DE2840503A1 - Material zur reversiblen fixierung biologischer makromolekuele, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung - Google Patents
Material zur reversiblen fixierung biologischer makromolekuele, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendungInfo
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- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/58—Use in a single column
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Material, das biologische Makromoleküle reversibel zu fixieren vermag,
auf seine Herstellung und seine Verwendung, insbesondere auf neue feste, poröse, zur Verwendung als
stationäre Phasen in Chromatographiesäulen geeignete Materialien, die sich dadurch auszeichnen, daß sie aus
einem mineralischen porösen Träger bestehen, überzogen mit einem Polysaccharidpolymeren oder mit einem modifizierten
Polysaccharidpolymeren der schematischen For mel I
R - (CH2) n - N-v (I)
worin R einen Polysaccharidpolymer-Rest bedeutet, η
eine ganze Zahl von 1 bis 10 und vorzugsweise von 2 bis 5 ist, R- und R2, identisch oder verschieden, einen
Niederalkylrest oder einen hydroxylierten Niederalkylrest
bedeuten, wobei der Polysaccharidüberzug, wenn nötig,
zu seiner Stabilisierung vernetzt ist,und daß auf dem gegebenenfalls modifizierten Polysaccharidüberzug Aminomoleküle
oder -makromoleküle aufgepfropft sind, die bei der Chromatographie eine reaktive Stelle darzustellen
vermögen und der Formel R1 - NH2 entsprechen, wobei R1
der Rest des Aininomoleküls oder -makromoleküls ist und
die Pfropfbindung des Aminomoleküls oder -makromoleküls der schematischen Formel
R3 - CH2 - NH - R1
entspricht, worin R1 wie zuvor definiert ist und R^ CH-
den Rest des Polysaccharidpolymeren oder des Polysaccharidpolymeren, modifiziert, nachdem es einer oxidativen
Spaltung und anschließender Reduktion unterworfen worden ist, darstellt. Nachfolgend bezeichnet ein "Nie-
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deralkyl"-Rest einen Alkylrest mit 1 bis 4 und vorzugsweise
1 oder 2 Kohlenstoffatomen.
Die gegebenenfalls modifizierten Polysaccharidpolymeren,
die zur Herstellung des erfindungsgemäßen festen, porösen Materials brauchbar sind, sind gegebenenfalls modifizierte
Polysaccharidpolymere, die die wohlbekannte Reaktion der oxidativen Spaltung mit Oxidationsmitteln,
wie Perjodaten oder Bleitetraacetat, erfahren können.
Nach bevorzugten Ausführungsformen besteht der mineralische,
poröse Träger insbesondere aus einem Metalloxid, wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid oder
einem Titanoxid, oder aus synthetischen oder natürlichen Derivaten dieser Oxide, wie Gläsern, Silikaten, Borsilikaten,
Kaolin usw., das Polysaccharidpolymere ist insbesondere Cellulose, das modifizierte Polysaccharidpolymere
ist ein Polymeres der Formel I, worin R ein Dextran-, Stärke- oder Celluloserest und insbesondere
Diäthylaminoäthyldextran, DEAE-Dextran, Diäthylaminoäthylstärke
oder Diäthylaminoäthylcellulose ist, der
Polysaccharidpolymerüberzug, wenn nötig durch Vernetzung
stabilisiert, wobei das Vernetzungsmittel z.B. eine Dicarbonylverbindung, ein Halogenhydrin oder ein Diepoxid
ist, insbesondere 1,4-Butandioldiglycidyläther, Epichlorhydrin,
Epibromhydrin oder ein Epoxid der Formel
worin R5 ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise ein Niederalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist und R. und Rg eine Kohlenwasserstoffkette mit
1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein Niederalkylen-
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rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, bedeuten, das
Aminomolekül oder -makromolekül der Formel R1-NH2
kann als Träger der reaktiven Stelle bei der Chromatographie jedes Molekül sein, das die NH2-Funktionen
trägt und in der Chromatographie mit biospezifischer, chemischer oder physikalisch-chemischer Affinität
brauchbar ist. Es handelt sich um Moleküle, die zu reversiblen Wechselwirkungen biospezifischer, chemischer
oder physikalisch-chemischer Art befähigt sind, z.B. ionischen Wechselwirkungen, Wechselwirkungen, die
hydrophobe Eigenschaften zum Zuge kommen lassen, Wechselwirkungen,
die eine biospezifische oder chemische Affinität zum Zuge kommen lassen, z.B. die Bildung reversibler
Komplexe. Das Aminomolekül oder -makromolekül kann kationischen Charakter haben, der vorteilhaft bei
Anionenaustauschreaktionen zur Geltung kommt; es kann anionische Gruppierungen tragen, wie Carboxyl- und
SuIfongruppen, und Kationenaustauschreaktionen erlauben,
es kann auch ein Aminomolekül oder -makromolekül sein, das bei der biospezifischen Chromatographie als reaktive
Stelle dient, und z.B. ein Enzymsubstrat oder -inhibitor, einen Hormon-, Protein-, Virus- oder Bakterienrezeptor,
ein Antigen oder ein Antikörper darstellen. Das Aminomolekül oder -makromolekül kann insbesondere ein PoIyamin
sein, wie 3-Diäthylaminopropylamin oder N,N-Diäthyläthylendiamin,
Taurin, £-Aminocapronsäure, Lysin, Phenylalanin, Pheny!hydrazin, meta-Aminophenylboronsäure,
bakterielle Antigene, Globuline, insbesondere die ^Globuline, Bakterientoxine, Viren oder deren Abbauprodukte,
wie die verschiedenen viralen Antigene, Zellenrezeptoren, wie die Hydrolyseprodukte der Ganglioside
mit NH2-Funktionen, insbesondere die Hydrolyseprodukte des Gangliosids G^, wie das Lysogangliosid G^ , oder
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die Produkte der partiellen Hydrolyse des Gangliosids GM1*
