JPH02501353A - 少なくとも１つの自然または合成ｄｎａ片を含有する分子の結合または分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 少なくとも１つの自然または合成りＮＡ片を含有する分子の結合または分離法 本発明は、ＤＮＡまたはＤＮＡ片を含む分子を分離する方法に関する。

ＤＮＡは殆ど完全に水に溶解することが知られており、これによって水と混和し ない溶剤における反応を含む化学的な転化をＤＮＡに対して行うことが非常に困 難であるか、または不可能でさえある。

精製されたＤＮＡを得る場合に、生ずる困難についてもまた知られており、今ま でに開発された方法は、液相による抽出を連続して行う方法を採用しているが、 これには、時間と手間がかかり自動化することが困難であるという欠点がある。

これらの方法のなかで、最も新しい方法の１つは。

ヨウ化ナトリュウムまたは過塩素酸力、リュムのようなカオトロピック剤によっ て、水溶液中でＤＮＡを粉末ガラスの粒子に結合させるものである。これは選択 的に行われるから、この混合によって、ＤＮＡが一般的にこれに付着している溶 液中の蛋白質とＲＮＡから分離され、粉末ガラスに結合されたＤＮＡが生産され ることになり、これからこのＤＮＡが水溶液を使用して行われる抽出によって分 離される。こうして得られたＤＮＡの溶液に対して連続的に精製を行わなければ ならないが、これは一般的にＲＮナーゼ、プロティナーゼに、フェノールおよび クロロホルムを使用した連続処理によって構成され、これらは全て液相の中で行 われる。

ＤＮＡの処理およびその精製には多くの困難が＠繍するが、これは特に多くの連 続した処理を行わなければならないことに起因し、このことがこの処理の収益性 を阻害し、特に自動装置の開発を妨げている。

このような理白によって１本出願人は、この処理。

特にＤＮＡに対して化学的又は物理的反応を行わせること、及びＤＮＡの精製を 改善する目的のため新しい方法を提案する。

この方法とは、少なくとも１つの自然又は合成りＮＡ片を含んでいる分子を結合 し、この分千七含有する液体混合物からこの分子を分離する方法であり、ａ）上 記の液体混合物をＤＮＡと可逆的で選択的非共有結合を行う性質と構造を有する 基質と接触させるステップ。

ｂ）ＤＮＡの結合後、残留混合物￥１：除去するステッブ、および Ｃ）少なくとも１つのＤＮＡ片を含有する分子と基質がその中で実質的に溶解し ない少なくとの１つの溶剤の甲で、結合したＤｓＡ”ｉｙ対して１つ以上の物理 および（または）化学反応を行った後、上記の結合したＤＮＡを抽出するステッ プによって構成される。

この処理を改善する目的、特にＤＮＡに対して化学的又は物理的反応を行うこと を改善する目的のため。

本出願人は１反応溶剤及び水のいずれにおいても溶解しない支持材に可逆的かつ 非共有的に結合されたＤＮＡに対して上記の反応を行うことによって構成される 方法を開発した。この方法によれば、麺用される支持体は、大きさが５ｐｍ以下 の粒子である０例えば、粉末ガラスのように細かく分割された支持体である。溶 剤を付加することによって、粗末ガラスに結合されたＤＮＡの混濁液が得られ、 これによって、ＤＮＡが液相／液相分離を行うことを必要とすることなしに１選 。

択された溶剤中の非均質相内で直接処理されることが可能になる。

それにも拘らず、この方法によってＤＮＡを処理する場合に発生する問題の１つ は１例えば、このプロセスを自動化しようとする場合又はこれを６診断キットの 形で提供しようとする場合、粉末ガラスに多くの欠陥が有ることである。

粉末ガラスは、湿温液内で使用することが可能であり、この場合これに欠陥は無 いが、もし９れをカラムに対するバッキングの形で使用するとすれば、大きな困 難が発生する。

基本的に、活性化されたガラス粒子の大きさく最大５７ｔｍ）およびこれらが角 張った性質を有していることのため、このガラスの気泡係数は非常に低く、その ため、粉末ガラスのカラム（ＨＰＬＣ）内に流体を通過させるためには、大きな 圧力が必要であり、従って、ＤＮＡは加えられた圧力とせん断力によって急速に 劣化する。

