zvlášť vysoké čistoty vo vysokých výťažkoch.
Podstata vynálezu
Spôsob podľa vynálezu v podstate spočíva v špecifickej interakcii medzi sekvenciou vloženou do DNA, ktorá má byť čistená, a oligonukleotidom tvoreným prírodnými alebo modifikovanými bázami.
Nedávno bolo dokázané, že niektoré oligonukleotidy sú schopné špecificky interagovať vo veľkej ryhe dvojzávitnice DNA za lokálneho vzniku trojitej závitnice, čo vedie k inhibícii transkripcie cielených génov (Héléne et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Tieto oligonukleotidy selektívne rozpoznajú 25 dvojzávitnicu DNA na sekvenciách oligopurín-oligopyrimidín, t. j. v oblastiach majúcich oligopyrimidínovú sekvenciu na komplementárnom reťazci, a tvoria tam lokálne trojitú závitnicu. Bázy tretieho reťazca (oligonukleotid) tvoria vodíkové väzby (väzby Hoogsteen alebo obrátené väzby Hoogsteen) s purinmi párov Watson-Crickových báz.
Použitie tohto typu interakcie na izolovanie plazmidu bolo opísané v doterajšom stave techniky. Tak Ito a 30 kol. (PNAS 89 (1992) 495) opisujú použitie biotinylovaných oligonukleotidov schopných rozpoznať konkrétnu sekvenciu plazmidu a vytvoriť s touto sekvenciou trojitú závitnicu. Takto vytvorené komplexy sú potom uvedené do styku s magnetickými guľôčkami pokrytými streptavidínom. Interakcia medzi biotínom a streptavidínom potom umožňuje izolovať plazmid magnetickou separáciou guľôčok a potom elúciou. Ale tento spôsob má niektoré nedostatky. Predovšetkým sú tu potrebné dve za sebou idúce špecifické interakcie, 35 pričom prvá interakcia prebieha medzi oligonukleotidom a plazmidom a druhá interakcia prebieha medzi biotinylovaným komplexom a streptavidínovými guľôčkami. Okrem toho môže byť výsledný roztok kontaminovaný biotinylovaným oligonukleotidom, ktorý sa nemôže použiť vo farmaceutickej kompozícii.
Spôsob podľa vynálezu predstavuje nový, zlepšený spôsob čistenia DNA, ktorý využíva uvedený typ interakcie. Konkrétnejšie, spôsob podľa vynálezu využíva oligonukleotidy, ktoré sú viazané kovalentnou väz40 bou k nosiču. Tento spôsob je mimoriadne rýchly a dosahuje sa pri ňom vysoká miera čistoty a hlavne vysoké výťažky. Navyše spôsob podľa vynálezu umožňuje čistiť DNA z komplexných zmesí obsahujúcich, predovšetkým, ďalšie nukleové kyseliny, proteíny, endotoxíny (také ako lipopolysacharidy), nukleázy a podobne. Použité nosiče môžu byť navyše ľahko recyklované a získané DNA majú zlepšené vlastnosti farmaceutickej bezpečnosti. Navyše sa spôsob podľa vynálezu realizuje iba na jedinom stupni, na rozdiel od spôsobov 45 doterajšieho stavu techniky.
Predmet vynálezu teda spočíva v spôsobe čistenia dvojvláknovej DNA, ktorého podstata spočíva v tom, že sa roztok obsahujúci uvedenú DNA v zmesi s ostatnými zložkami zavedie na nosič, ku ktorému je kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný hybridizáciou vytvoriť trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou prítomnou v uvedenej DNA. Uvedenou špecifickou sekvenciou môže byť sekvencia, ktorá je prirodzene prí50 tomná v dvojvláknovej DNA alebo syntetická umelo zavedená sekvencia.
Oligonukleotidy, ktoré sa používajú v rámci vynálezu, sú oligonukleotidy priamo hybridizujúce s dvojvláknovou DNA. Tieto oligonukleotidy môžu obsahovať nasledovné bázy:
- tymín (T), ktorý je schopný tvoriť triplety s dubletmi A.T dvojvláknovej DNA (Rajagopal a kol., Biochem 28 (1989) 7859),
- adenín (A), ktorý je schopný tvoriť triplety s dubletmi A.T dvojvláknovej DNA,
- guanín (G), ktorý je schopný tvoriť triplety s dubletmi G.C dvojvláknovej DNA,
- protónovaný cytozín (C+), ktorý je schopný tvoriť triplety s dubletmi G.C dvojvláknovej DNA (Rajagopal a kol., citovaný skôr),
- uracil (U), ktorý je schopný tvoriť triplety s pármi báz A.U alebo A.T.
SK 286956 Β6
Použitý oligonukleotid výhodne obsahuje homopyrimidínovú sekvenciu bohatú na cytozín a špecifickou sekvenciou prítomnou v DNA je homopurínová-homopyrimidmová sekvencia. Prítomnosť cytozínu umožňuje mať stabilnú trojitú závitnicu pri kyslom pH, keď sú cytozíny protónované, a destabilizovanú trojitú závitnicu pri alkalickom pH, kde sú cytozíny neutralizované.
Na umožnenie tvorby trojitej závitnice hybridizáciou je dôležité, aby oligonukleotid a špecifická sekvencia prítomná v DNA boli komplementárne. V tomto ohľade sa na dosiahnutie najlepších výsledkov a najlepšej selektivity sa v spôsobe podľa vynálezu používa oligonukleotid a špecifická sekvencia, ktoré sú plne komplementárne. Predovšetkým môže ísť o oligonukleotid poly-CTT a o špecifickú sekvenciu poly-GAA. Ako príklad možno uviesť oligonukleotid so sekvenciou 5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTT-CTT-3’ (GAGG(CTT))7 (SEQ ID n° 1), v ktorom bázy GAGG netvoria trojitú závitnicu, ale umožňujú oddeliť oligonukleotid od väzobného ramena. Takisto je možné uviesť sekvenciu (CTT)7 (SEQ ID n° 26). Tieto oligonukleotidy sú schopné tvoriť trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou obsahujúcou komplementárne motívy (GAA). Môže predovšetkým ísť o oblasť obsahujúcu 7, 14 alebo 17 motívov GAA, ako je to opísané v príkladovej časti.
Ďalšou zaujímavou špecifickou sekvenciou je sekvencia: 5’-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’ (SEQ ID n° 5).
Táto sekvencia tvorí trojitú závitnicu s oligonukleotidmi 5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’ (SEQ ID n° 6) alebo 5’-TTGGTGTGGTGGGTGGTT-3’-3’ (SEQ ID n° 7).
V tomto prípade sa oligonukleotid fixuje v antiparalelnej orientácii proti polypurínovému vláknu. Tieto trojité závitnice sú stabilné iba v prítomnosti Mg2+ (Vasquez a kol., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251, Beal a Dervan, Science, 1991,251,1360-1363).
Ako už bolo uvedené, môže byť špecifickou sekvenciou sekvencia, ktorá je v dvojvláknovej DNA prítomná prirodzeným spôsobom, alebo sekvencia syntetická, ktorá je do dvojvláknovej DNA zavedená umelo. Je obzvlášť zaujímavé použiť oligonukleotid schopný vytvoriť trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou, ktorá je prirodzene prítomná v dvojvláknovej DNA, napríklad pôvodom z replikácie plazmidu alebo v markerovom géne. Z tohto hľadiska prihlasovateľ uskutočnil sekvenčné analýzy plaznúdov a mohol takto dokázať, že niektoré oblasti týchto DNA, ktoré sú hlavne replikačného pôvodu, môžu obsahovať homopurínovéhomopyrimidínové oblasti. Syntéza oligonukleotidov schopných vytvoriť trojité závitnice s týmito homopurínovými-homopyrimidínovými oblasťami prirodzeného pôvodu výhodne umožňuje aplikovať spôsob podľa vynálezu na nemodifikované plazmidy, hlavne na komerčné plazmidy typu pUC, pBR322, pSV atď. Z homopurínových-homopyrimidínových sekvencií, ktoré sú prirodzene prítomné v dvojvláknovej DNA, možno uviesť sekvenciu obsahujúcu celok alebo časť sekvencie 5’-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’ (SEQ ID n° 2), ktorá je prítomná v replikačnom začiatku ColEl z Escherichia coli. V tomto prípade má oligonukleotid tvoriaci trojitú závitnicu sekvenciu: 5’-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3’ (SEQ ID n° 3) a viaže sa alternatívne na obe vlákna dvojzávitnice, ako to opísali Beal a Dervan (J.Am.Chem.Soc. 1992, 114, 4976-4982) a Jayasena a Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Takisto možno uviesť sekvenciu: 5’-GAAAAAGGAAGAG-3’ (SEQ ID n° 4) génu beta-laktamázy plazmidu pBR322 (Duval-Valentín a kol., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992, 89, 504508). Použitie oligonu-kleotidu schopného vytvoriť trojitú závitnicu so sekvenciou prítomnou v replikačnom začiatku alebo v markerovom géne je obzvlášť výhodné, lebo umožňuje rovnakým oligonukleotidom čistiť ľubovoľnú DNA obsahujúcu uvedený replikačný začiatok alebo uvedený markerový gén. Nie je teda nevyhnutné modifikovať plazmid alebo dvojvláknovú DNA tak, aby sa do nej inkorporovala špecifická sekvencia.
