JP2661712B2 - ハプテン性質を有する遊離物質の決定のための免疫的方法 - Google Patents
ハプテン性質を有する遊離物質の決定のための免疫的方法Info
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- JP2661712B2 JP2661712B2 JP63201016A JP20101688A JP2661712B2 JP 2661712 B2 JP2661712 B2 JP 2661712B2 JP 63201016 A JP63201016 A JP 63201016A JP 20101688 A JP20101688 A JP 20101688A JP 2661712 B2 JP2661712 B2 JP 2661712B2
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- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は決定されるべき性質のため１つまたはそれ以
上の生理的結合パートナーの存在において生物学流体中
に特にホルモン，ステロイド，薬剤またはその代謝物
質，ビタミンまたは毒素のハプテン性質を有する遊離物
質の決定のための免疫的方法に関する。この関連にて研
究されるべき生物的流体におけるこの型式の物質の全量
は遊離画分及び結合画分にわたり分布している。この関
連にて、結合画分は１つまたはそれ以上の生理学的タン
パク質または同様のこれらの物質のこれらの結合パート
ナーに結合し、一定の親和力をもって特異的に多かれ少
かれ特別の物質に結合できる。
上の生理的結合パートナーの存在において生物学流体中
に特にホルモン，ステロイド，薬剤またはその代謝物
質，ビタミンまたは毒素のハプテン性質を有する遊離物
質の決定のための免疫的方法に関する。この関連にて研
究されるべき生物的流体におけるこの型式の物質の全量
は遊離画分及び結合画分にわたり分布している。この関
連にて、結合画分は１つまたはそれ以上の生理学的タン
パク質または同様のこれらの物質のこれらの結合パート
ナーに結合し、一定の親和力をもって特異的に多かれ少
かれ特別の物質に結合できる。
結合及び非結合画分は相互に平衡状態にあり、非結合
画分，換言すれば遊離物質が生理的に活性成分を代表し
ていること、一方結合画分は、この物質を使用できるよ
うにする容器の型を構成することは妥当として最近の理
論に基づき考えられている。更に、所謂輸送タンパク質
に結合することは知られていて輸送タンパク質はその物
質を有機体に分布させるよう働き、作用する位置に彼等
を輸送する。
画分，換言すれば遊離物質が生理的に活性成分を代表し
ていること、一方結合画分は、この物質を使用できるよ
うにする容器の型を構成することは妥当として最近の理
論に基づき考えられている。更に、所謂輸送タンパク質
に結合することは知られていて輸送タンパク質はその物
質を有機体に分布させるよう働き、作用する位置に彼等
を輸送する。
物質の生理的に活性な画分と称される遊離物質の決定
が臨床的診断においては結合画分及び非結合画分を同時
的に決定することよりもさらに価値があると近年一般的
に認められてきた。「人体の流体における遊離（タンパ
ク質−非結合）ホルモンの直接的免疫的検定法」と題す
るR.P.Ekinsの論文はモデル的假説に基づき遊離物質の
決定の理由を説明し、さらに遊離物質の決定に適してい
る免疫学的決定法の種々のタイプを図表にする試みを行
っている。（「臨床化学のための免疫学的検定法」W.N.
Hunter及びJ.E.T.Corrieによる編輯,Churchill Livings
ton,第２版（1983年）319−339頁） ヨーロッパ特許26,103及び73,865,ドイツ特許3,415,8
13は実際の応用段階で開発された遊離物質のための免疫
学的決定法を記載している。
が臨床的診断においては結合画分及び非結合画分を同時
的に決定することよりもさらに価値があると近年一般的
に認められてきた。「人体の流体における遊離（タンパ
ク質−非結合）ホルモンの直接的免疫的検定法」と題す
るR.P.Ekinsの論文はモデル的假説に基づき遊離物質の
決定の理由を説明し、さらに遊離物質の決定に適してい
る免疫学的決定法の種々のタイプを図表にする試みを行
っている。（「臨床化学のための免疫学的検定法」W.N.
Hunter及びJ.E.T.Corrieによる編輯,Churchill Livings
ton,第２版（1983年）319−339頁） ヨーロッパ特許26,103及び73,865,ドイツ特許3,415,8
13は実際の応用段階で開発された遊離物質のための免疫
学的決定法を記載している。
Ｌ−サイロキシン（T4）及びＬ−トリヨードサイロナ
イン（T3）の遊離チロイドホルモンの決定を経由してチ
ロイドの生理学的状態を確立することは醫学的に重要で
あるので前記特許はまず第１にこの型の決定方法に関
し、記載された基本的な方法のこの特殊な場合に対する
応用を検討している。本発明において記述した免疫学的
決定方法の第１の重要さはチロイドの生理学的状態を確
立することにある。
イン（T3）の遊離チロイドホルモンの決定を経由してチ
ロイドの生理学的状態を確立することは醫学的に重要で
あるので前記特許はまず第１にこの型の決定方法に関
し、記載された基本的な方法のこの特殊な場合に対する
応用を検討している。本発明において記述した免疫学的
決定方法の第１の重要さはチロイドの生理学的状態を確
立することにある。
生きているヒトの有機体のなかを循環するT4が分布し
ている結合タンパク質はアルブミン（約10％），サイロ
キシン−結合プリアルブミン（TBPA,約30％）及びサイ
ロキシン−結合グロブリン（TBG,約60％）である。生理
学的能動遊離T4（FT4）はタンパク質結合T4の約0.01か
ら0.03％である。このことはFT4の正規の濃度範囲が人
体の流体の約８から20pg/mlの範囲にあることを意味し
ている。
ている結合タンパク質はアルブミン（約10％），サイロ
キシン−結合プリアルブミン（TBPA,約30％）及びサイ
ロキシン−結合グロブリン（TBG,約60％）である。生理
学的能動遊離T4（FT4）はタンパク質結合T4の約0.01か
ら0.03％である。このことはFT4の正規の濃度範囲が人
体の流体の約８から20pg/mlの範囲にあることを意味し
ている。
現在、FT4を決定する方法で承認されたものは血清の
平衡透析法である。（Clin.Invest.45（1966）153−163
頁を参照）。これは血清に加えられている放射性T4また
はT4の放射性免疫検定法で直接得られる透析物中のT4含
量を伴う。しかしながら、高い信頼性にも拘らず、この
方法は約20時間という各々の決定に好ましくない長時間
を必要として日常の臨床診断には不適当である。
平衡透析法である。（Clin.Invest.45（1966）153−163
頁を参照）。これは血清に加えられている放射性T4また
はT4の放射性免疫検定法で直接得られる透析物中のT4含
量を伴う。しかしながら、高い信頼性にも拘らず、この
方法は約20時間という各々の決定に好ましくない長時間
を必要として日常の臨床診断には不適当である。
従って、さらに表示する特徴を有し、或る場合には可
成りの不正確さを生じる方法に加えて、日常的臨床診断
のための決定されるべき遊離物質の濃度についての直接
的情報を与えることのできる免疫学的決定法が開発され
てきた。これに関連してこの型の免疫学的決定法が実際
の応用段階で開発され、特に放射性免疫検定法が決定さ
れるべき物質の標識した形が研究されるべき試料に加え
られ、公知の競争原理が行われ、適当な抗体との反応の
後に、決定されるべき物質の濃度について標識された抗
体に基づいて確立された結合形の画分から結論がひき出
される。この関連して、特にFT4の遊離物質の決定にお
いて結合タンパク質の変形による干渉を除外するために
公知の方法において所謂T4−類似のトレーサーが決定さ
れるべき物質の標識された形として使用される。（F
T4）のこれらのトレーサーは化学構造により結合タンパ
ク質に対する親和力が明らかに減少し、遊離物質／結合
物質の平衡に最小の作用を持つものである。しかしなが
ら、多くの著者はすくなくとも或る特殊な場合でこれら
の方法の有効性と臨床値について疑問を投げている。
（Helenius,T.,Liewendahl,K.,Clin.Chem.29（５）（19
83）,816−822頁;Mardell,R.,Gamlen,T.R.,The Lancet,
24th April 1983,973−974頁;Gow,S.M.等、Clinica Chi
mica Acta 152（1985）,325−333頁;Chopra,I.J.等、J.