Man weiß, daß die Ganglioside eine N-Acy!gruppierung
(Acy!derivat einer Fettsäure, wie der Stearinsäure) und
wenigstens eine N-Acetylgruppierung besitzen ( in 3-Stellung eines Galactosefragments), wobei weitere N-Acetylgruppierungen
durch Moleküle von Sialinsäuren gegebenenfalls vorliegen können. Diese N-Acyl- oder
N-Acetyl-Gruppierungen sind teilweise oder vollständig zu NH2-Gruppierungen hydrolysierbar. Analog zu der von
SVENNERHOLM für das Gangliosid GM1 vorgeschlagenen Nomenklatur
werden nachfolgend als "Lysoganglioside" die Produkte bezeichnet, die durch vollständige Hydrolyse
der N-Acyl- und N-Acetyl-Gruppierungen der Ganglioside an NH?-Gruppen erhalten wurden. Die Produkte der partiellen
Hydrolyse der Ganglioside, in denen bestimmte NH--Gruppen durch alkalische Hydrolyse deacyliert oder deacetyliert
wurden, stellen gleichermaßen als Aminomoleküle, die als reaktive Stellen in dem erfindungsgemäßen Material
dienen können, geeignete Derivate dar. Erwähnt werden sollte ferner, daß die erfindungsgemäßen Materialien,
auf denen sich das Lysogangliosid GM1 fixiert befindet,
das Choleratoxin festzuhalten vermögen, selbst nach Behandlung in stark saurem Milieu, z.B. bei pH 1. Nun ist
bekannt, daß in saurem Milieu die Ganglioside ein oder mehrere Sialinsäuremoleküle verlieren und in mono-Sialo-
oder a-Sialoganglioside (oder -lysoganglioside) überführt
werden können. Daraus ergibt sich, daß zur Fixierung des Choleratoxins ein erfindungsgemaßes Material
verwendet werden kann, an dem als Aminomolekül der Formel R'-NH- irgendein Gangliosidderivat verwendet werden kann
(dessen N-Acetyl- und N-Acyl-Gruppierungen vollständig
oder teilweise hydrolysiert wurden, um die NH2~Gruppen
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auftreten zu lassen), mit der Bedingung , daß dann das
Material ausreichend lange sauer behandelt wird, um die überführung der Poly-Sialogangliosid-Derivate in mono-
oder a-Sialogangliosid-Derivate zu ermöglichen.
oder a-Sialogangliosid-Derivate zu ermöglichen.
Zur Erfindung gehört auch ein Verfahren zur Herstellung des neuen Materials, wie es vorstehend definiert wurde.
Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß man den mineralischen porösen Träger mit dem Polysaccharidpolymeren
oder dem modifizierten Polysaccharidpolymeren
überzieht, daß man, wenn gewünscht, den Polysaccharidüberzug in einen modifizierten Polysaccharidüberzug
überführt, daß man, wenn nötig, eine Vernetzung zur
Stabilisierung des Überzugs vornimmt, daß man den gegebenenfalls modifizierten Polysaccharidüberzug einer
oxidativen Spaltung unterwirft, daß man das so erhaltene Oxidationsprodukt mit dem Aminomolekül oder Aminomakromolekül der Formel R1 - NH2 reagieren läßt und dann das erhaltene Iminoderivat der Einwirkung eines Reduktionsmittels, das die Iminobindung zu einer Aminobindung zu
reduzieren vermag, unterwirft.
überzieht, daß man, wenn gewünscht, den Polysaccharidüberzug in einen modifizierten Polysaccharidüberzug
überführt, daß man, wenn nötig, eine Vernetzung zur
Stabilisierung des Überzugs vornimmt, daß man den gegebenenfalls modifizierten Polysaccharidüberzug einer
oxidativen Spaltung unterwirft, daß man das so erhaltene Oxidationsprodukt mit dem Aminomolekül oder Aminomakromolekül der Formel R1 - NH2 reagieren läßt und dann das erhaltene Iminoderivat der Einwirkung eines Reduktionsmittels, das die Iminobindung zu einer Aminobindung zu
reduzieren vermag, unterwirft.
Das vorstehend beschriebene Verfahren besteht also insbesondere in der Fixierung des Aminomoleküls oder -makromoleküls
am Polysaccharidüberzug oder am Überzug des
durch die folgenden Reaktionen modifizierten Polysaccharids:
durch die folgenden Reaktionen modifizierten Polysaccharids:
a) Oxidative Spaltung der oc-Glykol-Gruppierungen zu
Carbonylderivaten, die man schematisch mit der Formel R- -CHO wiedergeben kann, wobei R. der Rest des
Polysaccharidmolekuls nach der oxidativen Spaltung ist;
Polysaccharidmolekuls nach der oxidativen Spaltung ist;
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b) Umsetzung des Aminomoleküls oder -makromoleküls
mit Carbonylgruppen gemäß der Reaktion
mit Carbonylgruppen gemäß der Reaktion
R4 - CHO + R1 - NH2 »R4 - CH = N - R' + H3O;
dann
c) Reduktion der Iminbindung zur stabilen Aminbindung,
z.B. mit naszierendem Wasserstoff, nach der Reaktion
z.B. mit naszierendem Wasserstoff, nach der Reaktion
R4 - CH = N - R1 + 2H >R3 - CH2 -NH-R',
wobei R-, wie zuvor definiert ist.
Diese verschiedenen chemischen Umwandlungen können bei Raumtemperatur in einer Chromatographie-Säule erfolgen.
Zu der an sich bekannten oxidativen Spaltung kann man z.B, Bleitetraacetat, Perjodsäure oder eines ihrer Derivate,
wie ein Alkaliperjodat, verwenden.
Ist das modifizierte Polysaccharidpolymere ein zu DEAE-Dextran
analoges Aminopolysaccharid, ist es nach der
Oxidationsreaktion nützlich, diese kationischen Gruppierungen mit Ionen zu sättigen, z.B. mit Halogenidionen,
um jede Gefahr der Störung der letzten Reaktion des Aminomoleküls oder -makromoleküls mit den Aldehydgruppen des Trägers zu vermeiden.
Oxidationsreaktion nützlich, diese kationischen Gruppierungen mit Ionen zu sättigen, z.B. mit Halogenidionen,
um jede Gefahr der Störung der letzten Reaktion des Aminomoleküls oder -makromoleküls mit den Aldehydgruppen des Trägers zu vermeiden.
Für die Reduktionsreaktion kann man z.B. ein Hydrid, wie Natriumborhydrid, verwenden.
