JPH0445785B2 - - Google Patents
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Description
本発明はリガンドのアツセイ、より詳細には抗
原またはハプテンのアツセイに関する。 被分析体（ハプテンまたは抗原である）をイム
ノアツセイ法によりアツセイする際には、被分析
体とトレーサーが抗体上の限られた数の結合部位
に関して競合し、抗体が結合したトレーサーの量
は試料中の被分析体の量に反比例する。抗体に結
合したトレーサーを結合していないトレーサーか
ら分離したのち、結合したトレーサーおよび遊離
トレーサーのうち少なくとも一方を試料中の被分
析体量の尺度として測定する。 一般に固相アツセイと呼ばれる、この種のアツ
セイの一つの型においては、抗体を固体支持体上
に支持し、これにより抗体に結合したトレーサー
は溶液中に残留する遊離トレーサーから容易に分
離される。 他の型のアツセイにおいては、被分析体、トレ
ーサーおよび抗体をインキユベートしたのち、こ
のインキユベートされた混合物を固体に支持され
た抗体と接触させる。これにより、インキユベー
ト中に結合しなかつたトレーサーはいずれも固体
に支持された抗体に結合する。この方法では、最
初のインキユベートに際して結合したトレーサー
を、インキユベートされた混合物中に残存するト
レーサーから分離し、上記のようにインキユベー
トされた混合物中の結合したトレーサーおよび遊
離トレーサーのうち少なくとも一方の量を測定す
ることにより、試料中に存在する被分析体を測定
することができる。このような方法の例は米国特
許第4108976号明細書に記載されている。この特
許は、固体に支持された抗体をこれに結合した物
質をのちに溶離することにより再使用できる自動
的操作法を示している。 後者の方法は被分析体の測定に有効ではある
が、この種の方法にはインキユベートされた混合
物中に存在する結合したトレーサーと遊離のトレ
ーサーを分離するために高価な抗体を使用する必
要がある。 他の型の先行技術によるアツセイの場合、被分
析体、トレーサーおよび第１抗体をインキユベー
トしたのち、このインキユベートされた混合物を
固体支持体に支持された第２抗体（この第２抗体
は第１抗体に対する結合剤である）と接触させ、
これにより第１抗体に結合していたトレーサーは
いずれも第１抗体を介して第２抗体に結合して
“結合した”トレーサーとなり、第１抗体に結合
していないトレーサーは第２抗体に結合せず“遊
離の”トレーサーとなる。“結合した”トレーサ
ーの量は試料中の被分析体の量と反比例する。こ
の型のアツセイはしばしば“第２抗体”アツセイ
と呼ばれ、この種のアツセイはある場合には有効
に用いられるが、感度を改善する必要がある。 本発明は、被分析体と共にインキユベートされ
る抗体の結合剤として、固体支持体上の抗原また
はハプテンを用いる被分析体（（ハプテンまたは
抗原）のための改良されたアツセイ法を提供する
ことを目的とする。 より詳細には、本発明の一観点によれば被分析
体（抗原またはハプテン）、トレーサー（標識さ
れた被分析体またはその適宜な同族体）ならびに
トレーサーおよび被分析体に特異的な抗体の混合
物をインキユベートし、その際抗体は被分析体お
よびトレーサーに対する結合部位少なくとも２個
を有し、抗体およびトレーサーは混合物中におい
てトレーサーが抗体の結合部位のすべてを飽和す
ることのない量用いられる。 ここで用いられる“適宜な同族体”という語
は、アツセイに用いられる抗体に結合する同族体
を意味する。 “標識された形の被分析体”という語は、標識
された被分析体または標識された適宜な被分析体
同族体を意味する。 インキユベートされた混合物を次いで抗体に特
異的な結合剤（被分析体またはその適宜な同族
体）と接触させる。これによりその結合部位がす
べて占有されていない抗体分子はいずれも支持さ
れた結合剤に結合し、その結合部位がすべて占有
されている抗体分子および結合していないトレー
サーはいずれも支持された結合剤に結合しないで
あろう。この様式の場合、支持された結合剤に結
合した抗体の量は試料中の被分析体の量に反比例
する。抗体にはトレーサーが結合しているので、
固体支持体上の結合剤に結合した抗体の量は、支
持された結合剤に結合した画分のトレーサー量の
測定により測定できる。 あるいは固体支持体上の結合剤に結合していな
いトレーサーの量を測定できることもできる。こ
の量は試料中の被分析体の量に正比例する（被分
析体の量が増加するのに伴い、結合部位がさらに
飽和され、その結果結合していない抗体の画分が
増加する）。 他の方法としては、抗体に対する固体に支持さ
れた結合剤に結合したトレーサーの量、および抗
体に対する固体に支持された結合剤に結合してい
ないトレーサーのいずれをもインキユベートされ
た混合物中に存在する被分析体の量の尺度として
測定することができる。 従つて本発明のこの観点によれば、抗体に結合
したトレーサー（支持された結合剤には結合して
いない）、および遊離のトレーサー（抗体に結合
していない）は“遊離の”画分（結合部位のすべ
てがトレーサーまたは被分析体のいずれかにより
飽和されている抗体分子）として測定され、固体
に支持された結合剤に結合した抗体に結合したト
レーサー（結合部位のすべてよりも少ない部位が
被分析体またはトレーサーにより飽和されている
抗体）は“結合した”画分として測定され、“結
合した”画分の量はインキユベートされた混合物
中に存在する被分析体の量と反比例する。“結合
した”画分は、その結合部位１個のみがトレーサ
ーまたは被分析体のいずれかにより占有された抗
体からなり、これに対し“遊離の”画分は結合し
ていないトレーサーならびに両結合部位が被分析
体および／またはトレーサーにより占有されてい
る抗体からなる。 固体支持体に支持された結合剤は、被分析体と
して測定すべき抗原もしくはハプテン、またはそ
れらの適宜な同族体である。 このように本発明のこの観点を押し進めること
によつて、先行技術に一般に用いられているよう
な抗体の代わりに、ハプテンまたは抗原のアツセ
イに際し抗原またはハプテンを固相結合剤として
用いることができる。 本発明の他の観点によれば、被分析体（抗原ま
たはハプテン、好ましくは抗原）を被分析体に対
する標識された抗体であるトレーサーと共にイン
キユベートする（抗体は被分析体に対する結合部
位を少なくとも２個もつ）。インキユベートした
のち混合物を固体支持体に支持された被分析体ま
たはその適宜な同族体と接触させる。これによ
り、その結合部位のすべてよりも少ない部位が被
分析体により占有されている標識された抗体分子
は支持された結合剤に結合し、その結合部位がす
べて被分析体により占有されている標識された抗
体分子は支持された結合剤に結合しないであろ
う。標識された被分析体またはその適宜な同族体
を用いるアツセイの場合と同様に、固体支持体に
結合した抗体の量は試料中の被分析体の量に反比
例する。従つて試料中に存在する被分析体の量
は、支持された結合剤に結合した標識抗体およ
び／または結合していない標識抗体の量を測定す
ることにより測定できる。 この実施態様の場合、前記の実施態様の場合と
同様にある抗体は支持された結合剤と結合し、あ
