JPH0123064B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、免疫化学的測定法で用いる、新規
な測定試薬に関するものである。

免疫化学的測定法とは、抗原（ハプテンを含
む）で実験動物（例えば家兎）を免疫して、上記
抗原と特異的に結合する抗体（例えば抗体免疫グ
ロブリン）を実験動物に作らせ、この抗体と上記
抗原との間の特異的な結合反応を利用して、抗原
または抗体を測定する方法である。

この測定法では、測定対象物である抗原または
抗体と、試薬として用いる抗原または抗体とを抗
原抗体反応させるに際し、後者の抗原または抗体
を放射性同位元素、酵素、螢光物質、不対電子を
もつ化合物等で標識しておき、抗原抗体反応した
標識抗原または標識抗体と、未反応の標識抗原ま
たは標識抗体の何れか一方の標識を測定する。し
たがつて、この測定法では、通常抗原抗体反応し
た（Bound）標識抗原または標識抗体と、未反応
の（Free）標識抗原または標識抗体とを、分離
（Ｂ／Ｆ分離）することが必要とされる。

しかし、均一な溶液として抗原抗体反応を行な
つた場合には、Ｂ／Ｆ分離が極めて繁雑となる。
そこで、Ｂ／Ｆ分離を容易にするため、抗原また
は抗体を固体状の担体に結合させ、こうして得ら
れる固相化抗原または固相化抗体を用いることが
提案された。このような固相化抗原または固相化
抗体としては、セルロースまたはセフアロースを
担体とし、そのヒドロキシル基をブロムシアンを
用いて活性化し、抗原または抗体と結合させたも
の、および、ポリスチレンのビーズを担体とし、
抗原または抗体を物理的に吸着させたものが知ら
れている。しかし、これらは、担体と抗原または
抗体との結合率が悪いという欠点があつた。

この発明者は、上記の欠点を改善しようと考え
た。そして、セルロースまたはその誘導体にメル
カプト基を導入し、キクシンイミドイル基を介し
てメルカプト基に抗原または抗体を化学的に結合
させると、結合率がよくなることを実験により確
認した。この発明は、このような確認に基づいて
なされたものである。

すなわち、この発明は、一般式 で表わされる免疫化学的測定試薬を要旨とするも
のである。ここで、Ｘは抗原または抗体、Ｙは直
接結合または架橋基、Cellはセルロース基、Ｚは
直接結合またはセルース誘導体における置換基を
表わす。

上記メルカプト基を含むセルロースまたはセル
ロース誘導体には、セルロースまたはセルロース
誘導体において、グルコース単位中のヒドロキシ
ル基がメルカプト基に変えられた化合物、および
セルロース誘導体において、グルコース単位以外
の部分にメルカプト基が存在している化合物が含
まれる。

ここで、セルロース誘導体には、セルロースエ
ステル、セルロースエーテルおよびセルロースエ
ステルのエーテルが含まれる。そのうち、セルロ
ースエステルには、セルースの有機酸エステル、
無機酸エステル、および有機酸・無機酸混合エス
テルが含まれる。有機酸エステルには、低級脂肪
酸セルロース（例えば酢酸セルロース、プロピオ
ン酸セルロース、酪酸セルロース、セルロースの
酢酸・酪酸混合エステル）、高級脂肪酸セルロー
ス（例えばカプリン酸セルロース、パルミチン酸
セルロース）、スルホン酸セルロース（例えばト
シルセルロース）等が含まれる。無機酸エステル
には、硝酸セルロース、硫酸セルロース等が含ま
れる。有機酸・無機酸混合エステルには、酢酸・
硝酸混合エステル等が含まれる。さらに、上に述
べたものの部分加水分解物も、セルロースエステ
ルに含まれる。セルロースエーテルには、エチル
セルロース、２―ヒドロキシプロピルセルロー
ス、２，３―ジヒドロキシブチルセルロース等が
含まれる。

上記メルカプト基を含むセルロースまたはセル
ロース誘導体は、セルロースまたはセルロース誘
導体にメルカプト基を導入することにより製造さ
れるが、ここで用いるセルロースまたはセルロー
ス誘導体としては、成形されたものが好ましい。
その成形された粒子は0.1ないし10mmの大きさを
もち、球状または円柱状等の形状であることが望
ましい。成形は、射出成形法等の熱可塑性樹脂の
一般的な成形法によることができる。なお、成形
された粒子は、表層のみがセルロースまたはセル
ロース誘導体であり、中心部が他の物質（例えば
ポリスチレン、ガラス等）であつてもよい。ま
た、表層のみがセルロースであり、中心部がセル
ロースエステルであつてもよい。

