JPS61181966A - カルボキシル基でつながれた固定化抗体 - Google Patents

カルボキシル基でつながれた固定化抗体

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JPS61181966A
JPS61181966A JP60274847A JP27484785A JPS61181966A JP S61181966 A JPS61181966 A JP S61181966A JP 60274847 A JP60274847 A JP 60274847A JP 27484785 A JP27484785 A JP 27484785A JP S61181966 A JPS61181966 A JP S61181966A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 見匪夏笈ｌ 抗体、特に固定化抗体が商品として出現したことで、そ
の持続的な発展が確約されている。
商業的な用途では、稀れに遊離の抗体が必要とされるが
、ある種の不溶性基体に結合した抗体も必要とされてい
る。この発明は固定化抗体に関するものであって、特に
、くり返し商業的に用いられることを意図した固定化モ
ノクローナル抗体に係る。
固定化抗体の分野は、比較的よく発展した固定化酵素の
分野と類似のようにみえるが、両者に対する要請とそれ
らの調製法は同一ではない。
ちなみに、固定化抗体は滅菌したパイロジエン・フリー
（「微生物菌体に由来する発熱物質を含まない」の意）
の環境で使われるので、それに求められる要請の一つは
、固定化抗体に用いられる支持体が、その抗体との結合
能力や結合した抗体の活性に悪影響を及ぼすことなしに
、滅菌操作やパイロジエン（発熱物質）を除く操作に耐
えられることである。固定化される抗体は、しばしば非
常に高価であるので、支持体に抗体が共有結合で結合さ
れるという第二の要求にも増して固定化抗体がくり返し
使用できることが最も重要である。抗体を効果的に用い
るうえでのもう一つの要請は、抗体が固定化された際、
溶液の場合に匹敵する活性と特異性を示すことであり、
この要請は以下の２つの派生的な要請に帰着する。その
一つは、抗体が結合される支持体が、使用環境下で抗体
、基質、あるいは他の溶液成分に対し、化学的及び生化
学的に不活性なことである。第二の派生的要請は、抗体
の活性のある（親和力のある）部位が、支持体からでき
るだけ離れた方向を向くよう固定化されることであって
、これによって抗原は妨害なく抗体に接近できるので、
抗体を効率よく利用することができる。支持体成分、結
合試薬及び抗体が、精製した抗原を使う過程で免疫反応
を起こす程、溶離したり、洗い出されたり、あるいは解
離したりしないことも重要である。最後に、高い線速度
をもった固定床方法（流動層や同様な方法）での要求は
、使用する支持体が非圧縮性で耐摩耗性であることであ
る。
本発明はアミノ化された芯となる支持体と抗体とが、支
持体のアミノ基と抗体のカルボキシル基の間に形成され
たアミド結合にて、共有的に結合せしめられた固定化抗
体系を提供する。
この固定化抗体システムは抗体の親和部位が支持体から
離れた方向に向いているので、上に述べたすべての要請
を満足するものであり、従って、このような固定化系は
意図する用途に対して非常に有益である。本発明で用い
る支持体（マトリックス）は、米国特許第４，１４１，
８５７号のそれと僅かに関連性があるが、アミド結合の
形成によってポリペプチドや蛋白性の物質にこの支持体
を利用することについて、特に上述の要請を考慮して利
用することについて、この特許は開示してもいなければ
、示唆してもいない。
共有結合で結合した固定化抗体は従来技術で多数に例示
されている。米国特許第４，３９９，２１７号はジアゾ
化したポリアミノスチレンに由来するジアゾ基を介して
、共有結合的に結合した固定化抗体に関する。米国特許
