DE3717209A1 - Mittel zur selektiven adsorption von biopolymeren - Google Patents
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Mittel
zur selektiven Adsorption von Biopolymeren aus einem
Gemisch von Biopolymeren an ein trägergebundenes Ma
terial sowie ein Verfahren zur Herstellung des erfin
dungsgemäßen Mittels.
In der molekularbiologischen Laborpraxis, biotechnolo
gischen Verfahrensanwendung und in der medizinischen
Diagnostik stellt sich häufig das Problem, daß aus ei
nem Gemisch unterschiedlichster Moleküle eine bestimmte
Stoffklasse wie Nukleinsäuren oder Proteine isoliert
werden soll. Bekannt sind Verfahren, die sich in ihrem
methodischen Aufwand sowie in der erzielbaren Reinheit
des isolierten Stoffes beträchtlich unterscheiden. So
liefert zum Beispiel die Säulenchromatographie mit Io
nenaustauschern in der Regel hochgereinigte Fraktionen.
Diese Reinigungsverfahren bedürfen aber eines großen
methodischen und apparativen Aufwands (zum Beispiel
HPLC-Apparaturen). Ist die Reinigung einer Vielzahl
separater Proben notwendig, wie beispielsweise bei der
DNS-Analyse rekombinanter Bakterienklone, DNS-Analysen
von Gewebeproben in der medizinischen Diagnostik und
automatisierte Nukleinsäureisolierung, wird eine derar
tige Methodik zu aufwendig. Hinzu kommt, daß die mehr
malige Verwendung einer Säule für die Reinigung ver
schiedener Präparate zu Kontaminationen führt, die ge
rade im biologisch/medizinischen Bereich höchst uner
wünscht sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel
bereitzustellen, das die einfache Vorbereitung und Wei
terverarbeitung von Proben gewährleistet, wobei die
Proben Biopolymere, insbesondere Nukleinsäure und/oder
Proteine enthalten.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Mit
tel, bestehend aus
- a) einem flächenhaften festen Träger
- b) einer Klebstoffschicht und
- c) einem Material, das die Biopolymeren adsorbiert.
Der Klebstoff fixiert das die Biopolymere adsorbierende
Material (Adsorbentien) auf flächigen Trägermateriali
en. Die Fixierung der Adsorbentien erfolgt durch einen
Klebstoff, vorzugsweise einen Schmelzkleber auf der
Basis von Polypropylen und Polybutylen, welcher vorher
auf die entsprechende Oberfläche aufgebracht wird. Als
besonders geeignet haben sich thermoplastische Klebstof
fe, zum Beispiel Vestoplast-508 (ein alpha-Olefin-Copo
lymer der Hüls AG), erwiesen, da sie technisch leicht
zu verarbeiten sind, die Fixierung in chemischer Hin
sicht unterschiedlichster Partikel gestatten und auf
grund der Unlöslichkeit in wäßrigen Lösungen nicht zu
Kontaminationen der Probe führen. Die erfindungsgemäß
eingesetzten Klebstoffe können durch Erhitzen verflüs
sigt werden und entwickeln erst dann ihre klebenden
Eigenschaften. Die Temperatur der Thermobehandlung des
Klebstoffes liegt zwischen 60 und 180°C, vorzugsweise
bei 70 bis 120°C. Der Klebstoff wird zum Auftragen auf
den festen flächenhaften Träger in Form eines einseitig
oder zweiseitig offenen Behälters (Reaktionsgefäß,
Schlauch und ähnliches) zunächst in Chloroform oder
Methylenchlorid gelöst oder suspendiert (0,05 bis 0,5
g/ml, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 g/ml Chloroform oder
Methylenchlorid). Danach gibt man diese Suspension in
das Gefäß. Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen Kleb
stoff und Gefäßwand wird die Gefäßwandung mit Klebstoff
beschichtet. Dann dekantiert man die überschüssige Sus
pension ab.