Zum überziehen des mineralischen, porösen Trägers mit
dem gegebenenfalls modifizierten Polysaccharidpolymeren kann man z.B. wie in der Hauptanmeldung beschrieben
vorgehen, d.h., daß man den mineralischen, porösen Träger in Pulverform in eine Chromatographie-Säule einbringt,
dem gegebenenfalls modifizierten Polysaccharidpolymeren kann man z.B. wie in der Hauptanmeldung beschrieben
vorgehen, d.h., daß man den mineralischen, porösen Träger in Pulverform in eine Chromatographie-Säule einbringt,
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einen Puffer vom pH 3 bis 12 bis zum Gleichgewicht
durchlaufen läßt, eine Lösung des Polymeren im gleichen Puffer einführt, dann bis zur Polymerenfreiheit
in den Eluaten eluiert,oder man imprägniert den mineralischen porösen Träger mit einer wäßrigen Lösung des Polymeren
bei einem pH zwischen 3 und 12, trocknet dann im Ofen zwischen 50 und 1200C bis zur Gewichtskonstanz.
Ist das Aminomolekül R'-NH2, auf dem porösen Träger
nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren fixiert, ein partielles oder vollständiges Hydrolyseprodukt eines
Poly- oder Monosialogangliosids, gehört zum erfindungsgemäßen Verfahren außerdem eine fakultative Endstufe
einer sauren Behandlung des erhaltenen Materials für eine zur Umwandlung des Hydrolyseprodukts in ein entsprechendes
Hydrolyseprodukt eines mono- oder a-Sialogangliosids
ausreichende Zeitspanne. Für diese saure Behandlung kann man z.B. eine 0,1η wäßrige Salzsäurelösung oder eine
solche höherer Konzentration verwenden.
Für die Bildung eines Celluloseüberzugs ist es von Vorteil f folgendermaßen vorzugehen:
Man imprägniert den mineralischen, porösen Träger mit Hilfe einer Lösung eines Celluloseester, trocknet und
läßt auf den überzogenen Träger ein Hydrolysemittel einwirken, z.B. eine wäßrig-alkalische Lösung, um die
Estergruppierungen zu hydrolysieren. So erhält man einen mineralischen, porösen, mit auf diese Weise regenerierter
Cellulose überzogenen Träger. Dieser Celluloseüberzug ist sehr stabil und kleidet die Poren des mineralischen,
porösen Trägers vollständig aus. Es ist überflüssig, diesen Überzug durch Vernetzen zu stabilisieren.
In diesem Stadium kann der Celluloseüberzug in einen Überzug modifizierter Cellulose überführt werden, indem
man ihn mit einem geeigneten Mittel umsetzt, z.B. mit
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einer Verbindung der Formel
X - (CH2)n -
worin n, R.. und R2 wie zuvor definiert sind und X ein
Halogenatom ist.
Man kann z.B. den mineralischen, porösen, mit Cellulose imprägnierten Träger mit 2-Chlortriäthylamin bei alkalischem
pH umsetzen und so einen überzug von Diäthylaminoäthy!cellulose
erhalten.
Zur Erfindung gehört auch das Verfahren des Aufbringens von Cellulose oder modifizierter Cellulose auf einen
mineralischen, porösen Träger, was nachfolgend beschrieben wird.
Der erfindungsgemäß brauchbare, mineralische, poröse Träger muß eine wohl definierte, gesteuerte Porosität haben.
Die innere Oberfläche des Trägers muß 100 m2/g oder darunter
sein und, wenn möglich, zwischen 5 und 80 m2/g betragen.
Der mittlere Porendurchmesser soll über oder bei 25nm und, wenn möglich, zwischen 50 und 1000 nm liegen,
genauere Bereiche können je nach der beabsichtigten Verwendung empfohlen werden. Für größere Oberflächen oder
geringere Porendurchmesser wird die innere Oberfläche des Trägers für das aminierte Polysaccharidpolymere und
letztlich für die zu trennenden Makromoleküle unzugänglich. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
ist der poröse, mineralische Träger Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid und vorzugsweise ein poröser Siliciumdioxidträger
mit anionischem Charakter, erhalten beispielsweise nach den in den FR-PS'en 1 473 239, 1 473 240, 1 475 929
und 1 482 867 beschriebenen Verfahren. Verwendet werden
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z.B. poröse, handelsübliche Siliciumdioxide (unter den
Bezeichnungen Spherosil XOB 030, XOB 015 und XOC 005 der Rhone-Poulenc Chimie Fine im Handel erhältlich)
die Oberflächen von 50, 25 bzw. 10 m2/g haben.
Das gegebenenfalls modifizierte Polysaccharidpolymere, das zum Imprägnieren und überziehen der inneren Oberfläche
des porösen, mineralischen Trägers dient, hat
4 ein Molekulargewicht von wenigstens 10 Daltons und
vorzugsweise zwischen 10 und 10 Daltons.
Gegenstand der Erfindung ist ferner auch die Verwendung der neuen, vorstehend beschriebenen Materialien zur
Reinigung oder Trennung biologischer Makromoleküle.
Allgemein besteht diese Verwendung in der Ausnutzung
der Affinitätseigenschaften des auf den Träger aufgepfropften
Aminomoleküls oder -makromoleküls in einer Chromatographie-Säule, sei es zur selektiven Fixierung
biologischer Makromoleküle, die man isolieren oder reinigen will, sei es zum selektiven Zurückhalten von Verunreinigungen
oder anderen unerwünschten Proteinen.
Diese Verwendung zeichnet sich durch die Tatsache aus, daß man durch eine das erfindungsgemäße Material enthaltende
Säule eine Lösung laufen läßt, die die biologischen Makromoleküle enthält, die man isolieren oder reinigen
will. Fixiert das Material die biologischen Makromoleküle, die man reinigen oder isolieren will, werden
diese anschließend mit einer geeigneten Lösung eluiert, was nach bekannten Methoden die Trennung der biologischen
Makromoleküle vom Molekül R1-NH2 zuläßt, an das sie
äffinitiv gebunden sind. Beispielsweise trennt man in dem
Fall, wo die zu isolierenden biologischen Makromoleküle durch biospezifische Affinität an einen Liganden fixiert
sind, diese nach den bekannten Trennmethoden für biologi-
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sehe Makromoleküle von ihrem Liganden ab. Je nach dem
zu isolierenden oder zu reinigenden biologischen Makromolekül wählt man ein poröses Material, an dem
ein Molekül R1-NH3 fixiert ist, das Affinität für das
biologische Makromolekül aufweist.
