JPS5942452A - 免疫化学的測定試薬用担体の製造方法 - Google Patents

免疫化学的測定試薬用担体の製造方法

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JPS5942452A
JPS5942452A JP15293482A JP15293482A JPS5942452A JP S5942452 A JPS5942452 A JP S5942452A JP 15293482 A JP15293482 A JP 15293482A JP 15293482 A JP15293482 A JP 15293482A JP S5942452 A JPS5942452 A JP S5942452A
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JP
Japan
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cellulose
carrier
antigen
antibody
ethyleneimine
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JP15293482A
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Fumio Ishikawa
文雄 石川
Masahiro Nakaya
仲谷 正博
Yoshiharu Urata
浦田 義治
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Sekisui Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sekisui Chemical Co Ltd
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Publication date
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548Carbohydrates, e.g. dextran

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  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫化学的測定試薬における、抗原又は抗体を
結合させる担体の製造方法に関する。
免疫化学的測定法とけ、抗原(・・ブテンを含む)で実
験動物(例えば家兎)を免疫して、上記抗原と特異的に
結合する抗体(例えば抗体免疫グロブリン)を実験動物
に作らせ、仁の抗体と上記抗原との間の特異的な結合反
応を利用して、抗原または抗体を測定する方法である。
この測定法では、測定対象物で4る抗原または抗体と、
試薬として用いる抗原または抗体とを抗原抗体反応させ
るに際し、後者の抗原捷だけ抗体を放射性同位元素、酵
素、蛍光物質、不対電子をもつ化合物等で標識しておき
、抗原抗体反応した標識抗原またけ標識抗体上、未反応
の標識抗原または標識抗体の何れか一方の標識を測定す
る。したがって、この測定法では、il’fi常抗原抗
体反応した( Bound )標識抗wtたは標識抗体
と、未反応の(Free )標識抗原捷たは標識抗体と
を、分m (B / F分離)することが必要とされる
しかし、均一々溶液として抗原抗体反応を行々つた場合
には、B/F分離が極めて繁雑となる。そこで、B/F
分離を容易にするため、抗原または抗体を固体状の担体
に結合させ、こうして得られる同相化抗原または同相化
抗体を用いることが提案された。このような同相化抗原
または同相化抗体用の担体としては、セルロース寸たは
セファロースを担体とし、そのヒドロキシル基をブロム
シアンを用いて活性化し、抗原捷たは抗体と結合させる
もの、および、セファロースを化学修飾し、アミノ基、
メルカプト基等の官能基を導入し架橋剤を用いて抗原あ
るいは抗体と結合させるもの、ポリスチレンのビーズを
担体とし、抗原または抗体を物理的に吸着させるものが
知られている。しかし、これらは、官能基の導入に数段
階の反応を要したり、担体と抗原寸たけ抗体との結合率
が悪い々どの欠点があった。
この発明者は、上記の欠点を改善しようと考えた。そし
て、セルロースまたはその誘導体にエチレンイミンまた
はプロピレンイミンによりアミノ基を導入し、アミ7基
を利用して抗原または抗体を化学的に結合させる七、結
合率がよくなることを実験により確認した。、この発明
は、このような確認に基づいてなされたものである。
す在わち、この発明は、セルロースまたはその誘導体を
、エチレンイミンまたはプロピレンイミンと反応させ、
アミン基を導入することを特徴とする、免疫化学的測定
試薬用担体の’j’) j作方法に存する。
ξこで、セルロース誘導体には、セルロースエステル、
セルロースエーテルおヨヒセルロースエステルのエーテ
ルが含捷れる。そのうち、セルロースエステルにrr!