Die jeweiligen Adsorbentien werden aufgetragen; im ein
fachsten Fall durch Bestreuen der Gefäßwand, und bei
einer Temperatur von 60 bis 180°C, vorzugsweise 70 bis
120°C prozessiert, so daß die Adsorbentien vermittels
Klebstoff an der Gefäßwand haften. Dabei ist es gleich
gültig, aus welchem Material das Adsorbens besteht. Es
können sowohl oberflächenmodifizierte Materialien auf
der Basis von Kieselgel, Aluminiumoxid, Titanoxid, Aga
rose, Cellulose, Hydroxylapatit, Acrylamid und andere
unlösliche Adsorbentien eingesetzt werden. Die Art der
Oberflächenmodifizierung spielt dabei ebenfalls keine
Rolle; Ionenaustauschergruppen enthaltende Adsorbentien
können ebenso verwendet werden wie beispielsweise Affi
nitätsadsorbentien oder Chelatbildner.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren fixierten Ad
sorbentien stellen eine grundsätzlich neue Anwendungs
form dar und bieten die Möglichkeit neuer und im Ver
gleich zur üblichen Methodik einfacherer Verfahren. Das
fixierte adsorbierende Material wird lediglich mit ei
ner die zu trennenden Substanzen enthaltenden Lösung
überschichtet und eine bestimmte Zeit inkubiert. In
Abhängigkeit von den Lösungsbedingungen binden bestimm
te Moleküle aufgrund unterschiedlicher Wechselwirkungen
reversibel an chemische Gruppen des Adsorbens. Nach der
Bindung wird die verbliebene Lösung dekantiert. In ei
nem Waschvorgang wird durch erneutes Überschichten und
Dekantieren das Adsorbens von unspezifisch gebundenen
und abzutrennenden Substanzen gereinigt. In einem ab
schließenden Elutionsschritt wird eine Lösung zugesetzt,
die zur Freisetzung der gebundenen Moleküle führt.
Als Adsorbentien kommen Materialien wie synthetische,
organische und anorganische Polymere, Kieselgel, Alumi
niumoxid, Titanoxid, Cellulose, Agarose, Hydroxylapa
tit, Acrylamid und andere unlösliche Adsorbentien in
Betracht, wobei diese Materialien meist oberflächlich
modifiziert sind. Vorzugsweise kann die Modifikation
aus chemischen Gruppen bestehen, die Ionenaustauscher
gruppen aufweisen oder die Möglichkeit zur Immobilisie
rung von Affinitätsliganden besitzen oder bereits mit
Affinitätsliganden beladene Adsorbentien sind. In einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche
des Trägermaterials mit Chelatbildnern modifiziert.
Auch sogenannte "reversed phase"-Materialien können für
bestimmte Applikationen wie Entfernung von hydrophoben
Bestandteilen eines Gemisches verwendet werden. Beson
ders bevorzugt sind Adsorbentien, die bekannt sind aus
DE-OS 32 11 309 sowie in der deutschen Patentanmeldung
der Anmelderin P 36 27 063 vorgeschlagen werden. Die
Partikelgröße beträgt 1 µm bis 2 mm. Die Porengröße
beträgt 5,0 bis 2500 nm, vorzugsweise 150 nm. Das in
Form von Partikeln vorliegende, oberflächlich modifi
zierte Adsorbens wird, wie oben beschrieben, mittels
eines thermoplastischen Klebstoffs an den flächenhaften
festen Träger gebunden, der aus organischem und/oder
anorganischem Material besteht. Der flächenhafte Träger
kann in bevorzugten Ausführungsformen bestehen aus Foli
en, Filtern, Schläuchen, Gefäßen oder Platten aus Kunst
stoffen, Glas, Keramik etc. Weitere bevorzugte Ausfüh
rungsformen des erfindungsgemäßen Mittels sind Arbeits
gerätschaften wie Reaktionsgefäße aus Kunststoff (Ep
pendorf-Gefäß), Pipettenspitzen, Objektträger, Mikro
titerplatten, Kanülen, Nylonfilter und ähnliches.