る抗体は支持された結合剤と結合しない。この実
施態様の場合、前記実施態様の場合と同様に、ハ
プテンまたは抗原のアツセイにおいて先行技術に
一般に用いられる抗体の代わりにハプテンまたは
抗原を固相結合剤として用いる。 両実施態様によれば、インキユベート後に支持
された抗原またはハプテンに結合している標識物
質（一方のアツセイにおいて結合した標識物質は
その抗原結合部位のすべてよりも少ない部位が占
有された標識された抗体分子であり、他のアツセ
イにおいては支持された抗原またはハプテンにそ
の抗原結合部位のすべてよりも少ない部位が占有
されている抗体分子を介して結合したトレーサー
である）は“結合した”画分であり、支持された
抗原またはハプテンに結合していない標識物質
（その抗原性部のすべてが占有されている標識さ
れた抗体；あるいは結合していないトレーサーま
たはその抗原結合部位のすべてが占有されている
抗体分子に結合したトレーサー）は“遊離の”画
分である。 被分析体の量は“結合した”および／または
“遊離の”画分を測定し、これを当技術分野で一
般に知られている方法を用いた各種の既知量また
は標準量の被分析体に関するアツセイにより作成
された標準曲線と比較することによつて測定でき
る。 本発明は各種の抗原およびハプテン、好ましく
は抗原のアツセイにいることができる。一般に、
アツセイされる抗原は比較的高分子量であること
を特色とし、特にこの種の抗原はポリペプチド、
殊にホルモンまたはポリペプチド蛋白質である。
この種の抗原の代表例としてはｈ TSH（ヒト甲
状腺刺激ホルモン）；HCG；インシユリン；
CEA；フエリチン、肝炎関連抗原ＡおよびＢ、
α−フエトプロテイン（α−fetoprothin）；生長
ホルモン；FSH、LH、ジオラクチン、ガストリ
ンなどがあげられる。本発明によりアツセイでき
るハプテンの代表例としては、T4，T3、ジゴキ
シン、コルチゾール、エストリオール、アルドス
テロン、テストステロン、プロゲステロン；各種
薬剤などがあげられる。 アツセイに用いる抗体成分は当技術分野で一般
に知られている方法により製造できる。たとえば
抗体は抗原を脊椎動物に投与するか、あるいはハ
プテンに対する抗体を製造すべきである場合はこ
のハプテンまたはその同族体を蛋白質に結合させ
て免疫原を製造する。 当技術分野で知られているように、アツセイに
用いられるトレーサーは一方の型のアツセイにお
いてはマーカー、タグ（tag）ないしは標識をア
ツセイすべき被分析体（リガンド）または被分析
体の適宜な同族体に付加することにより、また他
の型のアツセイにおいては被分析体に抗体に付加
することにより製造される。好ましい実施態様に
よれば、トレーサーは放射性同位体をマーカーな
いしは標識として用いることにより製造される。
この種の放射性同位体の代表例としては、ヨウ
素、トリチウム、コバルトなどの放射性同位体が
あげられ、放射性ヨウ素、特に125Iが好ましい。
しかし、他の放射性同位体の使用も本発明の範囲
に包含されると解すべきである。 同様に、被分析体もしくはその適宜な同族体、
または被分析体に対する抗体を放射性同位体以外
のものでマーカー付けないしは標識すること：た
とえば酵素標識；色原体標識（螢光物質による標
識を含む）などによりトレーサーを得ることもで
きる。適切なトレーサーを製造することは本発明
から当業者が容易になしうるものと思われる。 本発明に用いられる、固体に支持された抗原ま
たはハプテンは、前記のようにアツセイすべき被
分析体（リガンド）またはその適宜な同族体のい
ずれであつてもよい。前記のように、固体支持体
に支持された抗原またはハプテン（結合剤）は、
アツセイに用いられる抗体（標識されたもの、ま
たは標識されないもの）と結合できるものであ
る。従つて支持された抗原が被分析体と一致する
必要はなく、同一の総分子量をもつ必要はない。
たとえばヒトインシユリンのアツセイにおいては
支持された抗原はウシインシユリンまたはブタイ
ンシユリンのいずれかであつてもよく、またβ−
HCGに対する抗体を用いるHCGアツセイにおい
ては支持された抗原はHCGであつてよい。固体
支持体上に用いるのに適した抗原またはハプテン
の選択は本明細書の教示から当業者が容易になし
うるものであると思われる。 抗原またはハプテンは広範な固体材料に支持さ
せることができる。当技術分野で知られているよ
うに、この種の材料には適切なポリマー、たとえ
ばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリテトラフルオルエチレン、ポリアミド
類、ポリアクリルアミド類、架橋したアガロー
ス、デキストランなど；ガラス、細菌細胞；イオ
ン交換樹脂；綿（米国特許第4200625号に記載）
および米国特許第4059685号明細書に記載された
型の支持体が含まれる。適切な支持体の選択は本
明細書の教示から当業者が容易になしうるものと
思われる。 抗原またはハプテンは当技術分野で一般に知ら
れている方法（吸着および共有結合を含む）によ
り固体支持体に支持させることができる。物質を
固体支持体に支持させる方法は当技術分野で既知
であるという事実からみて、本発明を完全に理解
するためにこれに関してこれ以上の詳述は不必要
であると思われる。 抗原またはハプテンのための固体支持体は粒
子、シート、チユーブなどを含む広範な形状であ
りうるが、好ましい実施態様によれば抗体のため
の固体支持体は支持された抗原を貫流室（フロー
スルー室）に入れることができ、これによりイン
キユベートされた混合物を支持された抗原を入れ
た室内へ貫流させることがきるものである。この
種のフロースルー室の代表例が米国特許第
4059685号明細書に記載されている。 本発明を実施するに際しては、アツセイすべき
抗原またはハプテン（被分析体）を含有するかま
たは含有すると思われる試料を(a)標識された形の
被分析体もしくはその適宜な同族体または(b)被分
析体に対する標識された抗体のいずれかであるト
レーサーと共にインキユベートする。その際イン
キユベートは15〜40℃程度の温度で結合を行わせ
るのに十分な時間行われる。 インキユベート後に、混合物を支持された抗原
またはハプテンと適宜反応させて、両結合部位が
占有されてはいない抗体分子は結合させ、両結合
部位が占有された抗体分子は支持された抗原また
はハプテンに結合させないようにする。こうし
て、不完全に飽和された抗体分子は両結合部位が
飽和された抗体分子から分離される。 前記のように、支持された抗原もしくはハプテ
ンに結合した標識物質の量および／または支持さ
れた抗原もしくはハプテンに結合していない標識
物質の量を測定し、これを当技術分野で一般に知
られている方法により得られた標準曲線と比較す
るとによつて、試料中に存在する被分析体の量を
測定することができる。 好ましい実施態様によれば、支持された抗原ま
たはハプテンに結合した抗体をこれから溶離し
て、支持された抗原またはハプテンを再使用する
ことができる。これに関しては、支持された抗原
またはハプテンから抗体を溶離し、これらの支持
された抗原またはハプテンの結合能を破壊するこ
とのない適切な溶離液をいることによりこの種の
溶離を行うことができる。 好ましい実施態様においては、溶離液は3.0よ