Clin.Endocrin.Met.51（１）（1980）,135−143頁及びH
errmann,J.等、Nucl.−Med.21（５）（1982）,186−191
頁）。その方法は厳しい病（NTI＝非−甲状腺病）の場
合に多数の干渉及び影響因子（異化代謝産物，タンパク
質損失，内発的に放出されまたはヘパリンの影響のもと
で脂肪酸）のために失敗している。（Reiner,Ch.,rzt
l.Lab.31（1985）,331−344頁を参照）。Ito,M.等によ
りClim.Chem 30（10）（1984）,1682−1685頁に記述さ
れたFT4の決定のための酸素免疫検定法は類似のトレー
サー方法に含まれるものであり、そこでT4−β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ接合はトレーサーとして使用され、結合
タンパク質に結合していないものである。
成りの不正確さを生じる方法に加えて、日常的臨床診断
のための決定されるべき遊離物質の濃度についての直接
的情報を与えることのできる免疫学的決定法が開発され
てきた。これに関連してこの型の免疫学的決定法が実際
の応用段階で開発され、特に放射性免疫検定法が決定さ
れるべき物質の標識した形が研究されるべき試料に加え
られ、公知の競争原理が行われ、適当な抗体との反応の
後に、決定されるべき物質の濃度について標識された抗
体に基づいて確立された結合形の画分から結論がひき出
される。この関連して、特にFT4の遊離物質の決定にお
いて結合タンパク質の変形による干渉を除外するために
公知の方法において所謂T4−類似のトレーサーが決定さ
れるべき物質の標識された形として使用される。（F
T4）のこれらのトレーサーは化学構造により結合タンパ
ク質に対する親和力が明らかに減少し、遊離物質／結合
物質の平衡に最小の作用を持つものである。しかしなが
ら、多くの著者はすくなくとも或る特殊な場合でこれら
の方法の有効性と臨床値について疑問を投げている。
（Helenius,T.,Liewendahl,K.,Clin.Chem.29（５）（19
83）,816−822頁;Mardell,R.,Gamlen,T.R.,The Lancet,
24th April 1983,973−974頁;Gow,S.M.等、Clinica Chi
mica Acta 152（1985）,325−333頁;Chopra,I.J.等、J.
Clin.Endocrin.Met.51（１）（1980）,135−143頁及びH
errmann,J.等、Nucl.−Med.21（５）（1982）,186−191
頁）。その方法は厳しい病（NTI＝非−甲状腺病）の場
合に多数の干渉及び影響因子（異化代謝産物，タンパク
質損失，内発的に放出されまたはヘパリンの影響のもと
で脂肪酸）のために失敗している。（Reiner,Ch.,rzt
l.Lab.31（1985）,331−344頁を参照）。Ito,M.等によ
りClim.Chem 30（10）（1984）,1682−1685頁に記述さ
れたFT4の決定のための酸素免疫検定法は類似のトレー
サー方法に含まれるものであり、そこでT4−β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ接合はトレーサーとして使用され、結合
タンパク質に結合していないものである。
酸素免疫検定法はWeetal等によりClin.Chen.28（４）
（1982）,666−671頁に記載されているがFT4画分を計画
するための複雑な数学的モデル及び遊離及びタンパク質
−結合画分に対するT4−ワサビダイコン パーオキシダ
ーゼ接合の分布に基づいている。２つの最後に述べた方
法は日常的臨床診断の本質的な部分に未だなっていな
い。
（1982）,666−671頁に記載されているがFT4画分を計画
するための複雑な数学的モデル及び遊離及びタンパク質
−結合画分に対するT4−ワサビダイコン パーオキシダ
ーゼ接合の分布に基づいている。２つの最後に述べた方
法は日常的臨床診断の本質的な部分に未だなっていな
い。
決定されるべき物質の今迄の標識された形を記載した
すべての方法につまり標識された抗原が用いられた。
すべての方法につまり標識された抗原が用いられた。
しかしながら、これらの抗体に結合する抗原の定量的
検出のための標識抗体の使用は原理としてすでに同様に
Miles,L.E.M.及びHales.,C.N.,により最初Nature 219,
（1986）186−189頁に記載されている。標識抗体及び固
相に結合した抗体の使用によりステロイドホルモンのよ
うなより低い分子量の可能な免疫的決定の記述はStaffo
rd,J.E.H及びKilgallon,W.のJ.Immunol.Methods 34（19
80）,339−343頁にあり、放射性標識を使用している。
蛍光標識を使用する同様な決定法はWood,W.G等によるJ.
Clin.Chem.Clin.Biochem.20（1982）,825−831頁に記載
されている。
検出のための標識抗体の使用は原理としてすでに同様に
Miles,L.E.M.及びHales.,C.N.,により最初Nature 219,
（1986）186−189頁に記載されている。標識抗体及び固
相に結合した抗体の使用によりステロイドホルモンのよ
うなより低い分子量の可能な免疫的決定の記述はStaffo
rd,J.E.H及びKilgallon,W.のJ.Immunol.Methods 34（19
80）,339−343頁にあり、放射性標識を使用している。
蛍光標識を使用する同様な決定法はWood,W.G等によるJ.