Der Anwendungsbereich des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist außerordentlich breit. Beispielhaft seien genannt:
Plasmidpräparationen, Isolierung langkettiger, chromo
somaler DNS aus unterschiedlichsten Quellen, Isolierung
und Reinigung von Nukleinsäuren unterschiedlichster
Provenienz sowie Immobilisierung von Proteinen, insbe
sondere Immunoglobulinen sowie Reinigung von spezifi
schen Antigenen durch Affinitätsadsorption. Außerdem
ist es möglich, das erfindungsgemäße Mittel zur adsorp
tiven Immobilisierung von Biopolymeren zu verwenden, um
diese einer chemischen Modifizierungsreaktion zu unter
ziehen. So können beispielsweise Nukleinsäuren in ad
sorbiertem Zustand mit Enzymen, beispielsweise Restrik
tionsenzymen behandelt werden. Auch eine Behandlung mit
Polymerasen sowie radioaktive Markierung mittels Nick
translationen, Endmarkierungen mit Klenow-Polymerasen,
Methylierungen, Phosphatasebehandlungen und ähnlichen
Reaktionen der Nukleinsäurebiochemie sind mit dem er
findungsgemäßen Mittel in überraschend einfacher Weise
möglich. Das Verfahren ist Gegenstand einer gleichzei
tig mit dieser Patentanmeldung eingereichten Patentan
meldung.
Es ist auch möglich, zuerst ein Biopolymer, das eine
gewisse Affinität zu anderen Biopolymeren aufweist, an
dem betreffenden Adsorbens zu immobilisieren, wonach
dann das eigentlich zu untersuchende oder gewinnende
Biopolymere in Form eines Sekundärkomplexes an den pri
mären Komplex gebunden wird. So weist zum Beispiel Pro
tein A eine starke Affinität zu Immunglobulinen (IgG)
auf. Immobilisiert man also Protein A an dem Biopolyme
re adsorbierenden Material, wird man in die Lage ver
setzt, die IgG-Fraktion aus einer Probe selektiv zu
adsorbieren.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher
erläutert.
Die Kopplung der Partikel an den festen flächenhaften
Träger erfolgt mit Vestoplast-508, einem alpha-Olefin-
Copolymer der Hüls AG.
Um das Reaktionsgefäß mit einer einheitlich dicken
Schicht von etwa 20 µm mit dem Klebstoff zu beschich
ten, wird zunächst Vestoplast-508 in Chloroform suspen
diert (0,15 g/ml), so daß eine kolloidale Suspension
entsteht. Diese Klebstoffsuspension wird in das Reak
tionsgefäß gegeben und sofort wieder dekantiert. Auf
grund der Wechselwirkungen zwischen dem Material des
entsprechenden festen flächenhaften Trägers und dem
Klebstoff verbleibt ein dünner Film an der Innenwandung
des Gefäßes. Durch Unterdruck (5 Minuten im Exsikkator)
wird anschließend das Chloroform entfernt. Die zu fi
xierenden Partikel, zum Beispiel Anionenaustauscher wie
Fractogel TSK DEAE-650, Ionenaustauscher, vorgeschlagen
in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3 und be
kannt aus DE-OS 32 11 309, mit Partikelgrößen von 50
bis 1000 µm und Durchmesser der Poren mit dem 1- bis
20-fachen des Durchmessers des zu trennenden Moleküls,
werden in das Gefäß gefüllt, welches anschließend auf
ca. 74°C erhitzt wird und dabei seine klebenden Eigen
schaften entwickelt. Nach dem Abkühlen werden nicht
fixierte Partikel mittels Druckluft durch Wegblasen
entfernt.
