JP3527884B2

JP3527884B2 - 核酸の単離及び精製方法並びにその装置

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Publication number: JP3527884B2
Application number: JP2000223370A
Authority: JP
Inventors: コルパン・メチン
Original assignee: クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2004-05-17
Anticipated expiration: 2019-05-17
Also published as: JP3115324B2; DE59209997D1; EP0875271A2; DK0875271T3; DE4139664A1; DK0616639T3; WO1993011221A1; US8247545B1; JPH07501223A; DE4143639C2; EP0616639B1; JPH07501222A; US6609618B2; EP0616638B1; US20010047966A1; EP0616638A1; DE59209549D1; DE59205979D1; EP0616639A1; WO1993011218A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、プラスミド又はゲノム DNA の
ような核酸を細胞及び他の原料から単離及び精製する方
法、並びにその方法を実施するための装置に関する。

【０００２】核酸の調製においては、例えばプロテイナ
ーゼＫ及びリゾチームのような酵素；SDS 、Brij、トラ
イトン-X-100、トゥイーン 20 、及び DOCのような洗
剤；並びに水酸化ナトリウム、塩酸グアニジン、及びグ
アニジンイソチオシアネートのような化学物質を用いて
最初に細胞を消化(digestion)しなければならない。実
験者は、核酸を精製する前に細胞の破片を除去して、そ
の後細胞溶解物から核酸又は核酸分画を単離するという
問題に直面する。

【０００３】さらに、プラスミド DNA 又はゲノム DNA
を調製する際には、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)のよ
うな使用頻度の高い洗剤は除去する必要がある。SDS を
使用する場合のほとんどにおいて、SDS カリウム塩が水
溶性に乏しいことから酢酸カリウムでの沈殿によりこの
除去が行われる。その後、細胞の破片が沈殿したSDSと
共に遠心分離される。該溶解物中の成分が非常に大量か
つ泥状のゲル様ペレットを作りだすために、当該破片の
除去は高速遠心分離においても困難である。通常、細胞
破片の除去は 5,000 g〜 20,000 g で15〜 60 分間遠心
分離をすることにより行われる。この方法は、非常に多
くの時間と労力の投入を必要とし、自動化できないとい
う欠点を持つ。

【０００４】DE-A-36 39 949は、長鎖核酸でない体液の
成分と同様に、体液だけでなく、バクテリア、ウィル
ス、動物及び植物の組織及び細胞からのその他の物質、
特に細胞成分及び／又はそれらの分解産物からの長鎖核
酸の単離及び精製の方法を開示している。ここでは、緩
やかな消化並びに細胞破片及び他の不溶性成分の除去に
次いで、長鎖核酸が陰イオン交換体に固定され、一方分
離すべき物質は洗い出される。その後、固定された核酸
を高イオン強度のバッファーを用いてマトリックスから
除去する。

【０００５】DE-A 37 17 211から、核酸のような生体ポ
リマーの分離及び精製の方法が知られており、それにお
いて核酸は特殊な装置中に配置されたマトリックスに吸
着される。ここでは、バッファー条件は核酸が優先的に
吸着され、蛋白、低分子量物質又は細胞破片のような邪
魔な物質は結合しないように調整される。

【０００６】“核酸の単離、分画化及びハイブリダイゼ
ーション”；概論及び方法解説（ウルリッヒ・ボビス
(Ulrich Wobis) 編、フェルラーク・ケミエ、1980年）
に、核酸の単離方法が記載されている。それによると、
高分子量のリボ核酸は＞1.5 M塩化ナトリウムの塩溶液
には不溶性であり沈殿する。しかしながら、そのような
沈殿では有効と考えられないために、この研究論文では
高い塩濃度を用いた沈殿処理を複数回反復することが勧
められている。

【０００７】DNA 制限断片及びポリメラーゼ連鎖反応の
増幅産物の両方の効果的な分離が、J.Chromatogr., 512
巻, 433-444 頁, 1990年、に述べられている。クロマト
グラフィー部材として、 2.5μm サイズの非多孔質粒子
を有するイオン交換体 DEADNPR 部材が使用されてい
る。

【０００８】Biochemistry, 4848頁, 1972年、により、
酵母からの核酸がポリ-L-リジンでコーティングされた
珪藻土で分離されている。同様に、ミトコンドリアDNA
がこのようなクロマトグラフィー部材で分離されてい
る。

【０００９】Chromatographia, 19 巻, 236-9 頁, 1984
年、に、予備スケールでの合成オリゴデオキシリボヌク
レオチドの単離における多次元クロマトグラフィーの使
用が述べられている。ここでは、最初の処理としてセフ
ァデックス G-15 によるサイズ排除(size exclusion)ク
ロマトグラフィーを行い、次いで HPLC イオン交換体カ
ラム（パーティシル-10 SAX)を用いたサイズ排除クロマ
トグラフィーを行う。この後、 HPLC （ヌクレオシル C
18) を用いた疎水性クロマトグラフィーを行う。

【００１０】J. Biochem., 94 巻, 163-169 頁, 1983
年、は核酸の吸着クロマトグラフィー精製を行うための
疎水性コーティングされたガラス粒子の適合性について
報告している。

【００１１】従来のこの代用技術の欠点は、細胞溶解物
からの細胞断片及び不溶性成分を除去するために遠心分
離処理が必要であるという事実にある。もう一つの問題
は、高イオン強度のバッファーで溶出するために高濃度
に存在する塩類から核酸を回収して同時に濃縮しなけれ
ばならないことである。ほとんどの場合、こうして得ら
れた核酸のその後の処理操作は低イオン強度のバッファ
ー条件でのみ可能である。バッファー中に高濃度に溶解
している塩類の除去は透析によって行うこともできる
が、この処理は対応する試料中の核酸の著しい分解を招
く。

【００１２】透析に続いて、脱塩した核酸を凍結乾燥に
よって濃縮しなければならない。濃縮の他の方法はエタ
ノール、イソプロパノール、ポリ（エチレングリコー
ル)(PEG)で核酸を沈殿させることによる。核酸はこの系
に不溶性であり沈殿する。しかしながら、沈殿した核酸
を遠心分離処理によってペレット化しなければならな
い。核酸ペレットは一旦乾燥させた後、非常に低塩濃度
の低容量バッファーに溶解して無塩濃縮核酸試料を得
る。このような遠心分離及び沈殿方法では、核酸の簡単
且つ迅速な回収は不可能であり、自動化も達成困難であ
る。一方、いずれの場合も大量の試料を処理しなければ
ならない臨床診断術及びヒトゲノム配列決定における分
子生物学の進歩によって、核酸を調製するための簡単且
つ自動的な処理の必要性が増大しつつある。

【００１３】本発明が基本とする技術的課題は、細胞溶
解物中の細胞断片又は不溶性成分を除去するための遠心
分離処理の必要性がなく、さらにその後に核酸を脱塩及
び濃縮処理しなければならないような高塩濃度のバッフ
ァー系中に核酸を得ることなく、核酸を単離及び精製で
きる方法を提供することにある。実質的には、提供され
る方法によりその後の処理に直接かけることができる条
件にある核酸が供給される。上記の技術的課題の他の重
要な一面は、該方法を特に有利な様式で該方法を実施す
ることができる装置を製造することである。

【００１４】本発明が基本とする技術的課題は、請求項
１及び３に記載の構成を特徴とする方法により驚くほど
簡単な様式で解決される。方法に関する後読の請求項は
本発明の方法の好ましい態様に関するものである。

【００１５】特に有利な様式で本発明の方法を実施する
ことができる装置は、請求項２及び４に記載の構成を特
徴とする。それに関連した従属請求項は、本発明の装置
のさらに好ましい態様に関するものである。

【００１６】最初に、それから核酸を単離する細胞を通
常の様式で消化し、細胞の破片を除去する。これは濾過
又は遠心分離によって行ってもよい。好ましくは、回収
は段階的又はアシンメトリーに作られたフィルター層で
濾過することにより行う。核酸を含む濾液を直ちに陰イ
オン交換体で処理してもよい。