Akokoľvek sú plne komplementárne sekvencie výhodné v rámci spôsobu podľa vynálezu, je samozrejmé, že je možné tolerovať určité nedokonalé spárovanie medzi sekvenciou oligonukleotidu a sekvenciou prítomnou v DNA v prípade, že tieto nedokonalosti v párovaní nevedú k príliš veľkej strate afinity. Takto možno uviesť sekvenciu 5’-AAAAAAGGGAATAAGGG-3’ (SEQ ID n“ 8) prítomnú v géne beta-laktamázy Escherichia coli. V tomto prípade môže byť tymín prerušujúci polypurínovú sekvenciu rozpoznaný guanínom tretieho reťazca tvoriac takto triplet ATG, ktorý je stabilný, keď je zarámovaný dvoma tripletmi TAT (Kiesling a kol., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
V rámci špecifickej formy uskutočnenia vynálezu obsahujú oligonukleotidy podľa vynálezu sekvenciu (CCT)n, sekvenciu (CT)n alebo sekvenciu (CTT)n, v ktorej n znamená celé číslo od 1 do 15. Je obzvlášť výhodné použiť sekvencie typu (CT)n alebo (CTT)n. Prihlasovateľ v skutočnosti preukázal, že výťažok čistenia je ovplyvnený množstvom C v oligonukleotide. Ako je to uvedené v príklade 7, vzrastá výťažok čistenia v prípadoch, keď oligonukleotid obsahuje menej cytozínov. Je samozrejmé, že oligonukleotidy podľa vynálezu môžu byť takisto kombinované s motívmi (CCT), (CT) alebo (CTT).
Použitým oligonukleotidom môže byť prírodný oligonukleotid (tvorený prirodzenými nemodifikovanými bázami) alebo chemicky modifikovaný oligonukleotid. Použitý oligonukleotid môže výhodne obsahovať niektoré chemické modifikácie umožňujúce zvýšiť jeho odolnosť alebo ochranu proti nukleázam alebo jeho afinitu ku špecifickej sekvencii.
Pod pojmom oligonukleotid sa v rámci vynálezu rozumie ľubovoľný reťazec nukleozidov, ktorý podstúpil modifikáciu skeletu na zvýšenie jeho rezistencie proti nukleázam. Z možných modifikácií možno uviesť oligonukleotido-fosforotioáty, ktoré sú schopné vytvoriť trojité závitnice s DNA (Xodo a kol., Nucleic Acids Res., 1994,22, 3322-3330), takisto ako oligonukleotidy majúce formacetálový alebo metylfosfonátový skelet (Matteuci a kol., J.Am.Chem.Soc., 1991, 113, 7767-7768). Takisto je možné použiť oligonukleotidy syntetizované s alfa-anomérmi nukleotidov, ktoré takisto tvoria trojité závitnice s DNA (Le Doan a kol., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Ďalšiu modifikáciu skeletu predstavuje fosforamidátová väzba. Možno napríklad uviesť intemukleotidovú väzbu N3’-P5’-fosforoamidátového typu opísanú Gryaznov-om a Chenom, ktorá poskytuje oligonukleotidy tvoriace s DNA obzvlášť stabilné trojité závitnice (J.Am.Chem.Soc., 1994,116, 3143-3144). Z ostatných modifikácií skeletu možno takisto uviesť použitie ribonukleotidov, 2’-O-metylribózy, fosfodiesteru, (Sun a Héléne, Curr.Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Fosforovaný skelet môže byť nakoniec nahradený polyamidovým skeletom, ako je to v prípade PNA (peptid-nukleovej kyseliny), ktorý môžu takisto tvoriť trojité závitnice (Nielsen a kol., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim a kol., J.Am.Chem.Soc., 1993, 115, 6477-6481), alebo skeletom na báze guanidínu, ako je tomu v prípade DNG (deoxyribonukleoguanidínu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), a polykatiónovými analógmi DNA, ktoré tiež tvoria trojité závitnice.
Tymín tretieho reťazca môže byť tiež nahradený 5-bróm-uracilom, čo zväčšuje afinitu nukleotidu k DNA (Povsic a Dervan, J.Am.Chem.Soc., 1989,111, 3059-3061). Tretí reťazec môže takisto obsahovať neprírodné bázy, medzi ktorými možno uviesť 7-deaza-2’-deoxyxantozín (Milligan a kol., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), l-(2-deoxy-beta-D-ribofuranozyl)-3-metyl-5-amino-l-H-pyrazolo/4, 3-d/pyrimidin-7-ón (Koh a Dervan, J.Am.Chem.Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenín, 2-aminopurín, 2’-O-metyl-pseudoizocytidín alebo ľubovoľnou inou známou modifikáciou (pozri revue Sun a Héléne, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993,3, 345-356).
Ďalší typ modifikácie oligonukleotidu má za úlohu predovšetkým zlepšiť interakciu a/alebo afinitu medzi oligonukleotidom a špecifickou sekvenciou. V tomto ohľade spočíva obzvlášť výhodná modifikácia podľa vynálezu v tom, že sa metylujú cytozíny oligonukleotidu (pozri príklad 5). Takto metylovaný oligonukleotid má pozoruhodnú vlastnosť tvoriť stabilnú trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou v oblastiach pH bližších neutrálnej reakcii (pH vyššie alebo rovnajúce sa 5). Táto modifikácia takto umožňuje pracovať pri vyšších hodnotách pH, než je tomu v prípade oligonukleotidov patriacich do rozsahu súčasného stavu techniky, t. j. pri hodnotách pH, pri ktorých je výrazne nižšie riziko degradácie plazmidovej DNA.
Dĺžka oligonukleotidu použitého v rámci spôsobu podľa vynálezu sa rovná aspoň 3 bázam a výhodne sa pohybuje v rozsahu od 5 do 30 báz. Výhodne sa použije oligonukleotid majúci dĺžku vyššiu ako 10 báz. Dĺžka oligonukleotidu môže byť samotným odborníkom v danom odbore prispôsobená selektivite a stabilite požadovanej na uvedenú interakciu.
Oligonukleotidy použité v rámci vynálezu môžu byť syntetizované ľubovoľnou známou technikou. Hlavne môžu byť pripravené s použitím syntetizérov nukleových kyselín. Jednako len je zrejmé, že na tento účel môže byť použitá i akákoľvek iná známa metóda.
Na dosiahnutie kovalentného naviazania oligonukleotidu na nosič je oligonukleotid všeobecne funkcionalizovaný. Takto môže byť nukleotid modifikovaný koncovou tiolovou skupinou, aminovou skupinou alebo karboxylovou skupinou v polohe 5’ alebo 3’. Predovšetkým, zavedenie tiolovej, amínovej alebo karboxylovej skupiny umožňuje, napríklad, naviazanie oligonukleotidu na nosič nesúci funkčné skupiny disulfid, maleimid, amín, karboxyl, ester, epoxid, brómkyán alebo aldehyd. Tieto naviazania sa realizujú vytvorením disulfidovej, tioéterovej, esterovej, amidovej alebo amínovej väzby medzi oligonukleotidom a nosičom. Takisto môže byť použitá i akákoľvek iná metóda, ako napríklad metóda spočívajúca v použití bifunkčných väzobných reakčných činidiel.
Inak môže byť na zlepšenie hybridizácie s viazaným oligonukleotidom výhodné, aby oligonukleotid obsahoval „rameno“ a „dištančnú sekvenciu báz“. Použitie uvedeného ramena umožňuje v skutočnosti fixovať oligonukleotid vo zvolenej vzdialenosti od nosiča, čo zase umožňuje zlepšenie podmienok interakcie s DNA. Uvedené rameno je výhodne tvorené lineárnym uhlíkovým reťazcom obsahujúcim 1 až 18, výhodne 6 alebo 12 skupín (CH2), a amínom, ktorý umožňuje väzbu na nosič. Rameno je spojené s fosfátom oligonukleotidu alebo „dištančnou sekvenciou báz“ tvorenou bázami, ktoré neinterferujú s hybridizáciou. Uvedená „dištančná sekvencia báz“ môže obsahovať purmové bázy. Tak napríklad „dištančná sekvencia báz“ môže obsahovať sekvenciu GAGG. Uvedené rameno je výhodne tvorené lineárnym uhlíkovým reťazcom obsahujúcim 6 alebo 12 uhlíkových atómov.