Fixiert das Material die Verunreinigungen, wird das gewünschte biologische Makromolekül in Lösung direkt aufgefangen,
wozu also das poröse Material mit einem Aminomolekül R'-NH2 mit Affinität für die Verunreinigung, die
entfernt werden soll, überzogen ist. Dann kann man die Verunreinigungen mit einer geeigneten Lösung eluieren und
so das Material für einen neuen Arbeitsvorgang regenerieren.
Ist das zu isolierende biologische Makromolekül oder die zurückzuhaltende Verunreinigung am erfindungsgemäßen
Material unter Ausnutzung von dessen Ionenaustauscheigenschaften fixiert, erfolgt die Elution des so fixierten
Moleküls mit Hilfe einer Lösung geeigneten pH-Werts und geeigneter Molarität.
Wenn man nicht die Ionenaustauscheigenschaften des erfindungsgemäßen
Materials ausnützen will, z.B., wenn man nur die biospezifischen Affinitätseigenschaften ausnützen
will, ist es angebracht, in der Säule Lösungen ausreichender Ionenstärke zu verwenden, um die Ionenaustauschfunktionen
zu neutralisieren. So ist es in dem Falle, in dem das erfindungsgemäße Material kationische Stellen aufweist,
angebracht, die kationischen Gruppen zu neutralisieren, z.B. durch Cl -Ionen, um jede nicht-spezifische
Wechselwirkung ionischen Charakters zu beseitigen.
In bestimmten Fällen kann man die Ionenaustauscheigenschaften und die anderen Affinitätseigenschaften, z.B.
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biospezifische Äffinitätseigenschaften, des erfindungsgemäßen
Materials gleichzeitig nutzen, um bei einer einzigen Chromatographie mehrere verschiedene Proteine zu
trennen. Beispielsweise kann man mit einem Material, das gleichzeitig kationische Stellen und solche mit biospezifischer
Affinität aufweist, leicht ein Gemisch dreier Proteine trennen: Ein erstes Protein mit elektropositiver
Natur, ein zweites Protein mit elektronegativer Natur und ein drittes Protein, das an die Stellen mit
biospezifischer Affinität fixiert zu werden vermag. Tatsächlich wird bei der Chromatographie eines solchen Gemischs
das erste Protein nicht fixiert und findet sich also am Säulenauslauf wieder. Das zweite Protein wird
an den kationischen Stellen fixiert und kann mit einer Lösung eluiert werden, die Anionen enthält, die die
kationischen Stellen zu verdrängen vermögen, z.B. eine Natriumchloridlösung. Das dritte Protein wird an den Stellen
mit biospezifischer Affinität fixiert und kann von diesen mit einem geeigneten Elutionsmittel getrennt werden.
Nachfolgend finden sich einige nicht beschränkende Beispiele für die Anwendung der Erfindung.
A. Reinigung des Choleratoxins
Man weiß, daß die Cholera-Vibrione bei Entwicklung in
einem geeigneten Kulturmedium ein Choleragen oder Enterotoxin genanntes Toxin abscheidet, das für die durch diesen
Keim beim Menschen hervorgerufenen Durchfälle verantwortlich ist. Nach Zentrifugieren und Filtrieren des
fertigen Kulturmediums kann man ein "Rohkulturfiltrat"
erhalten, das das Choleratoxin im Gemisch mit zahlreichen anderen Makromolekülen des Ausgangskulturmediums oder
von den Vibrionen abgeschieden enthält.
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Das Choleratoxin wandelt sich teilweise und allmählich in eine nicht-toxische Form um, die Choleragenoid
genannt wird. Das Choleragenoid hat eine Struktur, die der des Choleragens nahesteht, aber das Choleragen
besitzt außerdem eine Polypeptidkette A, die für die Toxizität verantwortlich ist.
Das Choleragen und das Choleragenoid werden beide selektiv an einem Rezeptor fixiert, der 1973 identifiziert
und mit "Gangliosid G " bezeichnet wurde.
Verschiedene Autoren haben die Bedeutung des Choleragens und des Choleragenoids für die Herstellung von Vaccinen
beschrieben und daraus ist der Schluß zu ziehen, daß es nützlich ist, bedeutende Mengen dieser Produkte erhalten
zu können.
Die Reinigung des Choleragens und des Choleragenoids wurde von zahlreichen Autoren beschrieben, erfordert aber
häufig zahlreiche Stufen, um zu einwandfrei gereinigten und standardisxerten Produkten zu gelangen; daher sind
diese Methoden schwer in die Industriepraxis umzusetzen. Durch Chromatographie mit biospezifischer Affinität
ist es theoretisch möglich, in einer einzigen Stufe das gewünschte Produkt in einem sehr reinen Zustand zu erhalten.
So hat Cuatrecasas (1973) eine Methode beschrieben, um das Choleratoxin durch Affinitätschromatographie
selektiv zu erfassen. Agarose-Chromatographiesäulen wurden chemisch modifiziert, um das Gangliosid GM1 über
kovalente Bindung zu fixieren. Dank der Affinität für das GM1 war die Fixierung des Choleratoxins tatsächlich
möglich, aber die Wiedergewinnung dieses Toxins war aufgrund einer extrem starken Affinität zwischen GM1, an
die Agarose gebunden, und dem Toxin schwierig geworden. Dies machte die Verwendung denaturierender Medien zur
Spaltung des Komplexes notwendig und zog eine Denaturie-
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rung und schlechte Ausbeuten am Ende des Arbeitsgangs nach sich. Andererseits zwingt die gepriesene Methode
der Aktivierung von Agarose zur Verwendung des sehr gefährlich zu handhabenden Bromcyans, was folglich zu
unerwünschten Komplikationen bei einer eventuellen industriellen Entwicklung führen kann. Im übrigen
haben sich die auf Agarose nach der Bromcyanmethode hergestellten Präparate als ziemlich instabil, vorallem
bei sauren pH-Werten (pH ^ 3) erwiesen; da eine Ansäuerung des Mediums zur Rückgewinnung des Choleratoxins
notwendig war, ist erkennbar, daß die Lebensdauer dieser Träger mit dem Risiko behaftet ist, im Falle industrieller
Anwendung kurz zu sein.