【００１７】陰イオン交換体としては、単離すべき核酸
が各々の調製条件下で結合できるような市販の部材を選
択してもよい。好ましくは、例えば DEAE セファロース
(登録商標)、Q セファロース(登録商標)、DEAEセファデ
ックス(登録商標)、 DEAEトヨパール(登録商標)、アン
バーライト(登録商標)、ヌクレオゲン(登録商標)、キア
ゲン(登録商標)のような、好ましくはアガロース、デキ
ストラン、セルロース、アクリルアミド、ポリ(ビニル
アルコール)、ポリスチレン、ガラス、酸化アルミニウ
ム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、又はシリカゲ
ルから成るマトリックスでできている表面改質された担
体である。

【００１８】該陰イオン交換体は、相互作用に適した高
容量内部表面を持つ多孔質担体部材であるか、又は混合
物と相互作用して外部表面上でのみ分離する非多孔質担
体部材でもよい。特に好ましくは、該陰イオン交換体は
シリカゲルを基材とし、粒子径が１〜 250μm 、好まし
くは10〜50μm 、特に好ましくは15〜25μm であり、ポ
アの直径が１〜 2,500 nm 、好ましくは10〜 500 nm 、
特に好ましくは 100〜400nmである部材である。特に、
陰イオン交換体部材が高い表面電荷及び核酸に対する高
い結合能力を持つ部材であることが立証されている。好
ましくは、シリカゲル改質は、例えば EP-A 83 901 06
5、DE-A-39 35 098及び US-A-5,057,426に開示されてい
るように担体部材をシラン化することにより行われる。
EP-A 83901 065 では、例えば、γ- グリシジルオキシ
プロピルトリメトキシシラン及びN,N-ジメチルアミノエ
タノールが担体部材の改質に使用される。

【００１９】核酸の吸着は、一般的に低塩濃度で存在す
るような条件下で行われる。好ましくは、これらは核酸
をカラムから溶出させるものよりも低い塩濃度である。
ここでは、イオン交換体部材及び使用するpHに応じて、
該塩濃度は 0.25 〜1.5Mでよい。

【００２０】陰イオン交換体部材への核酸の吸着に続い
て、低イオン強度のバッファーを用いて最低一回の洗浄
処理を行ってもよい。ここでは、好ましくは、イオン交
換体部材を主に円筒形の中空体のカラムに入れる。その
後、カラムを可能な限り高いイオン強度の塩溶液で洗浄
するが、核酸は溶出されない。それにより、低分子量及
び電荷の弱い不純物及び蛋白が洗い出される。

【００２１】収量の不必要な損失を避けるために、吸着
処理及び溶出処理の間に各々の吸着部材の状態調節(con
ditioning)を行うか、又は特に高塩濃度条件下での核酸
の吸着を後に行おうとする領域において、最終の洗浄処
理として可能な限り高いイオン強度を実現すると都合が
よいであろう。特に、この目的において、pH が約５で
イオン強度が約 1.5 Mの過塩素酸ナトリウムに対応する
平衡化及び状態調節用の溶液を使用してもよい。

【００２２】対応して、高イオン強度の条件下で核酸を
結合させる部材を、別の主に円筒形の中空体に入れる。
イオン交換部材から脱着されて高塩濃度分画中にある核
酸分画を、高塩濃度条件下で核酸を吸着する部材の入っ
たカートリッジ又はカラム中に入れる。好ましい態様に
おいて、陰イオン交換体の入った容器が高塩濃度条件下
で核酸を吸着する部材の入った容器の上に配置されるよ
うに、各装置を対応する吸着部材に合わせる。

【００２３】特に、高イオン強度で核酸を吸着すること
ができる部材の状態調節は、そのような処理方法により
容易に行うことができる。高イオン強度で核酸に結合す
ることができる部材を、対応する高濃度の塩溶液で前処
理することにより状態調節を前もって行ってもよい。し
かしながら、例えば、核酸を吸着する部材を高イオン強
度の塩溶液で初めに処理し、その結果、水溶液がそれに
接触すると直ちに非常に高い塩濃度が生じて高イオン強
度下で該部材を核酸を吸着させるように、適当に前処理
した部材を使用することも可能である。陰イオン交換体
からの核酸の溶出により該部材から分離する最初の容量
が、十分な強度で次の部材に吸着させるには低すぎる塩
濃度となることが実際にあり得るために、状態調節は有
利である。そこで、比較的薄い溶出液滴が、上記のよう
に状態調節した、高イオン強度の条件下で核酸に結合す
ることができる部材に接触するに至った場合、高い塩濃
度が即座に得られ核酸がこの部材に吸着されるであろ
う。

【００２４】その後、核酸を高イオン強度の溶出バッフ
ァーで無機質担体に直ちに結合させるために、高イオン
強度のバッファーを用いて陰イオン交換体部材から該核
酸を脱着させてもよい。ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸
ナトリウムのようなカオトロピック(chaotropic)塩の存
在下では、微細ガラス又はシリカゲルの懸濁液を核酸に
加え、核酸がシリカゲルに結合できるように長時間イン
キュベーションを行った場合、核酸が微細粉砕ガラス又
はシリカゲルに結合することもある（B.フォーゲルステ
イン及びD.ギレスピー (B. Vogelstein and D. Gillesp
ia）：アガロースからの DNAの分取及び分析用精製：Pr
oc. Nat. Acad. Sci., U.S.A.,76巻, 615-19頁，1979
年；R.ヤン、J.リス及びB.ウ (R.Yang, J. Lis and B.
Wu):ゲル電気泳動後のアガロースからの DNAの溶出：Me
thods Enzymol., 65巻,176-182頁,1979 年；M.A.マル
コ、R.チッパーフィールド及び H.C. ビルンボイム (M.
A.Marko, R.Chipperfield and H.C. Birnboim) ：アル
カリ抽出及びガラスパウダーへの結合を用いた高度精製
プラスミドDNA の大量単離法：Anal. Biochem.,121巻,3
82-387 頁, 1982年）。

【００２５】驚くべきことに、核酸の無機質担体への吸
着は試料に低級アルコールを加えることによっても行う
ことができる。好ましくは、メタノール、エタノール、
プロパノール、イソプロパノール、及びブタノールが可
能である。試料に加えるアルコールの量の好ましい範囲
は、１- 50 % (v/v)の水に溶ける限りの範囲である。さ
らに、核酸の吸着はポリ（エチレングリコール）類を用
いて行うこともできる。使用できるエチレングリコール
は 1,000〜 100,000、とりわけ 6,000〜 8,000の分子量
を持つものである。ポリ（エチレングリコール）の添加
は試料の1-30 %の範囲でもよい。

【００２６】驚くべきことに本発明の方法は、核酸がガ
ラス又はシリカゲルの非常に薄い層を通過する際に、滞
留時間がわずか 1-30 s（秒）であるにもかかわらず、
効率よく吸着されることを示している。同様に、結合が
高濃度の塩化ナトリウム及び塩化リチウム中で起きるこ
と、及びカオトロピック塩は必要でないことが見られ
る。さらに、陰イオン交換体が核酸の精製に役立ち、0.
25 〜1.5 M の塩濃度で代謝物質、蛋白及び RNAの一
部、並びにポリサッカライド類のような不純物が除去さ
れて、これらは所定の条件下では下流のシリカゲル層に
吸着することができず、次の段階としてシリカゲル層へ
の核酸の吸着を可能にする十分に高い塩濃度で核酸が陰
イオン交換体から溶出される際に、該シリカゲル層が脱
塩及び濃縮の目的を果たすような、陰イオン交換体及び
シリカゲルの組み合わせはこれまでに述べられていな
い。

【００２７】無機質担体への吸着処理においては、表中
に示す濃度のバッファー塩を用いることができる。

【００２８】

【表１】

【００２９】塩溶液での処理は、フィルター上への滴下
及び吸水によって簡単に行ってもよい。好ましい態様に
おいては、該シリカゲル層を pH 6.5 〜 8.5、とりわけ
pH７〜８の過塩素酸溶液で処理する。便宜的には、こ
れをピペッティング及び吸水によって行う。特にこの目
的において好ましいのは、４〜８M のNaClO₄、５〜20mM
の Tris-HCl 、pH７-８、及び 0.5〜２mM のEDTAを含
む溶液の使用である。カオトロピック溶液、とりわけ過
塩素酸ナトリウム溶液の除去に続いて、再洗浄を好まし
くはエタノール、例えば 50-90 ％エタノールを用いて
行う。

