NO320428B1

NO320428B1 - Rensing av en trippelheliksformasjon med et immobilisert oligonukleotid

Info

Publication number: NO320428B1
Application number: NO19972710A
Authority: NO
Inventors: Daniel Scherman; Joel Crouzet; Pierre Wils
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1997-06-12
Publication date: 2005-12-05
Also published as: NO972710D0; CN100591776C; PT797682E; CY1110372T1; AU4178996A; JP2009045070A; NO972710L; SK51042008A3; EP1281774B1; EP1281774A2; SK75697A3; ZA9510756B; CA2208245C; MX9703670A; DE69529842T2; WO1996018744A2; PL320697A1; SK286956B6; UA72421C2; EP0797682B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ny fremgangsmåte for fremstilling av et medikament på basis av en sirkulær dobbelttrådet-DNA og en fremgangsmåte for rensing av plasmid- DNA. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater hurtig rensing dobbeltstrenget DNA som kan benyttes farmakologisk. Mere spesielt tar fremgangsmåten for rensing ifølge oppfinnelsen i bruk en spesifikk hybridering mellom en DNA-sekvens og et oligonukleotid.

Gen- og cellulærterapiteknikker undergår i dag en ekstraordinær utvikling. I tillegg implikerer disse teknikker muligheten for å fremstille vesentlige mengder DNA med farmasøytisk renhet. Således utgjøres, i disse nye terapier, medikamentet hyppig av DNA per se og det er vesentlig, i de ønskede mengder, å kunne fremstille, isolere og å rense på hensiktsmessig måte forbindelsene for å kunne gjøre dem egnet for en terapeutisk anvendelse på mennesker.

Foreliggende oppfinnelse beskriver en ny, enkel og særlig effektiv måte for rensing av DNA. Den tillater særlig å oppnå spesielt høye renheter i høye utbytter.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hviler i det vesentlige på en spesifikk interaksjon mellom en sekvens innskutt på det DNA som skal renses og et oligonukleotid bestående av naturlige eller modifiserte baser.

Det er i den senere tid vist at visse oligonukleotider er i stand til spesifikt å interagere i den store spalt av dobbeltskrue-DNA og lokalt å danne trippelskruer, noe som fører til en inhibering av transkripsjonen av målgenene (Héléne et Toulmé, "Biochim. Biophys. Acta", 1049 (1990) 99). Disse oligonukleotider erkjenner selektivt dobbeltskrue-DNAet på nivå med oligopurin-oligopyrimidin-sekvensene, det vil si på nivå med områdene som har en oligopurinsekvens på en gren og en oligopyrimidinsekvens på den komplementære gren, for der lokalt å danne en trippelheliks. Basene i den tredje gren (oligonukleotidet) danner hydrogenbindinger (Hoogsteen-binding eller invers-Hoogsteen) med purinene i Watson-Crick-baseparene.

En anvendelse av denne type interaksjon for å isolere et plasmid er beskrevet i den kjente teknikk. Således beskriver Ito et al. ("PNAS", 89 (1992) 495) anvendelsen av biotinylert oligonukleotider som er i stand til å erkjenne en bestemt sekvens av et plasmid og med denne å danne en trippelheliks. De således dannede komplekser bringes derefter i kontakt med magnetiske kuler dekket med streptavidin. Interaksjonen mellom biotin og streptavidin tillater så å isolere plasmidet ved magnetisk separering av kulene og efter- følgende eluering. Imidlertid har denne fremgangsmåte visse mangler. Særlig er det nødvendig med to spesifikke, suksessive interaksjoner, den første mellom oligonukleotid og plasmid og den andre mellom det biotinylerte kompleks og streptavidinkulene. Videre kan sluttoppløsningen være forurenset med biotinylert oligonukleotid som ikke kan benyttes i et farmasøytisk preparat.

Videre beskriver WO 92/17484 enkelttrådige sirkulære oligonukleotider som kan bru-kes til å isolere en kompletær nukleinsyre.

Foreliggende oppfinnelse beskriver en ny og forbedret fremgangsmåte for rensing av DNA og som gjør bruk av denne type interaksjon. Mere spesielt anvender fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oligonukleotider som på kovalent måte er koblet til en bærer. Denne fremgangsmåte er spesielt hurtig og fører til spesielt høye utbytter og renhets-grader. Videre tillater den å rense DNA fra komplekse blandinger særlig inneholdende andre nukleinsyrer, proteiner, endotoksiner (som lipopolysakkarider), nukleaser, og så videre. Bærerne som benyttes kan videre lett resirkuleres og det oppnådde DNA har forbedrede farmasøytiske sikkerhetsegenskaper. Til slutt unplikerer fremgangsmåten i motsetning til den kjente teknikk, kun et enkelt trinn.

En første gjenstand for oppfinnelsen ligger således i en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament på basis av en sirkulær dobbelttråd-DNA, kjennetegnet ved at den omfatter minst et rensetrinn der man fører en oppløsning inneholdende nevnte DNA i blanding med andre forbindelser over en kromatografibærer på hvilken det på kovalent måte er bundet et oligonukleotid i stand til ved hybridering å danne en trippelheliks med en spesifikk homopurin/homopyridinsekvens til stede på nevnte DNA.

En annen gjenstand for oppfinnelsen er en fremgangsmåte for rensing av plasmid DNA, kjennetegnet ved at den omfatter minst ett trinn der en oppløsning inneholdende nevnte DNA blandet med andre komponenter føres gjennom en kromatografisk bærer hvortil det kovalent er koblet et oligonukleotid i stand til å danne en trippelheliks ved hybridering med en spesifikk homopurin/homopyrimidinsekvens til stede i nevnte DNA.

Oligonukleotidene som benyttes ifølge oppfinnelsen er oligonukleotider som direkte hybriderer med DNA i dobbeltstreng. Disse oligonukleotider kan inneholde følgende baser: thymidin (T), som er i stand til å danne tripletter med dublettene A.T av dobbeltstreng-

DNA (Rajagopal et al., "Biochem", 28 (1989) 7859);

adenin (A), som er i stand til å danne tripletter med dublettene A.T av dobbeltstreng-DNA;

guanin (G), som er i stand til å danne tripletter med dublettene G.C av dobbeltstreng-DNA;

protonert cytosin (C+), som er i stand til å danne tripletter med dublettene G.C av dobbeltstreng-DNA (Rajagopal et al., supra); og

uracil (U), som er i stand til å danne tripletter med baseparene A.U eller A.T.