りも高くはなくかつ抗原の結合能が破壊されない
酸性PHのもの（すなわち溶離液を酸性にしすぎな
い）である。一般に溶離液は1.5よりも低くはな
く、好ましくは2.0よりも低くはないPHである。 特にこの種の溶離液は上記のPHに緩衝化された
水である。 種々の酸性緩衝液のいずれかを用いることによ
り酸性のPHが得られる。適切な緩衝剤の代表例と
しては、クエン酸塩、酢酸塩、グリシネート、グ
ルタミン酸塩、修酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、塩
酸など、またはそれらの混合物があげられる。適
切な緩衝剤の選択は本明細書中の教示から当業者
が容易になしうるものと思われる。 緩衝剤は、支持された抗原の結合能を破壊する
ことなく希望する溶離を与える濃度で用いられ
る。ある場合には溶液の塩濃度（イオン濃度）を
増すことにより溶離能が高められる。このような
塩濃度の増大は、緩衝液の濃度を高めることによ
り、または結合剤に不利な影響を与えない水溶性
塩の添加により達成できる。この種の塩の代表例
としては、アルカリ金属またはアンモニウムの水
溶性塩、たとえばハロゲン化物；硫酸塩、硝酸
塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩など；水溶性
の遷移金属塩、たとえば硝酸塩、ハロゲン化物な
ど；その他があげられる。前記のように、緩衝剤
を含む総塩濃度は支持された抗原の抗原性を破壊
することなく希望する溶離を与えるものであり、
一般に塩濃度は4Mを越えず、大部分の場合これ
は2Mを越えない。一般にこの種の塩を用いる場
合塩濃度は、少なくとも0.01Mである。 また溶離は水性アルコールを用いて塩基性PHに
おいて、たとえば75％メタノールを用いてPH13で
行いうることも理解すべきである。 本発明は支持された抗原またはハプテンの再生
行わないアツセイにも適用できるが、本発明は支
持された抗原またはハプテンを再生するアツセイ
に特に適用することができ、殊に自動化されたア
ツセイに適している。この種の自動化されたアツ
セイの場合、支持された抗原またはハプテンはフ
ロースルー室中に置かれ、自動化された装置はた
とえば米国特許第4009005号明細書に記載された
型のものである。 自動化されたアツセイ法の一例の場合、被分析
体を含有するかまたは含有すると思われる試料を
トレーサー（標識された形の被分析体またはその
適宜な同族体）、ならびにトレーサーおよび被分
析体に対する抗体と共にインキユベートし、得ら
れた混合物を支持された抗原またはハプテンを含
有する室内を貫流させて、両結合部位が被分析体
および／またはトレーサーにより占有されている
抗体分子を分離する。分離後に溶離液を室内へ導
通して、支持された抗原から抗体を溶離し、これ
により室内に支持された抗原をアツセイに再使用
することができる。 この種のアツセイの一実施態様によれば、トレ
ーサーはγ線を放出する放射性同位体を標識ない
しはマーカーとして含むものであり、室内からの
出口をγ線検出器に接続し、未結合抗体およびト
レーサーを最初に室内から洗い出してカウント
し、次いで結合した抗体を支持された抗原から溶
離し、この支持された抗原に結合していた画分の
総放射能を測定する。支持された抗原に結合して
いた画分の総放射能（％）は、試料中の被分析体
の濃度に反比例する。 他の実施態様においては、被分析体を含有する
かまたは含有すると思われる試料を被分析体に対
する標識された形の抗体と共にインキユベート
し、インキユベートされた混合物を固体支持体に
支持された被分析体またはその適宜な同族体（適
宜ハプテンは抗原）を含む室内を貫流させ、遊離
結合部位をもつ標識された抗体分子（室内で結合
したもの）をそれらの結合部位が完全に占有され
ている標識された抗体分子から分離する。アツセ
イの他の部分は、標識された被分析体を用いるア
ツセイについて先きに述べたものと同様である。 本発明の他の観点によれば、本発明方法により
アツセイを行うために適した試薬キツトまたは包
装品が提供され、この種のキツトまたは包装品は
主成分として：(a)被分析体のためのトレーサー
（標識された形の被分析体またはその適宜な同族
体）；(b)被分析体およびトレーサーに対する抗
体；ならびに(c)抗体を免疫反応で結合することが
できる固体支持体に支持されたハプテンまたは抗
原（被分析体またはその適宜な同族体）を含む。 試薬キツトまたは包装品の他の形態として、キ
ツトまたは包装品は主成分として(a)被分析体に対
する標識された形の抗体、および(b)標識された抗
体を免疫反応で結合し、固体支持体に支持されて
いるハプテンまたは抗原（被分析体またはその適
宜な同族体）を含む。 特に好ましい形態によれば、固体に支持された
この種の抗原またはハプテンはフロースルー室中
に存在させる。支持された抗原またはハプテンを
再使用する場合は、試薬キツトまたは包装品には
好ましくは、支持された抗原またはハプテンから
抗体を溶離することができる溶離液も含まれ、溶
離液は一般に前記の型の水性溶離液である。この
成分を含ませる場合、これらは試薬キツトまたは
包装品中で別個の容器たとえばバイアルに入れら
れる。試薬キツトまたは包装品は他の成分、たと
えばアツセイすべき抗原またはハプテンの標準
液、すなわち既知の濃度のアツセイすべき抗原ま
たはハプテンを含む抗原またはハプテンの試料；
緩衝液；洗浄液などを含んでいてもよい。 この種の物質１種または２種以上を試薬キツト
または包装品から分離して別個に包装し、別個の
物品として販売することもできると解すべきであ
る。たとえば固体支持体上に支持された抗原また
はハプテンを別個の物品として販売するためにフ
ロースルー室中に別個に包装することもできる。 本発明のアツセイおよびキツトは種々のアツセ
イに用いることができるが、本発明者らはこのア
ツセイおよびキツトは特にインシユリンまたは
HCGのアツセイに適していることを見出した。 インシユリンのアツセイの際しては、ウシまた
はブタのインシユリン（（好ましくはブタインシ
ユリン）を支持された抗原として用い、これは臭
化シアンにより活性化された綿ガーゼ上に支持さ
れていることが好ましい。 HCGのアツセイに際しては、固体支持体上に
支持された抗原は臭化シアンにより活性化された
架橋アガロース（セフアロース）に支持された
HCGであることが好ましい。 本発明をさらに下記の具体例に関連して述べる
が、本発明の範囲がこれれにより限定されるもの
ではない。 実施例 １ 支持された抗原の製造 高イオン濃度の緩衝液（（PH８）中の既知の量
の抗原を臭化シアンで活性化された一定量のセフ
アロース（フアルマシア社）または綿ガーゼ（ベ
クトン・デイツキンソン・イムノケミストリー）
と２〜３時間、室温で混合した。未反応の抗原を
除去し、固体支持体をエタノールアミン中で室温
において１時間インキユベートし、過剰の未反応
臭化シアン基をブロツクした。エタノールアミン
を除去し、固体支持体を高イオン強度の酸性緩衝
液およびアルカリ性緩衝液で交互に洗浄した。次
いでこれを洗浄し、使用前は生理緩衝液中に保存
した。 実施例 ２ インシユリンのアツセイ 室温で行う一般的なインシユリンアツセイにお
いて、試料150μを125Iインシユリン（150μCi／