Mit Vestoplast-508 kompatible Folien können direkt be
schichtet werden, indem der thermisch verflüssigte Kleb
stoff aufgetragen wird und mittels einer Roll- oder
Schlitzrakel ein homogener Film der jeweils gewünschten
Schichtdicke aufgezogen wird. Die Fixierung erfolgt
auch in diesem Fall durch Erwärmung des Klebers in Ge
genwart der Partikel.
Kanülen und Pipettierspitzen werden beschichtet, indem
die Klebstoffsuspension eingezogen, sofort wieder her
ausgedrückt und nach Einfüllen der jeweiligen Partikel,
zum Beispiel gemäß der deutschen Patentanmeldung
P 36 39 949.3, DE-OS 32 11 309 oder anderer Ionenaustauscher
erhitzt wird. Ungebundene Partikel werden mittels
Druckluft durch Wegblasen entfernt.
Gemäß den Beispielen 1 bis 3 können die folgenden Mate
rialien zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels
eingesetzt werden: Ionenaustauscher auf Silicagel-/Aga
rose-/Acrylamid-/Cellulose-Basis, wie DE-52 und TSK
DEAE-650 (Merck Katalog Nr. 14989; das Material muß mit
Wasser und Aceton vorher gewaschen und im Vakuum getrock
net werden) sowie handelsübliche Reversed-phase-Materia
lien, zum Beispiel Merck Lichroprep RP-18, Katalog-Nr.
13 900 sowie aktivierte Affinitätsadsorbentien, wie zum
Beispiel Eupergit-C (Roehm-Pharma).
Plasmidpräparation aus Escherichia coli mit Hilfe von
mit Ionenaustauscher beschichteten Eppendorf-Reaktions
gefäßen nach Beispiel 1, wobei das in der deutschen
Patentanmeldung P 36 39 949.3 vorgeschlagene Ionenaus
tauschermaterial verwendet wird:
Der Bakterienaufschluß erfolgt nach der Alkaline Lysis
Method (siehe Maniatis et al. 1982, Cold Spring Harbor
Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York). Anstelle der
Phenolisierung wird jedoch der Überstand auf 1 M Natri
umchlorid und 50 mM Natriumacetat pH 7 eingestellt und
in ein Reaktionsgefäß gegeben, wobei das Reaktionsgefäß
gemäß Beispielen 1 bis 3 mit dem Ionenaustauscher be
kannt aus der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3
beschichtet wurde.
Nach 15 Minuten wird die Lösung dekantiert, das Reak
tionsgefäß mit 2× je 1 ml der angegebenen Pufferlösung
gewaschen und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur mit
2×100 µl Elutionspuffer (1,5 M Natriumchlorid, 50 mM
Natrium-Acetat pH 7, 15% Ethanol) eluiert. Das Eluat
wird mit 25 µl Wasser und 80 µl Isopropanol versetzt,
20 Minuten bei -70°C inkubiert und anschließend abzen
trifugiert. Die so isolierte Plasmid-DNS ist in der
Reinheit mit durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie
gereinigten DNS-Proben vergleichbar. Sie kann erfolg
reich enzymatischen Behandlungen unterworfen werden.
Isolierung langkettiger, chromosomaler DNS aus Gewebe
mit Hilfe von mit Ionenaustauschern beschichteten Ep
pendorf-Reaktionsgefäßen nach Beispiel 1, wobei der
Ionenaustauscher in der deutschen Patentanmeldung
P 36 39 949.3 vorgeschlagen wird:
Für den Zellaufschluß eukaryotischer Zellen existieren
verschiedene Methoden (vgl. Maniatis et al. 1982, Cold
Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York).
Sobald die Zellen lysiert sind, wird das von störenden
Bestandteilen befreite Lysat (cleared lysate) auf 1 M
Natriumchlorid und 50 mM Natriumacetat pH 7 eingestellt
und anschließend, wie in Beispiel 4 beschrieben, behan
delt. Es können auf diese Weise extrem große DNS-Frag
mente (50 bis 1000 kb) isoliert werden. Bei allen ande
ren Methoden, die zur Reinigung und Isolierung von DNS
bekannt sind, wie Säulenchromatographie und phenoli
scher Aufschluß, kommt es aufgrund starker Scherkräfte
zur Fragmentierung der Nukleinsäuren. Werden die nach
Beispiel 1 hergestellten erfindungsgemäßen Mittel einge
setzt, unterliegen die Moleküle nur schwachen Diffu
sionskräften und nur geringfügigen Scherkräften.