Fortrinnsvis omfatter det benyttede oligonukleotid en homopyrimidinsekvens som er rik på cytosiner og den spesifikke sekvens som er til stede på DNA er en homopurin-homopyrimidin-sekvens. Nærværet av cytosiner tillater å oppnå en trippelheliks som er stabil ved sure pH-verdier, der cytosinene er protonert, og destabilisert ved alkalisk pH, der cytosinene er nøytralisert.

For å tillate dannelsen av en trippelheliks ved hybridering er det viktig at oligonukleotidet og den spesifikke sekvens som er til stede på DNA, er komplementær. I denne forbindelse og for å oppnå de beste utbytter og den beste selektivitet, benytter man ifølge oppfinnelsen et oligonukleotid og en spesifikk sekvens som perfekt er komplementære. Det kan særlig dreie seg om et oligonukleotid poly-CTT og en spesifikk sekvens poly-GAA. Som eksempel kan man nevnte oligonukleotidet med sekvensen 5'-GAGGCTTCTTC,^TCTTCTTCTTCTT-3, (GAGG(CTT)7; (SEQ ID nr. 1), der basene GAGG ikke danner noen trippelheliks, men tillater å skille oligonukleotidet av kob-lingsgrenen; man kan likeledes nevne sekvensen (CTT)7(SEQ ID nr. 26). Disse oligonukleotider er i stand til å danne en trippelheliks med en spesifikk sekvens omfattende komplementære deler (GAA). Det kan særlig dreie seg om et område omfattende 7,14 eller 17 GAA-deler, som beskrevet i eksemplene.

En annen sekvens av særlig interesse er sekvensen:

Denne sekvens danner en trippelheliks med oligonukleotidene:

I dette tilfellet fikseres oligonukleotidet i en antiparallell orientering til polypuringrenen. Disse trippelhelikser er ikke stabile annet enn i nærvær av Mg<2+>(Vasquez et al., "Biochemistry", 1995,34,7243-7251; Beal ogDervan, "Science", 1991,251, 1360-1363).

Som antydet ovenfor kan den spesifikke sekvens være en sekvens som naturlig er til stede på dobbelstreng-DNA'et, eller en syntetisk sekvens som kunstig er innført i denne. Det er særlig interessant å anvende et oligonukleotid som er i stand til å danne en trippelheliks med en sekvens som naturlig er til stede på en dobbeltstreng-DNA, for eksempel replikasjonsopprinnelsen til et plasmid, eller i en genmarkør. I denne forbindelse har foreliggende søkere gjennomført analyser av sekvensen av plasmider og har kunnet vise at visse områder av deres DNA, særlig replikasjonsopprinnelsen, kan ha homopurin-homopyrimidin-områder. Syntesen av oligonukleotider som er i stand til å danne trippelhelikser med naturlige homopurin-homopyrimidin-områder tillater på fordelaktig måte å anvende fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen på ikke-modifiserte plasmider, særlig kommersielle plasmider av typen pUC, pBR322, pSV og så videre. Blant de homopurin-homopyirmidin-sekvenser som naturlig er til stede på en dobbeltstreng-DNA, kan nevnes en sekvens som omfatter hele eller en del av sekvensen 5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID nr. 2) som er til stede i replikasjonsopprinnelsen ColEl av E. coli. I dette tilfellet har oligonukleotidet som danner trippelhelikser), sekvensen: 5'-GAAæTTCTTCCCTCmCC-3' (SEQ ID nr. 3) og fikserer seg alternativt på de to grener av dobbeltheliksen som beskrevet av Beal og Dervan ("J. Am. Chem. Soc", 1992,114,4976-4982) og av Jayasena og Johnston ("Nucleic Acids Res.", 1992,20,5279-5288). Man kan videre nevne sekvensen 5'-GAAAAAGGAAGAG-3'

(SEQ ID nr. 4) av genet av B-laktamase av plasmid pBR322 (Duval-Valentin et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 1992,90,504-508). Anvendelsen av et oligonukleotid som er i stand til å danne en trippelheliks med en sekvens som er til stede i en replikasjonsopprinnelse eller en genmarkør er særlig fordelaktig fordi den tillater, med det samme oligonukleotid, å rense enhver DNA inneholdende nevnte replikasjonsopprinnelse eller nevnte genmarkør. Det er således ikke nødvendig å modifisere plasmidet eller DNA-dobbeltstrengen for i denne å innarbeide en kunstig, spesifikk sekvens.

Selv om de perfekt komplementære sekvenser er foretrukket, skal det være klart at visse mistilpasninger kan tolereres mellom sekvensen av oligonukleotidet og sekvensen som er til stede på DNA, så lenge dette ikke fører til et for høyt affinitetstap. Man kan nevne sekvensen 5VAAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID nr. 8) som er til stede i genet av B-laktamase av E. coli. I dette tilfellet kan thymin som avbryter polypurinsekvensen erkjennes av et guanin av den tredje streng og derved danne en triplett ATG som er stabil når den omgis av to tripletts TAT (Kiessling et al., "Biochemistry", 1992,31,2829-2834).

I henhold til en særlig foretrukken utførelsesform omfatter oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen sekvensen (CCT)n, sekvensen (CT)n eller sekvensen (CTT)n, der n er et helt tall fra og med 1 til og med 15. Det er særlig fordelaktig åbenytte sekvenser av typen (CT)n eller (CTT)n. Foreliggende søkere har kunnet vise at renseutbyttet påvirkes av mengden av C i oligonukleotidet. Særlig og som antydet i eksempel 7, øker renseutbyttet når oligonukleotidet omfatter mindre cytosiner. Det skal være klart at oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen likeledes kan kombinere deler (CCT), (CT) eller

(CTT).

Det benyttede oligonukleotid kan være naturlig (bestående av naturlige, ikke modifiserte baser) eller kjemisk modifisert. Særlig kan oligonukleotidet med fordel oppvise visse kjemiske modifikasjoner som tillater å øke motstandsevnen eller beskyttelsen vis å vis nukleaser, eller dets affinitet vis å vis den spesifikke sekvens.