【００３０】フィルターが一旦乾燥すれば、溶出は、例
えば Anal. Biochem., 101巻, 339-341 頁, 1980年, に
述べられているような塩の希釈水溶液を用いて通常の様
式で行われる。好ましい溶出液は、0.05〜 0.2 mM の E
DTA を含む 0.5-2 mM Tris-HCl, pH７-８,であり、以後
TE と呼ぶ。それ以外の適当な溶出液として、例えば、
0.1% SDSのような洗剤の希釈溶液があるが、TEほど好ま
しくはない。

【００３１】シリカゲル以外に、他の無機質担体も核酸
の吸着に適当であることが見出だされた。しかしなが
ら、好ましい態様においては、１〜 250μm 、好ましく
は１〜50μm 、特に１〜５μm の粒子径のシリカゲルが
使用される。脱塩層を、二個のPE フリットの間に挟ま
れた粗く充填された層として抽出カラム中に使用しても
よい。別の態様には、EP-0 323 055 (12/07/1988、3M、
コンポジション・クロマトグラフィック・アーティク
ル）による膜の形態の無機質担体の適用が含まれる。

【００３２】本発明の方法を用いて、非常に多様な由来
の核酸を、該核酸がバクテリア、細胞培養物、血液、組
織、尿、ウィルスに由来するものであるかどうか、又は
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、SSSR（自立配列複
製）、リガーゼ連鎖反応、及び類似の反応のような増幅
反応に由来するものであるかどうかにかかわらず、或い
はビオチンラベル、蛍光ラベル、放射性ラベル等のラベ
ル化核酸が関係するかどうかにかかわらず、分離及び調
製することができる。該核酸が 10 ヌクレオチドから 2
00,000ヌクレオチドの範囲のサイズであれば可能であ
る。本発明で意味する核酸とは、10〜100 ヌクレオチド
のオリゴヌクレオチド、50〜25,000ヌクレオチドの RN
A、2,500 〜25,000塩基対のプラスミド DNA、 5,000〜
60,000 塩基対のコスミド DNA、又は 100〜200,000 塩
基対のゲノム DNAと理解される。

【００３３】本発明の方法のステップd) により得られ
た核酸分画は、低塩負荷の溶液として得られる。従って
続いて、その後の処理に必要なバッファー条件の調整が
可能である。特に便利な様式を取れば、シリカガラスに
結合した核酸はその後の処理用に設定されたバッファー
中にすでに溶出されている。

【００３４】単離された核酸は非常に多様な用途に用い
られる。特に度々用いられるのは、制限分析、配列決
定、放射性物質又はビオチン、FITC、ジゴキシゲニンの
ような非放射性マーカーによるラベル化、並びに PCR、
SSSR、及びリガーゼ連鎖反応を用いた増幅を行うための
制限酵素、ポリメラーゼ、及びリガーゼを用いた酵素反
応を行う場合においてである。

【００３５】本発明の方法はプラスミドDNA 及びゲノム
DNA の単離及び調製において特に適している。

【００３６】添付の図面は、核酸用の多様な吸着部材が
一装置に組み合わされた、本発明の装置の好ましい態様
を図解している。

【００３７】図１は、本発明の方法を実施するための装
置を示しており、入口開口部７及び出口開口部８を持つ
中空体１から成る。好ましくは、該中空体はポリプロピ
レン(PP)、ポリエチレン(PE)、ポリ(メチルメタクリレ
ート)(PMMA)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポ
リ(エチルテレフタレート)(PET)、又はポリアクリロニ
トリル(PAN)から成る。

【００３８】中空体１の中には、固定具５及び６の間に
無機質担体部材である第一の粉末部材 10 が配置されて
いる。中空体１の中の、第一の部材 10 及び出口開口部
８の間に無機質担体部材である第二の粉末部材 11 が置
かれている。第一及び第二の部材 10 及び 11 は核酸に
対して異なる吸着特性を持つ。吸着特性の差は、それぞ
れ、高イオン強度及び低イオン強度のバッファーにおけ
る異なる吸着作用により決定されている。例えば、低イ
オン強度の条件下で第一の部材 10 に核酸が吸着される
場合、第二の部材 11 は低イオン強度のバッファー条件
下では核酸を容易に通過させることができなくてはなら
ず、一方高イオン強度の条件下では、核酸は第一の部材
10 から脱着されて、第二の部材 11 に吸着されること
になる。

【００３９】好ましくは、第一の粉末部材 10 はアガロ
ース、デキストラン類、セルロース、アクリルアミド、
ポリ（ビニルアルコール）、ポリスチレン、ガラス、酸
化アルミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、
又はシリカゲルを基材として表面改質された担体の陰イ
オン交換体、特にシリカゲルを基材とする上記の型の陰
イオン交換体から成る。好ましい該塩基性イオン交換体
は、10〜40μm 、とりわけ15〜25μm 、特に15〜25μm
の粒子径を持ち、孔の直径が１〜 2,500 nm 、好ましく
は10〜 500 nm 、とりわけ 200〜 400nmである。

【００４０】第二の部材 11 は無機質担体部材であり、
とりわけシリカゲル、ガラス、ゼオライト、酸化アルミ
ニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリ
ン、珪藻土、好ましくはシリカガラスから成り、シリカ
ゲル懸濁液の形態を取ってもよい。第二の部材 11 は、
好ましくは１〜 250μm 、とりわけ１〜30μm の粒子径
を持ち、１〜５μm が好ましい。

【００４１】好ましくは、装置５及び６は焼結ガラス
（フリット類）；ポリエチレン、PTFE、ポリプロピレ
ン、ガラス、セラミックス、ナイロンのようなプラスチ
ック膜；又はポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン
でできた不織布から成る。好ましくは、装置５及び６の
気孔率(porosity)は 10 〜 500μm である。

【００４２】本発明の装置の別の好ましい態様を、図２
に図解する。ここでは、第一の部材10 及び第二の部材
11 は中空体１の中に、部材 10 及び 11 が直接隣接
し、即ち固定具５及び６によって一緒に固定されている
別々の層となるように配置されている。好ましくは、該
部材は分離具13により分離されており、当該分離具13は
多孔性の枠であり、好ましくは焼結ガラス、又はプラス
チック膜或いは好ましくはナイロン製のティッシュでで
きている。

【００４３】図３は本発明の装置の別の好ましい態様を
図解するもので、第二の部材 11 がチャンネルを形成す
る出口開口部 18 の中の固定具５及び15の間に固定され
ている。チャンネルを形成する出口開口部 18 は、中空
体１よりも小さな横断面を持ち、好ましくはチャンネル
18a で終わり、チャンネル18a の直径はチャンネル18の
直径よりも小さい。第一の部材 10 は中空体１の内部の
直径の長い領域に置かれ、装置６及び 16 により固定さ
れる。ここでは、第一及び第二の部材 10 及び 11 を隣
接させると、共通の手段 17 だけによって分離できるの
で都合がよいと考えられる（図４参照）。

【００４４】図５は本発明の装置の別の好ましい態様を
示しており、第一及び第二の部材10及び 11 の層の他
に、第一の部材 10 の上に配置された別の層 12 を中空
体の中に持つ。層 12 は機械的フィルター手段として設
計されている。好ましくは、第三の層 12 は、フィルタ
ーポア径が試料の流れる方向、即ち供給口７から出口開
口部８又は 18 の方向に小さくなるアシンメトリーなフ
ィルターである。それにより、装置を目詰まりさせる恐
れもなく試料中の細胞破片を除去することができる。

【００４５】本発明の装置の全ての態様において、部材
10 及び 11 のいずれも粉末形態でもよく、又は成形体
に設計されていてもよい。部材 10 及び 11 が粒子の形
態で存在する場合は、該層が US-PS 4,810,381及び US-
PS 4,699,717による膜であって DE 41 27 276 に提示さ
れているような形態で存在するように、それらを不活性
プラスチックのサポーティングネット中に埋封すること
が勧められるであろう。該サポーティングネットはテフ
ロン（登録商標）製でもよい。

【００４６】図６は本発明の装置の他の好ましい態様を
示しており、それにおいては８個の独立した別々の図２
の装置が互いに隣接して、８個で１ユニットを形成して
いる。図１−５に述べた個々の態様のいずれで実現して
もよいこの態様の利点は、マルチチャンネルピペットを
補助器具とする８試料の同時調製を基本とする。同様
に、この設計は 12 列形態に製造することもでき、それ
により 96 試料が処理可能となる。国際標準化微量滴定
フォーマットを用いる場合に非常に有利である。