、−wルロースノ有機eエステル、無機酸エステル、お
よび有機酸・無機酸混合エステルが含まれる。有機酸エ
ステルには、低級脂肪酸セルロース(例えば酢酸セルロ
ース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、セル
ロースの酢酸・醋酸混合エステル)、高級脂肪酸セルロ
ース(倒えはカプリン酸セルロース、/(/L/チミン
酸セルロース)、スルホン酸セルロース1lJtはトシ
ルセルロース) kIF、5z含まれる。又一般に熱可
塑性セルロースと称される成形加工性にすぐれたものも
セルロース誘導体に包含される。無機酸エステルには、
硝酸→リレロース、硫酸セルロース等が含まれる。有機
酸・無機酸混合エステルには、酢酸・硝酸混合エステル
等が含寸れる。さらに、上に述べたものの部分加水分解
物も、本発明におけるセルロース誘導体に含まれる。セ
ルロースエーテルには、エチルセルロース、2−ヒドロ
キシプロピルセルロース、2.3−ジヒドロキシグチル
セルロース等が含まれる。
上記セルロース、捷たはその誘導体は、エチレンイミン
またはプロピレンイミンによりアミ7基が導入されるが
、ここで用いるセルロース寸たけその誘導体としては、
成形されたものが好ましい。その成形された粒子は、0
.1ないし10楕の大きさをもち、厚状または円柱状等
の形状であることが望ましい。成形加工性の良好な熱可
塑性セルロースを使用する場合射出成形法等の熱可塑性
樹脂の一般的力成形法によるこ七ができる。なお、成形
された粒子は、表層のみがセルロースまたはその誘30
体であり、中心部が他の物質(例えばポリスチレン、ガ
ラス等)であってもよい。また、表層のみがセルロース
であり、中心部がセルロースエステルであってもよい。
また、熱可塑性セルロースとしては、成形されたセルロ
ースエステルを加水分解したものが好適である。加水分
解は、例えばセルロースエステルを水酸化ナトリウム水
溶液に35〜600Cで0.5〜2時間浸漬し、水洗し
、数%の酸溶液中に短時間放置するこ表により行なわれ
る。
エチレンイミン、プロピレンイミンによるア    □
ミノ基の導入は、次のよう々方法で行なうことができる
セルロースの水酸基にアミ7基を導入するには、セルロ
ースを強酸、例えば、塩酸など、を含むエチレンイミン
あるいは′/プロピレンイミン水溶液中でO℃〜60°
Cで数時間〜数日反応させることによりアミノ基が3甲
入される。セルロースの代ワリにセルロースエステルの
部分加水分解物を用いると1、アミ7基が導入されたセ
ルロースのエステルが得られる。
寸だ、中ルロース、またはその誘導体中にカルボキシル
基、スルホン酸基、メルカプト基を含む場合はエチレン
イミンあるいはプロピレンイミン水溶液中で、容易にそ
れらの官能基にアミ7基が導入される。
この発明の担体の製造法は、エチレンイミン、−プロピ
レンイミンによりアミノ基を導入するので反応が1段階
ですみ、セルロースまたはその誘導体中にアミン基が導
入されるので、そのアミ7基と抗原あるいは、抗体を架
橋剤を用いて結合させることができ、セルロースにブロ
ムシアンを用いて結合させる場合およびポリスチレンの
物理吸着による場合傾比較して、抗原または抗体の結合
率が高い。したがって、この発明の担体の製造方法を用
いて担体を製造すると容易に、精度の高い測定を行なう
ことのできる、固相化抗原オたけ固相化抗体用の担体を
製造することができる。
また、アミン基という反応性の高い基を用いて結合させ
るので、抗原または抗体との結合方法として、色々な方
法を用いることがてき、その結果、結合できる抗原また
は抗体の範囲が拡大されている。すなわち、抗原または
抗体が、メルカプト基、アミン基、カルボキシル端、ス
ルホン酸基のうち少ガくとも何れか1つの基をもってい
ると、その基をアミノ基が導入されたセルロースまたは
その誘導体上のアミン基と結合させることができる。さ
らに、アミン基と抗原または抗体との間に架橋基を介在
させるこ七により、抗原または抗体をグルコース単位が
ら離すことができ、それによって、抗原抗体反応を行な
う際の立体障害を避けることができる。
また、セルロースまたはその誘導体を基本性格とするの
で、面前中の妨害物質の吸着が少なく、その結果測定誤
差が少ない。さらに、セルロース誘導体は成形が容易で
あり、取扱い易い大きさの粒子とすることができる。こ
のように、この発明の担体の製造方法は、数多くの利点
を有する。
以下、実施例および比較例により、この発明の実施態様
と効果を詳細に説明する。
実施例1 (5) アミノ基が導入されたセルロース誘導体の製造 2酢酸セルロースを、底面の直径6ff、高さ4ffの
円柱状に射出成形し、これを4%水酸化ナトリクム水溶
液中に50℃で1時間浸漬して、加水分解した。その後
水洗し、0.IN塩酸中に室温で1時間浸漬し、水洗、