Clin.Chem.Clin.Biochem.20（1982）,825−831頁に記載
されている。
すでに引用したEkinsの理論的研究において１つの解
説がある。その330頁に第８図8.I.Jに記載された図を参
照して決定されるべき物質のため１つまたそれ以上の生
理学的結合タンパク質の存在で生物学流体のなかでハプ
テン性質を有る遊離物質の決定のための免疫学的方法を
設計する他の可能な方法であり、そこで生物学流体は決
定されるべき物質に対して特異性抗体の一定量と反応す
る。さらに決定されるべき物質または過剰のこの物質の
誘導体をもって液相から分離される固相について固相に
結合して固定された形で標識を測定することにより、液
相及び／または固相における標識された抗体の含量を測
定し、生物学的試料の決定されるべき遊離物質の含量が
得られた測定結果の電算機による処理で得られる。この
方法が有効であるとする考察において固相に結合する抗
原の性質は標識された抗体または抗体の混合物と100％
の交叉反応性があるものであり、それは遊離形にて存在
する抗原と比較して使用されている。かくして標識抗原
が可能であるこの方法による決定のために、固相に結合
する抗原及び遊離抗原に対して比較的高い親和力を持つ
べきである。しかしながら、この型の決定方法が実際に
成功したということは未だ報告されていない。
説がある。その330頁に第８図8.I.Jに記載された図を参
照して決定されるべき物質のため１つまたそれ以上の生
理学的結合タンパク質の存在で生物学流体のなかでハプ
テン性質を有る遊離物質の決定のための免疫学的方法を
設計する他の可能な方法であり、そこで生物学流体は決
定されるべき物質に対して特異性抗体の一定量と反応す
る。さらに決定されるべき物質または過剰のこの物質の
誘導体をもって液相から分離される固相について固相に
結合して固定された形で標識を測定することにより、液
相及び／または固相における標識された抗体の含量を測
定し、生物学的試料の決定されるべき遊離物質の含量が
得られた測定結果の電算機による処理で得られる。この
方法が有効であるとする考察において固相に結合する抗
原の性質は標識された抗体または抗体の混合物と100％
の交叉反応性があるものであり、それは遊離形にて存在
する抗原と比較して使用されている。かくして標識抗原
が可能であるこの方法による決定のために、固相に結合
する抗原及び遊離抗原に対して比較的高い親和力を持つ
べきである。しかしながら、この型の決定方法が実際に
成功したということは未だ報告されていない。
ドイツ公開公報3,442,817にはFT4の定量的決定を記載
する方法の原則の変形が記述されている。そこでの試料
は標識した抗−T4と共にT4の全モル量を基にして1/10か
ら1/2000の量で10分間以下の培養が行われる。そのあと
ただちに過剰の固定されたT4が加えられ、再び新しい培
養がすくなくとも１分間行われる。ドイツ公開特許3,44
2,817のこの方法は代表的な「動的」方法であり、それ
は標識された抗−T4抗原と共に第１の主な培養の間で最
初遊離形で存在するT4の量のみが捕獲され、そこには緩
慢に平衡に戻るために放出されないですでに結合したT4
の放出がないという假説に明らかに基づいている。その
ことは測定の結果を歪曲するであろう。前培養の期間に
おいて遊離T4と結合T4との間の平衡がよく知られている
ように迅速に到達するために検定法の結果は影響をうけ
るのでこの検定法はすべての同様の２段階検定法のよう
に検定条件における変化から干渉される傾向があり、実
際の臨床に適切な方法として使用することを困難にする
欠点を持つのは当然である。
する方法の原則の変形が記述されている。そこでの試料
は標識した抗−T4と共にT4の全モル量を基にして1/10か
ら1/2000の量で10分間以下の培養が行われる。そのあと
ただちに過剰の固定されたT4が加えられ、再び新しい培
養がすくなくとも１分間行われる。ドイツ公開特許3,44
2,817のこの方法は代表的な「動的」方法であり、それ
は標識された抗−T4抗原と共に第１の主な培養の間で最
初遊離形で存在するT4の量のみが捕獲され、そこには緩
慢に平衡に戻るために放出されないですでに結合したT4
の放出がないという假説に明らかに基づいている。その
ことは測定の結果を歪曲するであろう。前培養の期間に
おいて遊離T4と結合T4との間の平衡がよく知られている
ように迅速に到達するために検定法の結果は影響をうけ
るのでこの検定法はすべての同様の２段階検定法のよう
に検定条件における変化から干渉される傾向があり、実
際の臨床に適切な方法として使用することを困難にする
欠点を持つのは当然である。
本発明の目的は日常の臨床診断に適していて、すぐに
行うことができ、臨床的情報の術語において適切であ
り、最適の感度を有し、決定方法に必要とされる材料及
び物質の最適な品質管理を実施し、製造を可能とする遊
離物質の決定方法を提供することである。
行うことができ、臨床的情報の術語において適切であ
り、最適の感度を有し、決定方法に必要とされる材料及
び物質の最適な品質管理を実施し、製造を可能とする遊
離物質の決定方法を提供することである。
この目的は、本発明の特許請求の範囲第１項の前おき
部によりその特徴部にある特色による免疫学的決定方法
により達成される。
部によりその特徴部にある特色による免疫学的決定方法
により達成される。
有利な具体例は従属特許請求の範囲にある。本発明は
それ自身公知である基本的方法に基づく免疫学的決定法
の開発にあたり例えばEkinsによりすでに記述されてい
るように実際の目的のために充分に高い再現性をつ決定
法がもしも得られるならば、決定されるべきである遊離
抗原に比較してこのましくは８から25％の範囲にあり50
％以下の大きく減少した交叉反応性を持つことが固相に
結合した抗原のために必要であるという驚くべき認識に
基づいている。Ekinsにより提案された100％交叉−反応
性以上またはその領域においてより高い交叉−反応性が
明らかに歪曲した結果に導き、測定範囲が遊離物質のた
めの臨床適に適切な濃度範囲の外側にあることが驚くほ
どに明らかになった。交叉−反応性がすでに述べられた
範囲のなかに保たれる時に、ドイツ公開公報3,442,817
の方法では必要とされている前培養は不必要なものとな
り、その方法は生物学的流体が標識された抗体と過剰に
存在する固定された抗原と同時に実質的に反応すること
ができるために一段階で行うことができる。
それ自身公知である基本的方法に基づく免疫学的決定法
の開発にあたり例えばEkinsによりすでに記述されてい
るように実際の目的のために充分に高い再現性をつ決定
法がもしも得られるならば、決定されるべきである遊離
抗原に比較してこのましくは８から25％の範囲にあり50
％以下の大きく減少した交叉反応性を持つことが固相に
結合した抗原のために必要であるという驚くべき認識に
基づいている。Ekinsにより提案された100％交叉−反応
性以上またはその領域においてより高い交叉−反応性が
明らかに歪曲した結果に導き、測定範囲が遊離物質のた
めの臨床適に適切な濃度範囲の外側にあることが驚くほ
どに明らかになった。交叉−反応性がすでに述べられた
範囲のなかに保たれる時に、ドイツ公開公報3,442,817
の方法では必要とされている前培養は不必要なものとな
り、その方法は生物学的流体が標識された抗体と過剰に
存在する固定された抗原と同時に実質的に反応すること
ができるために一段階で行うことができる。
この一段階方法の可能性は重要な利点を表している。
一定の親和力を有する適切な抗体または抗体混合物を選
択するために一段階方法では遊離物質／結合物質の平衡
において干渉がないかまたはごく僅かである。したがっ
て標識された抗体と遊離物質及び固定された物質の異な
る交叉−反応性が固定された抗原に対して標識された抗
体の結合の動的について説明することが必要であること
を意味している。しかしながら培養時間が変えられると