Darüber hinaus bewirkt die rein oberflächliche Adsorp
tion eine zusätzliche Stabilisierung der langen Mole
küle, deren Länge 1 µm bis 3000 µm betragen kann.
Isolierung von Nukleinsäuren (BNYV-Virus) aus stark
verschmutzten Quellen, zum Beispiel Erde, mit Hilfe von
mit Ionenaustauscher beschichteten 50 ml-Falcon-Reak
tionsgefäßen, wobei die Reaktionsgefäße nach Beispiel 1
mit Ionenaustauscher, der in der deutschen Patentan
meldung P 36 39 949.3 vorgeschlagen wird, wie folgt
durchgeführt wird:
Etwa 10 g Erde werden mit 10 ml 40 mM TRIS-Puffer, pH
7,5, 20 mM Natrium-Acetat und 1 mM EDTA sowie mit 10 ml
wasser-gesättigtem Phenol versetzt und 2 Minuten mit
Ultraschall behandelt. Anschließend werden 800 µl 25%
iges Triton X-100 und 10 ml Chloroform zugesetzt und
nach Mischen 10 Minuten bei 3500 g zentrifugiert. Der
wäßrige Überstand wird mit 10 ml Chloroform versetzt
und erneut 10 Minuten bei 3500 g zentrifugiert. Die
wäßrige Phase wird nun auf 300 mM Natriumchlorid einge
stellt und in die beschichteten Reaktionsgefäße gegeben.
Die Bindung von Nukleinsäuren erfolgt während 40 Minu
ten bei 40°C. Anschließend wird der Überstand dekan
tiert und verworfen und das Reaktionsgefäß 2× mit was
sergesättigtem Phenol und 2× mit 50 ml 0,3 M Natrium
chlorid gewaschen. Die Elution erfolgt 10 Minuten bei
1,5 M Natriumchlorid, 50 mM Natrium-Acetat pH 7 und 15%
Ethanol. Das Eluat wird durch 1 Vol. Wasser und 20 ml
Isopropanol 30 Minuten bei -20°C gefällt und abzentri
fugiert. Darauf folgende Gelelektrophorese und DOT-
BLOT-Analysen belegen eine wesentlich höhere Probenrein
heit als es mit anderen Verfahren, wie zum Beispiel der
Säulenchromatographie, erreichbar ist.
Immobilisierung von Protein A und Reinigung von Human
Immunglobulinen (IgG) mit Protein A-Affinitätsadsorp
tion:
Ein mit aktiviertem Silicagel beschichtetes Eppendorf-
Reaktionsgefäß wird mit 500 µl 0,1 M Natriumphosphat
puffer, pH 8,0, gefüllt und 1 mg Protein A (aus Staphy
lococcus aureus oder rekombinantes Protein A) gelöst in
100 µl 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 8,0, zugegeben.