Die Erfindung ermöglicht die Ausnutzung der Leistungsfähigkeit und Schnelligkeit der biospezifische Affinität
anwendenden Chromatographie, aber unter Verwendung eines Trägers für die Chromatographie, der sich für die
industrielle Verwendung vollkommen eignet.
Die Verwendung dieses Trägers bei der biospezifischen Affinität ist erst möglich, nachdem der auf der internen
Oberfläche der Poren gewählte Ligand unbeweglich gemacht worden ist.
Zwei Arten verschiedener Liganden, beide für das Choleratoxin spezifisch, wurden eingesetzt. Der erste ist ein
Derivat des Gangliosids GM1, das mit einer starken und
für das Choleragen und das Choleragenoid spezifischen "biochemischen Affinität" ausgestattet ist. Der zweite
ist der Anticholeratoxin-Antikörper, ausgestattet mit einer spezifischen "immunologischen Affinität" gegenüber dem
Choleragen und dem Choleragenoid. Die Affinität des Toxins für das Gaiigliosid GM1 ist bekanntlich sehr
stark und wahrscheinlich stärker als die Affinität für Antikörper. Nach dem Aufpfropfen des Gangliosids GM1
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auf die Oberfläche des Siliciumdioxids nach den angegebenen Verfahren wurde jedoch festgestellt, daß die
erzielte Affinität zwischen dem so bepfropften G1
und dem Choleratoxin vollständig reversibel ist. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Cuatrecasas ist es also
möglich, das Choleratoxin unter verhältnismäßig milden Elutionsbedingungen rückzugewinnen. Dies ist theoretisch
nicht erklärbar und stellt ein überraschendes Ergebnis dar.
Zur Elution des an dem erfindungsgemäßen Material fixierten Choleratoxins kann man einen sauren Puffer verwenden,
z.B. einen sauren Citratpuffer, eine stark konzentrierte
Lösung von Harnstoff, Guanidin, Jodid (z.B. Natriumjodid), Thiocyanat (z.B. Kaliumthiocyanat) oder jedem
anderen chaotropen oder denaturierenden Mittel.
Bezüglich der Stabilität der aufgepfropften Liganden wurde erfindungsgemäß ebenfalls ein wesentlicher Fortschritt
erzielt. Es ist tatsächlich möglich, regelmäßig die Träger mit Lösungen, wie 0,1η HCl oder 0,1η NaOH zu waschen,
d.h. mit einem pH von 1 bis 13, ohne daß die Qualitäten der biospezifischen Affinität darunter leiden. Solche
Stabilitäten gibt es bei den bekannten Trägern beispielsweise auf der Basis von Agarose nicht, die nicht auf extreme
pH-Werte gebracht werden dürfen.
Schließlich haben auf mechanischem Gebiet mögliche Durchsätze von 200 bis 400 ml/cm2/h und das Fehlen einer Verdichtung
des Trägers die Bedeutung dieser neuen Methoden für die beabsichtigte industrielle Entwicklung bestätigt.
B. Andere Anwendungen
Mit dem erfindungsgemäßen Material mit Lysin als Aminomolekül
kann die Lysin-Plasminogen-Affinität zur Isolierung
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und Reinigung des Plasminogens des Blutes vorteilhaft genutzt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Material mit meta-Aminophenylboronsäure
als Aminomolekül ist es möglich, Zucker und Makromoleküle, die Zucker mit cis-Cb -Glykol-Funktion
tragen (Glykoproteine, Nukleinsäuren und Lipopolysaccharide)
reversibel zu fixieren.
Ebenso kann man unter Verwendung von Bakterienantigenen als Aminomolekül die entsprechenden Antikörper reversibel
fixieren; unter Verwendung von j^-Globulinen als Aminomolekül
kann man die entsprechenden Antigene reversibel fixieren; unter Verwendung von Bakterientoxinen als Aminomolekül
kann man insbesondere die entsprechenden Antikörper fixieren usw.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1 - Pfropfung des Lysogangliosids GM1 auf einen
mineralischen, porösen mit Diäthylamxnoäthyldextran imprägnierten und dann vernetzten Träger.
1.1. Der Träger auf der Basis von DEAE-Dextran wird nach einer der im Hauptpatent erwähnten Techniken hergestellt.
10 g Spherosil XOB 030 werden zu 30 ml DEAE-Dextran, 7,5 %, bei pH 11,5 gegeben. Das Ganze wird eine Nacht bei 800C
getrocknet, dann mit 30 ml einer Lösung von Butandioldiglycidylather,
1,5 % in Äthyläther, versetzt. Der Äther wird in einem Luftstrom verdampft, dann wird das Ganze
zur Vernetzung des DEAE-Dextrans 15h auf 800C gebracht.
1.2. Die Lösung der Ganglioside wird durch Ionenaustauschchromatographie
an porösem Siliciumdioxid, imprägniert mit DEAE-Dextran nach der in Beispiel 8 der DE-AS 26 33
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beschriebenen Methode, hergestellt.
Die so erhaltene rohe Gangliosid-Lösung enthält ungefähr 40 % Gangliosid GM1, das für die Erfindung brauchbar
ist.
Die beiden N-Acetyl-Funktionen und die N-Acyl-Funktion
des Gangliosids GM1 werden dann zu NH2-Aminofunktionen
durch alkalische Hydrolyse nach der zuvor von Holmgren, Mansson und Svennerholm "Medical Biology" (1974), 52,
229 - 233, beschriebenen Arbeitsweise hydrolysiert. Das so erhaltene Produkt wird Lysogangliosid genannt,
es besitzt drei NH2-Funktionen pro Molekül. Nach dem
Lyophilisieren wird das erhaltene Pulver in einem 0,01m Carbonatpuffer vom pH 9 mit 20 g/l NaCl zu einer Konzentration
von 1 mg/ml gelöst. Ein ml dieser Lösung enthält etwa 370 μg Sialinsäure pro ml.
1.3. Perjodat-Oxidation des Trägers 10 g Spherosil XOB 030, mit DEAE-Dextran imprägniert und
dann vernetzt, werden mit 100 ml einer wäßrigen, 0,02m Natriumperjodatlösung versetzt (pH bei 4,5). Die Oxidationszeit
beträgt 2h, Raumtemperatur reicht hierfür sehr gut aus.
Der Träger wird dann in einer 0,01m Natriumcarbonatlösung vom pH 9, mit 20 g/l Natriumchlorid versetzt, gewaschen.