本発明の目的は、また精製目的のためまたはＤＮＡの分子を化学的又は酵素によ って修飾する目的のため、ＤＮＡを容易に取扱うことのできるＤＮＡの処理方法 を提案することにあり、この方法は、容易に自動化できる方法、例えば、低圧ク ロマトグラフ法のような手法に適用することが可能である。

本発明は、更に少なくとも１つの自然又は合成りＮＡ片を含んでいる分子を結合 し、この分子を含有する液体混合物からこの分子を分離する方法であり、ａ）上 記の液体混合物をＤＮＡと可逆的で選択的非共有結合を行う性質と構造を有する 基質と接触させるステップであって、上記の基質を低圧クロマトグラフに使用す ることのできる上記のステップ。

ｂ）ＤＮＡの結合後、残留混合物を除去するステップ、および Ｃ）結合したＤＮＡに対して１つ以上の物理および（または〕化学反応を任意に 行った後、上記の結合したＤＮＡを抽出するステップによって構成される。

少なくとも１つの自然または合成りＮＡ片を含む分子には、上述の細胞ＤＮＡ自 身だけでは；く、化学的ラベリングのような化学的または物理的な変成を受けた 自然または合成オリゴヌクレオチドや複数のＤＮＡが存在し、またアビジン／ビ オチン系との結合物のような介在物質または物理化学的結合物が存在する。

使用される基質は、種々の材料によって構成されることが可能であり、特に可逆 的かつ選択的非共有結合によってＤＮＡを結合することができるものであれば、 ガラス、セラミックまたは金属、またはガラスとセラミックのような混合物から 構成されることができる。

これらの材料には、ホウケイ酸ガラスのようなホウ素を含有する材料があり、特 にコーニング・フランス社の販売するバイレックス・ガラス７３２−０１につい て説明しなければならない。

従来技術のケースでは、研究によって粉末ガラスの粒子の大きさがその選択性に 及ぼす影響が示されているが１本出願の場合には、基質の多孔度が１ミクロン以 上でなければならず、この基質の成分は任意に相互に結合されるが２ないし１０ ミクロンのオーダーの多孔度、例えば２ないし５ミクロンの多孔度を使用するこ とが望ましい。

この基質は、単一の形態をとることもできるし分割された形態をとることもでき る。

これが単一の形態である場合、これがケイ華形態の製品１例えばガラスまたは金 属のケイ華であることが望ましい。

基質が分割されている場合、これはファイバーまたはビーズの形である。このフ ァイバーはガラス・ウール・タイプのウールのように編み合わされてもいいし、 また編んだ布を組合したものであってもよい。

ビーズの場合、その直径は考えている用途に適合すること、ケイ華を使用するこ とは１診断用キットを作る場合、または使い捨ての構成品を作る場合に特に有利 である。実際上、ガラス粒子をベースにして圧縮され共に溶着されたケイ華は、 これを直径カラムとして使用することを可能にする機械的強度を有している。

この様な支持体の多孔度は低い（ｌｏＪＬｍ未満）が、それにもかかわらず、こ れは粒体が非常に低い圧力で通過することを可能し、粒速は毎分数ミリリｙ）ル であり、例えばフィルター・ポンプを使用することが可能である。基質と接触す る液体混合物のモノローラ・の材料は、どのようなものであってもよく、これは 細胞破壊の後に得られた媒体、またはもともと合成品の媒体でもよい、すなわち 、この媒体は、ヨウ化ナトリュウムまた。は過塩素酸カリュムのようなカオトロ ピック剤を含有する水性媒体であることが望ましし）。

当然、使用される基質は上記の媒体内で不溶性でなければならない。

結合された分子の基質からの抽出は、水溶液で行われることが望ましく、この水 溶液は、少なくとも１つの無機塩、１つの緩衝剤％　１つの千レート剤、および （または）ｉつの抗酸化剤を任意に含有することができる。