μg）、抗インシユリン80μ〔１：1000のモルモ
ツト抗ブタインシユリン、50mMトリス−0.15M
NaCl（BSA0.01％、PH8.0）中〕および50mMト
リス−0.15M・NaCl、BSA0.01％を含有する緩
衝液（（PH8.0）（吸着緩衝液）80μと共に30分間
インキユベートした。次いでこれを活性化された
綿ガーゼの６×2.54cmのストリツプに結合させた
ブタインシユリン0.15mgを含む0.5×1.5cmの室内
へ、1.0ml／分で0.6分間かけて通過させた。遊離
面分（結合しなかつた免疫複合体＋遊離125Iイン
シユリン）をカラムから吸着緩衝液により３ml／
分の流速で1.5分間洗い出し、1.7mlのフローセル
を備えたγ線検出器で計数した。結合した画分は
50mMグリシン緩衝液（PH2.0）を用いて2.5ml／
分の流速で1.3分間かけて室内から溶離した。溶
出液を0.5ml／分で流れるミカノール（アルキル
イミダゾリニウムジカルボキシレート塩10ｇ／水
）と1.3分間混和し、γ線検出器で計数した。
次いで吸着緩衝液で3.0ml／分において0.19分間
洗浄することにより室内を再平衡化した。 このインシユリンアツセイに関する典型的な実
施データは下記のとおりであつた。
原またはハプテンのアツセイに関する。 被分析体（ハプテンまたは抗原である）をイム
ノアツセイ法によりアツセイする際には、被分析
体とトレーサーが抗体上の限られた数の結合部位
に関して競合し、抗体が結合したトレーサーの量
は試料中の被分析体の量に反比例する。抗体に結
合したトレーサーを結合していないトレーサーか
ら分離したのち、結合したトレーサーおよび遊離
トレーサーのうち少なくとも一方を試料中の被分
析体量の尺度として測定する。 一般に固相アツセイと呼ばれる、この種のアツ
セイの一つの型においては、抗体を固体支持体上
に支持し、これにより抗体に結合したトレーサー
は溶液中に残留する遊離トレーサーから容易に分
離される。 他の型のアツセイにおいては、被分析体、トレ
ーサーおよび抗体をインキユベートしたのち、こ
のインキユベートされた混合物を固体に支持され
た抗体と接触させる。これにより、インキユベー
ト中に結合しなかつたトレーサーはいずれも固体
に支持された抗体に結合する。この方法では、最
初のインキユベートに際して結合したトレーサー
を、インキユベートされた混合物中に残存するト
レーサーから分離し、上記のようにインキユベー
トされた混合物中の結合したトレーサーおよび遊
離トレーサーのうち少なくとも一方の量を測定す
ることにより、試料中に存在する被分析体を測定
することができる。このような方法の例は米国特
許第4108976号明細書に記載されている。この特
許は、固体に支持された抗体をこれに結合した物
質をのちに溶離することにより再使用できる自動
的操作法を示している。 後者の方法は被分析体の測定に有効ではある
が、この種の方法にはインキユベートされた混合
物中に存在する結合したトレーサーと遊離のトレ
ーサーを分離するために高価な抗体を使用する必
要がある。 他の型の先行技術によるアツセイの場合、被分
析体、トレーサーおよび第１抗体をインキユベー
トしたのち、このインキユベートされた混合物を
固体支持体に支持された第２抗体（この第２抗体
は第１抗体に対する結合剤である）と接触させ、
これにより第１抗体に結合していたトレーサーは
いずれも第１抗体を介して第２抗体に結合して
“結合した”トレーサーとなり、第１抗体に結合
していないトレーサーは第２抗体に結合せず“遊
離の”トレーサーとなる。“結合した”トレーサ
ーの量は試料中の被分析体の量と反比例する。こ
の型のアツセイはしばしば“第２抗体”アツセイ
と呼ばれ、この種のアツセイはある場合には有効
に用いられるが、感度を改善する必要がある。 本発明は、被分析体と共にインキユベートされ
る抗体の結合剤として、固体支持体上の抗原また
はハプテンを用いる被分析体（（ハプテンまたは
抗原）のための改良されたアツセイ法を提供する
ことを目的とする。 より詳細には、本発明の一観点によれば被分析
体（抗原またはハプテン）、トレーサー（標識さ
れた被分析体またはその適宜な同族体）ならびに
トレーサーおよび被分析体に特異的な抗体の混合
物をインキユベートし、その際抗体は被分析体お
よびトレーサーに対する結合部位少なくとも２個
を有し、抗体およびトレーサーは混合物中におい
てトレーサーが抗体の結合部位のすべてを飽和す
ることのない量用いられる。 ここで用いられる“適宜な同族体”という語
は、アツセイに用いられる抗体に結合する同族体
を意味する。 “標識された形の被分析体”という語は、標識
された被分析体または標識された適宜な被分析体
同族体を意味する。 インキユベートされた混合物を次いで抗体に特
異的な結合剤（被分析体またはその適宜な同族
体）と接触させる。これによりその結合部位がす
べて占有されていない抗体分子はいずれも支持さ
れた結合剤に結合し、その結合部位がすべて占有
されている抗体分子および結合していないトレー
サーはいずれも支持された結合剤に結合しないで
あろう。この様式の場合、支持された結合剤に結
合した抗体の量は試料中の被分析体の量に反比例
する。抗体にはトレーサーが結合しているので、
固体支持体上の結合剤に結合した抗体の量は、支
持された結合剤に結合した画分のトレーサー量の
測定により測定できる。 あるいは固体支持体上の結合剤に結合していな
いトレーサーの量を測定できることもできる。こ
の量は試料中の被分析体の量に正比例する（被分
析体の量が増加するのに伴い、結合部位がさらに
飽和され、その結果結合していない抗体の画分が
増加する）。 他の方法としては、抗体に対する固体に支持さ
れた結合剤に結合したトレーサーの量、および抗
体に対する固体に支持された結合剤に結合してい
ないトレーサーのいずれをもインキユベートされ
た混合物中に存在する被分析体の量の尺度として
測定することができる。 従つて本発明のこの観点によれば、抗体に結合
したトレーサー（支持された結合剤には結合して
いない）、および遊離のトレーサー（抗体に結合
していない）は“遊離の”画分（結合部位のすべ
てがトレーサーまたは被分析体のいずれかにより
飽和されている抗体分子）として測定され、固体
に支持された結合剤に結合した抗体に結合したト
レーサー（結合部位のすべてよりも少ない部位が
被分析体またはトレーサーにより飽和されている
抗体）は“結合した”画分として測定され、“結
合した”画分の量はインキユベートされた混合物
中に存在する被分析体の量と反比例する。“結合
した”画分は、その結合部位１個のみがトレーサ
ーまたは被分析体のいずれかにより占有された抗
体からなり、これに対し“遊離の”画分は結合し
ていないトレーサーならびに両結合部位が被分析
体および／またはトレーサーにより占有されてい
る抗体からなる。 固体支持体に支持された結合剤は、被分析体と
して測定すべき抗原もしくはハプテン、またはそ
れらの適宜な同族体である。 このように本発明のこの観点を押し進めること
によつて、先行技術に一般に用いられているよう
な抗体の代わりに、ハプテンまたは抗原のアツセ
イに際し抗原またはハプテンを固相結合剤として
用いることができる。 本発明の他の観点によれば、被分析体（抗原ま