I henhold til foreliggende oppfinnelse menes med oligonukleotid også enhver kjede av nukleosider som er undergått en skjelettmodiflkasjon med det formål å gjøre den mer motstandsdyktig mot nukleaser. Blant de mulige modifikasjoner kan nevnes fosforo-tioatnukleotider som er i stand til å danne trippelhelikser med DNA (Xodo et al., "Nucleic Acids Res.", 1994,22,3322-3330), videre oligonukleotider som har formace-tal- eller metyl fosfonatskj el etter (Matteucci et al., "J. Am. Chem. Soc", 1991, 113. 7767-7768). Man kan likeledes benytte oligonukleotider som er syntetisert med a-anomerene av nukleotidene og som likeledes danner trippelhelikser med DNA (Le Doan et al., "Nucleic Acids Res.", 1987,15,7749-7760). En annen modifikasjon av skjelettet er fosforamidatbindingen. Man kan for eksempel nevne det internukleotidiske binding N3'-P5'-fosforamidat som beskrevet av Gryaznov og Chen, og som gir oligonukleotider som sammen med DNA danner spesielt stabile trippelhelikser ("J. Am. Chem. Soc", 1994, 116.3143-3144). Blant de andre skjelettmodifikasjoner kan man også nevne anvendelsen av ribonukleotider, 2'-0-metylribose, fosfodiester,... (Sun og Héléne, "Curr. Opinion Struct. Biol.", 116.3143-3144). Det fosforerte skjelett kan videre erstattes av et polyamidskjelett som i PNA (Peptid Nucleic Acid) og som likeledes kan danne trippelhelikser (Nielsen et al., "Science", 1991,254,1497-1500; Kim et al., "J. Am. Chem. Soc", 1993, 115,6477-6481), eller med et skjelett på basis av guanidin som i DNG (deoksyribonukleinguanidin, "Proe Nati. Acad Sei. USA", 1995,92,6097-6101), poly-kationiske analoger av DNA som likeledes danner trippelhelikser.

Thymidinet i den tredje gren kan videre erstattes med et 5—bromuracil, noe som øker affiniteten til oligonukleotidet for DNA (Povsic og Dervan, "J. Am. Chem. Soc", 19889, Ul, 3059-3061). Den tredje gren kan likeledes inneholde ikke-naturlige baser, blant hvilke man kan nevne 7-deaza-2-deoksyxantosin (Milligan et al., "Nucleic Acids Res.", 1993,21,327-333), l-(2-deoksy-B-D-irbofuranosyl)-3-metyl-5-amino-lH-pyrazolo[4,3—d]pyrimidin-7-on (Koh og Dervan, "J. Am. Chem. Soc, 1992,114,1470-1478), 8-oksoadenin, 2-aminopurin, 2-O-metyl-pseudoisocytidin eller en hvilken som helst annen modifikasjon som fagmannen kjenner til (for en oversikt, se Sun et Hélén, "Curr. Opinion Struct. Biol.", 1993,3,345-356).

En annen type modifikasjon av oligonukleotidet har mer spesielt til formål å forbedre interaksjonen og/eller affiniteten mellom oligonukleotid og den spesifikke sekvens. Særlig omfatter en ifølge oppfinnelsen meget fordelaktig modifikasjon å metylere cytosinene i oligonukleotidet (jevnfør eksempel 5). Det således metylerte oligonukleotid oppviser den bemerkelsesverdige egenskap å danne en stabil trippelheliks med den spesifikke sekvens i pH-soner som er meget nær nøytralitet (> 5). Dette tillater således å arbeide ved høyere pH-verdier enn oligonukleotidene ifølge den kjente teknikk, det vil si ved pH-verdier der risikoen for nedbrytning av plasmidisk DNA er mindre.

Lengden av oligonukleotidet som benyttes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er minst 3 baser og ligger fortrinnsvis mellom 5 og 30. Man benytter på fordelaktig måte et oligonukleotid med en lengde over 10 baser. Fagmannen kan alt ettersom tilpasse lengden som en funksjon av den tilsiktede selektivitet og interaksjonsstabilitet.

Oligonukleotidene som anvendes ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres på en hvilken som helst kjent måte. Særlig kan de fremstilles ved hjelp av nukleinsyresyntetisører. En hvilken som helst av fagmannen kjent måte kan selvfølgelig benyttes.

For å tillate den kovalente kobling på en bærer, blir oligonukleotidet generelt funksjona-lisert. Således kan det modifiseres med en terminal tiol-, amin- eller karboksylgruppe i 5'- eller 3'-stilling. Særlig tillater innarbeiding av en tiol-, amin- eller karboksylgruppe for eksempel å koble oligonukleotidet på en bærer som bærer disulfid-, maleimid-, amin-, karboksyl-, ester-, epoksyd-, cyanogenbromid- eller aldehydfunksjoner. Disse koblinger dannes ved opprettelse av disulfid-, tioeter-, ester-, amid- eller aminbindinger mellom oligonukleotid og bærer. Man kan benytte en hvilken som helst annen av fagmannen kjent metode som for eksempel bifunksjonelle koblingsreaktanter.

For videre å forbedre hybrideringen med det koblede oligonukleotid, kan det være fordelaktig at oligonukleotidet inneholder en "gren" og en "avstands"-basesekvens. Anvendelsen av en gren tillater å fiksere oligonukleotidet i en valgt avstand fra bæreren, noe som tillater å forbedre interaksjonsbetingelsene med DNA. Grenen består fortrinnsvis av en rett karbonkjede med 1 til 18 og fortrinnsvis 6 eller 12 grupper (CH2) og et amin som tillater bindingen til kolonnen. Grenen er forbundet med et fosfat av oligonukleotidet eller et "avstandsstykke" bestående av baser som ikke interfererer med hybrideringen. Videre kan "avstandsstykket" omfatte purinbaser. Som eksempel kan "avstandsstykket" omfatte sekvensen GAGG. Grenen består fortrinnsvis av en rett karbonkjede med 6 eller 12 karbonatomer.

For gjennomføring av oppfinnelsen kan man benytte forskjellige typer bærere. Det kan dreie seg om funksjonaliserte kromatografibærere i masse eller på forhånd kondisjonert i kolonne, funksjonaliserte plastoverflater eller funksjonaliserte latekskuler, eventuelt av magnetisk type. Som eksempel kan kromatograflbærerne som benyttes være agarose, akrylamid eller dekstran samt derivater derav (som Séphadex, Sépharose, Superose, og så videre), polymerer som polyfstyrendivinylbenzen) eller eventuelt podet silisium. Kromatograifkolonnene kan funksjonere efter diffusjons- eller perfusjonsmåten.