V rámci vynálezu môžu byť použité rôzne typy nosičov. Môže ísť o funkcionalizované chromatografické nosiče, a to voľne sypané alebo prekoncionované v kolóne, funkcionalizované povrchy plastických hmôt ale bo o fúnkcionalizované latexové guľôčky s magnetickým alebo nemagnetickým charakterom. Výhodnými sú chromatografícké nosiče. Ako príklady takýchto nosičov možno z chromatografíckých nosičov uviesť agarózu, akrylamín alebo Dextrán, takisto ako ich deriváty (ako Sephadex, Sepharose, Superose,), polyméry, ako poly(styiéndivinylbenzén) alebo vrúbľovaný alebo nevrúbľovaný oxid kremičitý (silika). Použité chromatografické kolóny môžu byť používané na princípe difúzie alebo perfúzie.
Na dosiahnutie lepších výsledkov čistenia je obzvlášť výhodné použiť na plazmide sekvenciu obsahujúcu niekoľko polôh hybridizácie s oligonukleotidom. Prítomnosť niekoľkých hybridizačných polôh priaznivo ovplyvňuje a uprednostňuje interakcie medzi uvedenou sekvenciou a oligonukleotidom, čo zase vedie k zlepšeniu výťažku čistenia. Takto je pre oligonukleotid obsahujúci n repetícií motívov (CCT), (CT) alebo (CTT) výhodné použiť sekvenciu DNA obsahujúcu aspoň n komplementárnych motívov, výhodne n + 1 komplementárnych motívov. Sekvencie nesúce n + 1 komplementárnych motívov takto ponúkajú oligonukleotidu dve hybridizačné polohy. Výhodne sekvencia DNA obsahuje 11 hybridizačných polôh, t. j. n + 10 komplementárnych motívov.
Spôsob podľa vynálezu môže byť použitý na čistenie ľubovoľnej dvojvláknovej DNA. Ide napríklad o kruhovú DNA, akou je plazmid nesúci všeobecne jeden alebo niekoľko terapeuticky zainteresovaných génov. Takýto plazmid môže takisto niesť počiatok replikácie, markerový gén atď. Spôsob podľa vynálezu môže byť tiež aplikovaný priamo na bunkový lyzát. Pri tomto spôsobe uskutočnenia vynálezu sa plazmid amplifíkovaný transformáciou a potom bunkovou kultúrou čistí priamo po lýze buniek. Spôsob podľa vynálezu môže byť takisto použitý na číry lyzát, t. j. supematant získaný po neutralizácii a odstredení bunkového lyzátu. Spôsob podľa vynálezu môže byť úplne jasne aplikovaný na roztok predbežne čistený známymi metódami. Spôsob podľa vynálezu takisto umožňuje čistiť lineárnu alebo kruhovú DNA nesúcu zainteresovanú sekvenciu zo zmesi obsahujúcej DNA rôznych sekvencii. Spôsob podľa vynálezu môže byť takisto použitý na čistenie dvojvláknovej RNA.
Bunkovým lyzátom môže byť lyzát prokaryotických alebo eúkaryotických buniek.
V prípade prokaryotických buniek môžu byť napríklad uvedené baktérie Escherichia coli, B. subtilis, S. typhimurium alebo Streptomyces. V prípade eúkaryotických buniek možno uviesť živočíšne bunky, kvasinky, huby atď. a predovšetkým kvasinky Kluyveromyces alebo Saccharomyces alebo bunky COS, CHO, C127, NIH3T3, atď.
Spôsob podľa vynálezu je obzvlášť výhodný vzhľadom na to, že umožňuje získať rýchlym a jednoduchým spôsobom plazmidovú DNA veľmi vysokej čistoty. Predovšetkým tento spôsob umožňuje, čo je napokon ilustrované v príkladoch, účinne oddeliť uvažovanú plazmidovú DNA od kontaminujúcich zložiek, akými sú fragmentovaná chromozomálna DNA, endotoxíny, proteíny, nukleázy atď. Spôsob podľa vynálezu predovšetkým umožňuje získať preparáty dvojvláknovej DNA, a to zvlášť plazmidovej DNA, ktorej obsah chromozomálnej DNA je nižší alebo rovnajúci sa 0,5 %. Ešte výhodnejšie majú prípravky DNA získanej s použitím spôsobu podľa vynálezu obsah chromozomálnej DNA nižší alebo rovnajúci sa 0,2 %. Spôsob podľa vynálezu teda poskytuje kompozície obsahujúce plazmidovú DNA použiteľné predovšetkým v génovej alebo bunkovej terapii. Vzhľadom na to je predmetom vynálezu takisto farmaceutická kompozícia obsahujúca lineárnu alebo plazmidovú dvojvláknovú DNA pripravenú opísaným spôsobom.
Vynález sa tiež týka preparátov plazmidovej DNA s obsahom chromozomálnej DNA nižším alebo rovnajúcim sa 0,5 %, výhodne rovnajúcim sa 0,2 % a ešte výhodnejšie rovnajúcim sa 0,1 %.
Uvedené kompozície môžu obsahovať samotnú plazmidovú DNA alebo DNA združenú s transportnými vektormi, akými sú lipozómy, nanočastice, katiónové lipidy, polyméry, proteíny, rekombinantné vírusy atď.
V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou príkladov jeho konkrétneho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciou patentových nárokov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Všeobecné techniky klonovania a molekulárnej biológie
Všeobecné metódy molekulárnej biológie, akými sú digescia reštrikčnými enzýmami, elektroforéza na géli, transformácia pri Escherichia coli, precipitácia nukleových kyselín atď., sú opísané v literatúre (Maniatis a kol., T.E.F.Fritsch a J.Sambrook, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2.vyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F.M., R.Brent, R.E.Kinston, D.D.Moore, J.A.Smith, J.G.Seidman a K.Struhl, 1987, Current protocols in molecular biology 1987-1988, John Willey and Sons, New York). Nukleotidové sekvencie boli stanovené metódou terminácie reťazcov podľa už uvedeného protokolu (Ausubel a kol., 1987).
Reštrikčné enzýmy boli poskytnuté firmou New-England, Beverly, MA (Biolabs).
Na ligáciu sa fragmenty DNA inkubujú v Tris-HCl-pufri s pH 7,4, 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, v prítomnosti DNA ligázy fága T4 (Biolabs).
Oligonukleotidy sa syntetizujú s použitím chémie fosforamidinov chránených v beta kyanoetylovou skupinou (Sinha, N.D.J.Biemat, J.McManus a H.Kôster, 1984, Polymér support oligonucleotide synthesis, XVII: Use of betacyano-ethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynu-cleosides for the synthesis of DNA fŕagments sipliíying de-protection and isolation of the final product, Nucl.Acids Res., 12, 4539-4557; Giles, J.W., 1985, Advances in automated DNA synthesis, Am. Biotechnol., Nov./Dec.) s využitím automatického syntetizéra DNA Biosearch 8600 a podľa odporučenia výrobcu.
Ligované DNA alebo DNA na testovanie ich transformačnej účinnosti sa použijú na transformovanie kompetentného kmeňa: E.coli DH5alfa/F / endAl, hsdR17, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, delta(lacZYA-argF)U169, deoR, fí80dlac(lacZdeltaM15)/.
Minipreparáty plazmidovej DNA sa získajú podľa protokolu Klein-a a kol., 1980.
Na nárast kmeňa Escherichia coli sa použije kultivačné médium LB (Maniatis a kol., 1982). Kmene sa inkubujú pri teplote 37 °C. Baktérie sa nanesú na misky s kultivačným médiom obohateným príslušnými antibiotikami.
Príklad 1
1.1. Príprava kolóny
Materiál:
Použitou kolónou je kolóna HiTrap, aktivovaná 1 ml NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia) a pripojená k peristaltickému čerpadlu (prietok menší ako 1 ml/min.). Použitý špecifický oligonukleotid má skupinu NH2 v polohe 5’. Má nasledujúcu sekvenciu:
5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’ (SEQ ID n° 1)
V tomto príklade sú použité nasledujúce pufre: kopulačný pufer: NaHCO3 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3, pufer A: etanolamín 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3, pufer B: acetát 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4.
Metóda:
Kolóna sa premyje 6 ml 1 mM HC1, a potom sa do kolóny zavedie oligonukleotid zriedený kopulačným pufŕom (50 mmólov v 1 ml), kde sa ponechá počas 30 minút pri laboratórnej teplote. Kolóna sa potom 3-krát po sebe premyje 6 ml pufŕa A a potom 6 ml pufŕa B. Oligonukleotid je takto kovalentne viazaný k náplni kolóny väzbou CONH. Kolóna sa potom uloží pri teplote 4 °C do PBS 0,1 % NaN3 a môže byť použitá aspoň štyrikrát.
1.2. Konštrukcia plazmidov
Boli syntetizované nasledujúce dva oligonukleotidy:
oligonukleotid 4817: 5’-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3’ (SEQ ID n° 9), oligonukleotid 4818: 5’-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3’ (SEQ ID n° 10).
Tieto oligonukleotidy po hybridizácii a klonovaní na plazmid prinášajú na zodpovedajúci plazmid homopurmovú-homopyrimidínovú sekvenciu (GAA)17, ktorá bola opísaná.
Sekvencie zodpovedajúce týmto dvom hybridizovaným oligonukleotidom boli klonované v polylinkeri klonovania plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning Systém, La Jolla CA), nesúcim gén rezistencie na ampicilín. S týmto cieľom sa oligonukleotidy hybridizujú nasledujúcim spôsobom. Jeden mikrogram týchto dvoch oligonukleotidov sa zmieša v 40 ml finálneho pufŕa 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2. Získaná zmes sa zahrieva na teplotu 95 °C, a potom sa teplota zníži na laboratórnu teplotu, pričom sa dodržuje postupné znižovanie teploty. 10 nanogramov zmesi hybridizovaných oligonukleotidov sa liguje 20 ng plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning Systém, La Jolla CA) naštiepeného BamHI a EcoRI v 20 μΐ finálneho pufŕa. Po ligácii bol alikvót transformovaný v DH5alfa. Transformačné zmesi boli vysiate na médium L obohatené ampicilínom (50 mg/1) a X-gal (20 mg/1). Rekombinantné klony musia vykazovať absenciu modrého zafarbenia na uvedenom médiu na rozdiel od materského plazmidu (pBKS+), ktorý umožňuje alfakomplementáciu fragmentu omega beta-ga-laktozidázy z E.coli. Po minipreparácii 6 klonov plazmidovej DNA všetky klony vykazovali vymiznutie miesta PstI, situovaného medzi miestami EcoRI a BamHI plazmidu pBKS+, a zvýšenie molekulovej hmotnosti pásu PvuII so 448 pb zahrnujúceho klonovacie multimiesto. Kloň bol zadržaný a zodpovedajúci plazmid bol označený ako pXL2563. Klonovaná sekvencia bola overená (verifikovaná) s použitím priméru -20 (5’-TGACCGGCAGCAAAATG-3’ (SEQ ID n° 11)) (Viera J. a J.Messing, 1982, The pUC plasmids, an M13mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with syntetic universal primers, Gene, 19, 259-268) plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning Systém, La Jolla CA). Plazmid pXL2563 bol purifikovaný s použitím súpravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison,
WI) a podľa odporučenia dodávateľa. Tento preparát plazmidovej DNA bol potom použitý v ďalej opísaných príkladoch.
1.3. Purifikácia plazmidu
Materiál:
Plazmid pXL2563 (opísaný v odseku 1.2.) bol purifikovaný na kolóne HiTrap, ktorej náplň je kopulovaná s oligonukleotidom opísaným v 1.1 z roztoku takisto obsahujúceho pBKS+. Počas tejto purifikácie boli použité nasledujúce pufre:
pufer F: NaCl 2 M, acetát 0,2 M, pH 4,5 až 5, pufer E: Tris 1 M, HCI pH 9, EDTA 0,5 mM.
Metóda:
Kolóna bola premytá 6 ml pufra F, potom sa do kolóny zavedú plazmidy (20 pg pXL2563 a 20 pg pBKS+ v 400 pl pufra F), kde sa inkubujú dve hodiny pri laboratórnej teplote. Kolóna sa premyje 10 ml pufra F, potom sa uskutoční elúcia pufrom E. Plazmidy sa detegujú po elektroforéze na agarózovom géli a zafarbení etídiumbromidom. Množstvo plazmidov v roztokoch sa stanoví na základe ich transformačnej aktivity na E. coli.
Výsledok:
Ak sa vychádzalo zo zmesi obsahujúcej 30 % pXL2563 a 70 % pBKS+, potom sa na výstupe z kolóny získa 100 % roztok pXL2563. Čistota vyjadrená vzťahom optickej hustoty pri 260 a 280 nm prechádza z 1,9 na 2,5, čo znamená, že sa uvedenou metódou eliminujú kontaminujúce proteíny.
Príklad 2
2.1 V tomto príklade sa opisuje purifikačný experiment, pri ktorom sa purifikuje plazmidová DNA. Kopulácia oligonukleotidu (5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’ (SEQ ID n° 1)) s náplňou kolóny bola uskutočnená spôsobom opísaným v príklade 1. Na túto kopuláciu je oligonukleotid modifikovaný na konci 5 ’ amínovou skupinou viazanou k dištančnej sekvencii báz ramenom obsahujúcim 6 uhlíkových atómov (modifikovaný oligonukleotid Eurogentec SA Belgique). Plazmid pXL2563 bol purifikovaný pomocou kitu Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) podľa odporučenia dodávateľa. V tomto príklade boli použité nasledujúce pufre:
pufer F: NaCl 0,2 M, acetát 0,2 M, pH 4,5 až 5, pufer E: Tris 1 M, HCI pH 9, EDTA 0,5 mM.
Kolóna sa premyje 6 ml pufra F a potom sa do kolóny zavedie 100 pg plazmidu pXL2563 zriedeného 400 μΐ pufra F, kde sa uskutočni inkubácia počas dvoch hodín pri laboratórnej teplote. Kolóna sa premyje 10 ml pufra F, potom sa uskutoční elúcia pufrom E. Plazmid sa potom kvantifikuje stanovením optickej hustoty pri 260 nm. V tomto príklade sa uskutoční fixácia v pufri, ktorého molarita NaCl sa mení od 0 do 2 M (pufer F). Výťažok purifikácie klesá s klesajúcou molaritou NaCl. pH fixačného pufra sa môže pohybovať od 4,5 do 5, pričom najlepší výťažok purifikácie sa dosiahne pri pH 4,5. Takisto je možné použiť iný elučný pufer s bázickým pH: takto sa elúcia uskutočňuje s použitím borátového pufra 50 mM, pH 9, EDTA 0,5 mM.
2.2 V nasledujúcom stupni sa pristúpi ku kopulácii oligonukleotidu: (5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’ (SEQ ID n° 1)) ku kolóne spôsobom, ktorý bol opísaný v príklade 1. Plazmid pXL2563 bol purifikovaný s použitím súpravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) pri rešpektovaní pokynov dodávateľa. V tomto príklade boli použité nasledujúce pufre:
pufer F: NaCl 0,1 M, acetát 0,2 M, pH 5, pufer E: Tris 1 M, HCI pH 9, EDTA 0,5 mM.
Kolóna sa premyje 6 ml pufra F a potom sa na kolónu zavedie 100 pg plazmidu pXL2563 zriedeného 400 pl pufra F, kde sa uskutoční inkubácia počas jednej hodiny pri laboratórnej teplote. Kolóna sa premyje 10 ml pufra F, potom sa uskutoční elúcia pufrom E. Stanoví sa obsah genómovej alebo chromozomálnej DNA z E. coli prítomnej vo vzorkách plazmidu pred zavedením a po zavedení oligonukleotidu na kolónu. Táto genómová DNA sa kvantifikuje prostredníctvom PCR s použitím primérov v géne galK E. coli. Postupuje sa podľa nasledujúceho protokolu:
Sekvencia a uvedené priméry sú opísané Debouck-om a kol. (Nucleic Acids Res., 1985, 13, 1841-1855): 5’-CCGATTTCTGGGGACCAAAGCAGTTTC-3’ (SEQ ID n° 24) a 5’-CCAAGGTTCACTGTTCACGACGGGTGT-3’ (SEQ ID n° 25).
Reakčné prostredie obsahuje v 25 pl pufra PCR (Promega France, Charbonniéres): 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 pM v priméri; 20 U/ml Taq polymeráza (Promega). Reakcia sa uskutoční v nesledujúcej časovej a teplotnej sekvencii:
- 5 min. pri 95 °C,
- 30 cyklov po 10 s pri teplote 95 °C,
- 30 s pri teplote 60 °C,
-1 minúta pri teplote 78 °C,
-10 minút pri teplote 78 °C.
Fragment amplifikovanej DNA s dĺžkou 124 párov báz sa separuje elektroforézou na 3 % agarózovom géli v prítomnosti SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA) a potom kvantifikuje porovnaním so stupnicou genómovej DNA Ultrapur E. coli, kmeň B (Sigma, ref. D4889). Obsah chromozomálnej DNA predstavuje vo vzorke privedenej na kolónu 1 %, kým vo vzorke purifikovanej na oligonukleotidovej kolóne je tento obsah 0,2 %.
Príklad 3
Aplikácia na číry lyzát