ころでは、これは遊離物質／結合物質の平衡の移動に影
響を及ぼさないで結合比に影響を及ぼす。
一定の親和力を有する適切な抗体または抗体混合物を選
択するために一段階方法では遊離物質／結合物質の平衡
において干渉がないかまたはごく僅かである。したがっ
て標識された抗体と遊離物質及び固定された物質の異な
る交叉−反応性が固定された抗原に対して標識された抗
体の結合の動的について説明することが必要であること
を意味している。しかしながら培養時間が変えられると
ころでは、これは遊離物質／結合物質の平衡の移動に影
響を及ぼさないで結合比に影響を及ぼす。
かくして一段階方法としての本発明による方法を重要
な単純性をもたらす前培養なしに行うことは好ましいこ
とである。
な単純性をもたらす前培養なしに行うことは好ましいこ
とである。
本発明による方法は特にホルモン，ステロイド，薬剤
またはその代謝物質，ビタミンまたは毒素を生物学的流
体のなかでハプテン性質を持つ遊離物質の決定のために
一般的に適当であるが、特に必要なことは遊離サイロキ
シン（FT4）と遊離トリヨードサイロナイン（FT3）との
関連である。
またはその代謝物質，ビタミンまたは毒素を生物学的流
体のなかでハプテン性質を持つ遊離物質の決定のために
一般的に適当であるが、特に必要なことは遊離サイロキ
シン（FT4）と遊離トリヨードサイロナイン（FT3）との
関連である。
さらに本発明の方法は固相に結合することにより固定
された反応物を使用する決定方法のすべて公知の利点を
持っている。固相の上の固定は必要である洗浄工程を著
しく簡単にし、決定の精度を改良する。決定されるべき
である物質の固定された形に結合される適切な固相はす
べてそれ自身よく知られている不活性のキャリヤ材料で
あり、適当な高結合能力及び充分に安定な結合性質を有
し、それにはポリスチレン，ポリエチレン，テフロンの
ようなプラスチックスまたはガラスが含まれている。適
当な固相はアメリカ特許4,657,873及びWood,W.G.及びGa
dow,A.によりJ.Clin.Chem.Clin.Biochem.21（1983）789
−797頁の刊行物に記載されている。抗体の反応性に相
対的に小さい作用を有する相対的に小さいマーカーによ
る標識は本発明の範囲において好ましいものである。特
別に放射性同位元素、特にヨードアイソトープ、及び発
光物がある。しかしながら、トレーサー部分が保持され
るべき適切な抗体に関して必要な交叉−反応性を与える
ことを假定するときに例えば酵素，基質，蛍光を発する
標識，燐光を発する標識，ビオチン（標識されたアビジ
ンを経由して検知できる）または助因子はマーカーとし
て適している。マーカーが測定の前に抗体から再び分離
され、光学的，物理的または化学的反応に基づき定量適
に検知することのできるすべての物質も同じく直接標識
方法に使用できる。
された反応物を使用する決定方法のすべて公知の利点を
持っている。固相の上の固定は必要である洗浄工程を著
しく簡単にし、決定の精度を改良する。決定されるべき
である物質の固定された形に結合される適切な固相はす
べてそれ自身よく知られている不活性のキャリヤ材料で
あり、適当な高結合能力及び充分に安定な結合性質を有
し、それにはポリスチレン，ポリエチレン，テフロンの
ようなプラスチックスまたはガラスが含まれている。適
当な固相はアメリカ特許4,657,873及びWood,W.G.及びGa
dow,A.によりJ.Clin.Chem.Clin.Biochem.21（1983）789
−797頁の刊行物に記載されている。抗体の反応性に相
対的に小さい作用を有する相対的に小さいマーカーによ
る標識は本発明の範囲において好ましいものである。特
別に放射性同位元素、特にヨードアイソトープ、及び発
光物がある。しかしながら、トレーサー部分が保持され
るべき適切な抗体に関して必要な交叉−反応性を与える
ことを假定するときに例えば酵素，基質，蛍光を発する
標識，燐光を発する標識，ビオチン（標識されたアビジ
ンを経由して検知できる）または助因子はマーカーとし
て適している。マーカーが測定の前に抗体から再び分離
され、光学的，物理的または化学的反応に基づき定量適
に検知することのできるすべての物質も同じく直接標識
方法に使用できる。
本発明による方法の適切な抗体はこの型の方法に適切
であると知られているすべての抗体である。この型の抗
体はT4及びT3のために親和力を有し、生理学的結合タン
パク質に対するT4とT3のおのおのの親和力よりも大きく
ない。この型の抗−T4（またはT3）抗体は普通1010/m
olまたはそれ以下の親和力常数を持っている。
であると知られているすべての抗体である。この型の抗
体はT4及びT3のために親和力を有し、生理学的結合タン
パク質に対するT4とT3のおのおのの親和力よりも大きく
ない。この型の抗−T4（またはT3）抗体は普通1010/m
olまたはそれ以下の親和力常数を持っている。
本発明による方法において固定された物質またはその
誘導体はキャリヤ物質と接合の形で固相に固定されるの
が望ましい。このための適切なキヤリヤ成分はタンパク
質，ポリペプチドまたは多糖類のような高分子量物質で
あり、標識された抗体及び標識された抗体混合物は0.5
％以下の交叉−反応性を持っている。これらのキヤリヤ
成分は決定されるべきである物質が使用される抗体の生
成に結合されたキャリヤ成分に同一でないのが適切であ
り好ましい。
誘導体はキャリヤ物質と接合の形で固相に固定されるの
が望ましい。このための適切なキヤリヤ成分はタンパク
質，ポリペプチドまたは多糖類のような高分子量物質で
あり、標識された抗体及び標識された抗体混合物は0.5
％以下の交叉−反応性を持っている。これらのキヤリヤ
成分は決定されるべきである物質が使用される抗体の生
成に結合されたキャリヤ成分に同一でないのが適切であ
り好ましい。
これに関連して、特別な接合の交叉−反応性がたとえ
同一条件の下で同一の出発物質から製造されたとしても
広く変化できることは明らかである。特別に固定された
形で明らかに同一な接合は非常に異なる交叉−反応性を
表示できる。したがって使用された抗体に関して各々特
別の一群の交叉−反応性は本発明による方法のために適
当であるかを決定するために決定されねばならない。そ
こで交叉−反応性の決定は本発明による方法において関
係する接合を使用する可能性についてなされるよう明確
な言明を与えている。これらの環境は決定されるべきで
あるところの物質または誘導体の直接的使用の場合に存
在する環境とは明らかに異なる。固定された形または溶
液中にて特殊な抗体に関する交叉−反応性はただ物質そ
れ自身の本質にのみ依存している。
同一条件の下で同一の出発物質から製造されたとしても
広く変化できることは明らかである。特別に固定された
形で明らかに同一な接合は非常に異なる交叉−反応性を
表示できる。したがって使用された抗体に関して各々特
別の一群の交叉−反応性は本発明による方法のために適
当であるかを決定するために決定されねばならない。そ
こで交叉−反応性の決定は本発明による方法において関
係する接合を使用する可能性についてなされるよう明確
な言明を与えている。これらの環境は決定されるべきで
あるところの物質または誘導体の直接的使用の場合に存
在する環境とは明らかに異なる。固定された形または溶
液中にて特殊な抗体に関する交叉−反応性はただ物質そ
れ自身の本質にのみ依存している。
本発明による方法を行うための培養条件はある限界の
範囲内で使用した標識によって結合性質に及ぼす影響の
考察して使用した特殊な抗体に依存し、本発明によって
確立された範囲内で正確な交叉−反応性に依存する。適
切な培養条件は培養温度が17゜から37℃であり、培養時
間は30分から３時間である。好ましい培養条件は、実施
例に使用された培養条件では22℃で、２時間（±10分）
水平型振とう機のなかで振とうして培養される。
範囲内で使用した標識によって結合性質に及ぼす影響の
考察して使用した特殊な抗体に依存し、本発明によって