【００４７】図７は、入口開口部７及び出口開口部８、
並びに二個の手段６及び５の間に固定された陰イオン交
換体部材 10 を有する円筒形中空体１を含む装置を示し
ている。その上に、内部に種々のフィルター層が配置さ
れている別の円筒形中空体が装着されている。フィルタ
ー層 20 、21、22は、焼結されたポリエチレン、ポリプ
ロピレン、PTFE、ガラス、シリカゲル、酸化アルミニウ
ム又は圧縮珪藻土、例えばセライト又はシリカゲルから
できていてもよい。もっとも、その他にポリプロピレ
ン、ポリエステル、ガラス繊維、及びシリカの織フリー
ス又は不織フリースも可能である。好ましくは、個々の
層の気孔率は15〜 500μm で、厚さは 0.1〜 10 mmであ
る。該フィルター層のポア径は、流れの方向に見て、順
に小さくなる。典型的な態様では、層 20 におけるポア
径はおよそ 100〜 300μm で、層21では 30 〜 100μm
、第三のフィルター層では５〜 30 μm である。

【００４８】図８は、図７の装置の別の好ましい態様を
図解しており、流れの方向に見て一番上のフィルター層
23 として疎水性の層が挿入されている。該疎水性中間
層 23 は、実際の濾過が開始される以前のフィルター層
中への望ましくない粗細胞溶解物の侵入を防ぐ。好まし
くは、疎水性中間層 23 は、気孔率が 10 〜 500μm
で、好ましくは厚さが 0.1〜５mmの、紡績又は焼結され
たポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル又はポ
リテトラフルオロエチレン(PTFE)繊維から成る。

【００４９】図９は、図７及び８に述べたものと類似の
設計の濾過装置を示しており、異なる点は、ポア径が小
さくなっていく種々のフィルター層が、連続的にポア径
が小さくなっていく単一のフィルター層 12 に合わせら
れていることにある。好ましくは、該アシンメトリック
フィルター層 12 の流れの方向に見て上面に疎水性フィ
ルター 23 が備えられる。好ましくは、該アシンメトリ
ックフィルター層 12は紡績ポリプロピレン又はポリエ
ステル繊維から成る。市販のものには、例えば、パル・
フィルターテクニク社（ドライアイヒ、フランクフル
ト）の、気孔率の段階的変化が 500から 50 μm のも
の、100 から 10 μm のもの、50から５μmのもの、及
び 10 から 0.1μm のものがある。好ましくは、該アシ
ンメトリックフィルター層の厚さは１〜 10 mmがよい。

【００５０】図10は、本発明で意味するところの核酸の
分離を行うための濾過装置を示しており、ここでは図９
のフィルター配置が再び使用され、アシンメトリックフ
ィルターに疎水性フィルター層 23 が備えられている。
陰イオン交換体 10 の代わりに、高濃度の塩溶液におい
て核酸を吸着することができる無機質担体 11 を中空体
１の中に置く。

【００５１】図11は、図９及び10を組み合わせた配置を
示す。ここでは、適当に設計されたカートリッジを挿入
するなどにより、アシンメトリックフィルター 12 及び
疎水性フィルター層 23 から成るフィルターヘッドが図
２に示した装置に単に備えられただけである。

【００５２】図１から５、及び図７から11により詳しく
述べられている個々の装置は全て、８列の単一の装置か
ら成る微量滴定ストリップに配置してもよい。これは、
図12から14に、もう一度例示してある。

【００５３】図12は、陰イオン交換体、微量滴定ストリ
ップ、又は８及び／又は８×12ウェルの微量滴定プレー
トを含む濾過装置を図解している。図12の装置において
は、装置５及び６の間に固定された陰イオン交換体層を
含む円筒形中空体１の上の、装着式カートリッジの中に
アシンメトリーの濾過装置が置かれている。

【００５４】図13は、陰イオン交換体部材の代わりに、
高塩濃度において核酸を吸着することができる無機質担
体部材を有する濾過装置に関する。好ましくはシリカゲ
ル層11 が、５及び６の二装置の間に配置されている。

【００５５】図14は、図２の配置、及び試料が流れる方
向に見て中空体１の上に置かれた疎水フィルター層を伴
うアシンメトリックフィルター層の組み合わせを図解し
ている。

【００５６】本発明の装置、特に図３又は４で詳細に検
討した装置は、非常に少量の液体を用いても第二の部材
からの核酸の溶出が確実になされることにおいて特に有
利である。

【００５７】基本的には、試料の本発明の装置中の流動
は重力によってなされるが、核酸の精製及び分離を促進
するために、開口部７を加圧するか、又は開口部８若し
くは18を減圧してもよい。本発明の装置の他の好ましい
態様では、アシンメトリックフィルターとして、該中空
体の中を試料が流れる方向にポア径が小さくなる焼結ガ
ラス、又はポア径が小さくなるプラスチック膜の積層か
らできているものを使用する。

【００５８】細胞及び他の原料からの核酸を、遠心分
離、フェノール／クロロホルム抽出、及びアルコール沈
殿をすることなく得ることができ、該処理の終了に際し
て核酸は水又は低塩濃度のバッファー中に濃縮された形
態で存在し、従って、直接その後の酵素反応に使用でき
る。別の利点は、高価な実験装置の使用を避けられるこ
とにある。例えば、溶出は重力によって行うことがで
き、いわゆる HPLC 装置により行う必要がない。

【００５９】好ましくは、シリカゲル陰イオン交換体／
シリカゲル抽出カラムの調製は、50μm の底部ポリエチ
レンフリット（ポリエチレン製の多孔質フィルター層、
厚さ1.5 mm)を持つ市販の 1.5 ml 遠心管の中にポリプ
ロピレン管をぴったりと封入し、50 mg のシリカゲル
（リクロスファー Si 100 、16-24 μm ；メルク、ダー
ムスタット、ドイツ）を積層させることにより行うこと
ができる。このシリカゲル層を第二の多孔質ポリエチレ
ンフリットでシールし、第二のフリットに 100mgのシリ
カゲル陰イオン交換体（キアゲン、ヂアゲン社、デュッ
セルドルフ、ドイツ）、粒子径 16 〜 23 μm 、を積層
させ、最後に第三の多孔質ポリエチレンフリットでシー
ルする。

【００６０】好ましくは、アガロース陰イオン交換体／
シリカゲル抽出カラムの調製は、50μm のポリエチレン
フリット（PE製の多孔質フィルター層、厚さ 1.5 mm)で
ポリプロピレン管の底部をシールし、50 mgのシリカゲ
ル（リクロスファー Si 100、16-24 μm ；メルク、ダ
ームスタット、ドイツ）を積層させることにより行うこ
とができる。このシリカゲル層を第二の多孔質ポリエチ
レンフリットでシールし、第二のフリットに0.5 mlの D
EAE セファロース FF(ファルマシア社、フロイバーグ、
ドイツ）、粒子径 45 〜 165μm 、を積層させ、最後に
第三の多孔質ポリエチレンフリットでシールする。

【００６１】好ましくは、図３の陰イオン交換体膜／シ
リカゲル膜抽出カラムの調製は、ポリプロピレン管の中
のポリエチレンフリットの上に、厚さが 1 mm のエムポ
アＲシリカゲル膜(３)(3M社、セント・ポール、MN、U.
S.A.) 、厚さが 0.2 mm のポリプロピレンフリース、及
び 16-23μm のキアゲン陰イオン交換体粒子（ヂアゲン
社、デュッセルドルフ、ドイツ）から成る厚さが 1 mm
の陰イオン交換体膜を置くことにより行うことができ
る。

【００６２】陰イオン交換体／シリカゲル微量滴定スト
リップ抽出カラムの調製は、以下のように行うことがで
きる。

【００６３】８又は96の位置を持つ微量滴定ストリップ
に DEAE シリカゲル膜及びシリカゲル膜を装填する。微
量滴定ストリップのボーリングの中に、シデント９シリ
カゲル粒子（デグサ社、フランクフルト、ドイツ）でで
きている厚さが 0.75 mmのシリカゲル膜、厚さが 0.2 m
m のポリプロピレンフリース層、及び 16-23μm のキア
ゲン（ヂアゲン社、デュッセルドルフ、ドイツ）ででき
ている厚さが 0.8 mmの陰イオン交換体膜を固定させ
る。