V tomto príklade sa opisuje purifikácia plazmidovej DNA z číreho lyzátu bakteriálnej kultúry v meradle zvanom „miniprep“: 1,5 ml nočnej kultúry kmeňa DH5alfa obsahujúceho plazmid pXL2563 sa odstredí a centrifugačný sediment pevného odstredeného podielu sa resuspenduje v 100 μΐ glukózy 50 mM, Tris 25 mM HC1 pH 8, EDTA 10 mM. Pridá sa 200 μΐ NaOH 0,2 M, SDS 1 % a obsah Eppendorfových skúmaviek sa rozmieša otáčaním, potom sa pridá 150 μΐ 3 M octanu draselného, pH 8 a obsah skúmaviek sa opäť premieša otáčaním. Po odstredení sa oddelí supematant, ktorý sa prenesie na oligonukleotidový stĺpec získaný spôsobom opísaným v príklade 1. Fixácia, premytie a elúcia sú rovnaké ako v príklade 1. Z 1,5 ml kultúry sa izoluje asi 1 pg plazmidu. Získaný plazmid sa po analýze elektroforézou na agarózovom géli a zafarbení etídiumbromidom prezentuje vo forme jediného pásu kruhovej „dobre zvinutej“ DNA. V plazmide purifikovanom uvedenou metódou nebola detegovaná žiadna stopa ako vysokomolekulárna (chromozomálna) DNA, tak ani stopa RNA. Pomer optických hustôt pri 260 a 280 nm bol vyšší než 2.
Príklad 4
4.1: Tento príklad opisuje purifikáciu plazmidovej DNA, uskutočnený za rovnakých podmienok ako v príklade 3, z 20 ml bakteriálnej kultúry kmeňa DH5alfa obsahujúceho plazmid pXL2563. Centrifugačný sediment sa premyje 1,5 ml glukózy 50 mM, Tris 25 mM HC1, pH 8, EDTA 10 mM. Lýza sa uskutoční 2 ml NaOH 0,2 M, SDS 1 %, zatiaľ čo neutralizácia sa uskutoční 1,5 ml 3 M octanu draselného, pH 5. DNA sa potom vyzráža 3 ml 2-propanolu a oddelený pevný podiel sa vymyje 0,5 ml 0,2 M octanu sodného, pH 5, NaCl 0,1 M a zmes sa nanesie na oligonukleotidovú kolónu získanú spôsobom opísaným v príklade 1. Fixácia, premytie kolóny a elúcia sa uskutočnia takisto ako v príklade 1 s výnimkou spočívajúcou v tom, že premývací pufer má molaritu NaCl rovnajúcu sa 0,1 M. Získa sa asi 16 pg plazmidovej DNA. Získaný plazmid sa po analýze elektroforézou na agarózovom géli a zafarbení etídiumbromidom prezentuje vo forme jediného pásu kruhovej „dobre zvinutej“ DNA. V purifikovanom plazmide nebola žiadna stopa vysokomolekulárnej (chromozomálnej) DNA ani stopa RNA. Digescia plazmidu reštrikčným enzýmom poskytuje jediný pás s očakávanou molekulovou hmotnosťou 3 kilobázy. Koncentrácia proteínov vo vzorkách sa zmenila z 125 pg/ml v čírom lyzáte na menej ako 1 pg/ml v purifikovanom plazmide (stanovenie Micro-BCA, Pierce). Koncentrácia endotoxínov, určená stanovením LAL (Biosepra), je viac než desaťkrát nižšia v purifikovanom plazmide oproti východiskovému číremu lyzátu.
4.2: Použitý plazmid obsahuje kazetu zahrnujúcu promótor Cytomegalovírusu, ktorým je gén kódujúci luciferázu, a homopurínovú-homopyrimidínovú sekvenciu (GAA)17 pochádzajúcu z plazmidu pXL2563. Kmeň DH1 (Maniatis a kol., 1989), ktorý obsahuje tento plazmid, sa kultivuje v 7 litrovom fermentore. Číry lyzát sa pripraví z 200 gramov buniek; bunkový sediment sa rozpustí v 2 litroch Tris 25 mM, pH 6,8, glukózy 50 mM, EDTA 10 mM, ku ktorým sa pridajú 2 litre NaOH 0,2 M, SDS 1 %. Lyzát sa neutralizuje pridaním jedného litra 3 M octanu draselného. Po diafiltrácii sa 4 ml tohto lyzátu nanesú na kolónu HiTrap-NHS s obsahom 5 ml, ktorej obsah je kopulovaný s oligonukleotidom majúcim sekvenciu 5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’ (SEQ ID n° 1) metódou opísanou v príklade 1.1. Premytie a elúcia sa uskutočnia takisto v príklade 1. Izoluje sa asi 400 mikrogramov plazmidu. Obsah genómovej DNA v tejto vzorke, stanovený technikou opísanou v príklade 2.2, je 0,1 %.
Príklad 5
Použitie modifikovaného oligonukleotidu
V tomto príklade sa opisuje použitie oligonukleotidu nesúceho metylované cytozíny.
Použitý nukleotid má nasledujúcu sekvenciu: 5’-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT-3’ (SEQ ID n° 12).
SK 286956 Β6
Tento oligonukleotid obsahuje skupinu NH2 v polohe 5’. M'C=5-metylcytozín. Tento oligonukleotid umožňuje purifíkovať plazmid pXL2563 za podmienok opísaných v príklade 1 a fixačného pufŕa s pH 5 (takto sa zníži riziko degradácie plazmidu).
Príklad 6
V predchádzajúcich príkladoch je použitý oligonukleotid modifikovaný na konci 5’ amínovou skupinou viazanou k fosfátu ramenom obsahujúcim 6 uhlíkových atómov: NH2-(CH2)6. V tomto príklade je aminová skupina viazaná k fosfátu na konci 5’ ramenom obsahujúcim 12 uhlíkových atómov: NH2-(CH2)i2. Kopulácia oligonukleotidu a nanesenie na kolónu sa uskutočnia takisto ako v príklade 2 s použitím pufra F: NaCl 2 M, acetát 0,2 M, pH 4,5. Tento oligonukleotid umožňuje dosiahnutie lepších purifikačných výťažkov: dosiahne sa výťažok 53 %, zatiaľ čo pri použití oligonukleotidu s 6 uhlíkovými atómami sa za v podstate rovnakých podmienok dosiahne výťažok asi 45 %.
Príklad 7
S použitím klonovacej stratégie opísanej v príklade 1.2 sa konštruujú dva ďalšie plazmidy nesúce homopurínové-homopyrimidínové sekvencie: plazmid pXL2725, ktorý obsahuje sekvenciu (GGA)i5, a plazmid pXL2726, ktorý obsahuje sekvenciu (GA)25.
Príklad 7.1
Konštrukcia plazmidov
Plazmidy pXL2725 a pXL2726, ktoré sú analogické s plazmidom pXL2563, boli konštruované s použitím stratégie klonovania opísanej v príklade 1.2 s použitím nasledujúcich dvojíc oligonukleotidov: 5986: 5’-GATCC(GA)2SGGG-3’ (SEQ ID n° 13) 5987: 5’-AATTCCC(TC)25G-3’ (SEQ ID n° 14) 5981: 5’-GATCC(GGA)i7GG-3’ (SEQ ID n“ 15) 5982: 5’-AATT(CCT)i7CCG-3’ (SEQ ID n° 16).
Dvojica oligonukleotidov 5986 a 5987 bola použitá na konštrukciu plazmidov pXL2726 klonovaním oligonukleotidov v miestach BamHI a EcoRI plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning Systém, La Jolla CA), zatiaľ čo oligonukleotidy 5981 a 5982 boli použité na konštrukciu plazmidu pXL2725. Použili sa rovnaké experimentálne podmienky ako pri konštrukcii plazmidu pXL2563, pričom boli vymenené iba dvojice oligonukleotidov. Rovnakým spôsobom boli klonované sekvencie verifikované sekvenovaním na plazmidy. Toto sekvenovanie umožnilo preukázať, že plazmid pXL2725 obsahuje modifikáciu vzhľadom na požadovanú sekvenciu spočívajúcu v tom, že namiesto sekvencie GGA opakovanej sedemnásťkrát je tu GGAGA(GGA)i5 (SEQ ID n° 17).
Príklad 7.2
Príprava kolón a purifikácia
Oligonukleotidy tvoriace trojité závitnice s homopurínovými sekvenciami boli kopulované s náplňou kolón HiTrap metódou opísanou v príklade 1.1. Ide o oligonukleotid majúci sekvenciu: 5’-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3’ (SEQID n° 18) na purifikáciu plazmidu pXL2725 a o oligonukleotid majúci sekvenciu 5’-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3’ (SEQ ID n° 19) na purifikáciu plazmidu pXL2726.
Obe takto získané kolóny umožnili purifíkovať zodpovedajúce plazmidy technikou opísanou v príklade 2 s použitím nasledujúcich pufrov: pufer F: NaCl 2 M, acetát 0,2 M, pH 4,5, pufer E: Tris 1 M, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.
Získané výsledky tvoria 23 % a 31 % pre pXL2725, resp. PXL2726.
Príklad 8
Tento príklad ilustruje vplyv dĺžky špecifickej sekvencie prítomnej na plazmide na výťažok purifikácie.
Príklad 8.1: Konštrukcia plazmidu
Reportérovým génom použitým pri tejto štúdii na preukázanie účinnosti kompozícií podľa vynálezu je gén kódujúci luciferázu (Luc).
Plazmid pXL2621 obsahuje kazetu zahrnujúcu promótor Cytomegalovírusu (CMV) s 661 bp extrahovanú z pcDNA3 (Invitrogen, Corp., San Diego, CA) sekciou s použitím reštrikčných enzýmov Mlul a HindlII a klonovanou pred génom kódujúcim luciferázu v miestach Mlul a HindlII do vektora pGh basic Vector (Promega Corp., Madison, WI). Tento plazmid bol konštruovaný s použitím štandartných techník molekulárnej biológie.
Plazmidy pXL2727-l a pXL2727-2 boli konštruované nasledujúcim spôsobom.
Dva mflaogramy plazmidu pXL2621 boli linearizované s použitím BamHI. Enzým bol inaktivovaný tepelným spracovaním pri teplote 65 °C trvajúcim 10 minút. Paralelne boli oligonukleotidy 6006 a 6008 hybridizované spôsobom opísaným na konštrukciu plazmidu pXL2563.