確立された範囲内で正確な交叉−反応性に依存する。適
切な培養条件は培養温度が17゜から37℃であり、培養時
間は30分から３時間である。好ましい培養条件は、実施
例に使用された培養条件では22℃で、２時間（±10分）
水平型振とう機のなかで振とうして培養される。
結果として生じる検定方法の品質のために固相に結合
するところの物質または誘導体の減少した交叉−反応性
の重要性はFT3及びFT4の決定に関係する本発明の請求の
範囲にあって好ましい実施例によって以下詳しく説明さ
れる。
するところの物質または誘導体の減少した交叉−反応性
の重要性はFT3及びFT4の決定に関係する本発明の請求の
範囲にあって好ましい実施例によって以下詳しく説明さ
れる。
固定に使用されるT4誘導体の製造 1.L−サイロキシン エチルエステル（Ｌ−T4 OEt） サイロキシンエチルエステルはClayton,J.C及びHems,
B.A.,J.Qrg.Chem.1950年,840−843頁）を変形した方法
により製造された。
B.A.,J.Qrg.Chem.1950年,840−843頁）を変形した方法
により製造された。
2.N−トリフルオロアセチルサイロキシン（TFAT4） TFAT4はSchroeder等：「酵素学の方法」,57巻，生物
発光及び化学発光，ニューヨーク，アカデミープレス
1978年,424−445頁の変形した方法により製造された。
発光及び化学発光，ニューヨーク，アカデミープレス
1978年,424−445頁の変形した方法により製造された。
この目的のため5gのＬ−サイロキシンは60mlの無水酢
酸エチルに溶解した。11.5mlの３フッ化酢酸及び1.9ml
の３フッ化酢酸無水物が加えられ、混合物は０℃で１時
間撹拌した。
酸エチルに溶解した。11.5mlの３フッ化酢酸及び1.9ml
の３フッ化酢酸無水物が加えられ、混合物は０℃で１時
間撹拌した。
反応混合物は加温して室温にした。200mlの水が反応
混合物に加えられ、得られた溶液は塩化ナトリウムで飽
和した。有機相は分離して除かれ、飽和塩化ナトリウム
溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥
した相は過され、乾燥のため蒸発された。精製残渣は
次の合成にさらに精製することなしに使用した。
混合物に加えられ、得られた溶液は塩化ナトリウムで飽
和した。有機相は分離して除かれ、飽和塩化ナトリウム
溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥
した相は過され、乾燥のため蒸発された。精製残渣は
次の合成にさらに精製することなしに使用した。
収量 4.8g 元素分析 計算値:C23.39％ H1.15％ N1.60％ 実測値 C23.19％ H1.12％ N1.63％ T4又はT4誘導体の接合（conjugate）の製造 接合（conjugate）1:IgG−Ｌ−T4OEt接合（NH2に結合） 接合（conjugate）は活性エステル法により製造され
た。
た。
80.5mgのＬ−T4OEt及び11mgの無水コハク酸は2mlの乾
燥しアミンを除去したDMFに溶融され、室温で一夜間撹
拌された。12.6mgのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド及び
22.6mgのN,N′−ジシクロヘキシカルボジイミドが反応
混合物に加えられ、室温で１時間撹拌された。
燥しアミンを除去したDMFに溶融され、室温で一夜間撹
拌された。12.6mgのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド及び
22.6mgのN,N′−ジシクロヘキシカルボジイミドが反応
混合物に加えられ、室温で１時間撹拌された。
活性エステル混合物は接合の製造にさらに精製するこ
となしに使用された。
となしに使用された。
この目的のために100mgのウサギの免疫グロブリンIgG
（SIGMA,Munich）は20mlの水に溶解された。200μｌの
活性エステルが800μｌの乾燥したアミンを除去したDMF
に稀釈され、ウサギのIgGの水溶液に加えられた。約12
時間後、反応混合物は限外過により精製された。
（SIGMA,Munich）は20mlの水に溶解された。200μｌの
活性エステルが800μｌの乾燥したアミンを除去したDMF
に稀釈され、ウサギのIgGの水溶液に加えられた。約12
時間後、反応混合物は限外過により精製された。
収量:85mg Ｌ−T4OEtとりこみ速度は紫外線分光器により決定さ
れIgGのモル当たり4.2であった。
れIgGのモル当たり4.2であった。
接合タンパク質の構造 接合2:IgG−Ｌ−T4接合（NH2及びCOOHに結合） 接合はカルボジイミド法により製造された。
1gのウサギのIgG（SIGMA,Munich）が100mlの二回蒸留
した水に溶解され、10から15℃にて均衡に保った。
した水に溶解され、10から15℃にて均衡に保った。
200mgのＬ−サイロキシン（Henning Berlin,Berlin）
が乾燥されアミンを除去したDMF及びメタノールのアル
カリ性1:1混合物の5mlに溶解された。
が乾燥されアミンを除去したDMF及びメタノールのアル
カリ性1:1混合物の5mlに溶解された。
1.25mlのサイロキシン溶液及び100mgの固体の１−エ
チル−２−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド（EDC）が1.5時間の間、撹拌されたIgG水溶液に加
えられた。pHを５と６の間に保った。最後の添加の後、
混合物は４℃で１夜間放置され、その後限外過により
精製された。
チル−２−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド（EDC）が1.5時間の間、撹拌されたIgG水溶液に加
えられた。pHを５と６の間に保った。最後の添加の後、
混合物は４℃で１夜間放置され、その後限外過により
精製された。
収量:860mg Ｌ−T4とりこみ速度は紫外線分光器により決定されIg
Gのモル当たり4.3であった。
Gのモル当たり4.3であった。
接合タンパク質の構造 又は 接合3:IgG−Ｌ−T4接合（COOHに結合） 接合は活性エステル法により製造された。
43.6mgのＮ−トリフッ素アセチルサイロキシン,6.32m
gのＮ−ヒトロキシコハク酸イミド及び11.33mgのN,N′
−ジシクロヘキシルカルボジイミドが1mlの乾燥したア
ミンを除去したDMFに溶解され室温で１時間撹拌した。
gのＮ−ヒトロキシコハク酸イミド及び11.33mgのN,N′
−ジシクロヘキシルカルボジイミドが1mlの乾燥したア
ミンを除去したDMFに溶解され室温で１時間撹拌した。
100mgのウサギIgG（SIGMA,Munich）が二回蒸留した水
の20mlに溶解された。
の20mlに溶解された。
400μｌの活性エステル混合物は乾燥したアミンを除
去したDMFの600μｌで稀釈し、IgG水溶液に加えられ
た。反応混合物が室温で12時間撹拌された後にアンモニ
ヤ性の条件下で限外過により精製された。同時にトリ
フッ素アセチル保護基の同時消去が行われる。
去したDMFの600μｌで稀釈し、IgG水溶液に加えられ
た。反応混合物が室温で12時間撹拌された後にアンモニ
ヤ性の条件下で限外過により精製された。同時にトリ
フッ素アセチル保護基の同時消去が行われる。
収量:94mg Ｌ−T4とりこみ速度は紫外線分光器により決定されIg
Gのモル当たり11.5であった。
Gのモル当たり11.5であった。
接合タンパク質の構造： 接合4:IgG−Ｌ−T4OEt接合（NH2で結合） 接合はカルボイミド法により製造された。
10gのウサギのIgG（SIGMA,Munich）が1000mlの二回蒸
留した水に溶解された。
留した水に溶解された。
1.25gのＬ−T4OEtが僅かに酸性の40mlのメタノールに