【００６４】以下の実施例により本発明をさらに説明す
る。

【００６５】実施例１プラスミド DNAの調製 pUC 18- 形質転換 HB 101 大腸菌細胞を含む LB アンピ
シリン培地による培養物 100 ml を 5,000 gで 10 分間
遠心分離する。該細胞ペレットを 10 mlの 50mM Tris-H
Cl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 及び 100μg/ml RNase Aに再
懸濁する。

【００６６】細胞を溶解するために、10 ml の 0.2 M N
aOH 及び 1% SDS を細胞懸濁液に加え、注意深く攪拌
し、５分間室温に置く。これを、10mlの 3M 酢酸カリウ
ム及び2 M 酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で 15
分間インキュベートする。該溶解物を 15,000 g で 30
分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。澄んだ細胞
溶解物 1 ml をピペットで DEAE 陰イオン交換体／シリ
カゲル遠心分離抽出カラム上に載せ、該試料を 2,500 g
で１分間遠心分離してイオン交換体層を通過させる。該
抽出カラムを、0.8 mlの 1 M NaCl, 15% エタノール、5
0 mM MOPS, pH7.0、及び 15 %エタノール、10 mM 酢酸
ナトリウム,pH7.0、及び 0.8mlの 1 M NaClO₄ で洗浄し
て RNA及び蛋白を除去する。DNA を 7 M NaClO₄, 15%
エタノール、10mM酢酸ナトリウム, pH 7.0で溶出し、そ
れによりシリカゲル層に直接結合させる。該抽出カラム
を、0.8 mlの 70% エタノール、100mM NaCl, 10 mM 酢
酸ナトリウム, pH 7.0 、及び 0.8 ml の 90% エタノ
ール／水で洗浄する。場合により、痕跡量のエタノール
をさらに遠心分離して除去する。続いて、50μl の10mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0を用いて DNAを遠心分離
により溶出し、別の 1.5 ml 試験管に回収する。溶出さ
れた DNAはその後、例えば制限処理、ラベル化、配列決
定、又は増幅のような酵素反応に直接使用することがで
きる。

【００６７】実施例２プラスミド DNAの同時調製８ DEAE シリカゲル膜／シリカゲル抽出カラムを減圧チ
ャンバー上に装着する。プラスミド DNAを含む各々 1 m
l ×８の細胞溶解物を、減圧（2×10³−7.5×10⁴Pa(20
〜 750 mb))吸引により該抽出カラムを通過させる。該
抽出カラムを0.8mlの 1 M NaCl, 15% エタノール、50 m
M MOPS, pH 7.0、及び15% エタノール、10 mM 酢酸ナト
リウム, pH 7.0、及び 0.8 ml の 1 M NaClO₄ で洗浄し
て RNA及び蛋白を除去する。DNA を 7 M NaClO₄, 15%
エタノール、10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0で該陰イオ
ン交換体層から溶出し、それによりシリカゲル層に直接
結合させる。該抽出カラムを、0.8 mlの 70% エタノー
ル、100 mM NaCl, 10 mM酢酸ナトリウム, pH 7.0及び
0.8 ml の 90% エタノール／水で洗浄する。高濃度の塩
溶液を除去するために、該サンプル管を、0.8 mlの 70%
エタノール、100mMNaCl, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH
7.0、及び0.8 mlの 90% エタノール／水で洗浄する。該
抽出層中に残存するエタノール／H₂O を、減圧吸引して
空気を 1-2分間通すことにより蒸発させる。続いて、該
８試料を50μl の 1mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 8.0
で溶出する。

【００６８】実施例３ M13一本鎖 DNAの調製 1 mlの M13ファージ懸濁液に 0.5 ml の 30% PEG 6000,
1.5 M NaCl を加え、氷上で 10 分間インキュベート
し、これを 15,000 g で 15 分間遠心分離する。ファー
ジペレットを 0.5 ml の 0.5 Mグアニジン-HCl, 1 % ト
ライトン X-100に再懸濁し、70℃で10分間溶解させる。
実施例３に従って、減圧チャンバー上の抽出カラム中に
該ファージ溶解物を吸引して通過させ、吸着させる。該
抽出カラムを 1 ml の 0.75 M NaCl, 15% エタノール、
50 mM MOPS, pH 7.0、及び 1 ml の0.75 M NaClO₄, 50
mM Tris-HCl, pH 7.0で洗浄する。DNA を該陰イオン交
換体層から 7M グアニジン,15% エタノール, 50 mM 酢
酸ナトリウム, pH 7.0で溶出し、SiO₂層に吸着させる。

【００６９】実施例４血液からのゲノムDNA の調製 1 mlのクエン酸安定化ヒト全血に、赤血球を溶解させる
ためにサポニン1 mlを加え、混合後直ちに 2,500 gで 5
分間遠心分離する。白血球を PBSバッファー 1ml に再
懸濁し、再ペレット化する。洗浄した該白血球を 1 ml
の 500 mMグアニジン-HCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDT
A, pH 8.0に再懸濁し、0.1 mlのプロテイナーゼ K (10
mg/ml) を加えて、50 ℃に２時間置き、細胞を溶解させ
る。該白血球溶解物を直ちにピペットで、アガロース／
陰イオン交換体／シリカゲル／抽出カラムに載せ、 1 m
l の 0.25 M NaCl, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0及び
1mlの 0.25 M NaClO₄, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0
で洗浄する。1 mlのクエン酸安定化ヒト全血を、陰イオ
ン交換体／シリカゲルカラム中を減圧吸引して通過させ
る。それにより、白血球はマトリックス中に取り込ま
れ、一方実質的により小さな赤血球はマトリックス中を
移動する。

【００７０】該抽出カラムを 1 ml の PBSバッファーを
用いて２回再洗浄する。取り込まれた白血球を 10%トゥ
イーン 10 を用いて室温で 15 分間溶解する。細胞断片
及び蛋白を 1 ml の 1M グアニジン-HCl, pH 7.0を用い
て洗い出し、DNA を 7M NaClO₄, 50 mM 酢酸ナトリウ
ム, pH 7.0で該カラムから溶出する。

【００７１】実施例５微量滴定フォーマットにおける DNAの調製、脱塩及び濃
縮 XL 1 Blue 大腸菌細胞中のプラスミド pBLUESCRIPTの 9
6 ×1 mlの培養物を、1.5 mlウェルを持つ微量滴定プレ
ート（ベックマン社、ミュンヘン）中の 2×YT 培地中
で、18時間、37℃で培養する。細胞を、微量滴定遠心分
離機で 2,500 gで 10 分間遠心分離してペレット化す
る。８チャンネルピペット（マトリックス・テクノロジ
ー社、ローウェル、MA、U.S.A.) を用いて、0.25mlの 5
0 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA,100 μg/ml RNAg1A を微量
滴定プレートウェル中に注入し、細胞を振動シェイカー
で５分間再懸濁させる。

【００７２】0.25 ml の 0.2 M NaOH, 1% SDS を各々に
加え、緩く振動させながら室温に５分間置き、細胞を溶
解させる。続いて、0.25 ml の 3M 酢酸カリウム, 2 M
酢酸, pH 5.5-6.0 中和用バッファーを各々に加え、各
ウェルに蓋をして密封し混合する。氷上で10分間インキ
ュベートした後、試料を 3,000 gで 30 分間遠心分離し
て、細胞断片及び SDS沈殿をペレット化する。８チャン
ネルピペットを用いて上清を注意深く取り、DEAEシリカ
ゲル膜及びシリカゲル膜を有する 96 穴微量滴定プレー
ト中に入れる。96試料全てを移した後、該濾過装置に減
圧を加えることにより試料を微量滴定プレート中に通過
させる。それにより、DNA は該陰イオン交換体層に吸着
されるが、一方蛋白、RNA 及び代謝物質はこの条件下で
は吸着されない。