For å oppnå de beste renseutbytter, er det særlig fordelaktig, på plasmidet, å benytte en sekvens omfattende flere hybrideringsposisjoner med oligonukleotidet. Nærværet av flere hybrideringsposisjoner favoriserer interaksjonene mellom sekvensen og oligonukleotidet, noe som fører til en forbedring av renseutbyttene. For et oligonukleotid som omfatter n delerepetisjoner (CCT), (CT) eller (CTT), er det videre fordelaktig å benytte en DNA-sekvens som omfatter minst n komplementære deler og aller helst n+1 komplementære deler. En sekvens med n+1 komplementære deler gir således oligonukleotidet to hybrideringsposisjoner. Fortrinnsvis omfatter DNA-sekvensen opptil 11 hybrideringsposisjoner, det vil si n+10 komplementære deler.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å rense dobbeltstreng-DNA. Det dreier seg om en sirkulær DNA som et plasmid som generelt bærer ett eller flere terapeutisk interessante gener. Dette plasmid kan likeledes bære en replikasjonsopprinnelse, et markør gen, og så videre. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes direkte på et cellelysat. Ved denne utførelsesform blir plasmidet, forsterket ved transformasjon og etterfølgende cellekultur, renset direkte efter lysering av cellene. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan likeledes anvendes på et klart lysat, det vil si en supernatant som er oppnådd efter nøytralisering og sentrifugering av cellelysatet. Den kan selvføl-gelig anvendes også på en oppløsning som er renset på forhånd ved i og for seg kjente teknikker. Denne fremgangsmåte tillater også å rense sirkulært DNA som bærer en sekvens av interesse, fra en blanding omfattende DNA med forskjellige sekvenser. En lig-nende fremgangsmåte kan likeledes anvendes for rensing av dobbeltstreng-RNA.

Cellelysatet kan være et lysat av prokaryotiske eller eukaryotiske celler.

Dreier det seg om prokaryotiske celler, kan man for eksempel nevne bakteriene E. coli, B. subtilis, S. typhimurium eller Streptomyces. Dreier det seg om eukaryotiske celler, kan man nevne animalske celler, gjær, sopp, og så videre og helt spesielt gjærene Kluy-veromyces eller Saccharomyces eller cellene COS, CHO, C127, NEH3T3, og så videre.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt fordelaktig fordi den tillater på hurtig og enkel måte å oppnå plasmidisk DNA med høy renhet. Særlig og som vist i eksemplene, tillater denne fremgangsmåte effektivt å separere kontaminerende forbindelser fra det angjeldende plasmidiske DNA, for eksempel fragmentert kromosomisk DNA, endotoksiner, proteiner, nukleaser, og så videre. Mere spesielt tillater fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen å oppnå et dobbeltstrenget DNA, særlig plasmidisk, med en andel av kromosomisk DNA på lik mindre enn 0,5%. Ennu mere foretrukket har de fremstilte DNA-preparater en kromosomisk DNA-mengde lik mindre enn 0,2%. Foreliggende oppfinnelse beskriver således preparater omfattende plasmidisk DNA som kan benyttes farma-søytisk og særlig ved gen- eller cellulær terapi.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte hvor medikamentet omfatter en mengde av kromosomisk DNA som er lik mindre enn 0,5%, fortrinnsvis mindre enn 0,2% og aller helst mindre enn 0,1%.

Medikamentene kan omfatte "nakent" plasmidisk DNA eller et slikt i forbindelse med transportvektorer som Iiposomer, nanopartikler, kationiske lipider, polymerer, rekombinante vimser eller proteiner, og så videre.

Oppfinnelsen skal beskrives i større detalj ved hjelp av de følgende eksempler.

Generelle teknikker ved kloning og molek<y>lær biologi

De klassiske metoder i molekylærbiologien som fermentering med restriksjonsenzymer, elektroforese på gel, transformering i E. coli, precipitering av nukleinsyrer og så videre, er beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., E.F. Fritsch og J. Sambrook, 1989, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kinston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman og K. Struhl, 1987, "Current Protocols in Molecular Biology", 1987-1988, John Wiley & Sons, New York]. Nukleotidsekvensene er bestemt ved kjedetermineirngsmetoden i henhold til den protokoll som allerede forelig-ger (Ausubel et al., 1987).

Restriksjonsenzymene er tilveiebragt fra New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).

For ligaturene blir DNA-fragmentene inkubert i en buffer Tris-HCl, pH 7,4 50 mM, MgCl210 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, i nærvær av DNA-ligase av fagen T4 (Biolabs).

Nukleotidene syntetiseres under anvendelse av kjemien for fosforamiditter som er beskyttet i 6 med en cyanoetylgruppe (N.D. Sinha, J. McManus og H. Kaster, 1984, "Po-lymer support oligonucleotide synthesis", XVIII: "Use of B-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of déoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product", "Nucl. Acids Res.", 12,4539-4557; J.W. Giles, 1985, "Advances in automated DNA synthesis", "Am. Biotechnol.", november/desember) med en automatisk Biosearch 8600 DNA-syntetisør i henhold til fabrikantens anbefalinger.

DNA-ligaturene som testes på transformeringseffektivitet benyttes for å transformere stammen som er gjort kompetent: E. coli DH5ct [F / endAl. hsdR17. supE44. thi-1. recAl. evrA96. relAL A( lacZYA- areFlU169. deoR. <D80dlac/lac2AM15)].

De plasmidiske DNA-minipreparater tilveiebringes i henhold til protokollen ifølge Klein et al., 1980.

LB-kulturmediet benyttes for vekst av E. coli-stammene (Maniatis et al., 1982). Stammene inkuberes ved 37°C. Bakteriene fordeles på LB-mediumkolber, supplert med de ønskede antibiotika.

Eksempel 1

1. 1. Fremstilling av kolonnen

Materiell:

Den benyttede kolonne er en HiTrap-kolonne som er aktivert med NUS (N-hydroksyccinimid, Pharmacia) på 1 ml, forbundet med en peristaltisk pumpe (mengde < 1 ml/min.). Det spesifikke oligonukleotid som benyttes har en NH2-gruppe ved 5' sekvensen er som følger:

Bufrene som benyttes i dette eksempel er de følgende:

Koblingsbuffer: NaHCC«3 0,1M, NaCl 0,5M, pH 8,3.