溶解され2.5gのEDCと共にIgG水溶液に加えられた。反応
混合物は室温でpHを約５にして２時間光を排除して撹拌
され、一夜間４℃で貯蔵された。混合物はその後限外
過により精製された。
溶解され2.5gのEDCと共にIgG水溶液に加えられた。反応
混合物は室温でpHを約５にして２時間光を排除して撹拌
され、一夜間４℃で貯蔵された。混合物はその後限外
過により精製された。
収量:6.8g Ｌ−T4OEtとりこみ速度は紫外線分光器により決定さ
れIgGモル当たり1.5であった。
れIgGモル当たり1.5であった。
接合タンパク質の構造： 接合5:L−T4−IgG接合（NH2及びCOOH）で結合） 接合はカルボジイミド法により製造された。
500mgのＬ−サイロキシン（Henning Berlin,Berlin）
が弱アルカリ性条件のもとで10％のアミンを除去したDM
Fを含む500mlの２回蒸留した水に溶解された。
が弱アルカリ性条件のもとで10％のアミンを除去したDM
Fを含む500mlの２回蒸留した水に溶解された。
5gのウサギのIgGは500mlの２回蒸留された水に溶解さ
れた。Ｌ−サイロキシンとウサギのIgGの２つの水溶液
は混合され、約10分間の間隔を置いて撹拌しながら全部
で1.9gのEDCが10部に加えられた。反応混合物は一夜間
４℃に放置されその後限外過により精製された。
れた。Ｌ−サイロキシンとウサギのIgGの２つの水溶液
は混合され、約10分間の間隔を置いて撹拌しながら全部
で1.9gのEDCが10部に加えられた。反応混合物は一夜間
４℃に放置されその後限外過により精製された。
収量:2.3g Ｌ−T4とりこみ速度は紫外線分光器により決定され、
IgGモル当たり3.3であった。
IgGモル当たり3.3であった。
得られた接合の構造は接合２で表示した構造に一致し
ている。
ている。
抗体に関して製造された接合の交叉反応性の決定 一般的方法：交叉反応性試験を行うため、使用されるポ
リ−またはモノクロナル抗体，またはこれら抗体の混合
物はエポキシ基を含み、均一な粒子の大きさ1.055±0.0
32μｍを有する超微粒子に共有結合している。各々の場
合に結合する抗体（複数）／抗体の混合物の量は超微粒
子のグラム当たり350μｇの精製抗体（複数）または抗
体混合物であった。結合の後に表れる別の結合位置は不
活性物質で飽和された。このやり方で製造された超微粒
子は10mlの0.1Mの燐酸塩緩衝液すなわち超微粒子のグラ
ム当たりpH7.2で1mol/のNaClと0.05％のアジドを含ん
でいる緩衝液に溶解した。
リ−またはモノクロナル抗体，またはこれら抗体の混合
物はエポキシ基を含み、均一な粒子の大きさ1.055±0.0
32μｍを有する超微粒子に共有結合している。各々の場
合に結合する抗体（複数）／抗体の混合物の量は超微粒
子のグラム当たり350μｇの精製抗体（複数）または抗
体混合物であった。結合の後に表れる別の結合位置は不
活性物質で飽和された。このやり方で製造された超微粒
子は10mlの0.1Mの燐酸塩緩衝液すなわち超微粒子のグラ
ム当たりpH7.2で1mol/のNaClと0.05％のアジドを含ん
でいる緩衝液に溶解した。
交叉反応性試験に使用されるトレーサーは125I−標識
サイロキシンであり、比活性度は濃度27.6mg/におい
て6.22M Bg/μｇであった。
サイロキシンであり、比活性度は濃度27.6mg/におい
て6.22M Bg/μｇであった。
研究されるべき接合タンパク質は決定されるべき物質
の参照物質として使用されるトリヨウ素サイロキシンま
たはサイロキシンと同様に0.2％のゼラチン及び遊離の
結合タンパク質を含む20m mol/の燐酸塩緩衝液から成
る緩衝液マトリックスのなかに各検定法のために新しく
調合された。このために次の濃度が選択された。
の参照物質として使用されるトリヨウ素サイロキシンま
たはサイロキシンと同様に0.2％のゼラチン及び遊離の
結合タンパク質を含む20m mol/の燐酸塩緩衝液から成
る緩衝液マトリックスのなかに各検定法のために新しく
調合された。このために次の濃度が選択された。
FT4:L−T4/mlの7.8,16,31,62,125,250及び500mg。
接合の濃度は次のように調整された。
接合：接合/mlの0.01,0,1,1,10及び100μｇ。
すべての交叉反応性試験の混合物に使用される計画は
次のようであった。
次のようであった。
100μｌの緩衝液（ゼロ標準）または標準プラス100μ
ｌの125I−標識サイロキシン（トレーサー）プラス適当
な稀釈度の1mlの超微粒子懸濁液。
ｌの125I−標識サイロキシン（トレーサー）プラス適当
な稀釈度の1mlの超微粒子懸濁液。
このため、使用された抗体に結合する超微粒子懸濁液
の稀釈度は最大識別がT4/mlの30と40ngとの間の範囲に
あるように調整された。
の稀釈度は最大識別がT4/mlの30と40ngとの間の範囲に
あるように調整された。
混合物は22℃で１時間培養された。10分間2000xgで遠
心分離し、つづいて遠心分離のあいだ沈降した超微粒子
から上澄液を（結合／遊離の分離）乾燥されるまで吸引
された。結合相の測定はガンマ線計数器で60秒間各々の
接合の交叉反応性が公知の方法によって決定された。
心分離し、つづいて遠心分離のあいだ沈降した超微粒子
から上澄液を（結合／遊離の分離）乾燥されるまで吸引
された。結合相の測定はガンマ線計数器で60秒間各々の
接合の交叉反応性が公知の方法によって決定された。
マウスの抗体を使用して得られた交叉反応性は次に示
す表の最後から２番目の欄に示されている。
す表の最後から２番目の欄に示されている。
表の最後の欄は「5.0％交叉」（pg/ml）の欄であり、
次に示される実施例１及び実施例２を基に決定された。
この欄は本発明による方法で使用されるために研究され
た抗体との接合において特別な接合が適しているかどう
かを示している。標準のプロットの最大傾斜の領域を表
し、濃度における小さな差異の間の最大識別を表す50％
切点が８から20pg/mlのFT4のため正規の生理学的濃度範
囲であるときには、相当する接合は本発明による方法で
使用するのに非常に好都合である。
次に示される実施例１及び実施例２を基に決定された。
この欄は本発明による方法で使用されるために研究され
た抗体との接合において特別な接合が適しているかどう
かを示している。標準のプロットの最大傾斜の領域を表
し、濃度における小さな差異の間の最大識別を表す50％
切点が８から20pg/mlのFT4のため正規の生理学的濃度範
囲であるときには、相当する接合は本発明による方法で
使用するのに非常に好都合である。
第１図で交叉−反応性が30％（9.5から28％）以下で
あるこれらの接合によってこれらの条件が一致している
ことが理解できる。交叉−反応性が36％であるときには
50％交点は40pg/mlであり、検定法の感度における減少
が明らかに表示されている。
あるこれらの接合によってこれらの条件が一致している
ことが理解できる。交叉−反応性が36％であるときには
50％交点は40pg/mlであり、検定法の感度における減少
が明らかに表示されている。
表の最後の欄に与えられた数字は第１図に示されるよ
うに実施例１プラス２の同一の検定条件下で決定され
た。
うに実施例１プラス２の同一の検定条件下で決定され
た。
第１図に示されるプロット及び表の最後の欄に示され
た数値を決定するための記載された形式で使用された本
発明の方法はさらに詳しく２つの実施例に基づきこの後
に説明される。
た数値を決定するための記載された形式で使用された本
発明の方法はさらに詳しく２つの実施例に基づきこの後
に説明される。
実施例１ 遊離サイロキシン（FT4）の決定方法 研究された接合の各々の１μｇは公知の被覆されたポ
リスチレン管である固相に結合された。
リスチレン管である固相に結合された。
使用された抗体はモノクロナールT4−特異性のマウス
の抗体であった。抗体は公知の方法で125Iをもって生成