【００７３】該抽出カラムを、0.8 mlの 1 M NaCl, 15%
エタノール、50 mM MOPS, pH 7.0、及び15% エタノー
ル、10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0、及び 0.8mlの 1M
NaClO₄で洗浄して RNA及び蛋白を除去する。DNA を 7 M
NaClO₄, 15% エタノール、10mM酢酸ナトリウム, pH 7.
0で溶出し、それによりシリカゲル層に直接結合させ
る。該抽出カラムを、0.8 mlの 70% エタノール、100mM
NaCl, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0 、及び 0.8 ml
の 90% エタノール／水で洗浄する。続いて、塩を含ま
ない濃縮された形態の DNAを、50μl の 1mM Tris-HCl,
0.1 mM EDTA, pH 8.0を用いて該シリカゲル層から別の
微量滴定プレート中に溶出する。

【００７４】遠心分離の補助が必要な細胞溶解物の調製
は時間と費用のかさむ処理である。主として、日常的に
多くの試料を調製しなければならない場合に制約が生ま
れる。遠心分離には自動化できないという欠点がある。

【００７５】本発明の他の対象物（及び方法）は、該方
法を遠心分離を行わずに自動的に稼働させるための、核
酸が実際に精製されるところよりも上流にある濾過ユニ
ットの形態を取る装置及び方法である。

【００７６】ここでは、試料をプロテイナーゼ、洗剤及
び／又は温度又はアルカリを用いて周知の方法により溶
解する。この粗溶解物を、濾過ヘッド上に直接注ぐか、
移すか、又はピペットで載せる。該濾過ヘッドのフィル
ター層は、細胞破片、沈殿蛋白又は洗剤によるフィルタ
ーの目詰まりを避けるように設計されている。該細胞溶
解物は、ピストン或いは高圧によりフィルター層を加圧
通過されるか、又は減圧により吸引されて通過する。そ
れにより、不溶性成分は全て残り、澄んだ溶解物が直接
吸着層に滴下する。適当な吸着条件を選択することによ
り、核酸が該吸着層に吸着される。フィルターケーキを
含む濾過ユニットは吸着ユニットから取り外して廃棄す
るか、又はフィルターケーキを分析するために取ってお
く。該吸着ユニットは適当な溶媒又はバッファーで再洗
浄して望ましくない成分を除去し、最後に、求める試料
が適当な溶出剤を使用して溶出される。

【００７７】本発明の方法により、例えばプラスミド D
NAを、浄化目的の遠心分離を冷蔵遠心分離機で行うこと
なく調製することができる。XL1 Blue大腸菌細胞中のプ
ラスミド pBLUESCRIPTの培養物 96 × 1 ml を、1.5 ml
ウェルを持つ微量滴定プレート（ベックマン社、ミュン
ヘン）中の 2× YT 培地中で、18時間、37℃で培養す
る。細胞を、微量滴定遠心分離機で 2,500 gで 10 分間
遠心分離してペレット化する。

【００７８】８チャンネルピペット（マトリックス・テ
クノロジー社、ローウェル、MA、U.S.A.) を用いて、0.
25 ml の 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100μg/ml RNA
g1Aを微量滴定プレートウェル中に注入し、振動シェイ
カーで５分間再懸濁させる。再懸濁した細胞を濾過ヘッ
ドのサンプルリザーバーに移し、それに 0.25 ml の0.2
m NaOH/ 1% SDS を加える。該試料を振動シェイカー上
で５分間振盪するか、又は栓或いは接着フィルムでシー
ルして混合するか、又は上下ピペッティングを繰り返し
て混合する。

【００７９】室温で５分間インキュベートして溶解させ
た後、NaOHを中和し SDSを沈殿させるために、上記の方
法のうちのひとつに従って、0.25 ml の 3M 酢酸カリウ
ム及び 2M 酢酸を加えて混合する。次に、減圧チャンバ
ー上で遠心分離する代わりに、この粗細胞溶解物を1×1
0³−8×10⁴Pa(10-800 mb)の減圧条件で吸引して濾過層
を通過させる。厚さが 2-10 mmで、200 から 5μm の範
囲のアシンメトリック又はステップワイズな多孔性を持
つフィルター層が、目詰まりすることなく細胞断片及び
他の不溶性又は沈殿性成分を保持する。プラスミド DNA
を含有する澄んだ細胞溶解物が該フィルター層を通じて
吸着層（陰イオン交換体又はシリカゲル）上に滴下し、
DNA が吸着されるが、一方蛋白、RNA 及び他の細胞代謝
物は所定の塩条件下では結合しない。濾過は約 10-60秒
後に完了する。該フィルターヘッドを取り外し、フィル
ターケーキと共に廃棄する。

【００８０】結合した DNAは 1 ml の 1 M NaCl, 15%エ
タノール、50 mM Tris-HCl, pH 7.0で１回、さらに 1.5
M NaClO₄, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 6.5で２回洗浄
し、該陰イオン交換体から 7 M NaClO₄, 15%エタノー
ル、50 mM Tris-HCl, pH 7.0で溶出し、分離層を通過し
た後、高塩濃度下で直ちにナイロンネット又は PP フリ
ースからシリカゲル層に結合される。ここにおける 1-2
M NaClO₄ では、蛋白及び RNAは該シルカゲル層には結
合しないで洗い出される。残留する痕跡量の蛋白を除去
するために、該シリカゲル層を 1 ml の 7M グアニジン
-HCl, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0で洗浄する。7 M
NaClO₄の高塩溶液は、1 mlの 70 % EtOH,100 mM NaCl,
10 mM酢酸ナトリウム, pH 7.0及び1 mlの 90% エタノー
ル／水又は1 mlの 90%アセトン／水で洗浄すると都合が
よい。乾燥させた後に、プラスミドDNA が、50μl の 1
mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.5により、無塩、且つ
濃縮された形態で溶出される。

【００８１】この方式により、遠心分離、フェノール／
クロロホルム抽出及びアルコール沈殿を行うことなく、
濃縮された形態のプラスミド DNAを非常にわずかな時間
で単離することができ、収率は 50-80 % の範囲であ
る。上記のような微量滴定プレート型を用いると、1-2
mlの大腸菌培養物によるプラスミド少量調製品(minipre
p) 96 個が一人の操作で 60 分以内に調製することがで
き、１〜10μg の DNAが得られる。これまでの周知の方
法では、６〜12時間が必要である。

【００８２】実施例６図７の装置を用いたプラスミド少量調製 LB 培地中の pUC 18 プラスミド DNAを有する XL Blue
大腸菌培養物 1.5 mlを 10,000 g で５分間遠心分離し
て、細胞をペレット化する。該細胞ペレットを0.25 ml
の 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 100μg/ml R
Nase Aに再懸濁する。細胞を溶解するために、 0.25 ml
の 0.2 M NaOH 及び 1% SDS を該細胞懸濁液に加え、注
意深く攪拌し、５分間室温に静置する。次いで、0.25 m
l の 3M酢酸カリウム及び 2M 酢酸を用いて中和し、混
合して、氷上で15分間インキュベートする。該溶解物を
図７の濾過装置に移す。該装置全体を減圧チャンバー上
に装着し、細胞溶解物を2×10³−8×10⁴Pa(20-800 mb)
で吸引して装置中を通過させる。或いは、該試料をピス
トン又は高圧を用いて濾過層中を加圧通過させてもよ
い。濾過後、濾過装置を取り外し、フィルターケーキを
細胞断片、変性蛋白及び沈殿 SDSと共に破棄する。

【００８３】該抽出カラムを、0.8 mlの 1 M NaCl, 15%
エタノール, 50 mM MOPS, pH 7.0で２回洗浄して RNA及
び蛋白を除去する。DNA を 1 ml の 1.25 M NaCl, 15%
エタノール, 50 mM Tris-HCl, pH 8.5で溶出する。脱塩
及び濃縮するために、溶出された DNAをアルコールで沈
殿させ、該アルコール沈殿物を遠心分離によりペレット
化させる。

【００８４】実施例７図８の装置を用いたプラスミド DNAの調製 LB 培地中の pUC 18 プラスミド DNAを有する XL Blue
大腸菌培養物 1.5 mlを 10,000 g で５分間遠心分離し
て、細胞をペレット化する。該細胞ペレットを0.25 ml
の 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 100μg/ml R
Nase Aに再懸濁し、濾過装置に移す。細胞を溶解するた
めに、 0.25 mlの 0.2 M NaOH 及び 1%SDS を図８の濾
過装置中の該細胞懸濁液に加え、該装置を栓又は接着フ
ィルムによりシールし、注意深く攪拌して、５分間室温
に静置する。次いで、0.25 ml の3M 酢酸カリウム及び
2M 酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で15分間イン
キュベートする。該装置全体を減圧チャンバー上に装着
し、細胞溶解物を2×10³−8×10⁴Pa(20-800 mb)で吸引
して装置中を通過させる。或いは、該試料をピストン又
は高圧を用いて濾過層中を加圧通過させてもよい。