乾燥して、表層が加水分解され、中央部が2酢酸セルロ
ースのままの円柱状成形物を得た。
これを0. OI Mの塩酸を含む10%エチレンイミ
ン水溶液中で室温で24時間反応させ水洗、乾燥しアミ
ノエチル酢酸セルロース(部分加水分解物)(以下担体
Aという)を得た。
アミ7基が導入されたことの確認は担体Aをα05%2
,4.6−)リニトロベンセ°ンスルホン酸ナトリクム
の0.5MNRHCOa溶液中で室温で1時間反応させ
担体Aが黄色に染色されることにより確認した。
] 測定試薬の製造 担体Aを容器に入れ、ウサギIgGに対する、1125
で標識した抗体の0.1 M !Jリン酸衝液(pH値
7.4)溶液(抗体の濃度:1mg/me)を5+nI
!量加え、続いて25重重景のグルタルアルデヒド水溶
液を15 ml加えたのち、20℃で1時間インキュベ
ートした。次いで0.1 Mリン酸綴街液で洗浄し、0
.1重量%の牛血清アルブミンを含む0.1 M IJ
ン酸a術液5−中に移し4℃で16時間インキュベート
した。インキュベート後の担体を取出しくこれを測定試
薬AGと名付ける)、放射活性を測定した。対照として
、担体Aと同一形状のポリスチレン成形物(以下担体B
という)に同じ処理を施したもの(これを測定試薬BG
と名付ける)と、担体A、Bについて2.5%のグルタ
ルアルデヒド水溶液の代りに蒸留水を加えた以外は同じ
処理を施こしたもの(これらを夫々測定試薬AP 、B
Pと名付ける)を用意し、放射活性を測定した。
(C1測定試薬と抗原の反応 試験管に■125で標識したウサギIgG(以下抗原と
いう)の0.1重量%の牛血清アルブミンを含むαIM
jJン酸緩衝液の溶液(濃度 10mg1暢 1nりを容器1ooTnlすっとり、(6)で製造1−
だ測定試薬AG、BG、AP、BPを加え、20℃で1
6時間インキュベートした。インキュベート後、1−の
0.1重量%の牛血清アルブミンを含む0.1 M !
Jンe緩衝液により3回ずつ測定試薬AG、BG、AP
、BPを洗浄し、次いでこれらの測定試薬を取出し放射
活性を測定した。
CB)で測定した放射活性との差を求め、測定試薬AG
、BG、AP、BP中の抗体と反応した抗原の量の比較
をした。
(D)   結  果 第1図は(B)で測定した放射活性をグラフにしたもの
であるが、担体Aについては測定試薬APよりも、本発
明による測定試薬AGの方がより多く結合していること
がわかった。これは測定試薬APの場合は、抗体が物理
的に担体A上に吸着しているKすぎないのに対し、測定
試薬AGの場合は抗体がグルタルアルデヒドという架橋
剤により化学的に担体A上に結合していることを示す。
又、測定試薬BP1BGと比較しても、測定試蓼AGの
方が抗体との結合量がほぼ同等か、それ以上であること
がわかる。
第2図は、(C)で測定した放射活性と(B)で測定し
た放射活性の差、すなわち抗体と反応した抗原の量に相
当する値をグラフにしたものでちる。
本発明による測定試薬AGの方が対照となる測定試薬A
P、BP、BGK比較してより多くの抗原と反応してい
ることを示す。
このため、本発明による測定試薬AGは、放射線免疫測
定(RIA)、酵素免疫測定(EIA)#Fによる免疫
崩清検査において、測定可能領域を広くとることができ
、精度のよい測定ができるととKなる。
【図面の簡単な説明】
第1図は実施例1(B)で測定した測定試薬AG1AP
1BG、BPの夫々の放射活性の値を示すグラフであり
、又@2図は実施例1(C)で測定した放射活性の値か
ら(B)で測定した放射活性の値を差引いた値を測定試
薬AG1/¥P、BG、BPの犬々について示すグラフ
である。 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 胛 沼 基 利

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 セルロースまたはその誘導体を、エチレンイミンま
    たtまグロビレンイミンと反応させ、アミノ基を導入す
    ることを特徴とする、免疫化学的測定試薬用担体の製造
    方法 2、 セルロースの誘導体が、セルロースエステルであ
    る、特許請求の範囲第1項記載の免疫化学的測定試薬用
    担体の製造方法 3、 セルロースの誘導体がセルロースエステルのエー
    テルである、特許請求の範囲第1項記載の免疫化学的測
    定試薬用担体の製造方法 4、  (=ルロースの誘導体がセルロースエーテルで
    ある、特許請求の範囲@1項記載の免疫化学的測定試薬
    用担体の製造方法 5、 セルロースの誘導体が、部分加水分解物である、
    特許請求の範囲第1項記載の免疫化学的測定試薬用担体
    の製造方法
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