された。精製した標識抗体の比活性度は抗体の25及び35
K Bq/μｇの間であった。標識抗体はpH7.2の1mol/の
塩化ナトリウムの0.05％のアジドを含む0.1Mの燐酸塩緩
衝液に溶解された。標識抗体の濃度はこの緩衝液におい
て１及び1.25μg/の間であった。
の抗体であった。抗体は公知の方法で125Iをもって生成
された。精製した標識抗体の比活性度は抗体の25及び35
K Bq/μｇの間であった。標識抗体はpH7.2の1mol/の
塩化ナトリウムの0.05％のアジドを含む0.1Mの燐酸塩緩
衝液に溶解された。標識抗体の濃度はこの緩衝液におい
て１及び1.25μg/の間であった。
使用された標準物質は次の濃度を持つヒトの血清マト
リックスであった。
リックスであった。
FT4/mlの0,2.8,5.6,11.3,22.5,45及び90pgである。
検定は次のように行われた。
50μｌの標準物質は研究されるべき固定された接合を
含むポリスチレン管のなかにピペットで採取され、500
μｌの125I−標識抗体（トレーサー）が加えられた。
含むポリスチレン管のなかにピペットで採取され、500
μｌの125I−標識抗体（トレーサー）が加えられた。
反応物は22℃で２時間水平振とう機で培養された。免
疫反応はすべて管の外に培養液を吸引することにより停
止された。
疫反応はすべて管の外に培養液を吸引することにより停
止された。
4mlの洗浄溶液（0.15mol/ NaCl）が各々管のなかに
置かれ３回デカンテーションした。
置かれ３回デカンテーションした。
固相に結合し残った活性度は60秒間ガンマ線計数器で
測定された。得られた結果は公知方法によりデータ減少
によって数値を求めた。
測定された。得られた結果は公知方法によりデータ減少
によって数値を求めた。
実施例２ 遊離サイロキシン（FT4）の決定 実施例１と同様に被覆されたポリスチレン管が研究さ
れるべき接合の固定に用いられた。
れるべき接合の固定に用いられた。
用いられた抗体はモノクロナールT4−特異性マウスの
抗体であった。しかし放射性核種で標識されないで発光
物で標識された。発光物は公知の方法（アメリカ特許4,
645,646;ドイツ公開公報2,921,781または3,132,491を参
照）で抗体に結合された。環式ジアシルヒトラジド誘導
体が発光物として用いられた。
抗体であった。しかし放射性核種で標識されないで発光
物で標識された。発光物は公知の方法（アメリカ特許4,
645,646;ドイツ公開公報2,921,781または3,132,491を参
照）で抗体に結合された。環式ジアシルヒトラジド誘導
体が発光物として用いられた。
発光物で標識した抗体はpH7.2の1mol/のNaClと0.05
％のアジドを含む0.1Mの燐酸塩緩衝液に溶解された。標
識抗体の濃度はこの緩衝液中１と1.25μg/の間であっ
た。
％のアジドを含む0.1Mの燐酸塩緩衝液に溶解された。標
識抗体の濃度はこの緩衝液中１と1.25μg/の間であっ
た。
用いられた標準物質は実施例１と同じく同じヒトの血
清マトリックスであった。検定法は実施例１のそれに正
確に一致している。
清マトリックスであった。検定法は実施例１のそれに正
確に一致している。
固相に結合し残った活性度は化学発光を測定するため
発光計ですくなくとも４秒間測定位置に（Berlhold LB
9502またはHamilton LUMICON）注入して測定された。測
定方法及びこのために用いられる試薬は、なかんづく、
すでに引用したアメリカ特許4,645,646に詳しく記載さ
れている。
発光計ですくなくとも４秒間測定位置に（Berlhold LB
9502またはHamilton LUMICON）注入して測定された。測
定方法及びこのために用いられる試薬は、なかんづく、
すでに引用したアメリカ特許4,645,646に詳しく記載さ
れている。
公知方法により後のデータ減少は想像した濃度を与え
た。
た。
２つの実施例の方法１及び２で用いられた固相は被覆
されたポリスチレン管であった。しかしながら、固相と
して他のプラスチック例えばポリプロピレン，ナイロ
ン，テフロン及び他の適当な活性化プラスチックもガラ
スと同じく困難なく使用できる。この場合の接合の結合
は文献から公知の方法で例えば吸着によりまたは共有、
結合的行われる。（Catt,K.,Tregear,G.W:Science,158
（1967）1570/1572頁；アメリカ特許4,657,873またはWo
od,W.G.及びGadow,A.:J.Clin.Chem.Biochem.21（198
3）,789−797頁を参照）。
されたポリスチレン管であった。しかしながら、固相と
して他のプラスチック例えばポリプロピレン，ナイロ
ン，テフロン及び他の適当な活性化プラスチックもガラ
スと同じく困難なく使用できる。この場合の接合の結合
は文献から公知の方法で例えば吸着によりまたは共有、
結合的行われる。（Catt,K.,Tregear,G.W:Science,158
（1967）1570/1572頁；アメリカ特許4,657,873またはWo
od,W.G.及びGadow,A.:J.Clin.Chem.Biochem.21（198
3）,789−797頁を参照）。
放射性核種（125I）及び実施例１及び２において用い
られた発光物による標識の代わりに他の公知の方法で標
識することができる。酵素，基板，螢光物質または他の
検知できる物質が使用され、勿論その場合適当な検知方
法が選択されるべきである。
られた発光物による標識の代わりに他の公知の方法で標
識することができる。酵素，基板，螢光物質または他の
検知できる物質が使用され、勿論その場合適当な検知方
法が選択されるべきである。
本発明に含まれる実験はすべてFT4の検出に関係して
いる。FT3の検出に対して本発明による方法が適当であ
るために同じ方法に関係する実験結果が利用できる。FT
3についても本発明の記述における供述を確認してい
る。
いる。FT3の検出に対して本発明による方法が適当であ
るために同じ方法に関係する実験結果が利用できる。FT
3についても本発明の記述における供述を確認してい
る。
第１図は同一検定条件のもと異なる交叉−反応性の接合
（conjugate）１から５についてのFT4検定のため標準プ
ロット（マウスの抗−T4抗体）を示し、縦軸は抗原抗体
反応時結合T4と非結合T4（B/B0）比を、横軸は定量され
るFT4の濃度を示す。
（conjugate）１から５についてのFT4検定のため標準プ
ロット（マウスの抗−T4抗体）を示し、縦軸は抗原抗体
反応時結合T4と非結合T4（B/B0）比を、横軸は定量され
るFT4の濃度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハートムート ロコス ドイツ連邦共和国 1000 ベルリン 37 アム フィシュタル 24ベー
Claims (7)
- 【請求項１】ハプテン性質を有するホルモン及び該ホル
モンと結合する１つまたはそれ以上の生理学的結合パー
トナーを含む生物学的流体中に存在する遊離したハプテ
ン性質を有するホルモンを定量的に決定するための免疫
学的方法において、 ｉ）17から37℃の範囲の温度で、前記生物学的流体を、 ａ）所定量の前記ホルモンに特異的な標識抗体、及び、 ｂ）固相に固定化された過剰量の前記ホルモンまたはそ
の誘導体の接合であって、前記生理学的結合パートナー
に対する反応性が前記ホルモンの反応性より低下した接
合を含む液体反応混合物とを接触させ、 ii）30分から３時間反応させた後、前記固相を前記液体
反応混合物から分離し、 iii）前記液体反応混合物中の標識抗体、及び、前記固
相中の標識抗体の量を測定し、その結果から前記生物学
的流体中の遊離したハプテン性質を有するホルモンの量
を決定する過程を具備し、 前記特異的な標識抗体の前記固定化した接合に対する親
和力が、前記決定すべき遊離したハプテン性質を有する
ホルモンに対する前記特異的な標識抗体の親和力の28％