たはハプテン、好ましくは抗原）を被分析体に対
する標識された抗体であるトレーサーと共にイン
キユベートする（抗体は被分析体に対する結合部
位を少なくとも２個もつ）。インキユベートした
のち混合物を固体支持体に支持された被分析体ま
たはその適宜な同族体と接触させる。これによ
り、その結合部位のすべてよりも少ない部位が被
分析体により占有されている標識された抗体分子
は支持された結合剤に結合し、その結合部位がす
べて被分析体により占有されている標識された抗
体分子は支持された結合剤に結合しないであろ
う。標識された被分析体またはその適宜な同族体
を用いるアツセイの場合と同様に、固体支持体に
結合した抗体の量は試料中の被分析体の量に反比
例する。従つて試料中に存在する被分析体の量
は、支持された結合剤に結合した標識抗体およ
び／または結合していない標識抗体の量を測定す
ることにより測定できる。 この実施態様の場合、前記の実施態様の場合と
同様にある抗体は支持された結合剤と結合し、あ
る抗体は支持された結合剤と結合しない。この実
施態様の場合、前記実施態様の場合と同様に、ハ
プテンまたは抗原のアツセイにおいて先行技術に
一般に用いられる抗体の代わりにハプテンまたは
抗原を固相結合剤として用いる。 両実施態様によれば、インキユベート後に支持
された抗原またはハプテンに結合している標識物
質（一方のアツセイにおいて結合した標識物質は
その抗原結合部位のすべてよりも少ない部位が占
有された標識された抗体分子であり、他のアツセ
イにおいては支持された抗原またはハプテンにそ
の抗原結合部位のすべてよりも少ない部位が占有
されている抗体分子を介して結合したトレーサー
である）は“結合した”画分であり、支持された
抗原またはハプテンに結合していない標識物質
（その抗原性部のすべてが占有されている標識さ
れた抗体；あるいは結合していないトレーサーま
たはその抗原結合部位のすべてが占有されている
抗体分子に結合したトレーサー）は“遊離の”画
分である。 被分析体の量は“結合した”および／または
“遊離の”画分を測定し、これを当技術分野で一
般に知られている方法を用いた各種の既知量また
は標準量の被分析体に関するアツセイにより作成
された標準曲線と比較することによつて測定でき
る。 本発明は各種の抗原およびハプテン、好ましく
は抗原のアツセイにいることができる。一般に、
アツセイされる抗原は比較的高分子量であること
を特色とし、特にこの種の抗原はポリペプチド、
殊にホルモンまたはポリペプチド蛋白質である。
この種の抗原の代表例としてはｈ TSH（ヒト甲
状腺刺激ホルモン）；HCG；インシユリン；
CEA；フエリチン、肝炎関連抗原ＡおよびＢ、
α−フエトプロテイン（α−fetoprothin）；生長
ホルモン；FSH、LH、ジオラクチン、ガストリ
ンなどがあげられる。本発明によりアツセイでき
るハプテンの代表例としては、T4，T3、ジゴキ
シン、コルチゾール、エストリオール、アルドス
テロン、テストステロン、プロゲステロン；各種
薬剤などがあげられる。 アツセイに用いる抗体成分は当技術分野で一般
に知られている方法により製造できる。たとえば
抗体は抗原を脊椎動物に投与するか、あるいはハ
プテンに対する抗体を製造すべきである場合はこ
のハプテンまたはその同族体を蛋白質に結合させ
て免疫原を製造する。 当技術分野で知られているように、アツセイに
用いられるトレーサーは一方の型のアツセイにお
いてはマーカー、タグ（tag）ないしは標識をア
ツセイすべき被分析体（リガンド）または被分析
体の適宜な同族体に付加することにより、また他
の型のアツセイにおいては被分析体に抗体に付加
することにより製造される。好ましい実施態様に
よれば、トレーサーは放射性同位体をマーカーな
いしは標識として用いることにより製造される。
この種の放射性同位体の代表例としては、ヨウ
素、トリチウム、コバルトなどの放射性同位体が
あげられ、放射性ヨウ素、特に125Iが好ましい。
しかし、他の放射性同位体の使用も本発明の範囲
に包含されると解すべきである。 同様に、被分析体もしくはその適宜な同族体、
または被分析体に対する抗体を放射性同位体以外
のものでマーカー付けないしは標識すること：た
とえば酵素標識；色原体標識（螢光物質による標
識を含む）などによりトレーサーを得ることもで
きる。適切なトレーサーを製造することは本発明
から当業者が容易になしうるものと思われる。 本発明に用いられる、固体に支持された抗原ま
たはハプテンは、前記のようにアツセイすべき被
分析体（リガンド）またはその適宜な同族体のい
ずれであつてもよい。前記のように、固体支持体
に支持された抗原またはハプテン（結合剤）は、
アツセイに用いられる抗体（標識されたもの、ま
たは標識されないもの）と結合できるものであ
る。従つて支持された抗原が被分析体と一致する
必要はなく、同一の総分子量をもつ必要はない。
たとえばヒトインシユリンのアツセイにおいては
支持された抗原はウシインシユリンまたはブタイ
ンシユリンのいずれかであつてもよく、またβ−
HCGに対する抗体を用いるHCGアツセイにおい
ては支持された抗原はHCGであつてよい。固体
支持体上に用いるのに適した抗原またはハプテン
の選択は本明細書の教示から当業者が容易になし
うるものであると思われる。 抗原またはハプテンは広範な固体材料に支持さ
せることができる。当技術分野で知られているよ
うに、この種の材料には適切なポリマー、たとえ
ばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリテトラフルオルエチレン、ポリアミド
類、ポリアクリルアミド類、架橋したアガロー
ス、デキストランなど；ガラス、細菌細胞；イオ
ン交換樹脂；綿（米国特許第4200625号に記載）
および米国特許第4059685号明細書に記載された
型の支持体が含まれる。適切な支持体の選択は本
明細書の教示から当業者が容易になしうるものと
思われる。 抗原またはハプテンは当技術分野で一般に知ら
れている方法（吸着および共有結合を含む）によ
り固体支持体に支持させることができる。物質を
固体支持体に支持させる方法は当技術分野で既知
であるという事実からみて、本発明を完全に理解
するためにこれに関してこれ以上の詳述は不必要
であると思われる。 抗原またはハプテンのための固体支持体は粒
子、シート、チユーブなどを含む広範な形状であ
りうるが、好ましい実施態様によれば抗体のため
の固体支持体は支持された抗原を貫流室（フロー
スルー室）に入れることができ、これによりイン
キユベートされた混合物を支持された抗原を入れ
た室内へ貫流させることがきるものである。この
種のフロースルー室の代表例が米国特許第
4059685号明細書に記載されている。 本発明を実施するに際しては、アツセイすべき
抗原またはハプテン（被分析体）を含有するかま
たは含有すると思われる試料を(a)標識された形の
被分析体もしくはその適宜な同族体または(b)被分
析体に対する標識された抗体のいずれかであるト
レーサーと共にインキユベートする。その際イン
キユベートは15〜40℃程度の温度で結合を行わせ
るのに十分な時間行われる。 インキユベート後に、混合物を支持された抗原
またはハプテンと適宜反応させて、両結合部位が
占有されてはいない抗体分子は結合させ、両結合