Buffer A: etanolamin 0,5M, NaCl 0,5M, pH 8,3.

Buffer B: acetat 0,1M, NaCl 0,5M, pH 4.

Metode:

Kolonnen vaskes med 6 ml 1 mM HC1 og derefter bringes oligonukleotidet, fortynnet i koblingsbufferen (50 nmol i 1 ml) på kolonnen og den settes hen i 30 minutter ved omgivelsestemperatur. Kolonnen vaskes tre ganger efter hverandre med 6 ml buffer A og derefter 6 ml buffer B. Oligonukleotidet bindes på denne måte kovalent til kolonnen med en CONH-binding. Kolonnen settes hen ved 4°C i PBS 0,1% NaN3og kan benyttes minst fire ganger.

1. 2 Konstruksjon av plasmidene

De to følgende oligonukleotider syntetiseres.

Oligonukleotid 4817:

Oligonukleotid 4818:

Disse oligonukleotider bringer, når de først er hybridisert og klonet på et plasmid, til det tilsvarende plasmid en homopurin-homopyrimidinsekvens (GAA)i7, som beskrevet ovenfor.

Sekvensene tilsvarende disse to hybridiserte oligonukleotider klones til kloningsmultisetet av plasmidet pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA) som bærer et ampicillinresistensgen. For å gjøre dette hybridiseres oligonukleotidene på følgende måte. 1 ug av de to oligonukleotider bringes sammen i 40 ml av en sluttbuffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,10 mM MgCl2- Denne blandingen oppvarmes til 95°C og anbringes derefter ved romtemperatur slik at temperaturen langsomt synker. 10 ng av blandingen av hybridiserte oligonukleotider ligeres med 200 ng av plasmid pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA), digerert med BamHI og EcoRI i 30 fil slutt. Efter ligering blir en aliquot transformert i DH5a. Transformeringsblandingene bringes på L-miljø, supplert med ampicillin (50 mg/l) og X-gal (20 mg/l). De rekombinante kloner må oppvise fravær av blåfarving på dette miljø i motsetning til opphavsplasmidet (pBKS+) som tillater a-komplementering av fragmentet oa av IJ-galaktosidasen av E. coli. Efter mini-preparering av plasmidisk DNA på 6 kloner, viste de alle bortfall av setet Pstl mellom setene EcoRI og BamHI av pBKS+, og en økning av molekylvekten av båndet PvuEI på 448 pb inneholdende kloningsmultisetet En klon oppnås og det tilsvarende plasmid kalles pXL2563. Den klonede sekvens verifiseres ved å anvende primeren -20 (5'-TGACCGGCATCAAAATG-3' (SEQ ID nr. 11)) (J. Viera og J. Messing, 1982, "The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers", "Gene", 19,259-268) av plasmidet pBKS+

(Stratagene Cloning System, La Jolla, CA). Plasmidet pXL2563 renses i henhold til en tilgjengelig kitt Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) ved å følge leveran-dørens anbefalinger. Denne fremstilling av plasmidisk DNA benyttes i det følgende i de nedenfor beskrevne eksempler.

1. 3 Rensing av plasmid

Materiell:

Plasmidet pXL2563 (beskrevet under 1.2) renses på HiTrap-kolonnen, koblet til oligonukleotidet som beskrevet under 1.1., fra en oppløsning som også inneholder plasmidet pBKS+.

Bufrene som benyttes under denne rensing er som følger:

Buffer F: NaCl 2M, acetat 0,2M, pH 4,5 til 5.

Buffer E: Tris IM, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM

Metode:

Kolonnen vaskes med 6 ml buffer F og derefter bringes plasmidene (20 ug pXL2563 og 20 fig pBKS+ i 400 fil buffer F) på kolonnen og inkuberes i 2 timer ved omgivelsestemperatur. Kolonnen vaskes med 10 ml buffer F og derefter gjennomføres elueringen med buffer £. Plasmidene detekteres efter elektroforese på 1% agarosegel og farving med etidiumbromid. Andelen av plasmider i oppløsningen estimeres ved å måle deres transformantaktivitet på E. coli.

Resultat:

Ved å gå ut fra en blanding inneholdende 30% pXL2563 og 70% pBKS+ gjenvinnes ved utløpet av kolonnen en oppløsning på 100% pXL2563. Renheten, estimert ved forholdet mellom de optiske densiteter ved 260 og 280 nm, går fra 1,9 til 2,5, noe som an-tyder at man ved denne metode eliminerer forurensende proteiner.

Eksempel 2

11

Dette eksempel beskriver et forsøk på rensing av plasmidisk DNA. Koblingen av oligonukleotidet (S^GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-S' (SEQ ID nr. 1)) på kolonnen skjer som angitt i eksempel 1. For denne kobling blir oligonukleotidet modifisert ved 5'-enden med en amingruppe bundet til avstandsfosfatet med en gren inneholdende 6 karbonatomer (modifisert oligonukleotid fra Eurogentec SA, Belgia). Plasmidet pXL2563 renses ved hjelp av en Wizard Megaprep-kitt (Promega Corp., Madison, WI) i henhold til leverandørens anbefalinger.

Bufrene som benyttes i dette forsøk er som følger:

Buffer F: NaCl 0-2M, acetat 0,2M, pH 4,5 til 5.

Buffer E: Tris IM, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM

Kolonnen vaskes med 6 ml buffer F og derefter bringes 100 fig plasmid pXL2563, fortynnet i 400 pl buffer F, på kolonnen som så inkuberes i 2 timer ved omgivelsestemperatur. Kolonnen vaskes med 10 ml buffer F, hvoretter eluering gjennomføres med buffer E. Plasmidet kvantifiseres ved måling av den optiske densitet ved 260 nm.

I dette eksempel gjennomføres fikseringen i en buffer hvis NaCl-molaritet varierer fra 0 til 2M (buffer F). Renseutbyttet reduseres når NaCl-molariteten synker. pH-verdien for fikseringsbufferen kan variere fra 4,5 til 5, renseutbyttet er bedre ved 4,5. Man kan likeledes benytte en annen elueringsbuffer med basisk pH-verdi, således er eluering gjen-nomført med en boratbuffer 50 mM, pH 9, EDTA 0,5 mM. 2. 2.