6006 5’-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3’ (SEQ ID n°20) 6008 5’-GATCAGATCTGCAG(TTC)i7A-3’ (SEQ ID n° 21).
Táto hybridizačná zmes bola klonovaná na koncoch BamHI plazmidov pXL2621 a po transformácii v DH5alfa boli rekombinantné klony detegované analýzou na báze enzymatickej reštrikcie s použitím PstI, pretože oligonukleotidy zavádzajú miesto PstI. Dva klony boli zadržané a nukleotidová sekvencia klonovaného fragmentu bola verifikovaná s použitím priméru (6282, 5’-ACAGTCATAA-GTGCGGCGACG-3’ (SEQ ID n° 22) ako reakčného sekvenčného priméru (Viera J. a J. Messing, 1982, Tlie pUC plasmids an M13mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers, Gene 19:259-268).
Prvý kloň (pXL2727-l) obsahuje sekvenciu GAA opakovanú desaťkrát. Druhý kloň (pXL2727-2) obsahuje sekvenciu 5’-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3’ (SEQ ID n° 23).
Príklad 8.2: Príprava kolón a purifikácia
Použije sa kolóna, ktorá bola opísaná v príklade 1 a ktorej obsah je kopulovaný s oligonukleotidom: 5’-GAGGCTTCTTCTTC-TTCTTCTTCTT-3’ (SEQ ID n° 1).
Plazmid pXL2727-l nesie 14 repetícií sekvencie GAA. Opísaný oligonukleotid, ktorý obsahuje len 7 repetícií zodpovedajúcich hybridizačnej sekvencií CTT, môže sa teda hybridizovať s plazmidom v 8 rôznych polohách. Naopak plazmid pXL2727-2 obsahuje hybridizačnú sekvenciu (GAA)7 majúcu rovnakú dĺžku ako oligonukleotid fixovaný na obsah kolóny. Tento oligonukleotid sa teda môže hybridizovať iba v jedinej polohe na pXL2727-2.
Použitá metodika je rovnaká ako metodika opísaná v príklade 2, pričom sa použijú nasledujúce pufre: pufer F: NaCl 2 M, acetát 0,2 M, pH 4,5, pufer E: Tris 1 M, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM. Výťažok purifikácie je 29 % pri plazmide pXL2727-l a 19 % pri plazmide pXL2727-2.
Príklad 8.3: Transfekcia in vitro cicavčích buniek
Použitými bunkami sú bunky NIH 3T3 naočkované v predvečer pokusu na 24 jamkové kultivačné platne v množstve 50 000 buniek na jamku. Plazmid sa zriedi v NaCl 150 mM a zmieša sa s lipofekčným činidlom RPR115335. Použije sa pomer pozitívnych nábojov lipofekčného činidla k negatívnym nábojom DNA rovnajúceho sa 6. Zmes sa rozmieša, ponechá počas 10 minút pri laboratórnej teplote, zriedi kultivačným prostredím bez teľacieho fetálneho séra a potom pridá v množstve 1 pg DNA na kultivačnú jamku. Po dvoch hodinách pri teplote 37 °C sa pridá 10 obj. % fetálneho teľacieho séra a bunky sa inkubujú počas 48 hodín pri teplote 37 °C v prítomnosti 5 % oxidu uhličitého. Bunky sa potom dvakrát premyjú PBS a stanoví sa aktivita luciferázy s použitím opísaného protokolu (kit Promega, Promega Corp. Madison, WI) na luminometri Lumat LB9501 (EG a Berthold, Evry). Plazmid pXL2727-l, purifíkovaný spôsobom opísaným v príklade 8.2, poskytne dvakrát lepšie výťažky transfekcie, ako sú výťažky pri tom istom plazmide, ktorý bol purifíkovaný súpravou Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI).
Zoznam sekvencií
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 1 dĺžka: počet párov báz 25 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc Popis sekvencie SEQ ID n° 1 GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 2 dĺžka: počet párov báz 19 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc Popis sekvencie SEQ ID n° 2 CTTCCCGAAG GGAGAAGG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 3 dĺžka: počet párov báz 21 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 3 GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 4 dĺžka: počet párov báz 13 typ; nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 4 GAAAAAGGAA GAG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 5 dĺžka: počet párov báz 19 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 5 AAGGGAGGGA GGAGAGGAA
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 6 dĺžka: počet párov báz 19 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 6 AAGGAGAGGA GGGAGGGAA
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 7 dĺžka: počet párov báz 19 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 7 TTGGTGTGGT GGGTGGGTT
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 8 dĺžka: počet párov báz 17 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 8 AAAAAAGGGA ATAAGGG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 9 dĺžka: počet párov báz 58 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 9
GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 10 dĺžka: počet párov báz 58 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 10
AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 11 dĺžka: počet párov báz 17 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 11 TGACCGGCAG CAAAATG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 12 dĺžka: počet párov báz 17 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc ďalšie informácie: všetky cytozíny C sekvencie sú metylované
Popis sekvencie SEQ ID n° 12
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 13 dĺžka: počet párov báz 58 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 13
GATCCGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGGG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 14 dĺžka: počet párov báz 58 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 14
AATTCCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 15 dĺžka: počet párov báz 58 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 15
GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 16 dĺžka: počet párov báz 58 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 16
AATTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCG
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 17 dĺžka: počet párov báz 50 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 17
GGAGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 18 dĺžka: počet párov báz 25 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 18
AATGCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCT
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 19 dĺžka: počet párov báz 26 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n 19
AGTGCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCT
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 20 dĺžka: počet párov báz 66 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 20
GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAACTGC AGATCT
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 21 dĺžka: počet párov báz 66 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 21
GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCA
Informácie o sekvencií SEQ ID n°: 22 dĺžka: počet párov báz 21 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc
Popis sekvencie SEQ ID n° 22
ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G
Informácie o sekvencii SEQ ID n°: 23 dĺžka: počet párov báz 39 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc Popis sekvencie SEQ ID n° 23
GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA
Informácie o sekvencii SEQ ID n°: 24 dĺžka: počet párov báz 27 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc Popis sekvencie SEQ ID n° 24 CCGAATTCTG GGAACCAAAG CAGTTTC
Informácie o sekvencii SEQ ED n°: 25 dĺžka: počet párov báz 27 typ: nukleotid počet reťazcov: jediný konfigurácia: lineárna molekulový typ: DNAc Popis sekvencie SEQ ID n° 25 CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT.