部位が占有された抗体分子は支持された抗原また
はハプテンに結合させないようにする。こうし
て、不完全に飽和された抗体分子は両結合部位が
飽和された抗体分子から分離される。 前記のように、支持された抗原もしくはハプテ
ンに結合した標識物質の量および／または支持さ
れた抗原もしくはハプテンに結合していない標識
物質の量を測定し、これを当技術分野で一般に知
られている方法により得られた標準曲線と比較す
るとによつて、試料中に存在する被分析体の量を
測定することができる。 好ましい実施態様によれば、支持された抗原ま
たはハプテンに結合した抗体をこれから溶離し
て、支持された抗原またはハプテンを再使用する
ことができる。これに関しては、支持された抗原
またはハプテンから抗体を溶離し、これらの支持
された抗原またはハプテンの結合能を破壊するこ
とのない適切な溶離液をいることによりこの種の
溶離を行うことができる。 好ましい実施態様においては、溶離液は3.0よ
りも高くはなくかつ抗原の結合能が破壊されない
酸性PHのもの（すなわち溶離液を酸性にしすぎな
い）である。一般に溶離液は1.5よりも低くはな
く、好ましくは2.0よりも低くはないPHである。 特にこの種の溶離液は上記のPHに緩衝化された
水である。 種々の酸性緩衝液のいずれかを用いることによ
り酸性のPHが得られる。適切な緩衝剤の代表例と
しては、クエン酸塩、酢酸塩、グリシネート、グ
ルタミン酸塩、修酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、塩
酸など、またはそれらの混合物があげられる。適
切な緩衝剤の選択は本明細書中の教示から当業者
が容易になしうるものと思われる。 緩衝剤は、支持された抗原の結合能を破壊する
ことなく希望する溶離を与える濃度で用いられ
る。ある場合には溶液の塩濃度（イオン濃度）を
増すことにより溶離能が高められる。このような
塩濃度の増大は、緩衝液の濃度を高めることによ
り、または結合剤に不利な影響を与えない水溶性
塩の添加により達成できる。この種の塩の代表例
としては、アルカリ金属またはアンモニウムの水
溶性塩、たとえばハロゲン化物；硫酸塩、硝酸
塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩など；水溶性
の遷移金属塩、たとえば硝酸塩、ハロゲン化物な
ど；その他があげられる。前記のように、緩衝剤
を含む総塩濃度は支持された抗原の抗原性を破壊
することなく希望する溶離を与えるものであり、
一般に塩濃度は4Mを越えず、大部分の場合これ
は2Mを越えない。一般にこの種の塩を用いる場
合塩濃度は、少なくとも0.01Mである。 また溶離は水性アルコールを用いて塩基性PHに
おいて、たとえば75％メタノールを用いてPH13で
行いうることも理解すべきである。 本発明は支持された抗原またはハプテンの再生
行わないアツセイにも適用できるが、本発明は支
持された抗原またはハプテンを再生するアツセイ
に特に適用することができ、殊に自動化されたア
ツセイに適している。この種の自動化されたアツ
セイの場合、支持された抗原またはハプテンはフ
ロースルー室中に置かれ、自動化された装置はた
とえば米国特許第4009005号明細書に記載された
型のものである。 自動化されたアツセイ法の一例の場合、被分析
体を含有するかまたは含有すると思われる試料を
トレーサー（標識された形の被分析体またはその
適宜な同族体）、ならびにトレーサーおよび被分
析体に対する抗体と共にインキユベートし、得ら
れた混合物を支持された抗原またはハプテンを含
有する室内を貫流させて、両結合部位が被分析体
および／またはトレーサーにより占有されている
抗体分子を分離する。分離後に溶離液を室内へ導
通して、支持された抗原から抗体を溶離し、これ
により室内に支持された抗原をアツセイに再使用
することができる。 この種のアツセイの一実施態様によれば、トレ
ーサーはγ線を放出する放射性同位体を標識ない
しはマーカーとして含むものであり、室内からの
出口をγ線検出器に接続し、未結合抗体およびト
レーサーを最初に室内から洗い出してカウント
し、次いで結合した抗体を支持された抗原から溶
離し、この支持された抗原に結合していた画分の
総放射能を測定する。支持された抗原に結合して
いた画分の総放射能（％）は、試料中の被分析体
の濃度に反比例する。 他の実施態様においては、被分析体を含有する
かまたは含有すると思われる試料を被分析体に対
する標識された形の抗体と共にインキユベート
し、インキユベートされた混合物を固体支持体に
支持された被分析体またはその適宜な同族体（適
宜ハプテンは抗原）を含む室内を貫流させ、遊離
結合部位をもつ標識された抗体分子（室内で結合
したもの）をそれらの結合部位が完全に占有され
ている標識された抗体分子から分離する。アツセ
イの他の部分は、標識された被分析体を用いるア
ツセイについて先きに述べたものと同様である。 本発明の他の観点によれば、本発明方法により
アツセイを行うために適した試薬キツトまたは包
装品が提供され、この種のキツトまたは包装品は
主成分として：(a)被分析体のためのトレーサー
（標識された形の被分析体またはその適宜な同族
体）；(b)被分析体およびトレーサーに対する抗
体；ならびに(c)抗体を免疫反応で結合することが
できる固体支持体に支持されたハプテンまたは抗
原（被分析体またはその適宜な同族体）を含む。 試薬キツトまたは包装品の他の形態として、キ
ツトまたは包装品は主成分として(a)被分析体に対
する標識された形の抗体、および(b)標識された抗
体を免疫反応で結合し、固体支持体に支持されて
いるハプテンまたは抗原（被分析体またはその適
宜な同族体）を含む。 特に好ましい形態によれば、固体に支持された
この種の抗原またはハプテンはフロースルー室中
に存在させる。支持された抗原またはハプテンを
再使用する場合は、試薬キツトまたは包装品には
好ましくは、支持された抗原またはハプテンから
抗体を溶離することができる溶離液も含まれ、溶
離液は一般に前記の型の水性溶離液である。この
成分を含ませる場合、これらは試薬キツトまたは
包装品中で別個の容器たとえばバイアルに入れら
れる。試薬キツトまたは包装品は他の成分、たと
えばアツセイすべき抗原またはハプテンの標準
液、すなわち既知の濃度のアツセイすべき抗原ま
たはハプテンを含む抗原またはハプテンの試料；
緩衝液；洗浄液などを含んでいてもよい。 この種の物質１種または２種以上を試薬キツト
または包装品から分離して別個に包装し、別個の
物品として販売することもできると解すべきであ
る。たとえば固体支持体上に支持された抗原また
はハプテンを別個の物品として販売するためにフ
ロースルー室中に別個に包装することもできる。 本発明のアツセイおよびキツトは種々のアツセ
イに用いることができるが、本発明者らはこのア
ツセイおよびキツトは特にインシユリンまたは
HCGのアツセイに適していることを見出した。 インシユリンのアツセイの際しては、ウシまた
はブタのインシユリン（（好ましくはブタインシ
ユリン）を支持された抗原として用い、これは臭
化シアンにより活性化された綿ガーゼ上に支持さ
れていることが好ましい。 HCGのアツセイに際しては、固体支持体上に
支持された抗原は臭化シアンにより活性化された