Man går videre med kobling av oligonukleotidet: (S-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-S' (SEQ ID nr. 1)) på kolonnen som angitt i eksempel 1. Plasmidet pXL2563 renses ved hjelp av Wizard Megaprep-kitten (Promega Corp., Madison, WI) ved åfølge leverandørens anbefalinger.

De benyttede buffere i dette eksempel er som følger:

Buffer F: NaCl 0,1M, acetat 0.2M, pH 5.

Buffer E: Tris IM, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM

Kolonnen vaskes med 6 ml buffer F og derefter blir 100 ug plasmid pXL2563, fortynnet i 400 fil buffer F, bragt på kolonnen og inkubert i 1 time ved omgivelsestemperatur. Kolonnen vaskes med 10 ml buffer F, hvoretter eluering gjennomføres med buffer E. Man måler mengden genomisk eller kromosomisk DNA av E. coli som er til stede i plasmidprøven før og efter passasje på oligonukleotidkolonnen. Denne genomiske DNA kvantifiseres ved PCR under anvendelse av sonder i genet galK av E. coli i henhold til følgende protokoll: Sekvensen for disse sonder er beskrevet av Debouck et al. ("Nucleic Acids Res.", 1985,13,1841-1853):

Reaksjonsmediet omfatter, i 25 fil PCR-buffer (Promega France, Charbonniéres): 1,5 mM MgCl2J0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 uM sonde; 20 U/ml Taq-polymerase (Promega). Reaksjonen gjennomføres i henhold til sekvensen:

5 minutter ved 95°C

30 cykler på 10 sekunder ved 95°C

30 sekunder ved 60°C

1 minutt ved 78°C

- 10 minutter ve 78°C.

Det forsterkede DNA-fragment med en lengde på 124 basepar separeres ved elektroforese på 3% agarosegel i nærvær av SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA) og kvantifiseres derefter ved referanse til en genomisk DNA-mal Ultrapur av E. coli, stamme B (Sigma, ref. D4889).

Man har 1% kromosomisk DNA i prøven som avsettes på kolonnen og 0,2% i prøven som renses på oligonukleoitdkolonnen.

Eksempel 3

Forsøk med klart lvsat

Dette eksempel beskriver rensing av plasmidisk DNA fra et klart lysat av bakteriekultur i målestokken kalt "miniprep": 1,5 ml av en nattkultur av stammene DH5a inneholdende plasmidet pXL2563 sentrifugeres og puten bringes i suspensjon i 100 pl glukose 50 mM, Tris 25 mM HC1, pH 8, EDTA 10 mM. Man tilsetter 200 ul NaOH 0,2M, SDS 1%, rørene omrøres ved inversjon og derefter tilsettes 150 fil 3M kaliumacetat, pH 5, og rørene agiteres ved inversjon. Efter sentrifugering gjenvinnes supematanten og bringes på oligonukleotidkolonnen som er oppnådd som beskrevet i eksempel 1. Fikseringen, vaskingen og elueringen gjennomføres på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Man gjenvinner ca. 1 fig plasmid fra 1,5 ml kultur. Det oppnådde plasmid, analysert ved elektroforese på agarosegel og farving med etidiumbromid, viser seg i form av et enkelt sirkulært "superspole" DNA-bånd. Intet spor av DNA med høy molekylvekt (kromosomisk) og heller ikke RNA kan detekteres i plasmidet som renses ved denne metode. Forholdet mellom de optiske densiteter ved 260 og 280 nm er større enn 2.

Eksempel 4

4. 1.

Dette eksempel beskriver et forsøk på rensing av plasmidisk DNA gjennomført under de samme betingelser som i eksempel 3, fra 20 ml bakteriekultur av stammene DH5ct inneholdende plasmidet pXL2563. Celleputen tas opp i 1,5 ml glukose 50 mM, Tris 25 mM HC1, pH 8, EDTA 10 mM. Lyseringen gjennomføres med 2 ml NaOH 0,2M, SDS

1% og nøytraliseringen med 1,5 ml kaliumacetat 3M, pH5. Det oppnådde DNA precipi-teres derefter med 5 ml 2-propanolol, det avfiltrerte tas opp i 0,5 ml natriumacetat 0,2M, pH 5, NaCl 0,IM og chargeres på oligonukleotidkolonnen som er oppnådd som beskrevet i eksempel 1. Fikseringen, vasking av kolonnen og elueringen skjer som beskrevet i eksempel 1 bortsett fra vaskebufferen hvis NaCl-molaritet er 0,1M. Man oppnår på denne måte ca. 15 ug plasmidisk DNA. Det oppnådde plasmid, analysert ved elektroforese på agarosegel og farving med etidiumbromid, presenterer seg i form av et enkelt, sirkulært "superspole" DNA-bånd. Intet spor av DNA med høy molekylvekt (kromosomisk) eller RNA kan detekteres i det rensede plasmid. Fermentering av plasmidet med

et restriksjonsenzym gir et enkelt bånd med ventet molekylvekt på 3 kilobaser. Konsentrasjonen av proteiner i prøvene går fra 125 ug/ml i det klare lysat til mindre enn 1 ug/ml i det rensede plasmid (bestemmelse Micro-BCA, Pierce). Konsentrasjonen av endotok-

siner, anslått ved LAL-bestemmelse (Biosepra) kan divideres med en faktor på over 10 i det rensede plasmid i forhold til det klare utgangslysat. 4. 2. Det benyttede plasmid bærer en kassett inneholdende cytomegalovirus-promoteren, genet som koder for luciferase og homopurin-homopyirmidinsekvensen (GAA)i 7 fra plasmidet pXL2563. Stammen DH1 (Maniatis et al., 1989) inneholdende dette plasmid dyrkes i en fermenter på 7 liter. Et klart lysat fremstilles fra 200 g celler: den cellulære tllterkake tas opp i 2 liter Tris 25 mM, pH 6,8, glukose 50 mM, EDTA 10 mM, hvor til det settes 2 liter NaOH 0,2M, SDS 1%. Lysatet nøytraliseres ved tilsetning av 1 liter 3M kaliumacetat. Efter diafiltrering avsettes 4 ml av dette lysat på en HiTrap-NHS-kolonne på 5 ml, koblet til oligonukleotidet med sekvensen:

i henhold til den metode som er beskrevet i eksempel 1.1. Vaskingen og elueringen skjer som i eksempel 1. Man gjenvinner ca. 400 ug plasmid. Mengden av genomisk DNA i denne prøve, målt ved den teknikk som er beskrevet i eksempel 2.2, er 0,1%.