Die höhere Ionenstärke dieses Puffers soll die kationischen Gruppierungen des vernetzten und oxidierten
DEAE-Dextrans durch Cl -Ionen sättigen und sie daran hindern, das Lysogangliosid durch elektrostatische Kräfte
schließlich zu fixieren, was die Gefahr heraufbeschwören würde, die Reaktion der Aminogruppen mit den
Aldehyd-Funktionen des Trägers zu behindern.
909813/095"?
In diesem Stadium treten die Aldehyd-Funktionen des oxidierten Trägers leicht hervor. In Gegenwart eines
Schiff'sehen Reagenz entwickelt sich eine intensive
violett-rosa Verfärbung.
1.4. Pfropfung des Lysogangliosids
Der obige Träger wird gewaschen, dann mit 50 ml der Lösung des Lysogangliosids GM1 versetzt. Nach einer
Kontaktzeit von 2 h wird die überstehende Flüssigkeit dekantiert. Durch eine Dosierung von Sialinsäure kann man
leicht zeigen, daß praktisch das gesamte Lysogangliosid
gekuppelt worden ist (95 bis 100 %).
Der Träger wird mit Carbonatpuffer vom pH 9 gespült. In
diesem Stadium ist leicht zu zeigen, daß die Färbung des Trägers mit dem Schiff-Reagenz viel schwächer ist als
in der vorhergehenden Stufe, was eine gute Fixierung des Lysogangliosids an die Aldehyd-Funktionen des oxidierten
Trägers anzeigt.
1.5. Reduktion mit Natriumborhydrid
50 ml einer 0,2m NaBH.-Lösung in Wasser (pH 9) werden
zu dem obigen Träger gegeben. Nach einer Kontaktzeit von 2 h bei Raumtemperatur wird der Träger mit Wasser
gespült und dann in eine Säule gebracht. Nach Gleichgewichtseinstellung
in dem gewählten Chromatographie-Puffer (0,01m Phosphatpuffer vom pH 7,2 mit einem Gehalt
von 20 g/l NaCl) ist die Säule mit biospezifischer Affinität zur Verwendung bereit.
In diesem Stadium ist keine Spur von Aldehydfunktion mehr durch Verfärbung mit dem Schiff"sehen Reagenz festzustellen.
Die Aldehyd-Funktionen, die mit dem Lysogangliosid nicht reagiert haben, werden ihrerseits in primäre Alkoholfunktionen
überführt.
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Zu bemerken ist, daß der so erhaltene Träger vollkommen als Ionenaustauscher wirken kann. Will man die ionischen
Wechselwirkungen mit den Proteinen unterdrücken, um nur die biospezifischen Wechselwirkungen beizubehalten,
muß also eine Mindestionenstärke vorliegen. In der Praxis reicht eine Mindestkonzentration von 10 g/l
NaCl zur Unterdrückung des Ionenaustauscheffekts.
1.6. Folgt man streng der gleichen Technik, kann man ebenso wirksam Lysin, Phenylalanin, Phenylhydrazin,
meta-Aminophenylboronsäure pfropfen. Man stellt fest, daß man auch jedes Molekül, das NH--Funktionen trägt, pfropfen
kann, z.B. ein Enzymsubstrat oder -inhibitor, einen Hormon-, Protein-, Virus- oder Bakterienrezeptor, ein
Antigen oder einem Antikörper, und daß man jeden dieser Träger bei der biospezifischen Affinitätschromatographie
einsetzen kann.
Beispiel 2 - Pfropfung von Lysogangliosid GM1 auf einen
mit Cellulose imprägnierten mineralischen, porösen Träger
2.1. Imprägnierung mit Cellulose
10 g Spherosil XOC 005 Coder irgendeines anderen mineralischen,
porösen Trägers) werden mit 30 ml einer 3%igen Celluloseacetat/Acetonlösung versetzt (Cellulosepropionat
oder andere in einem organischen Lösungsmittel lösliche und hydrolysierbare Äther können auch geeignet sein,
vorausgesetzt,sie liefern wieder bei alkalischer Hydrolyse
die Ausgarrgscellulose) .
Das Ganze wird unter einem warmen Luftstrom getrocknet.
Das Pulver kann dann, wenn nötig, gesiebt und in eine Säule gebracht werden.
Dann wird mit 10 1 einer 0,1η wäßrigen NaOH-Lösung bei
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einem Durchsatz von 500 ml/h eine Nacht lang kontinuierlich gewaschen. Nach dieser alkalischen Hydrolyse
kann die Säule mit Aceton oder mit Wasser, je nach pH, gewaschen werden, die so regenerierte Cellulose ist
nicht mehr löslich und bleibt vollständig in den Poren des mineralischen, porösen Trägers, die sie um so besser
auskleidet, je leichter das Ausgangspolymere insgesamt zur internen Oberfläche Zutritt hatte. Aus diesem
Grunde ist die Verwendung von Celluloseestern mit möglichst geringem Molekulargewicht ratsam.
2.2. Herstellung der Lösung des Lysogangliosids GM1
mit Aminofunktionen
Die Bedingungen sind die gleichen wie im Abschnitt 1.2.
2.3. Perjodatoxidation des Trägers
Die Bedingungen sind die gleichen wie im Abschnitt 1.3.
2.4.. Pfropfung des Lysogangliosids Die Bedingungen sind die gleichen wie im Abschnitt 1.4.
2.5. Reduktion mit Natriumborhydrid, NaBH4
Die Bedingungen sind die gleichen wie im Abschnitt 1.5.
Im Unterschied zu dem im vorhergehenden Beispiel hergestellten Träger besitzt dieser keine Ionenaustauscheigenschaften und kann also gegebenenfalls für geringere Ionen
kräfte eingesetzt werden, in Fällen, in denen dies von Vorteil ist. Für die Affinität zwischen dem Lysogangliosid
und dem Choleratoxin ist dies gleichgültig.
2.6. Folgt man streng der gleichen Technik, kann man Ionenauetauechfunktionen insbesondere mit 3-Diäthylaminopropylamin od«r Ν,Ν-Diäthyläthylendiamin aufpfropfen und
die so erhaltenen Träger bei der Chromatographie von Proteinen
einsetzen.