架橋アガロース（セフアロース）に支持された
HCGであることが好ましい。 本発明をさらに下記の具体例に関連して述べる
が、本発明の範囲がこれれにより限定されるもの
ではない。 実施例 １ 支持された抗原の製造 高イオン濃度の緩衝液（（PH８）中の既知の量
の抗原を臭化シアンで活性化された一定量のセフ
アロース（フアルマシア社）または綿ガーゼ（ベ
クトン・デイツキンソン・イムノケミストリー）
と２〜３時間、室温で混合した。未反応の抗原を
除去し、固体支持体をエタノールアミン中で室温
において１時間インキユベートし、過剰の未反応
臭化シアン基をブロツクした。エタノールアミン
を除去し、固体支持体を高イオン強度の酸性緩衝
液およびアルカリ性緩衝液で交互に洗浄した。次
いでこれを洗浄し、使用前は生理緩衝液中に保存
した。 実施例 ２ インシユリンのアツセイ 室温で行う一般的なインシユリンアツセイにお
いて、試料150μを125Iインシユリン（150μCi／
μg）、抗インシユリン80μ〔１：1000のモルモ
ツト抗ブタインシユリン、50mMトリス−0.15M
NaCl（BSA0.01％、PH8.0）中〕および50mMト
リス−0.15M・NaCl、BSA0.01％を含有する緩
衝液（（PH8.0）（吸着緩衝液）80μと共に30分間
インキユベートした。次いでこれを活性化された
綿ガーゼの６×2.54cmのストリツプに結合させた
ブタインシユリン0.15mgを含む0.5×1.5cmの室内
へ、1.0ml／分で0.6分間かけて通過させた。遊離
面分（結合しなかつた免疫複合体＋遊離125Iイン
シユリン）をカラムから吸着緩衝液により３ml／
分の流速で1.5分間洗い出し、1.7mlのフローセル
を備えたγ線検出器で計数した。結合した画分は
50mMグリシン緩衝液（PH2.0）を用いて2.5ml／
分の流速で1.3分間かけて室内から溶離した。溶
出液を0.5ml／分で流れるミカノール（アルキル
イミダゾリニウムジカルボキシレート塩10ｇ／水
）と1.3分間混和し、γ線検出器で計数した。
次いで吸着緩衝液で3.0ml／分において0.19分間
洗浄することにより室内を再平衡化した。 このインシユリンアツセイに関する典型的な実
施データは下記のとおりであつた。
【表】
【表】
【表】
実施例 ３
HCGのアツセイ
室温で行う一般的HCGアツセイにおいて、試
料150μを125I・HCG（（100〜150μCi／μg）102μ
、抗HCG−β（吸着緩衝液中１：100の家兎抗
HCG−β）54μ、および吸着緩衝液306μと共
に１時間インキユベートた。次いでこれを、
HCG1mg／活性化セフアロース１mlを含む0.5×
1.5cmの室内に1.0ml／分で0.6分間かけて通過し
た。遊離画分（結合しなかつた免疫複合体＋遊離
125I−HCG）を流速1.45ml／分の流速の吸着緩衝
液で1.75分間で室内から洗い出し、1.7mlフロー
セルを備えたγ線検出器で計数した。結合した画
分はPH2.0の50mMグリシン緩衝液により流速1.45
ml／分で2.32分間で室内から溶離した。次いで室
内を吸着緩衝液により2.35ml／分で0.33分間洗浄
することによつて再平衡化し、溶出液を3.75ml／
分で0.08分間流れ、次いで８ml／分で0.05分流れ
るミカノール（micanol・アルキルイミダゾリニ
ウムジカルボキシレート塩10ｇ／水）と混合し
た。 HCGアツセイに関する典型的な実施データは
下記のとおりである。 標準曲線 mU 結合率(%) ０ 4.43 ５ 41.7 10 40.1 20 35.9 40 29.4 80 21.6 160 14.7 320 10.2 Bo＝44.3％ Bm＝5.0％ 切片＝4.60 勾配＝1.14 C.F.＝0.95 平均＝28008 CV＝2.25
料150μを125I・HCG（（100〜150μCi／μg）102μ
、抗HCG−β（吸着緩衝液中１：100の家兎抗
HCG−β）54μ、および吸着緩衝液306μと共
に１時間インキユベートた。次いでこれを、
HCG1mg／活性化セフアロース１mlを含む0.5×
1.5cmの室内に1.0ml／分で0.6分間かけて通過し
た。遊離画分（結合しなかつた免疫複合体＋遊離
125I−HCG）を流速1.45ml／分の流速の吸着緩衝
液で1.75分間で室内から洗い出し、1.7mlフロー
セルを備えたγ線検出器で計数した。結合した画
分はPH2.0の50mMグリシン緩衝液により流速1.45
ml／分で2.32分間で室内から溶離した。次いで室
内を吸着緩衝液により2.35ml／分で0.33分間洗浄
することによつて再平衡化し、溶出液を3.75ml／
分で0.08分間流れ、次いで８ml／分で0.05分流れ
るミカノール（micanol・アルキルイミダゾリニ
ウムジカルボキシレート塩10ｇ／水）と混合し
た。 HCGアツセイに関する典型的な実施データは
下記のとおりである。 標準曲線 mU 結合率(%) ０ 4.43 ５ 41.7 10 40.1 20 35.9 40 29.4 80 21.6 160 14.7 320 10.2 Bo＝44.3％ Bm＝5.0％ 切片＝4.60 勾配＝1.14 C.F.＝0.95 平均＝28008 CV＝2.25
【表】
実施例３のアツセイ法を採用し、ただし活性化
されたセフアロース上に支持されたHCGの代わ
りに活性化されたセフアロース上に支持された第
２抗体（ヤギ抗ウサギ抗体）が室内に含まれる場
合は、HCGを010mU／mlの範囲で検出すること
はできなかつた。従つて、本発明によるアツセイ
法は、先行技術による第２抗体アツセイ法に比べ
て感度が改善されている。 実施例 ４ インシユリンのアツセイ（標識抗体） 室温で行われる一般的なインシユリンアツセイ
において、試料200μを125Iモルモツト抗インシ
ユリン（40μCi／Ng）100μ、ならびに50mMト
リス−0.15M・NaCl、BSA0.01％を含有する緩
衝液（PH8.0、吸着緩衝液）100μと共に120分間
インキユベートした。次いでこれをセフアロース
と結合したブタインシユリン0.25mgを含有する
0.5×1.5cmの室内へ通過させた。遊離の画分（結
合していない免疫複合体）を吸着緩衝液によりカ
ラムから洗い出し、1.7mlのフローセルを備えた
γ線検出器で計数した。結合した画分は50mMグ
リシン緩衝液（PH2.0）により室内から溶離した。
溶出液をミラノール（アルキルイミダゾリニウム
ジカルボキシレート塩10ｇ／水）と混和し、γ
線検出器で計数した。次いで同室を吸着緩衝液で
洗浄することにより再び平衡化した。 このインシユリンアツセイに関する典型的な実
施データは下記のとおりであつた。 標準曲線 μU／ml 結合率(%) ０ 80％ １ 77％ 2.5 72％ 5.0 68％ 10.0 62％ 25.0 57％ 50.0 54％ 100.0 50％ 本発明は、これにより固体上に支持された抗体
の代わりに固体上に支持された抗原を使用できる
点でに有利である。固体上に支持された抗原の使
用により費用の安い方法が提供されるだけでな
く、さらにアツセイの感度が増大する。 上記の教示からみて本発明につき種々の修正お
よび変更が可能であり、従つて特許請求の範囲内
において、本発明を詳述した以外の態様で実施す
ることができる。