Eksempel 5

Anvendelse av et modifisert oligonukleotid

Dette eksempel beskriver anvendelsen av et oligonukleotid som bærer metylerte cytosiner.

Sekvensen for det benyttede oligonukleotid er som følger:

Dette oligonukleotid har en NH2-gruppe ved 5'. ^<e>C = 5—metylcytosin. Dette oligonukleotid tillater å rense plasmidet pXL2563 under de betingelser som er beskrevet i eksempel 1, med en fikseringsbuffer pH 5 (man reduserer således risikoen for nedbrytning av plasmidet).

Eksempel 6

I de foregående eksempler er det benyttede oligonukleotid modifisert ved 5-enden med en amingruppe bundet til fosfat med en gren inneholdende 6 karbonatomer: NH2-(CH2)6-1 dette eksempel er amingruppen bundet til fosfatet ved den terminale 5'-ende med en gren på 12 karbonatomer: NH2-(CH2)i2- Koblingen av oligonukleotidet og føringen på kolonnen gjennomføres som antydet i eksempel 2 med en buffer F: NaCl 2M, acetat 0,2M, pH 4,5. Dette oligonukleotid tillater åoppnå bedre renseutbytter: man oppnår et utbytte på 53%, mens man med oligonukleotidet med 6 karbonatomer under de samme betingelser oppnår et utbytte i størrelsesorden 45%.

Eksempel 7

Ved å følge den kloningsstrategi som er beskrevet i eksempel 1.2., konstrueres det to ytterligere plasmider som bærer homopurin-homopyirmidinsekvenser: plasmidet pXL2725 som inneholder sekvensen (GGA)i5og plasmidet pXL2726 som inneholder sekvensen (GAfø.

7. 1 Konstruksjon av plasmider

Plasmidene pXL2725 og pXL2726, analoger med plasmid pXL2563, konstrueres i henhold til den kloningsstrategi som er vist i eksempel 1.2. under anvendelse av de følgen-de oligonukleotidpar:

Oligonukleotidparene 5986 og 5987 benyttes for å konstruere plasmidet pXL2726 ved å klone oligonukleotidene til setene BamHI og EcoRI av pBKS+ (Stratagene Cloning

System, La Jolla, CA), mens oligonukleotidene 5981 og 5982 benyttes for konstruksjon av plasmidet pXL2725. De samme forsøksbetingelser som ble benyttet for konstruksjon av plasmidet pXL2563 benyttes også her og kun oligonukleotidparene er endret. Videre er de klonede sekvenser verifisert ved sekvensering på plasmider. Dette har tillatt å ob-servere at plasmidet pXL2725 har en modifikasjon i forhold til den ventede sekvens, i stedet for sekvensen GGA repetert 17 ganger, har den GGAGA(GGA)i5(SEQ ID nr. 17).

7. 2. Fremstilling av kolonner og rensing

Oligonukleotidene som danner trippelhelikser med homopurinsekvensene kobles til HiTrap-kolonner i henhold til den teknikk som er beskrevet i eksempel 1.1. Det dreier seg om oligonukleotidet med sekvensen for rensing av plasmidet pXL2725, og oligonukleotidet med sekvensen

for rensing av plasmidet pXL2726.

De to således oppnådde kolonner tillates å rense de tilsvarende plasmider i henhold til den teknikk som er beskrevet i eksempel 2, med de følgende buffere:

Buffer F: NaCl 2M, acetat 0,2M, pH 4,5.

Buffer E: Tris IM, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.

De oppnådde utbytter er 23% henholdsvis 31% for pXL2725 henholdsvis pXL2726.

Eksempel 8

Dette eksempel viser innvirkningen av lengden av den spesifikke sekvens som er til stede på plasmidet, på renseutbyttene.

8. 1 ♦ Konstruks i on «v plasmidene

Det benyttede rapportørgen i disse forsøk på å påvise en aktivitet for preparatene ifølge oppfinnelsen, er genet som koder for luciferase (Lue).

Plasmidet pXL2621 bærer en kassett inneholdende promoteren av cytomegalovirus (CMV) på 661 bp og som stammer fra pcDNA3 (Invitrogen, Corp., San Diego, CA) ved kutting med restriksjonsenzymene Mlul og Hindlll, klonet oppstrøms genet som koder for luciferase, på setene Mlul og Hindlll i vektoren pGL basic Vector (Promega Corp., Madison, WI). Dette plasmid er konstruert ved å bruke standardteknikker innen molekylærbiologien.

Plasmidene pXL2727-l og pXL2727-2 er konstruert på følgende måte:

To ug plasmid pXL2621 lineariseres med BamHI; enzymet inaktiveres ved en behand-ling av 10 mn ved 65°C; parallelt hybridiseres oligonukleotidene 6006 og 6008 som beskrevet for konstruksjonen av plasmid pXL2563. Denne hybrideringsblanding klones til BamHI-enden av plasmidet pXL2621 og efter transformering i DH5a blir de rekombinante kloner påvist ved analyse ved enzymatisk restriksjon med Pstl fordi oligonukleotidene innfører Pstl-setet. To kloner beholdes og nukleotidsekvensen av det klonede fragment verifiseres under anvendelse av primeren (6282, 5-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (SEQ ID nr. 22)) som sonde for reaksjonen av sekvensen (J. Viera og J. Messing, 1982, "The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with syntetic universal primers.", "Gene", 19: 259-268). Den første klon (pXL2727-l) inneholder sekvensen GAA repetert 10 ganger. De andre (pXL2727-2) inneholder sekvensen

8. 2 Fremstilling av kolonner og rensing

Man benytter en kolonne som beskrevet i eksempel 1 og som er koblet til oligonukleotid 5,-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3,(SEQ ID nr. 1).

Plasmidet pXL2727-l bærer 14 repetisjoner av sekvensen GAA. Det ovenfor beskrevne oligonukleotid som ikke teller mer enn 7 repetisjoner av den tilsvarende hybriderings-sekvens CTT, kan således hybridiseres med plasmidet i 8 forskjellige stillinger. Plasmidet pXL2727-2 har i motsetning til dette en hybriderende sekvens (GAA)7med samme lengde som oligonukleotidet som er fiksert på kolonnen. Dette oligonukleotidet kan således ikke hybridere med mer enn en posisjon på pXL2727-2.