この方法は、また結合された分子がＤＮＡおよび基質が溶解しない溶剤中で１つ 以上の物理的および（または）化学的反応を受けることを可能にする。

この方法の１つの特徴は、支持体に結合されたＤＮＡの反応性が、均質相反応と 比較して化学反応中に改善されることである（特に接触面積が非常に大きいこと の結果）。

指摘するべきことは、これらの反応が、エチルアルコールのような溶剤を使用す る可能性のある残留反応混合物、特にカオトロピック剤の除去と混同されるべき でないことである。

この場合に使用される溶剤は、ＤＮＡまたは基質を溶解しない特性を有していれ ばどのような有機またはａｓ！溶剤でもよい、少なくとも１つの無機塩を含む水 又は水溶液をこの溶剤に付加することが可能であり、これはまた少なくとも１つ の緩衝剤、１つのキレート剤および（または）１つの抗酸化剤を含むことができ る。

本発明による方法で使用することのできる溶剤の例として、上記のアルコール、 ハロゲン化溶剤及び（または）フェノールがあり、特に、クロロホルム、エタノ ール、インプロパツール、ブタノール、または水で飽和したフェノールの溶液が ある。

例えば、少量の塩化ナトリウム、ＥＤＴＡまたはトリＨＣＪＩを溶剤に付加する ことのできる水に加えてもよい。

この方法の１実施例では、ＤＮＡと基質との複合体が適当な試薬による分子の化 学的又は酵素による修飾の目的のため溶剤内で処理される。

本発明による方法の他の実施例では、ＤＮＡと基質との複合体はＤＮＡまたは精 製された分子を得る目的のために処理される。この場合、溶剤を使用する処理は 、基本的にＤＮＡに結合した汚染分子をそのＤＮＡから分離することを目的とす る。これらの汚染分子は、なかんず＜、ＤＮＡ分子をラベリングする”のに使用 されるタンパク質、アゲローゼ（ｓｉｃ）、脂肪または臭化エチジウムのような 蛍光剤である。

この場合、溶剤の選択は精製さｎるべきＤＮＡのもとの材料によって決り、この 場合、ＤＮＡがタンパク質によって顕著に汚染されていれば、水に飽和したフェ ノールを使用することが有利であり、汚染が王として脂肪によって構成される場 合には、この溶剤はクロロホルムであることが望ましい。

本発明は、最終的には、上述した基質を低圧クトマトグラフに適応することと、 結合されたＤＮＡの分子を含有する上述の基質に関する。

と特徴を示すための物である。

例−ｍ−」２ この例は、大腸菌のプラスミＦ　Ｄ　Ｎ　Ａの製造を説明するものである。１． ５ｍＭの培養大腸菌が遠心分離され、１００終１のＴＧＥ　（２５ｍＭのトリＨ ＣｌｐＨ７，５；　ｌ　ＯｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのグルコース）内でベレッ トが取られた。これに続く全ての段階は４℃で行われた。

０．２ＭのＮａＯＨを２００　ｋｆＬおよび１％（７）ＳＤＳ溶液が加えられ、 得られた組成物が混合され、５Ｍの酢酸カリウム１５０ｐＪＬが加えられ、この 組成物が加えられ、反応するために５分間報知される。

この混合物は、２ないし５分間遠心分離され（微細化遠心分離）１次に４００Ｐ 文の浮遊物質か回収される。

８ＭのＮａｌ水溶液８００路１と約２．５ｍｇの粉末ガラスがこの浮遊物質に加 えられる。この組成物は約５分間混合され、その混合物は工ないし５分間遠心分 離され、浮遊物質が除去される。

４００μ文の水で飽和したフェノール内でベレットが取出され、混合物が５分間 攪拌される。これは１ないし５分間遠心分離され浮遊物質が除去される。

４００μ交のクロロホルムの中でベレットが取出され、組成物は５分間攪拌され る。

この混合物は、工ないし５分間遠心分ｍされて浮遊物質が除去される。

５０％ノエタノールＴＥおよび０．３ＭのＮａＣ文（ＴＥ＝ｌＯｍＭ　）　リ　 ＨＣ！Ｌ　ｐＨ７，５；ｉｎＭ　ＥＤＴＡ）を含有するｌｌＬｉの洗疹液内でベ レットを取出す０組成物を５分間混合Ｔる。