【００８５】濾過後、濾過装置を取り外し、フィルター
ケーキを細胞断片、変性蛋白及び沈殿 SDSと共に破棄す
る。該抽出カラムを、0.8 mlの 1 M NaCl, 15%エタノー
ル、50 mM MOPS, pH 7.0で２回洗浄して RNA及び蛋白を
除去する。DNA を 1 ml の 1.25 M NaCl, 15% エタノー
ル、50 mM Tris-HCl, pH 8.5 で溶出する。脱塩及び濃
縮するために、溶出された DNAをアルコールで沈殿さ
せ、該アルコール沈殿物を遠心分離によりペレット化さ
せる。

【００８６】実施例８図10の装置を用いたシリカゲル層におけるプラスミド D
NAの調製 LB 培地中の pUC 18 プラスミド DNAを有する XL Blue
大腸菌培養物 1.5 mlを 10,000 g で５分間遠心分離し
て、細胞をペレット化する。該細胞ペレットを0.25 ml
の 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 100μg/ml R
Nase Aに再懸濁し、濾過装置に移す。細胞を溶解するた
めに、 0.25 mlの 0.2 M NaOH 及び 1%SDS を濾過装置
中の該細胞懸濁液に加え、該装置を栓又は接着フィルム
によりシールし、注意深く攪拌して、５分間室温に静置
する。次いで、0.5 mlの 5.5 Mグアニジン-HCl, 0.25 M
酢酸カリウム, pH 5.5を用いて中和し、混合して、氷
上で15分間インキュベートする。

【００８７】図10の装置全体を減圧チャンバー上に装着
し、細胞溶解物を 2×10³−8×10⁴Pa(20-800 mb)で吸引
して装置中を通過させる。或いは、該試料をピストン又
は高圧を用いて濾過層中を加圧通過させてもよい。濾過
後、濾過装置を取り外し、フィルターケーキを細胞断
片、変性蛋白及び沈殿 SDSと共に破棄する。該抽出カラ
ムを、1 mlの 7 M NaClO₄, 10 mM酢酸ナトリウム, pH
7.0で２回洗浄し、さらに 0.8 ml の 90% エタノール／
水で洗浄し、痕跡量のエタノールを吸引除去する。最後
に、DNA を 50 μl の 10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA, pH
8.0 で溶出し、別の 1.5 ml 試験管に回収する。溶出
された DNAは、例えば制限処理、ラベル化、配列決定、
又は増幅のような酵素反応に直接使用することができ
る。

【００８８】実施例９微量滴定ストリップによる８×プラスミド DNAの調製 LB 培地中の pUC 18 プラスミド DNAを有する XL Blue
大腸菌培養物 8×1.5 mlを 10,000 g で５分間遠心分離
して、細胞をペレット化する。該細胞ペレットを0.25 m
l の 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 100μg/ml
RNase Aに再懸濁し、図14の装置に移す。細胞を溶解す
るために、 0.25 mlの 0.2 M NaOH 及び1 % SDS を濾
過装置中の該細胞懸濁液に加え、該装置を栓又は接着フ
ィルムによりシールし、注意深く攪拌して、５分間室温
に静置する。

【００８９】次いで、0.25 ml の 3M 酢酸カリウム及び
2M 酢酸を加えて中和し、混合して、氷上で15分間イン
キュベートする。該装置全体を減圧チャンバー上に装着
し、細胞溶解物を 2×10³−8×10⁴Pa(20-800 mb)で吸
引して装置中を通過させる。或いは、該試料を高圧によ
り濾過層中を加圧通過させてもよい。濾過後、濾過装置
を取り外し、フィルターケーキを細胞断片、変性蛋白及
び沈殿 SDSと共に破棄する。

【００９０】該抽出カラムを、0.8 mlの 1M NaCl, 15%
エタノール, 50 mM MOPS, pH 7.0、及び 0.8 ml の1M N
aClO₄, 15%エタノール, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0
で洗浄して RNA及び蛋白を除去する。DNA を 7 M NaClO
₄, 15%エタノール, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0を用
いて陰イオン交換体層 10 から溶出し、それにより直接
シリカゲル層 11 に結合させる。該抽出カラムを、0.8
mlの 70%エタノール,100 mM NaCl, 10 mM酢酸ナトリウ
ム, pH 7.0及び 0.8 ml の 90%エタノール／水で洗浄す
る。抽出カラム中に残存するエタノール／H₂O は減圧吸
引して空気を 1-2分間通すことにより蒸発させる。続い
て、該８試料を50μl の 1mM Tris-HCl,0.1 mM EDTA, p
H 8.0で溶出する。

【００９１】実施例10 図 13 の装置を用いた８×1 mlの M13 DNAの調製８×1 mlの M13ファージ懸濁液に、0.5 mlの 30% PEG 6
000, 1.5 M NaCl を加え、これを氷上で 10 分間インキ
ュベートする。該試料を図 13 の装置に移し、ファージ
溶解物を減圧チャンバー上の図 13 の装置に直接吸引し
て通過させて濾過する。該ファージペレットを 7M グア
ニジン-HCl, pH 7.0中を吸引により通過させて溶解し、
同時に DNAをシリカゲル層 11 に吸着させる。該抽出カ
ラムを、0.8 mlの 70%エタノール, 100 mM NaCl, 10 mM
酢酸ナトリウム, pH 7.0及び 0.8ml の 70%エタノール,
100 mM NaCl, 100 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0及び 0.
8ml の 90%エタノール／水で洗浄し、吸引により空気を
1-2分間通す。最後に、DNA を 50 μl の 10 mM Tris-
HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0で溶出し、別の1.5 ml試験管に
回収する。

【００９２】溶出された DNAはその後、例えば制限処
理、ラベル化、配列決定、又は増幅のような酵素反応に
直接使用することができる。

【００９３】実施例11 図14の装置を用いた８×12プラスミド DNAの調製 LB 培地中の pUC 18 プラスミド DNAを有する XL Blue
大腸菌培養物96×1.5 mlを 2,500 gで５分間遠心分離し
て、細胞をペレット化する。該細胞ペレットを0.25 ml
の 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 100μg/ml R
Nase Aに再懸濁し、該装置に移して、栓又は接着フィル
ムによりシールし、注意深く攪拌して、５分間室温に静
置する。次いで、0.25 ml の 3M 酢酸カリウム及び 2M
酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で15分間インキュ
ベートする。該装置全体を減圧チャンバー上に装着し、
細胞溶解物を2×10³−8×10⁴Pa(20-800 mb)で吸引して
装置中を通過させる。或いは、該試料を高圧により濾過
層中を加圧通過させてもよい。

【００９４】濾過後、濾過装置を取り外し、フィルター
ケーキを細胞断片、変性蛋白及び沈殿 SDSと共に破棄す
る。該抽出カラムを、0.8 mlの 1M NaCl, 15% エタノー
ル,50mM MOPS, pH7.0、及び 0.8 ml の1M NaClO₄, 15%
エタノール, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0で洗浄して
RNA及び蛋白を除去する。DNA を 7 M NaClO₄, 15%エタ
ノール, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0を用いて陰イオ
ン交換体層 10 から溶出し、それにより直接シリカゲル
層 11 に結合させる。該抽出カラムを、0.8mlの 70%エ
タノール, 100 mM NaCl, 10 mM酢酸ナトリウム, pH 7.0
及び 0.8 mlの 90%エタノール／水で洗浄する。

【００９５】抽出層中に残存するエタノール／H₂O は減
圧吸引して空気を 1-2分間通すことにより蒸発させる。
続いて、該 96 試料を各々50μl の 1mM Tris-HCl, 0.1
mMEDTA, pH 8.0で溶出し、別の 1.5 ml 試験管に回収
する。溶出された DNAは例えば制限処理、ラベル化、配
列決定、又は増幅のような酵素反応に直接使用すること
ができる。