されたセフアロース上に支持されたHCGの代わ
りに活性化されたセフアロース上に支持された第
２抗体（ヤギ抗ウサギ抗体）が室内に含まれる場
合は、HCGを010mU／mlの範囲で検出すること
はできなかつた。従つて、本発明によるアツセイ
法は、先行技術による第２抗体アツセイ法に比べ
て感度が改善されている。 実施例 ４ インシユリンのアツセイ（標識抗体） 室温で行われる一般的なインシユリンアツセイ
において、試料200μを125Iモルモツト抗インシ
ユリン（40μCi／Ng）100μ、ならびに50mMト
リス−0.15M・NaCl、BSA0.01％を含有する緩
衝液（PH8.0、吸着緩衝液）100μと共に120分間
インキユベートした。次いでこれをセフアロース
と結合したブタインシユリン0.25mgを含有する
0.5×1.5cmの室内へ通過させた。遊離の画分（結
合していない免疫複合体）を吸着緩衝液によりカ
ラムから洗い出し、1.7mlのフローセルを備えた
γ線検出器で計数した。結合した画分は50mMグ
リシン緩衝液（PH2.0）により室内から溶離した。
溶出液をミラノール（アルキルイミダゾリニウム
ジカルボキシレート塩10ｇ／水）と混和し、γ
線検出器で計数した。次いで同室を吸着緩衝液で
洗浄することにより再び平衡化した。 このインシユリンアツセイに関する典型的な実
施データは下記のとおりであつた。 標準曲線 μU／ml 結合率(%) ０ 80％ １ 77％ 2.5 72％ 5.0 68％ 10.0 62％ 25.0 57％ 50.0 54％ 100.0 50％ 本発明は、これにより固体上に支持された抗体
の代わりに固体上に支持された抗原を使用できる
点でに有利である。固体上に支持された抗原の使
用により費用の安い方法が提供されるだけでな
く、さらにアツセイの感度が増大する。 上記の教示からみて本発明につき種々の修正お
よび変更が可能であり、従つて特許請求の範囲内
において、本発明を詳述した以外の態様で実施す
ることができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ハプテン及び抗原よりなる群から選ばれた被
分析体のアツセイ法において、 被分析体を、標識された形の被分析体を含むト
レーサー、ならびに、トレーサーおよび被分析体
に対する抗体と共にインキユベートして、インキ
ユベートされた混合物を与え、ここで、該抗体
は、インキユベートされた混合物において、それ
に結合したトレーサーを含む、結合部位の全てが
占有されていない抗体分子の第１の部分、及び、
それに結合したトレーサーを含む、結合部位の全
てが占有されている抗体分子の第２の部分を与え
る量存在しており； インキユベートされた混合物を、固体支持体上
に支持された、抗原およびハプテンよりなる群か
ら選ばれる、抗体のための結合剤と接触させ、そ
れによつて、該抗体分子の第１の部分は支持され
た結合剤と結合し、該抗体分子の第２の部分は支
持された結合剤と結合せず； 結合した物質を、結合していない物質から分離
し； 結合した物質中のトレーサーの量か、結合して
いない物質中のトレーサーの量の少なくとも一方
を被分析体の指標として測定することを特徴とす
る前記方法。 ２ 被分析体が抗原である特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ３ 支持された結合剤が、貫流室内に支持されて
いる特許請求の範囲第１項または第２項記載の方
法。 ４ 標識された形の被分析体が放射性同位元素で
標識されたものである特許請求の範囲第１ないし
第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５ 被分析体がインシユリンである特許請求の範
囲第１ないし第４項のいずれか１項に記載の方
法。 ６ 支持された結合剤が活性化された綿に支持さ
れたインシユリンである特許請求の範囲第５項記
載の方法。 ７ 被分析体がhCGである特許請求の範囲第１な
いし第４項のいずれか１項に記載の方法。 ８ 支持された結合剤が活性化された架橋アガロ
ースに支持されたhCGである特許請求の範囲第７
項記載の方法。 ９ 支持された結合剤をアツセイにおいて再使用
するために、支持された結合剤から結合した抗体
を溶離することを更に含む特許請求の範囲第１な
いし第８項のいずれか１項に記載の方法。 １０ 1.5〜３のPHに緩衝されている水性溶離液
で溶離を行う特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 試薬パツケージ中に、被分析体に対する抗
体、標識された形の被分析体を含むトレーサー、
並びに、固体支持体上に支持された抗体のため
の、抗原及びハプテンよりなる群から選ばれた結
合剤を含み、該抗体は、キツトの内容物を分析す
べき被分析体と共にインキユベートした場合に、
インキユベートされた混合物において、それに結
合したトレーサーを含む、結合部位の全てが占有
されていない抗体分子の第１の部分、及び、それ
に結合したトレーサーを含む、結合部位の全てが
占有されている抗体分子の第２の部分を与える量
存在していることを特徴とする、ハプテン及び抗
原よりなる群から選ばれた被分析体をアツセイす
るための試薬キツト。 １２ 固体支持体上に支持された結合剤が貫流室
内に配置されている特許請求の範囲第１１項記載
のキツト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US486781 | 1983-04-19 | ||
| US06/486,781 US4666866A (en) | 1983-04-19 | 1983-04-19 | Immunoassay for antigens employing supported binder |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59200963A JPS59200963A (ja) | 1984-11-14 |
| JPH0445785B2 true JPH0445785B2 (ja) | 1992-07-27 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59055972A Granted JPS59200963A (ja) | 1983-04-19 | 1984-03-23 | 支持されたバインダ−を用いる抗原のイムノアツセイ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4666866A (ja) |
| EP (1) | EP0122695B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59200963A (ja) |
| AU (1) | AU566054B2 (ja) |
| CA (1) | CA1212624A (ja) |
| DE (1) | DE3477843D1 (ja) |
| MY (1) | MY100371A (ja) |
| NZ (1) | NZ206501A (ja) |
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