Die Suspension wird 4 Stunden bei 4°C geschüttelt, um
eine hohe Immobilisierung von Protein A zu gewährlei
sten. Nach der Reaktion wird das nicht immobilisierte
Protein A pipettiert und das Eppendorf-Reaktionsgefäß
2× mit je 500 µl 0,1 molar Natriumphosphatpuffer, pH
8,0, gewaschen. Die nicht reagierten aktiven Gruppen
werden blockiert durch zweistündiges Schütteln mit 250
µl 0,05 M Mercaptoethanol in 0,1 M Natriumphosphatpuf
fer, pH 8,0. Nach der Blockierungsreaktion wird das
Produkt 5× mit 500 µl 0,1 molar Natriumphosphatpuffer
pH 7,0 gewaschen. Das mit Protein A beschichtete Eppen
dorf-Reaktionsgefäß wird mit 1 ml 0,1 M Natriumphosphat
puffer, pH 7,0, und 1 ml 0,05 M Natriumcitratpuffer, pH
3,0, gewaschen und 2× mit 1 ml 0,1 M Natriumphosphat
puffer, pH 7,0, äquilibriert. Die IgG-Probe, bestehend
aus 1 mg rohem human IgG, wird in 500 µl 0,1 M Natrium
phosphatpuffer, pH 7,0, gelöst, in das mit Protein A
beschichtete Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert und 30
Minuten bei 10°C geschüttelt und adsorbiert. Verunreini
gungen mit anderen Proteinen und unspezifisch gebunde
nes IgG werden durch dreimaliges Waschen mit 500 µl 0,1
M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, ausgewaschen und das
spezifisch gebundene human IgG mit 2× 100 µl 0,05 M
Citratpuffer, pH 3,0, eluiert.
Die Bindekapazität von mit Protein A beschichteten Ep
pendorf-Reaktionsgefäßen wurde zu je 200 µg IgG be
stimmt.
Immobilisierung von Maus anti-human IgG und Reinigung
von Human Immunglobulinen (IgG) mit Maus anti-human
IgG-Affinitätsadsorption:
Ein mit aktiviertem Silicagel beschichtetes Eppendorf-
Reaktionsgefäß wird mit 500 µl 0,1 M Natriumphosphat
puffer, pH 8,0, gefüllt und 1 mg Maus anti-human IgG
gelöst in 100 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0,
zugegeben. Die Suspension wird 4 Stunden bei 4°C ge
schüttelt, um einen hohen Immobilisierungsgrad von Maus
anti-human IgG zu gewährleisten. Nach der Reaktion wird
das nicht immobilisierte Maus anti-human IgG pipettiert
und das Eppendorf-Reaktionsgefäß 2× mit je 500 µl 0,1
M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen. Die nicht
abreagierten, aktiven Gruppen werden blockiert durch
zweistündiges Schütteln mit 250 µl 0,05 M Mercaptoetha
nol in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0. Nach der
Blockierungsreaktion wird das Produkt 5× mit 500 µl
0,1 M Natriumphospatpuffer, pH 7,0, gewaschen. Das mit
Maus anti-human IgG beschichtete Eppendorf-Reaktionsge
fäß wird mit 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0
und 1 ml 0,05 M Natriumcitratpuffer, pH 3,0, gewaschen
und 2× mit je 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH
7,0, äquilibriert. Die IgG-Probe, bestehend aus 1 mg
rohem human IgG, wurde in 500 µl 0,1 M Natriumphosphat
puffer, pH 7,0, gelöst, in das mit Maus anti-human IgG
geschichtete Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert und 30
Minuten bei 4°C geschüttelt und adsorbiert.
Verunreinigungen mit anderen Proteinen und unspezifisch
gebundenes IgG werden durch dreimaliges Waschen mit je
500 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, ausgewa
schen und das spezifisch gebundene human IgG mit 2× je
100 µl 0,05 M Gitratpuffer, pH 3,0, eluiert. Die Bin
dekapazität von einem mit Maus anti-human IgG beschich
teten Eppendorf-Reaktionsgefäß wurde zu 50 µg IgG be
stimmt.