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2.7. Folgt man stets der gleichen Technik/ kann man verschiedene
Liganden mit Aminofunktionen aufpfropfen, also Lysin, Phenylalanin, Phenylhydrazin, meta-Aminophenylboronsäure,
und die so erhaltenen Träger bei der biospezifischen Affinitätschromatographie einsetzen.
Ebenso kann man jedes Molekül mit Aminofunktion(en) aufpfropfen, z.B. ein Enzymsubstrat oder -inhibitor,
einen Hormon-, Protein-, Virus- oder Bakterienrezeptor, ein Antigen oder einen Antikörper, und jeden dieser Träger
bei der biospezifischen Affinitätschromatographie verwenden.
Beispiel 3 - Verwendung beim Isolieren und Reinigen des Choleratoxins
Die in den vorhergehenden Beispielen (außer 2.6.) beschriebenen Säulen sind bei der biospezifischen Affinitätschromatographie
anwendbar. Die Gegenwart von 10 bis 20 g/l NaCl in dem Chromatographiepuffer wird empfohlen,
um jede nicht-spezifische Wechselwirkung ionischer Art mit den elektrischen Ladungen der Ionenaustauschfunktionen
der Liganden oder der auf dem Träger vorhandenen Proteine zu beseitigen.
Durch Hindurchführen eines mit 10 g/l NaCl versetzten Filtrats einer Kultur von Choleravibrionen durch jede
dieser Säulen ist leicht festzustellen, daß das Choleragen und das Choleragenoid sich an den Träger hängen.
Um unter der maximalen Fixierkapazität der Säule zu bleiben, wird das am Auslauf der Säule aufgefangene Filtrat
vollständig von toxischer, nach bekannten Teats meßbarer Aktivität befreit.
Nach dem Waschen mit dem Chromatographiepuffer zum Eliminieren
nicht-fixierter Proteine kann man das fixierte
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Choleragen und Choleragenoid durch Elution mit dem 0,05m Citrat/Zitronensäure-Puffer vom pH 2,8 rückgewinnen.
Die dabei eingetretene Denaturierung ist offenbar vernachläßigbar, da die erhaltenen Ausbeuten
zwischen 50 und 100 % liegen, gemessen nach den klassischen Tests der Dosierung des Choleratoxins.
Die Reinheit des Präparats kann chromatographisch an Sephadex G-200 (das Choleragen liefert einen Peak entsprechend
einem Molekulargewicht von 84.000, das Choleragenoid liefert einen Peak entsprechend einem
Molekulargewicht von 56.000) oder nach immunochemischen Methoden mit Kontrollantiseren ermittelt werden (ein
Antikulturfiltrat-Antiserum ohne Anticholeratoxin-Antikörper
darf keine Fällungslinie mit diesen gereinigten Präparaten geben).
Eine Säule mit 10 g, hergestellt nach einer der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Methoden, ermöglicht
die Behandlung von KuItürfiltratmengen von 500 ml
bis 10 1, wobei die genaue Menge offenbar von mehreren
Parametern abhängt, d.h. der Menge des in dem Kulturfiltrat vorhandenen Toxins und der Menge an GM1 in der
rohen Gangliosid-Lösung.
Die möglichen Anwendungen sind folgende:
Herstellung einer Lösung gereinigten Choleragens und Choleragenoids zur Herstellung eines Vaccins,
Befreien eines Choleravibrionen-Kulturfiltrats von jeder
Spur Choleragen und Choleragenoid,
Herstellen von Antisera gegen diese beiden Arten von
Lösungen.
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Beispiel 4 - Trennung der Bestandteile eines Gemisches von ^-Globulinen, Albumin und Choleratoxinen in einer
einzigen Chromatographie.
Dieses Beispiel soll die Möglichkeiten der gleichzeitigen Verwendung des im Beispiel 1 beschriebenen Materials
zugleich bei der Ionenaustauschchromatographie und der Affinitätschromatographie zeigen. Im Gegensatz zum vorigen
Beispiel 3 gibt man kein Natriumchlorid in das Chromatographielösungsmittel, das ein künstliches Gemisch
von drei Proteinen enthält;
^-Globuline, Albumin und Choleratoxin. Die /""-Globuline,
die einen elektropositiven Charakter zeigen, werden an der Schicht modifizierten DEAE-Dextrans nicht adsorbiert,
während das Albumin, das einen elektronegativen Charakter zeigt, an dieser Schicht fixiert wird. Das Choleratoxin
wird an den Stellen mit Lysogangliosid G .. fixiert. Verwendet man einen Chromatographie-Puffer mit geringer
Ionenstärke (0,01m Phosphatpuffer vom pH 6,8), findet man
die ^-Globuline am Säulenauslauf in Form nicht-adsorbierten Peaks wieder. Durch anschließende Elution mit einem
10 g/l Natriumchlorid enthaltenden Puffer wird das Albumin verdrängt und eluiert. Die endgültige Elution
mit einem Citratpuffer vom pH 2,8 ermöglicht dann die
Elution des Choleratoxins.
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Claims (23)
1. Festes, poröses, in Chromatographiesäulen brauchbares
Material, das biologische Makromoleküle reversibel zu fixieren vermag, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich aus einem porösen, mineralischen, mit einem Polysaccharidpolymeren oder einem modifizierten
Polysaccharidpolymeren zusammensetzt, wobei der Polysaccharidüberzug, wenn nötig, in vernetztem
Zustand zur Begünstigung seiner Stabilisierung vorliegt, und daß auf den gegebenenfalls modifizierten
Polysaccharidüberzug aminierte Moleküle oder Makromoleküle aufgepfropft sind, die bei der Chromatographie
eine reaktive Stelle darstellen können und der Formel
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20ΑΠ503
R1 - NH~ entsprechen, wobei R' der Rest des aminierten
Moleküls oder Makromoleküls ist, wobei die Pfropfbindung des aminierten Moleküls oder Makromoleküls
der schematischen Formel
R3 - CH2 -NH-R'
entspricht, worin R1 wie zuvor definiert ist und
R3 - CH2 - den Rest des Polysaccharidpolymeren oder
des Polysaccharidpolymeren, das modifiziert wurde, nachdem dieses einer oxidativen Spaltung mit nachfolgender
Reduktion unterworfen worden ist, bedeutet.
2. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der mineralische poröse Träger ein Metalloxid, wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid, ein Oxid
des Titans oder ein synthetisches oder natürliches Derivat dieser Oxide, wie Gläser, Silikate, Borsilikate
oder Kaolin, ist.
3. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polysaccharidpolymere oder das modifizierte Polysaccharidpolymere Polymere
sind, die zu der bekannten Reaktion der oxidativen Spaltung befähigt sind.
4. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polymere aus der Gruppe Dextran, Cellulose, Stärke und der entsprechenden
modifizierten Polymeren ausgewählt ist.
5. Material nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Polymere ein modifiziertes Polysaccharid der schematischen Formel
R-(CH9) -N <T
2 η
R2
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ist, worin R den Rest des Polysaccharidpolymeren bedeutet,
η eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und R-.und R2 einen Niederalkylrest oder einen hydroxylierten
Niederalkylrest bedeuten.
6. Material nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte Polysaccharidpolymere aus der Gruppe
Diäthylaminoäthyldextran, Diäthylartiinoäthylstärke oder
Diäthylaminoäthylcellulose ausgewählt ist.
7. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polymere vernetzt ist.
8. Material nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel eine Dicarbonylverbindung, ein
Halogenhydrin oder ein Diepoxid ist.
9. Material nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel 1,4-Butandioldiglycidylather,
Epichlorhydrin, Epibromhydrin oder ein Epoxid der Formel
CH0 - CH - R„ - N - R,- - CH - CH0
ist, worin R_ ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen
ist, vorzugsweise ein Niederalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, und R4 und Rg eine Kohlenwasserstoff
kette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein Niederalkylenrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
sind.
10. Material nach einem der Ansprüche 1, 2 und 7 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharidpolymere Cellulose ist.
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11. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das aminierte Molekül oder Makromolekül ein Enzymsubstrat oder -inhibitor,
ein Hormon-, Protein-, Virus- oder Bakterienrezeptor, ein Antigen oder ein Antikörper ist.
12. Material nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das aminierte Molekül oder Makromolekül aus
der Gruppe eines Polyamine, wie des 3-Diäthylaminopropylamins oder des Ν,Ν-Diäthylendiamins,
des Lysins, Phenylalanins, Phenylhydrazins, Taurins,
•^-Aminocapronsäure, meta-Aminophenylboronsäure,
der Bakterienantigene, der Globuline,insbesondere der ,^-Globuline, der Bakterientoxine, der Viren
oder deren Abbauprodukte, wie der verschiedenen viralen Antigene, und der Zellenrezeptoren ausgewählt
ist.
13. Material nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellenrezeptor ein Produkt aus der vollständigen
oder teilweisen Hydrolyse der N-Acyl- und N-Acetylgruppen
eines Gangliosids ist.
14. Material nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellenrezeptor das Lysogangliosid GM1 ist.
15. Verfahren zur Herstellung eines Materials gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß man den mineralischen porösen Träger mit dem Polysaccharidpolymeren oder dem modifizierten
Polysaccharidpolymeren überzieht, daß man, wenn gewünscht, den Polysaccharidüberzug in einen modifizierten
Polysaccharidüberzug überführt, daß man, wenn nötig,
eine Vernetzung zur Stabilisierung des Überzugs vornimmt, daß man den gegebenenfalls modifizierten Polysaccharidüberzug
einer Perjodat-Oxydation unterwirft,
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daß man das so erhaltene Oxidationsprodukt mit dem Aminomolekül oder Aminomakromolekül der Formel
R1 - NH2 reagieren läßt und dann das erhaltene
Iminoderivat der Einwirkung eines Reduktionsmittels, das die Iminobindung zu einer Aminobindung
zu reduzieren vermag, unterwirft.
16. Verfahren zur Herstellung eines festen, porösen,
mit Cellulose oder modifizierter Cellulose überzogenen
Materials, insbesondere gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man einen
mineralischen, porösen Träger mit einer Lösung eines hydrolysierbaren Celluloseesters imprägniert, den
so erhaltenen überzogenen Träger trocknet und mit einer wäßrig-alkalischen Lösung zur Hydrolyse der
Estergruppierungen behandelt und so einen mit Cellulose überzogenen mineralischen, porösen Träger erhält
und dann, wenn gewünscht, den Celluloseüberzug in einen
modifizierten Celluloseüberzug überführt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß
man den Celluloseüberzug in einen Überzug modifizierter Cellulose durch Umsetzen des mit Cellulose überzogenen
Materials mit einer Verbindung der Formel X - (CH2) - NR. (R2) , worin n, R.. und R2 wie in Anspruch
5 definiert sind und X ein Halogenatom ist, überführt.
18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
daß die oxidative Spaltung mit Hilfe von Perjodsäure oder einem ihrer Derivate durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 und 18, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reduktion mit einem Hydrid, wie Natriumborhydrid, durchgeführt wird.
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20. Verwendung des Materials gemäß einem der Ansprüche bis 14 in einer Säule, durch die man eine Lösung
mit biologischen Makromolekülen, die man isolieren oder reinigen will, laufen läßt, wobei das mit einem
R'NEU-Molekül überzogene Material Affinität für
die zu entfernenden Verunreinigungen oder die zu isolierenden biologischen Makromoleküle aufweist,
um im letzteren Falle das biologische Makromolekül zu eluieren.
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Material mit Lysogangliosid GM1 überzogen ist, und wobei man eine
unreine Lösung von Choleratoxinen durch die Säule laufen läßt und dann das Toxin eluiert.
22. Verwendung nach Anspruch 20, in Verbindung mit einer Lösung mit einer Ionenstärke des zu reinigenden
Makromoleküls, die ausreicht, um jede nicht-spezifische
Wechselwirkung ionischer Art mit dem Trägermaterial zu vermeiden.
23. Verwendung nach Anspruch 20, wobei man eine Lösung geringer Ionenstärke mit einem ersten biologischen
Makromolekül mit ionischer Affinität für das Material und einem zweiten biologischen Makromolekül mit
biospezifischer Affinität durch das R1NH2-Molekül
über die Säule laufen läßt und das erste Makromolekül mit einer Lösung solcher Ionenstärke eluiert,
die zur Beseitigung der Wechselwirkungen ionischer Art ausreicht, und dann das zweite Makromolekül
mit einer Lösung eluiert, die den zwischen dem zweiten Makromolekül und den reaktiven Stellen des R1NH2-Moleküls
gebildeten Komplex zu dissoziieren vermag.
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