また、セルースとしては、成形されたセルロー
スエステルを加水分解したものが好適である。加
水分解は、例えばセルロースエステルを水酸化ナ
トリウム水溶液に35〜60℃で0.5〜２時間浸漬し、
水洗し、数％の酸溶液中に短時間放置することに
より行なわれる。

メルカプト基の導入は、次のような色々な方法
で行なうことができる。

まず、セルロース誘導体として酢酸セルロース
を選び、これに５塩化燐を反応させてクロロアセ
チルセルロースとし、次いでチオ硫酸ナトリウム
を反応させてブテン塩とし、ブテン塩を加水分解
または還元することによりメルカプト基を導入
し、こうしてメルカプトアセチルセルロースが得
られる。同様にして、メルカプト基を含む他の脂
肪酸セルロースが得られる。

次に、セルロースを選び、これにエピクロルヒ
ドリンを反応させて２，３―エポキシプロピルセ
ルロースとし、次いでチオ硫酸ナトリウムを反応
させてブンテ塩とし、ブンテ塩を加水分解または
還元することによりメルカプト基を導入し、こう
して２―ヒドロキシ―３―メルカプトプロピルセ
ルロースが得られる。セルロースの代りにセルロ
ースエステルの部分加水分解物を用いると、２―
ヒドロキシ―３―メルカプトプロピルセルロース
のエステルが得られる。

また、セルロースにビスオキシランを反応させ
て３，４―エポキシ―２―ヒドロキシブチルセル
ロースとし、これにチオ硫酸ナトリウムを反応さ
せてブンテ塩とし、ブンテ塩を加水分解または還
元することによりメルカプト基を導入し、こうし
て２，３―ジヒドロキシ―４―メルカプトブチル
セルロースが得られる。セルロースの代りにセル
ロースエステルの部分加水分解物を用いると、
２，３―ジヒドロキシ―４―メルカプトブチルセ
ルロースのエステルが得られる。

この発明における抗原としては、各種ポリペプ
チド系ホルモン、ステロイド系ホルモン、ビタミ
ンB₁₂、葉酸、サイロキシン、トリヨードサイロ
ニン、補体、α―フエトプロテイン、カルシノエ
ンブリオニツクアンチゲン、臓器および血液中の
各種酵素および蛋白質、HBs抗原等の各種微生
物抗原、植物ホルモン、抗生物質、抗てんかん剤
等の薬物等が用いられる。そのうち特に重要なも
のは、甲状腺ホルモン、下垂体ホルモン、HBs
抗原、インシユリン、免疫グロブリンおよび肝酵
素である。

この発明における抗体としては、上に述べた抗
原に対応して動物体内で生産されるものが含まれ
る。

上記のメルカプト基に抗原または抗体を化学的
に結合させるには、これらを直接結合させる方法
と、架橋基を介して結合させる方法とがある。

架橋基を介して結合させるには、メルカプト基
を含むセルロースまたはセルロース誘導体と、架
橋剤と、抗原または抗体とを逐次または同時に反
応させる。ここで用いる架橋剤としては、一端に
メルカプト基と結合し得る基をもち、他端にメル
カプト基またはアミノ基と結合し得る基をもつも
のが用いられる。具体的には、抗原または抗体が
メルカプト基を有する場合には、例えばＮ、
N′―オルトフエニレンジマレイミドが用いれる。
この場合には、抗原または抗体のメルカプト基
と、セルロースまたはセルロース誘導体上のメル
カプト基とが、下式 で示される架橋基を介して結合するに至る。

また、抗原または抗体がアミノ基を有する場合
には、例えばＮ―（ｍ―マレイミドベンゾイルオ
キシ）サクシンイミドが架橋剤として用いられ
る。この場合には、抗原または抗体のアミノ基
と、セルロースまたはセルロース誘導体上のメル
カプト基とが、下式 （但し、左側に抗原または抗体のアミノ基が結
合し、右側にセルロースまたはセルロース誘導体
上のメルカプト基が結合する）で示される架橋基
を介して結合するに至る。