この混合物′ｆ：ｌないし５分間遠心分離し、浮遊物質を回収する。

５０ないし１００ｐ旦のＴＥ内でベレー、トを取出し１組成物を５分間混合する 。この混合物を５分間遠心分離し浮遊物質を回収する。

得られたプラスミドＤＮＡは非常に純粋である。

ＲＮナーゼ、プロテイナーゼＫ、フェノールおよびクロロポルムを使用する処理 の段階はもはや必要ではない。

このようにして得られたＤＮＡは、別々の分子生物反応で試験され、これによて 得られた結果、その高い純度が確認された。

例　２ ガラス９ケイ華上のＤＮＡの精製 精製するべきＤＮＡは１例えば、蛋白質、アガロースおよび（または）ＲＮＡに よって汚染されている可能性がある。下記の例では、このＤＮＡはおもにタンパ ク質とＲＮＡによって汚染されている（８０％のＲＮＡ、リボヌクレオチド、リ ポヌクレオサイによって市販され、平均粒度５ミクロンに粉砕された粉末パイレ ックス７３２．０１ガラスから得られる。

８ＭのＮａＩが２ｍＭ、ＤＮＡ溶液（最終的に３ｆｉＬｉの容量、３１５ｇＨの ＤＮＡ）に加えられる。

この溶液は、このケイ華（直径３ｃｍ、厚さ２ｍｍ、多孔性２ＪＬｍ未満）（フ ィルター・ポンプによって真空化で吸引）を通過する。

このケイ華は、１０ｍＭの８ＭのＮａＩで洗浄され、次ぎに下記の物質で洗浄さ れる。

−５０ｍＪｌのＨ２０で飽和したフェノール（これの目的はＤＮＡに結合したタ ンパク質を分離することである）、 −５０ｍ　ｆＬのクロロホルム。

−５−ｍ　ｎ　（７）　５０％ノエタノール、０．３ＭのＮａＣＬの溶液。

このケイ華は、２ないし３分吸引によって軽く乾燥される。

次いでＤＮＡは、１０ｍＭトリＨ１ｄｌＰＨ８゜１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ＰＨ８１７ ）２ＰＨ８１７）２倍をもッテ溶出される。

資料は１％の７ガロース・ゲル上に散在された。

−レーン１：精製されるＤＮＡの試料、ＲＮＡが明確に目視出来る（矢印のレベ ルで）。

−レーン２：第１抽出１ 、−レーン３：第２抽出 下記の所見が得られる： 第１拍出では、７０％のＤＮＡ　（２２０鉢ｇ）第２抽出では、２５％のＤＮＡ （８０ルｇ）写真では、抽出ｌと２でＲＮＡの無くなっていることがはっきり分 る。

ＲＮＡは結合されず、ＤＮＡのみが結合されて、抽に付着されていた蛋白質はフ ェノール処理によって分離されている。

浄書（内容に変更なし） 手続補正書（自発） 平成１年１１月２０日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 国際出願番号　ＰＣＴ／ＦＲ８８１００４６１３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　フランス国、６７４０２　イルキッヒ　セデックスビーピー　７２ バルク　ド　イノヴアション　ル　デュ　ラアン名称　アブリジン 代表者　ピース、クロード 国　籍　フランス国 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人の欄（２）図 面 （３）代理権を証明する書面及び訳文 （４）法人証明書及び訳文 ６、補正の内容 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人の欄を、別紙 の通り、補正致します。

手続補正書（方式） 平成　２年　２月２３日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 国際出願番号　ＰＣＴ／ＦＲ８８１００４６１３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　フランス国、６７４０２　イルキッヒ　セデックス代表者　ビー人りロ ード 国　語　フランス国 ６、補正の対象 （１）明細書の翻訳文 （２）請求の範囲の翻訳文 国際調査報告 ｊ＋＋ｗ＋＋＋ｗｍｍａ、１１．Ｎｖ　”””　８８ノ００４６１茗１頁の続き ■Ｉｎｔ、　ＣＬ　’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｈ２１１０４Ｚ　７８２ ２−４Ｃ優先権主張　［相］１９８７年１１月５日［相］フランス（ＦＲ）［相 ］８７／１６３３８り発　明　者　ソバジョ、マルタン　フランス国、６７００ ０特表平：ｐ−５ｏ１３ｓ３（７） コ　ストラスブルグ、ル　ドウ　モルシエイム　１イルキツヒ、アンパース　リ オテ、４