【００９６】実施例12 状態調節を行わないプラスミド DNAの調製 pUC 18- 形質転換 HB 101 大腸菌細胞を含む LB アンピ
シリン培地による培養物 3 ml を 5,000 gで 10 分間遠
心分離する。該細胞ペレットを 0.25 mlの 50mM Tris-H
Cl, 10 mM EDTA, pH 8.0,及び 100μg/ml RNase Aに再
懸濁する。細胞を溶解するために、0.25 ml の 0.2 M N
aOH 及び 1% SDS を細胞懸濁液に加え、注意深く攪拌
し、５分間室温に置く。これを、0.25 ml の 3M 酢酸カ
リウム及び2M 酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で
15 分間インキュベートする。該溶解物を 10,000 g で
15 分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。

【００９７】澄んだ該細胞溶解物をピペットで DEAE 陰
イオン交換体／抽出カラム上に載せ、該試料を吸引して
イオン交換体層を通過させる。該抽出カラムを、0.8 ml
の 1M NaCl, 15% エタノール、50 mM MOPS, pH 7.0及び
15%エタノール、10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0で洗浄
して RNA及び蛋白を除去する。DNA を 7 M NaClO₄,15%
エタノール, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0を用いて、
ガラス繊維膜を有する抽出カラム上に吸引して載せる。
7 M NaClO₄中の溶出 DNA溶液を吸引してガラス繊維膜を
通過させ、それにより直接シリカゲル層に吸着させる。
該抽出カラムを、0.8 mlの 70% エタノール、100mM NaC
l, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0、及び0.8 mlの 90%
エタノール／水で洗浄する。

【００９８】場合により、吸引して空気を通すことによ
り痕跡量のエタノールを除去する。最後に、10μl の 1
0mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 を用いて DNAを溶出
し、別の1.5 ml試験管に回収する。

【００９９】実施例13 状態調節を行うプラスミド DNAの調製 pUC 18- 形質転換 HB 101 大腸菌細胞を含む LB アンピ
シリン培地による培養物 3 ml を 5,000 gで 10 分間遠
心分離する。該細胞ペレットを 0.25 mlの 50mM Tris-H
Cl, 10 mM EDTA, pH 8.0,及び 100μg/ml RNase Aに再
懸濁する。細胞を溶解するために、0.25 ml の 1.2 M N
aOH 及び 1% SDS を細胞懸濁液に加え、注意深く攪拌
し、５分間室温に置く。これを、0.25 ml の 3M 酢酸カ
リウム及び2M 酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で
15 分間インキュベートする。該溶解物を 10,000 g で
15 分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。

【０１００】澄んだ該細胞溶解物をピペットで DEAE 陰
イオン交換体／抽出カラム上に載せ、該試料を吸引して
イオン交換体層を通過させる。該抽出カラムを、0.8 ml
の 1M NaCl, 15% エタノール, 50 mM MOPS, pH 7.0で洗
浄して RNA及び蛋白を除去し、0.8 mlの１M NaClO₄, 15
%エタノール、10 mM 酢酸ナトリウム, pH 5.0を用いて
状態調節を行う。DNA を 0.7 ml の 7 M NaClO₄, 15%エ
タノール, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0を用いて、ガ
ラス繊維膜を有する抽出カラム上に吸引して載せる。

【０１０１】このガラス繊維膜は、より良好な DNA吸着
をもたらし最初の滴下中の損失を避けるために、 0.2 m
l の 7 M NaClO₄, 15%エタノール, 10 mM 酢酸ナトリウ
ム,pH 7.0を用いて予め状態調節されている。次いで、7
M NaClO₄中の溶出 DNA溶液を減圧装置上で吸引してガ
ラス繊維膜を通過させ、それにより直接シリカゲル層に
吸着させる。該抽出カラムを、0.8 mlの 70%エタノー
ル, 100mM NaCl, 10 mM酢酸ナトリウム, pH 7.0、及び
0.8 mlの 90%エタノール／水で洗浄する。場合により、
吸引して空気を通すことにより痕跡量のエタノールを除
去する。最後に、100 μlの 10mM Tris-HCl, 1 mM EDT
A, pH 8.0 を用いて DNAを溶出し、別の1.5ml試験管に
回収する。

【０１０２】前状態調節は、 7 M NaClO₄, 15%エタノー
ル, 10 mM 酢酸ナトリウム, pH 7.0に浸した後乾燥させ
た膜を使用することによって行うこともできる。この前
状態調節により、吸着損失が 30%から 5% 以下に減少
し、DNA の総収率が 50-60% から 80-90% に増加する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法を実施するための装置を示した
説明図である。

【図２】本発明の装置の別の好ましい態様を示した説
明図（その１）である。

【図３】本発明の装置の別の好ましい態様を示した説
明図（その２）である。

【図４】本発明の装置の別の好ましい態様を示した説
明図（その３）である。

【図５】本発明の装置の別の好ましい態様を示した説
明図（その４）である。

【図６】本発明の装置の別の好ましい態様を示した説
明図（その５）である。

【図７】入口開口部及び出口開口部、並びに２個の固
定具の間に固定された円筒形中空体を含む装置を示した
説明図である。

【図８】図７の装置の別の好ましい態様を示した説明
図である。

【図９】図7及び図８に述べたものと類似の設計の濾
過装置を示す説明図である。

【図１０】本発明で意味するところの核酸の分離を行
うための濾過装置を示す説明図である。

【図１１】図９及び図１０を組み合わせた装置を示す
説明図である。

【図１２】陰イオン交換体、微量滴定ストリップ、又
は８及び／又は８×12ウェルの微量滴定プレートを含む
濾過装置を示した説明図である。

【図１３】陰イオン交換体部材の代わりに、高塩濃度
において核酸を吸着することができる無機質担体部材を
有する濾過装置を示す説明図である。

【図１４】図２の配置、及び試料が流れる方向に見て
中空体の上に置かれた疎水フィルター層を伴うアシンメ
トリックフィルター層の組み合わせた装置を示す説明図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＢ０１Ｄ 39/20 Ｂ０１Ｊ 41/04 ＨＢ０１Ｊ 41/04 Ｃ１２Ｍ 1/00 ＡＣ１２Ｍ 1/00 1/12 1/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献特開昭63−150294（ＪＰ，Ａ) 特開平３−297387（ＪＰ，Ａ) 萩原文二・橋本光一編「膜による分離法」講談社（1974年10月10日）第192〜 194頁；５．３．２多段式分画法Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 94，ｐｐ．163−169 （1983) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12M 1/00 B01D 15/00 B01D 39/20 C07H 21/04 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞又は他の原料からの核酸を単離及び
精製する方法であって、ａ）細胞溶解物を、撹拌することなしに、流れの方向に
ポア径が小さくなる１つのフィルター層又は流れの方向
にポア径が小さくなるように複数のフィルターが隣接し
て設けられたフィルター層に付して、細胞破片及び他の
粒子を除去し、ｂ）次いで、溶出液を、低イオン強度のバッファー溶液
中で陰イオン交換体により処理する方法。
【請求項２】請求項１記載の方法を実施するための装
置であって、流れの方向にポア径が小さくなる１つのフ
ィルター層又は流れの方向にポア径が小さくなるように
複数のフィルターが隣接して設けられたフィルター層
（12，20，21又は22)が実質的に円筒形の中空体（１）
の内部に、二個の手段 (５，６）の間に固定された陰イ
オン交換特性を持つ層（10）よりも入口開口部（７）の
方向から見て上流に配置されている装置。
【請求項３】細胞又は他の原料からの核酸を単離及び
精製する方法であって、ａ）細胞溶解物を、撹拌することなしに、流れの方向に
ポア径が小さくなる１つのフィルター層又は流れの方向
にポア径が小さくなるように複数のフィルターが隣接し
て設けられたフィルター層に付して、細胞破片及び他の
粒子を除去し、ｂ）次いで、溶出液を、高イオン強度のバッファー溶液
中で無機質担体により処理する方法。
【請求項４】請求項３記載の方法を実施するための装
置であって、流れの方向にポア径が小さくなる１つのフ
ィルター層又は流れの方向にポア径が小さくなるように
複数のフィルターが隣接して設けられたフィルター層(1
2，20，21又は22)が実質的に円筒形の中空体（１）の
内部に、二個の手段 (５，６）の間に固定された、高イ
オン強度の各溶液において核酸を結合することができる
層（11）よりも入口開口部（７）の方向から見て上流に
配置されている装置。