ここで、抗原または抗体にメルカプト基を導入
するには、抗原または抗体がアミノ基をもつ場合
は、例えばメルカプトアルキルイミデート、イミ
ノチオシラン等のような化合物を用いることがで
きる。また抗原が水酸基をもつ場合は、例えば２
―イミノチオシランのような化合物を用いること
ができる。

この発明の測定試薬は、メルカプト基を含むセ
ルロースまたはセルロース誘導体を用いたので、
セルロースにプロムシアンを用いて結合させる場
合およびポリスチレンの物理吸着による場合に比
較して、抗原または抗体の結合率が高い。したが
つて、この発明の測定試薬を用いると、精度の高
い測定を行なうことができる。これが、この発明
のもたらす大きな利点である。

また、メルカプト基という反応性の高い基を用
いて結合させるので、抗原または抗体との結合方
法として、色々な方法を用いることができ、その
結果、結合できる抗原または抗体の範囲が拡大さ
れている。すなわち、抗原または抗体が、メルカ
プト基、アミノ基、カルボキシル基のうち少なく
とも何れか１つの基をもつていると、その基をセ
ルロースまたはセルロース誘導体上のメルカプト
基と結合させることができる。さらに、メルカプ
ト基をセルロースまたはセルロース誘導体のグル
コース単位以外の部分に導入するか、またはメル
カプト基と抗原または抗体との間に架橋基を介在
させることにより、抗原または抗体をグルコース
単位から離すことができ、それによつて、抗原抗
体反応を行なう際の立体障害を避けることができ
る。

また、セルロースまたはセルロース誘導体を基
本骨格とするので、血清中の妨害物質の吸着が少
なく、その結果測定誤差が少ない。さらに、セル
ロース誘導体は成形が容易であり、セルロースは
成形したセルロース誘導体から作ることができる
から、容易に取扱い易い大きさの粒子とすること
ができ、このように、この発明の測定試薬は、数
多くの利点を有する。

以下、実施例および比較例により、この発明の
実施態様と効果を詳細に説明する。

実施例 １ (A) メルカプト基を含むセルロース誘導体の製
造。

２酢酸セルロースを、底面の直径６mm、高さ４
mmの円柱状に射出成形し、これを４％水酸化ナト
リウム水溶液中に50℃で１時間浸漬して、加水分
解した。その後水洗し、0.1N塩酸中に室温で１
時間浸漬し、水洗、乾燥して、表層が加水分解さ
れ、中央部が２酢酸セルロースのままの円柱状成
形物を得た。

これを、0.4N水酸化ナトリウム水溶液中で、
0.6Mエピクロルヒドリン水溶液と40℃で２時間
反応させ、水洗後、直ちに2Mチオ硫酸ナトリウ
ム／0.5M燐酸緩衝液（PH6.3）と30℃で16時間反
応させた。次いで水洗し、0.1M炭酸水素ナトリ
ウム水溶液、1mMエチレンジアミンテトラ酢酸
２ナトリウム水溶液、10mMジチオスライトール
により30℃で30分間還元し、２―ヒドロキシ―３
―メルカプトプロピル酢酸セルロース（部分加水
分解物）（以下、担体Ａという）を得た。本品は、
直ちに次の反応に用いた。

(B) 測定試薬（抗うさぎIgG固相化抗体）の製
造。

やぎ産生のうさぎIgGに対する抗血清から、ア
フイニテイクロマトグラフイーにより精製したう
さぎIgGに対する抗体7.8ナノモルと、Ｎ―（ｍ―
マレイミドベンゾイルオキシ）サクシンイミド78
ナノモルとを0.02M燐酸緩衝液（PH7.0）・0.1M塩
化ナトリウム水溶液２ml中30℃で１時間反応させ
た。次いで、セフアデツクスＧ―25を用いたゲル
過により、高分子量分画と低分子量分画とを分
離した。そのうち高分子量分画を0.02M燐酸緩衝
液（PH7.0）・0.1M塩化ナトリウム水溶液により
全量23.5mlに希釈し、これに上記(A)で製造した担
体Ａを50個加え、室温で２時間反応させ、0.02M
燐酸緩衝液（PH7.0）・0.1M塩化ナトリウム水溶
液で洗浄して測定試薬を得た。本品は、0.02M燐
酸衝液（PH7.2）・0.1M水酸化ナトリウム水溶
液・1mM塩化マグネシウム水溶液・0.1％牛血清
アルブミン・0.1％ナトリウムアジド水溶液（以
下、緩衝液Ａという）中４℃で保存した。