Claims (30)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob prípravy liečiva na báze kruhovej dvojvláknovej DNA, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa aspoň jeden čistiaci stupeň, pričom sa roztok obsahujúci uvedenú DNA v zmesi s ostatnými zložkami vedie cez chromatografický nosič, na ktorom je kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný tvoriť hybridizáciou trojitú závitnicu so špecifickou homopurínovou/homopyrimidínovou sekvenciou prítomnou v uvedenej DNA.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že roztokom obsahujúcim uvedenú DNA je bunkový lyzát.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že bunkovým lyzátomje číry lyzát.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že dvojvláknová DNA je predčistená.
  5. 5. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa špecifická sekvencia zavedie do dvojvláknovej DNA umelo.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid obsahuje sekvenciu poly-CTT a špecifickou sekvenciou prítomnou v DNA je sekvencia poly-GAA.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid obsahuje sekvenciu GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT označenú ako SEQ ID n° 1.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid obsahuje sekvenciu (CTT)7 označenú ako SEQ ID n° 26.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 7 alebo 8, vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia prítomná v DNA obsahuje sekvenciu (GAA)7, (GAA)i4 alebo (GAA))7.
  10. 10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia prítomná v DNA obsahuje sekvenciu SEQ ID n“ 5 a oligonukleotid obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 6 alebo SEQ ID n° 7.
  11. 11.Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia prítomná v DNA obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 17 a oligonukleotid obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 18.
  12. 12. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia prítomná v DNA obsahuje sekvenciu (GA)2s a oligonukleotid obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 19.
  13. 13. Spôsob podľa niektorého z nárokov laž 4, vyznačujúci sa tým, že špecifickou sekvenciou je špecifická sekvencia prirodzene prítomná v dvojvláknovej DNA.
  14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že špecifickou sekvenciou prirodzene prítomnou v DNA je homopurínová-homopyrimidínová sekvencia prítomná v replikačnom začiatku plazmidu.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia DNA obsahuje celok alebo časť sekvencie SEQ ID n° 2 obsiahnutej v replikačnom začiatku ColEl z E.coli.
  16. 16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 3.
  17. 17. Spôsob podľa nároku 13, v y z n a č u j ú c i sa tým, že špecifická sekvencia DNA obsahuje celok alebo časť sekvencie SEQ ID n“ 4 alebo sekvencie SEQ ID n° 8, ktoré sú obsiahnuté v géne betalaktamázy plazmidu pBR322.
  18. 18. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid je naviazaný na chromatografický nosič disulfidickou, tioéterovou, esterovou, amidovou alebo amínovou väzbou.
  19. 19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid je viazaný ku chronatografickému nosiču prostredníctvom ramena tvoreného uhlíkovým reťazcom (CH2)n, v ktorom n znamená celé číslo v rozsahu od 1 do 18, pričom uvedené rameno je viazané k oligonukleotidu fosfátom a ku kolóne amidovou väzbou.
    sa tým, že rameno je tvorené lineárnym uhlí-
  20. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci kovým reťazcom obsahujúcim 6 uhlíkových atómov.
  21. 21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci kovým reťazcom obsahujúcim 12 uhlíkových atómov.
  22. 22. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid má aspoň jednu chemickú modifikáciu, ktorá ho robí rezistentným proti nukleázam alebo ho chráni proti nukleázam alebo zvyšuje jeho afinitu ku špecifickej sekvencií.
  23. 23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotid obsahuje homopyrimidínovú sekvenciu, v ktorej je aspoň jeden z cytozínov metylovaný.
  24. 24. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci obsahuje naviac jednu alebo niekoľko terapeuticky významných sekvencií.
  25. 25. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci vláknovou DNA je kruhová DNA, ako je plazmid.
  26. 26.Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že špecifická sekvencia prítomná v dvojvláknovej DNA obsahuje niekoľko polôh na hybridizáciu s oligonukleotidom.
  27. 27. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci DNA nižší alebo rovnajúci sa 0,5 %.
  28. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci
    DNA nižší alebo rovnajúci sa 0,2 %.
  29. 29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci DNA nižší alebo rovnajúci sa 0,1 %.
  30. 30. Spôsob čistenia plazmidovej DNA, vyznačujúci sa peň, v ktorom sa roztok obsahujúci uvedenú DNA v zmesi s ostatnými zložkami vedie cez chromatografický nosič, na ktorom je kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný tvoriť hybridizáciou trojitú závitnicu so špecifickou homopurínovou/homopyrimidínovou sekvenciou prítomnou v uvedenej DNA.
    s a tým, že rameno je tvorené lineárnym uhlís a tým, že DNA s a tým, že dvojtým, tým, tým, že liečivo má obsah chromozomálnej že liečivo má obsah chromozomálnej že liečivo má obsah chromozomálnej tým, že zahŕňa aspoň jeden stu-
SK756-97A 1994-12-16 1995-11-08 Spôsob čistenia DNA tvorbou trojitej závitnice s imobilizovaným oligonukleotidom SK286956B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9415162A FR2728264B1 (fr) 1994-12-16 1994-12-16 Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise
PCT/FR1995/001468 WO1996018744A2 (fr) 1994-12-16 1995-11-08 Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK75697A3 SK75697A3 (en) 1998-02-04
SK286956B6 true SK286956B6 (sk) 2009-08-06