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つの自然または合成ＤＮＡ片を含有する分子を結合し、これら の分子を該分子を含有する液体混合物から分離する方法において、上記の方法は 、 ａ）上記の液体混合物をＤＮＡと可逆的で選択的非共有結合を行う性質と構造を 有する基質と接触させるステップ、 ｂ）ＤＮＡの結合後、残留混合物を除去するステップ、および ｃ）少なくとも１つのＤＮＡ片を含有する分子と基質がその中で実質的に溶解し ない少なくとも１つの溶剤の中で、結合したＤＮＡに対して１つ以上の物理およ び（または）化学反応を行った後、上記の結合したＤＮＡを抽出するステップに よって構成されることを特徴とする方法。
2. ２．上記の基質を低圧クロマトグラフで使用することがでさることを特徴とする 請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．物理および（または）化学反応が、アルコール、ハロゲン化溶剤および（ま たは）フェノールから選択された溶剤の中で行われることを特徴とする請求の範 囲第１項および第２項の１つに記載の方法。
4. ４．溶剤が、水溶液中のクロロホルム、エタノール、イソプロパノール、ブタノ ールおよびフェノールで構成される属から選択されることを特徴とする請求の範 囲第３項記載の方法。
5. ５．少なくとも１つのＤＮＡ片を含有する分子に対して、 −少なくとも１つのハロゲン化溶剤による脱脂肪、および（または） −少なくとも１つのフェノール溶剤による脱蛋白質が行われることを特徴とする 請求の範囲第１項ないし第４項の１つに記載の方法。
6. ６．少なくとの１つのＤＮＡ片を含有する分子に対して溶剤中で化学反応が行わ れることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項の１つに記載の方法。
7. ７．上記の基質がガラス、セラミック、金属またはこれらの構成物の混合成分に よって構成されることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第６項の１つに記載 の方法。
8. ８．基質が多孔度が１ミクロンを超えることを特徴とする請求の範囲第１項ない し第７項の１つに記載の方法。
9. ９．基質が２ないし１０ミクロンのオーダーの多孔度を有することを特徴とする 請求の範囲第１項ないし第７項の１つに記載の方法。
10. １０．基質がフッイバーまたはビーズのケイ華の形態であることを特徴とする請 求の範囲第１項ないし第９項の１つに記載の方法。
11. １１．基質がガラスであることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１０項の １つに記載の方法。
12. １２．基質がホウケイ酸ガラスであることを特徴とする請求の範囲第１１項記載 の方法。
13. １３．基質がガラス・ケイ華であることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第 １２項の１つに記載の方法。
14. １４．上記の分子を含有する液体混合物が水性媒体であることを特徴とする請求 の範囲第１項ないし第１３項の１つに記載の方法。
15. １５．上記の分子を結合し含有するたわに使用される混合物がカオトロピック剤 を含有することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１４項の１つに記載の方 法。
16. １６．カオトロピック剤はヨウ化ナトリウムおよび過塩素酸カリウムから選択さ れることを特徴とする特許請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. １７．結合に使用される残留混合物がカオトロピック剤用の溶剤による処理によ って除去されることを特徴とする請求の範囲第１５項および第１６項の１つに記 載の方法。
18. １８．結合されたＤＮＡに対して、ＤＡＮと基質が溶解しない溶剤の中で１つ以 上の物理および（または）化学反応が行われることを特徴とする請求の範囲第１ 項ないし第１７項の１つに記載の方法。
19. １９．抽出が水溶液によって行われることを特徴とする請求の範囲第１損ないし 第１８項の１つに記載の方法。
20. ２０．水溶液が無機塩、緩衝剤、キレート剤むよび抗酸化剤から選択された少な くとも１つの化合物をまた含有することができることを特徴とする請求の範囲第 １９項に記載の方法。