(C) 酵素標識うさぎIgGの製造。

上記(B)で用いたのと同じ抗うさぎIgG抗体とＮ
―（ｍ―マレイミドベンゾイルオキシ）サクシン
イミドとの反応物の高分子量分画を、５mg／mlの
β―ガラクトシダーゼ10μlと30℃で２時間反応さ
せた後、セフアロースCL―6Bによるゲル過で
精製し、酵素標識抗うさぎIgGを得た。精製の際
の溶出は、0.02M燐酸緩衝液（PH7.2）・0.1M塩化
ナトリウム水溶液・1mM塩化マグネシウム水溶
液により行なつた。本品は、牛血清アルブミンと
ナトリウムアジドとをそれぞれ最終濃度0.1％に
なるように加え、４℃で保存した。

(D) 酵素活性の測定。

上記(C)で用いたβ―ガラクトシダーゼの活性
は、４―メチルウンベリフエリル―β―Ｄ―ガラ
クトシド（以下、4MUGと略称する）を基質と
して用い、遊離した４―メチルウンベリフエロン
（以下、4MUと略称する）を螢光光度計を用いて
励起波長365nm、螢光波長448nmの条件下で定量
することにより測定した。活性を表わすには、30
℃で１分間に1μモルの4MUGを4MUに分解する
酵素活性を、１単位とした。

(E) うさぎIgGの酵素免疫測定法による測定。

試験管中に緩衝液A100μlを入れたものを用意
し、うさぎIgG0〜100ngを含む試料（試料の希釈
は緩衝液Ａによる）100μlを加え、(B)で製造した
測定試薬を１個づつ加えて、30℃で２時間反応さ
せた。測定試薬を緩衝液Ａ／mlで２回洗浄し、こ
れに、緩衝液Ａを用いて200μ単位の活性をもつ
ように希釈した酵素標識抗うさぎIgG抗体200μl
を加え、30℃で２時間反応させた。測定試薬を緩
衝液Ａ／mlで２回洗浄し、新しい試験管に移し、
10^-4Mの4MUG（緩衝液Ａに溶解したもの）200μl
を加え、30℃で30分間反応させた。次に、0.2M
グシン緩衝液（PH10.6）２mlを加えて反応を停止
させた。生成した4MUの螢光強度を測定し、測
定試薬に結合した酵素活性を求めた。

結果は、第１図に曲線1Aとして示す通りであ
る。（なお、この曲線は、未知検体について酵素
活性を測定し、抗うさぎIgG量を求める際に、検
量線として用い得るものである。） 比較例 １ 実施例１(A)で用いた２酢酸セルロースと同形同
大のポリスチレン粒子を作つた。この粒子50個
を、抗うさぎIgG抗体7.8ナノモルを0.02M燐酸緩
衝液（PH7.0）・0.1M塩化ナトリウム水溶液で全
量23.5mlに希釈したものに加え、室温で２時間反
応させ、さらに、４℃で16時間放置して抗体を物
理的に吸着させ、0.02M燐酸緩衝液（PH7.0）・
0.1M塩化ナトリウム水溶液で洗浄して、比較用
の測定試薬を作つた。この測定試薬を用いて、実
施例１(E)と同様に操作し、酵素活性を求めた。

結果は、第１図に曲線1Bとして示す通りであ
る。

第１図において、100Pg〜10ng／試験管の範囲
で、logy＝ａ＋blogxにあてはめた場合のｂ値
（曲線の傾き）を求めると、曲線1Aでは0.71、曲
線1Bでは0.56であり、明らかに曲線1Aの方が傾
きが大きい。このことから、実施例１の測定試薬
による方が、比較例１の測定試薬によるより、精
度の高い測定をできることがわかつた。

また、IgG量が０のときの酵素活性を求める
と、実施例１の測定試薬では1.09±0.012（μ単
位）であり、比較例１の測定試薬では2.26±
0.138（μ単位）であつた。このことから、実施例
１の測定試薬の方が、比較例１の測定試薬より、
低濃度の領域で使用できることがわかつた。