Family

ID=9469865

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK5104-2008A SK288366B6 (sk) 1994-12-16 1995-11-08 Nosič na čistenie dvojvláknovej DNA a spôsob jeho prípravy
SK756-97A SK286956B6 (sk) 1994-12-16 1995-11-08 Spôsob čistenia DNA tvorbou trojitej závitnice s imobilizovaným oligonukleotidom

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK5104-2008A SK288366B6 (sk) 1994-12-16 1995-11-08 Nosič na čistenie dvojvláknovej DNA a spôsob jeho prípravy

Country Status (31)

Country Link
US (2) US6287762B1 (sk)
EP (2) EP0797682B1 (sk)
JP (2) JPH10510427A (sk)
KR (1) KR100431163B1 (sk)
CN (1) CN100591776C (sk)
AT (1) ATE233825T1 (sk)
AU (1) AU715630B2 (sk)
BG (1) BG64198B1 (sk)
BR (1) BR9510089A (sk)
CA (1) CA2208245C (sk)
CY (1) CY1110372T1 (sk)
CZ (1) CZ295474B6 (sk)
DE (1) DE69529842T2 (sk)
DK (1) DK0797682T3 (sk)
ES (2) ES2197928T3 (sk)
FI (1) FI120836B (sk)
FR (1) FR2728264B1 (sk)
HU (1) HU221062B1 (sk)
IL (2) IL171488A (sk)
MX (1) MX9703670A (sk)
NO (1) NO320428B1 (sk)
NZ (1) NZ297023A (sk)
PL (1) PL184430B1 (sk)
PT (1) PT797682E (sk)
RO (1) RO116970B1 (sk)
RU (1) RU2174125C2 (sk)
SK (2) SK288366B6 (sk)
TW (1) TW459043B (sk)
UA (1) UA72421C2 (sk)
WO (1) WO1996018744A2 (sk)
ZA (1) ZA9510756B (sk)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7038026B2 (en) 2000-05-26 2006-05-02 Centelion Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
DE19806962B4 (de) * 1997-02-22 2004-08-05 Universität Heidelberg Markierung von Nukleinsäuren mit speziellen Probengemischen
US20030105040A1 (en) * 2001-11-13 2003-06-05 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of inhibitor-kappa B-R expression
WO2000046366A1 (en) * 1999-02-04 2000-08-10 Invitrogen Corporation Isolation of nucleic acid molecules
US7052844B2 (en) * 1999-12-21 2006-05-30 Ingeneus, Inc. Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism
ATE382688T1 (de) * 2000-05-26 2008-01-15 Centelion Reinigung einer tripelhelixformation mittels eines immobilisierten oligonukleotides
US20060008817A1 (en) 2000-12-08 2006-01-12 Invitrogen Corporation Methods and compositions for generating recombinant nucleic acid molecules
DE10104025B4 (de) * 2001-01-31 2008-07-10 Qiagen North American Holdings, Inc. Verfahren zur Aufreinigung und anschließenden Amplifikation von Doppelstrang-DNA
FR2822476B1 (fr) 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
EP1370692A2 (fr) * 2001-03-23 2003-12-17 Gencell S.A. Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice.
KR100790764B1 (ko) 2002-11-12 2008-01-03 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코포레이션 조혈세포 집단에서 정지세포를 증대시키는 방법
WO2005100542A1 (en) * 2004-04-19 2005-10-27 Centelion Method for purifying plasmid dna
NZ545449A (en) * 2003-09-17 2009-07-31 Centelion Formerly Gencell Sas Device and Method of preparation of pharmaceutical grade plasmid DNA
AU2005214329A1 (en) 2004-02-12 2005-09-01 Population Genetics Technologies Ltd Genetic analysis by sequence-specific sorting
EP1737945B1 (en) 2004-04-19 2011-01-26 Aventis Pharma S.A. Method for purifying plasmid dna
NZ553658A (en) 2004-08-16 2009-11-27 Nature Technology Corp Improved strains of E. coli for plasmid DNA production
US7407757B2 (en) * 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
CN105316314B (zh) * 2014-07-29 2018-07-27 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种高纯度的微环dna及其制备方法和应用
EP4056716A1 (en) * 2017-03-24 2022-09-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US5166315A (en) * 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4766072A (en) 1985-07-17 1988-08-23 Promega Corporation Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence
US5665541A (en) 1986-10-28 1997-09-09 The Johns Hopkins University Formation of triple helix complexes for the detection of double stranded DNA sequences using oligomers which comprise an 8-modified purine base
EP0333813A1 (fr) 1987-09-17 1989-09-27 Appligene Procede de fixation et de separation de molecules comportant au moins un fragment d'adn naturel ou synthetique
US5352578A (en) 1989-02-15 1994-10-04 Worcester Foundation For Experimental Biology Method of separating oligonucleotides from a mixture
EP0463036B1 (en) 1989-03-10 1995-02-22 Amoco Corporation Immobilized oligonucleotide probes and uses therefor
CA2015515C (en) * 1990-01-03 1999-12-07 Jean-Marie Saint-Remy Pharmaceutical compositions containing antigen-antibody complexes and uses therefor
WO1992009705A1 (en) * 1990-11-23 1992-06-11 Gilead Sciences, Inc. Triplex-forming oligomers containing modified bases
EP0566670A4 (en) * 1990-12-17 1993-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
WO1992013963A1 (en) 1991-01-30 1992-08-20 Hyman Edward D Method for preparation of closed circular dna
EP0533952A4 (en) 1991-04-15 1993-07-07 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Process for separating or extracting nucleic acid from specimen containing the same
NZ246203A (en) 1991-12-24 1996-09-25 Tepnel Medical Ltd Copying of a nucleic acid sequence using a solid support system, apparatus therefor
WO1994000600A1 (en) 1992-06-25 1994-01-06 Microprobe Corporation Solid supports for nucleic acid hybridization assays
US5401632A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Triple helix purification and sequencing
WO1994017086A1 (en) * 1993-01-25 1994-08-04 Apollon, Inc. Gene regulation by targeting putative intramolecular triple helix

Also Published As

Publication number Publication date
FI972526A0 (fi) 1997-06-13
HUT77104A (hu) 1998-03-02
EP1281774A3 (fr) 2004-02-04
AU715630B2 (en) 2000-02-03
CA2208245C (fr) 2011-04-19
KR100431163B1 (ko) 2004-07-22
FI120836B (fi) 2010-03-31
PT797682E (pt) 2003-07-31
PL320697A1 (en) 1997-10-27
TW459043B (en) 2001-10-11
EP0797682B1 (fr) 2003-03-05
SK51042008A3 (en) 1998-02-04
NO320428B1 (no) 2005-12-05
EP0797682A2 (fr) 1997-10-01
WO1996018744A3 (fr) 1996-08-29
NO972710D0 (no) 1997-06-12
JP2009045070A (ja) 2009-03-05
SK75697A3 (en) 1998-02-04
BR9510089A (pt) 1998-07-14
US6319672B1 (en) 2001-11-20
FR2728264B1 (fr) 1997-01-31
DE69529842D1 (de) 2003-04-10
AU4178996A (en) 1996-07-03
WO1996018744A2 (fr) 1996-06-20
MX9703670A (es) 1997-08-30
DK0797682T3 (da) 2003-06-23
CA2208245A1 (fr) 1996-06-20
NO972710L (no) 1997-06-12
NZ297023A (en) 2000-01-28
CN100591776C (zh) 2010-02-24
ES2446983T3 (es) 2014-03-11
SK288366B6 (sk) 2016-07-01
EP1281774A2 (fr) 2003-02-05
IL116398A0 (en) 1996-03-31
RU2174125C2 (ru) 2001-09-27
DE69529842T2 (de) 2003-08-28
FR2728264A1 (fr) 1996-06-21
UA72421C2 (en) 2005-03-15
BG101620A (en) 1998-03-31
ZA9510756B (en) 1996-05-30
HU221062B1 (hu) 2002-07-29
IL116398A (en) 2006-10-31
JPH10510427A (ja) 1998-10-13
ATE233825T1 (de) 2003-03-15
EP1281774B1 (fr) 2013-12-25
PL184430B1 (pl) 2002-10-31
ES2197928T3 (es) 2004-01-16
RO116970B1 (ro) 2001-08-30
FI972526A (fi) 1997-06-13
IL171488A (en) 2012-01-31
CN1170438A (zh) 1998-01-14
US6287762B1 (en) 2001-09-11
CZ185897A3 (en) 1997-09-17
BG64198B1 (bg) 2004-04-30
CZ295474B6 (cs) 2005-08-17
CY1110372T1 (el) 2013-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK286956B6 (sk) Spôsob čistenia DNA tvorbou trojitej závitnice s imobilizovaným oligonukleotidom
US8399636B2 (en) Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide
AU2007202804A1 (en) Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide
AU2001263459A1 (en) Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
IL152860A (en) Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change of owner's name

Owner name: CENTELION, VITRY SUR SEINE, FR

Effective date: 20110120

TB4A Correction of name

Owner name: CENTELION (SAS), VITRY SUR SEINE, FR

MK4A Expiry of patent

Expiry date: 20151108