より低い（交差反応性＜28％）ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記固定化接合に対する前記特異的な標識
抗体の親和力が、前記決定すべき遊離したハプテン性質
を有するホルモンに対する該特異的な標識抗体の親和力
の８から25％の範囲（８％＜交差反応性＜25％）から選
択されることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記決定すべき遊離したハプテン性質を有
するホルモンを含む生物学的流体が、前記標識抗体及び
ホルモンまたはその誘導体の固定化接合と、実質的に同
時に接触することを特徴とする請求項１または２に記載
の方法。 - 【請求項４】決定すべき遊離したハプテン性質を有する
ホルモンが、チロイドホルモンのＬ−サイロキシンまた
はＬ−トリヨードサイロナインでることを特徴とする請
求項１から３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】前記固相が、プラスチックまたはガラスか
らなることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項６】前記ホルモンまたはその誘導体の固定化接
合が、タンパク質、ポリペプチド、またはポリサッカラ
イドからなるキャリア成分を含有し、このキャリア成分
を介して固相に固定化されることを特徴とする請求項１
から５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】前記キャリア成分に対する前記標識抗体の
親和力が、前記決定すべき遊離したハプテン性質を有す
るホルモンに対する該標識抗体の親和力の0.5％より低
いことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の
方法。
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6468661A JPS6468661A (en) | 1989-03-14 |
| JP2661712B2 true JP2661712B2 (ja) | 1997-10-08 |
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ID=6333832
Family Applications (1)
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| JP63201016A Expired - Lifetime JP2661712B2 (ja) | 1987-08-14 | 1988-08-11 | ハプテン性質を有する遊離物質の決定のための免疫的方法 |
Country Status (7)
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| JP (1) | JP2661712B2 (ja) |
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| DE (2) | DE3727238A1 (ja) |
| ES (1) | ES2042661T3 (ja) |
| GR (1) | GR3005066T3 (ja) |
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| US4595661A (en) * | 1983-11-18 | 1986-06-17 | Beckman Instruments, Inc. | Immunoassays and kits for use therein which include low affinity antibodies for reducing the hook effect |
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| DE3415818C1 (de) * | 1984-04-27 | 1985-04-18 | Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk, 1000 Berlin | Verfahren zur Bestimmung freier Substanzen in biologischen Fluessigkeiten |
| DE3442817A1 (de) * | 1984-11-23 | 1986-05-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur quantitativen bestimmung von freiem thyroxin in plasma, serum oder vollblut |
| FR2598514B1 (fr) * | 1986-05-12 | 1988-07-01 | Commissariat Energie Atomique | Procede de dosage immunologique des hormones thyroidiennes t3 et/ou t4 utilisant la thyroglobuline |
| DE3624464A1 (de) * | 1986-07-19 | 1988-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis eines analyten sowie hierfuer geeignetes mittel |
| GB8800419D0 (en) * | 1988-01-08 | 1988-02-10 | Amersham Int Plc | Method for measuring free fraction of ligands in biological fluids |
-
1987
- 1987-08-14 DE DE19873727238 patent/DE3727238A1/de active Granted
-
1988
- 1988-08-11 JP JP63201016A patent/JP2661712B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-12 ES ES88113141T patent/ES2042661T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-12 EP EP88113141A patent/EP0303284B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-12 AT AT88113141T patent/ATE77487T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-08-12 DE DE8888113141T patent/DE3872098D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-15 US US07/232,251 patent/USH1018H/en not_active Abandoned
-
1992
- 1992-06-30 GR GR920401407T patent/GR3005066T3/el unknown
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| GR3005066T3 (ja) | 1993-05-24 |
| DE3727238C2 (ja) | 1989-05-18 |
| ATE77487T1 (de) | 1992-07-15 |
| DE3727238A1 (de) | 1989-02-23 |
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