実施例 ２ (A) 測定試薬（固相化セフアレキシン）の製造。

抗原として、セフアレキシン（化学名７―フエ
ニルグリシルアミノ―３―メチル―３―セフエム
―４―カルボン酸）1.3×10^-4モルを用い、これ
とＮ―（ｍ―マレイミドベンゾイルオキシ）サク
シンイミド1.3×10^-3モルとを、0.02M燐酸緩衝液
（PH7.0）５ml中30℃で40分間反応させた。反応液
に、0.02M燐酸緩衝液20mlを加えた後、実施例１
(A)で製造した担体Ａを50個加え、室温で２時間反
応させ、さらに４℃で16時間放置し、水洗して測
定試薬を得た。本品は、緩衝液Ａ中の牛血清アル
ブミンを卵白アルブミンに置きかえたもの（以
下、緩衝液Ａ（EWA）と略称する）中４℃で保存
した。

(B) 抗セフアレキシン血清の製造。

抗セフアレキシン血清は、セフアレキシンをハ
プテンとして牛血清アルブミンに結合させたもの
を、フロイント完全アジユバントとともにうさぎ
に投与して生産させた。

(C) 抗セフアレキシン抗体の酵素免疫測定法によ
る測定。

抗セフアレキシン血清を緩衝液Ａ（EWA）によ
り10³〜10⁶倍に希釈したもの100μlと、緩衝液Ａ
（EWA）100μlと、実施例２(A)で製造した測定試
薬１個とを、30℃で２時間反応させた後、測定試
薬を緩衝液Ａ（EWA）１mlで２回洗浄した。これ
に、実施例１(C)で製造した酵素標識抗体を酵素活
性が200μ単位になるように緩衝液Ａで希釈した
もの200μlを加え、30℃で２時間反応させた。測
定試薬を緩衝液Ａ／mlで２回洗浄し、新しい試験
管に移し、10^-4Mの4MUG200μlを加え、30℃で
30分間反応させた。次に、0.2Mグリシン緩衝液
（PH10.6）２mlを加えて反応を停止させた。生成
した4MUの螢光強度を測定し、測定試薬に結合
した酵素活性を求めた。

結果は、第２図に曲線２として示す通りであ
る。（なお、この曲線は、未知検体について酵素
活性を測定し、抗セフアレキシン抗体量を求める
際に、検量線として用い得るものである。） 第２図において、曲線の傾きは充分大きく、し
たがつて精度の高い測定をできることがわかつ
た。また、正常うさぎ血清について上記(C)と同様
に操作した場合に得られた酵素活性が、4.53±
0.848（μ単位）で極めて低いことから、この測定
試薬は妨害物質の吸着が極めて少ないことがわか
つた。これらの結果から、セフアレキシンのよう
な低分子物質を抗原として用いても、この発明に
よると、充分使用できる測定試薬が得られること
がわかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、うさぎIgGの測定曲線、第２図は、
抗セフアレキシン抗体の測定曲線をそれぞれ示
す。 図中、１Ａは実施例１による測定曲線、１Ｂは
比較例１による測定曲線、２は実施例２による測
定曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 で表わされる免疫化学的測定試薬。但し、Ｘは抗
   原または抗体、Ｙは直接結合または架橋基、Cell
   はセルロース基、Ｚは直接結合またはセルロース
   誘導体における置換基を表わす。 ２ セルロース誘導体がセルロースエステルであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の測定試薬。 ３ セルロースエステルが低級脂肪酸セルロース
   である、特許請求の範囲第２項記載の測定試薬。 ４ 低級脂肪酸セルロースが酢酸セルロース、プ
   ロピオン酸セルロース、または酪酸セルロースで
   ある、特許請求の範囲第３項記載の測定試薬。 ５ 低級脂肪酸セルロースがセルロースの酢酸・
   酪酸混合エステルである、特許請求の範囲第３項
   記載の測定試薬。 ６ セルロースエステルが高級脂肪酸セルロース
   である、特許請求の範囲第２項記載の測定試薬。 ７ セルロースエステルが硝酸セルロースまたは
   硫酸セルロースである、特許請求の範囲第２項記
   載の測定試薬。 ８ セルロースエステルがセルロースの酢酸・硝
   酸混合エステルである、特許請求の範囲第２項記
   載の測定試薬。