Nukleinsäuren können in adsorbiertem Zustand, insbeson
dere gebunden an Ionenaustauscher, vorgeschlagen in der
deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3 der Anmelderin,
Fractogel TSK DEAE-650 und DE-52 Cellulose, nach den
bekannten Verfahrensweisen (siehe Maniatis et al. 1982,
Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN-0-87969-136-0, New
York) enzymatisch behandelt werden. Vor Zugabe des En
zyms empfiehlt sich die Zugabe von Rinderserumalbumin
(BSA). 3 µg Plasmid, zum Beispiel pBR 322, die nach der
oben beschriebenen Plasmidpräparationsmethodik isoliert
worden sind und an einen Anionenaustauscher wie DE-52
Cellulose gebunden sind, werden mit Eco R 1 endonukleo
lytisch gespalten. Hierzu wird zunächst eine Rinderse
rumalbumin-Lösung (2 mg/ml Eco RI Puffer) in das Reak
tionsgefäß gegeben. Nach 10 Minuten wird diese Lösung
dekantiert und verworfen. Mit 3 Einheiten Eco R 1 wird
nun 30 Minuten in 100 mM Natriumchlorid, 50 mM TRIS, pH
7,5, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM Dithiothreitol
verdaut. Etwa 90 bis 95% der gesamten Plasmid-Spaltstel
len ist umgesetzt, wie sich nach Elution mit anschlie
ßender Gelelektrophorese nachweisen läßt.
Claims (13)
1. Mittel zur selektiven Adsorption von Biopolymeren aus
einem Gemisch von Biopolymeren an ein trägergebundenes
Material bestehend aus
- a) einem flächenhaften festen Träger
- b) einer Klebstoffschicht und
- c) einem Material, das die Biopolymeren adsorbiert.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der
die Klebstoffschicht bildende Klebstoff ein thermopla
stischer Klebstoff ist.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der flächenhafte feste Träger aus organischem und/
oder anorganischem Material besteht.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge
kennzeichnet, daß der flächenhafte feste Träger ein
bzw. eine Kunststoffolie, (Eppendorf)-Reaktionsgefäß,
Pipettenspitze, Objektträger, Mikrotiterplatte, Kanüle,
Nylonfilter und/oder Kunststoffschlauch ist.
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge
kennzeichnet, daß das die Biopolymere adsorbierende
Material Kieselgel, synthetische organische und anor
ganische Polymere, Aluminiumoxid, Titanoxid, Agarose,
Zellulose, Hydroxylapatit und/oder Acrylamid ist, wobei
diese Materialien oberflächlich modifiziert sind.
6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Oberfläche des die Biopolymere
adsorbierenden Materials durch Ionenaustauschergruppen
oder Affinitätsliganden modifiziert ist.
7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Oberfläche des die Biopolymeren
adsorbierenden Materials mit Chelatbildnern modifiziert
ist.
8. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der
Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß auf ei
nen festen Träger eine Schicht aus thermoplastischem
Klebstoff aufgebracht wird, wonach das Material, das
die Biopolymere adsorbiert, auf die Klebstoffschicht
aufgetragen und bei erhöhter Temperatur behandelt wird.
9. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der
Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der fe
ste flächenhafte Träger ein einseitig oder zweiseitig
offener Behälter ist und
- a) der Klebstoff in organischen Lösungsmitteln suspen diert aufgebracht,
- b) das Lösungsmittel abdekantiert und nach Verdampfen des restlichen Lösungsmittels
- c) das Adsorbens eingefüllt und dann bei 60 bis 180°C, vorzugsweise 70 bis 120°C behandelt wird.
10. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der
Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der flä
chenhafte Träger eine Folie ist und
- a) der Klebstoff mit einer Roll- oder Schlitzrakel auf gebracht,
- b) mit dem Adsorbens beschichtet und dann
- c) bei 60 bis 180°C, vorzugsweise 70 bis 120°C behan delt wird.
11. Verwendung des Mittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis
7 zur Adsorption, Trennung, Reinigung und/oder Isolie
rung von Biopolymeren.
12. Verwendung des Mittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis
7 zur chemischen Modifizierung von Biopolymeren.
13. Verwendung des Mittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis
7, wobei das die Biopolymere adsorbierende Material
seinerseits ein am festen flächenhaften Träger immobi
lisiertes Biopolymeres ist, welches zu einem weiteren
Biopolymeren eine Affinität besitzt.
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