Forsøket er identisk med det som er beskrevet i eksempel 2 med de følgende buffere:

Buffer F: NaCl 2M, acetat 0,2M, pH 4,5.

Buffer E: Tris 1M, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.

Renseutbyttet er 29% med plasmid pXL2727-l og 19% med pXL2727-2.

8. 3. Transfeksion in vitro av mammifære celler

De benyttede celler er NTH 3T3-celler, sådd umiddelbart før forsøket i dyrkningsplater med 24 brønner i en mengde av 50 000 celler/brønn. Plasmidet fortynnet i NaCl 150 mM og blandes med lipofektanten RPR115335. Man benytter et forhold mellom positi-ve ladninger av lipofektanten og negative ladninger av DNA lik 6. Blandingen omrøres heftig, settes hen i 10 minutter ved omgivelsestemperatur, fortynnes i medium fritt for føtalt kalveserum, hvoretter det tilsettes 1 ug DNA pr. kulturbrønn. Efter 2 timer ved

37°C tilsettes 10 volum-% føtalt kalveserum og cellene inkuberes i 48 timer ved 37°C i nærvær av 5% CC7. Cellene vaskes to ganger med PBS og luciferase-aktiviteten måles i henhold til den beskrevne protokoll (Promega-kitt, Promega Corp., Madison, WI) på et Lumat LB9501-luminometer (EG og G Berthold, Evry). Plasmidet pXL2727-l, renset som beskrevet i eksempel 8.2., gir transfeksjonsutbytter som er to ganger større enn de som oppnås med det samme plasmid, men som er renset ved Wizard Megaprep-kitten (Promega Corp., Madison, WT).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et medikament på basis av en sirkulær dobbelttråd-DNA,karakterisert vedat den omfatter minst et rensetrinn der man fører en oppløsning inneholdende nevnte DNA i blanding med andre forbindelser over en kromatografibærer på hvilken det på kovalent måte er bundet et oligonukleotid i stand til ved hybridering å danne en trippelheliks med en spesifikk homopurin/homopyridinsekvens til stede på nevnte DNA.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat oppløsningen inneholdende nevnte DNA er et cellelysat.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat cellelysatet er et klart lysat.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat dette dobbelttråd-DNA er forrenset.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat den spesifikke sekvens innføres kunstig i dobbelttråd-DNA'en.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat oligonukleotidet omfatter en poly-CTT-sekvens og at den spesifikke sekvens som er til stede på nevnte DNA er en poly-GAA-sekvens.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat oligonukleotidet har sekvensen GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID nr. 1).

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat oligonukleotidet har sekvensen (CTT)7(SEQ ID nr. 26).

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8,karakterisertv e d at den spesifikke sekvens som er til stede på nevnte DNA omfatter sekvensen (GAA)7, (GAA)i4eller (GAA)i7.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den spesifikke sekvens som er til stede på DNAet omfatter sekvensen SEQ ID nr. 5 og at oligonukleotidet omfatter sekvensen SEQ DD nr. 6 eller SEQ ID nr. 7.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den spesifikke sekvens som er til stede på DNA'et omfatter sekvensen SEQ ID nr. 17 og at oligonukleotidet omfatter sekvensen SEQ ID nr. 18.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den spesifikke sekvens som er til stede på DNA'et omfatter sekvensen (GA)25og at oligonukleotidet omfatter sekvensen SEQ ID nr. 19.

13. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat den spesifikke sekvens er en spesifikk sekvens som naturlig er til stede på dobbelttråd-DNA'et.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat den spesifikke sekvens som naturlig er til stede på DNAet er en homopurin-homopyrimidinsekvens som er til stede i replikasjonsopprinnelsen av et plasmid.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14,karakterisert vedat den spesifikke DNA-sekvens omfatter hele eller en del av SEQ H) nr. 2 inneholdt i rep likasjonsopprinnelsen ColEl av E. coli.

16. Fremgangsmåte ifølge krav IS,karakterisert vedat oligonukleotidet omfatter sekvensen SEQ ID nr. 3.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat den spesifikke DNA-sekvens omfatter hele eller en del av SEQ DD nr. 4 eller sekvensen SEQ ID nr. 8, inneholdt i genet fi-laktamase av plasmid pBR322.

18. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat oligonukleotidet er koblet til bæreren via en disulfid-, tioeter-, ester-, amid- eller aminbinding.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat oligonukleotidet er fiksert til kolonnen ved hjelp av en gren bestående av en karbonkjede (CH2)n>der n er et helt tall fra og med 1 til og med 18, idet grenen er forbundet til oligonukleotidet via et fosfat og til kolonnen via en amidbinding.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19,karakterisert vedat grenen består av en rett karbonkjede med 6 karbonatomer.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 19,karakterisert vedat grenen består av en rett karbonkjede med 12 karbonatomer.

22. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat oligonukleotidet oppviser minst en kjemisk modifikasjon som gjør det motstandsdyktig mot eller beskyttet vis å vis nukleaser, eller som øker dets affinitet for den spesifikke sekvens.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat oligonukleotidet omfatter en homopyrimidinsekvens i hvilken minst cytosinene er mety-len.

24. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat DNA'et videre omfatter en eller flere terapeutisk interessante sekvenser.

25. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat dobbelttråd-DNA'et er et sirkulært DNA som et plasmid.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den spesifikke sekvens som er til stede på dobbelttård-DNA'et omfatter flere stillinger for hybridering med oligonukleotidet.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat medikamentet har et innhold av kromosomisk DNA på lik-mindre enn 0,5%.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27,karakterisert vedat medikamentet har et innhold av kromosomisk DNA på lik mindre enn 0,2%.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28,karakterisert vedat medikamentet har et innhold av kromosomisk DNA på lik mindre enn 0,1%.

30. Fremgangsmåte for rensing av plasmid DNA,karakterisertv e d at den omfatter minst ett trinn der en oppløsning inneholdende nevnte DNA blandet med andre komponenter føres gjennom en kromatografisk bærer hvortil det kovalent er koblet et oligonukleotid i stand til å danne en trippelheliks ved hybridering med en spesifikk homopurin/homopyrimidinsekvens til stede i nevnte DNA.