第４，３８１，２９１号はブロムシアンで活性化された
微結晶性セルロースと抗体との共有結合を例示する。米
国特許第４．３５７，３１１号では、　トリクロロ−ｓ
−トリアゼンで活性化した微多孔性のセルロースエステ
ルに、共有的に結合した抗体が記載されている。
米国特許第４，３４３，３１２号ではアシル化したアミ
ノプロピルシリル化ガラスに抗体を共有結合で固定して
いる。米国特許第４，２６０，６７８号は無機担体とし
て金属酸化物を使うことを含む抗体の固定化を広く記載
している。しかしながら、典型的なものだけを挙げた上
記の従来技術は、すべて単回の使用のみに関したもので
あることに注目することが必要である。すなわち従来の
固定化抗体は一回の免疫化学的な測定に使用された後は
廃棄されている。さらに、従来技術は非特異的な配向で
結合された抗体に関するものであり、活性化された支持
体の滅菌性や非パイロジエン性を教示していない。つま
り、従来技術は固定化抗体を好ましくは滅菌してパイロ
ジエン・フリーで反復使用することを、それも活性を殆
どあるいは全く減少させることなく反復使用することを
口論んでいない。
米国特許第４，３６１，５０９号ではアフィニチイ・ク
ロマトグラフィーに使われるカラムを得るために、ブロ
ムシアンで活性化された架橋化アガロースに、非特異的
な配向でモノクローナル抗体を結合させている。これは
共有結合した固定化抗体の反復使用を例示したものであ
るが、この特許では前段で述べた固定化抗体に対する他
の要請事項が検討されていない。
ｌ胛立ｌ且 この発明の目的は化学的に不活性で、多孔質で、大きな
表面積を持ち、非圧縮性で、しかもパイロジエン・フリ
ーにすることや滅菌することができるような支持体を使
用して、安定で、非浸出性で、高度に効率のよい固定化
抗体系を提供することにある。その−具体例は多孔質又
は半長孔質の固体のアミノ化された芯となる支持体のア
ミノ基が、抗体又はその断片のカルボキシル基とアミド
結合を介して共有的に結合したものである。さらに特定
した具体例は、任意的に架橋されたポリエチレンイミン
が含浸せしめられたアルミナが、芯となる支持体であり
、抗体はモノクローナル抗体である場合である。
もう一つの具体例では、抗体の実質的部分が支持体から
離れた方向にその親和部位を向けた特異的な配向で、す
なわち、両方の親和基が露出した状態で結合されている
。
見班立星遮 抗体のカルボキシル基との反応によって共有的アミド結
合を形成するようなアミノ化された多孔質または半長孔
質の固体を支持体とした固定化抗体系は、支持体が殺菌
されたり、乾燥されたり、パイロジエン・フリーにする
ための処理を受けた時でも、浸出によって抗体が事実上
物理的に消失することなく、また他の固定化抗体系を単
回使用あるいは短期間に連続使用する時にしばしば付随
する変性や他の物理的又は化学的分解による活性の低下
を伴うことなく、反復使用または連続使用ができること
が見い出された。本発明はこの知見にに基づくものであ
る。
この固定化抗体系で使われる支持体、すなわち担体は、
アミノ化された多孔質あるいは半長孔質固体である。こ
の発明の一つの態様では、芯となる支持体がアミノ化し
た無機材料であり、もう一つの態様では支持体がアミノ
基の機能を持ったポリハイドロキシ有機材料である。両
方とも抗体のカルボキシル基と反応して共有的なアミド
結合を形成し得る多くのアミノ基を持った一様な支持体
特性を示す。
芯となる支持体がアミノ化された無機固体である態様で
は、これに使用可能な材料として、アルミナ、シリカ、
シリカ−アルミナ、ジルコニア、シリカ−ジルコニア−
アルミナ、マグネシア、チタニア、多孔質ガラス、適当
な形のチャコール、ケイソウ土及びこれらの混合物が挙
げられる。アルミナは特に望ましい支持体で、特にガン
マ−アルミナ、アルファーアルミナ、シータ−アルミナ
等がよい、これらすべての支持体は滅菌され、パイロジ
エン・フリーになるよう調製される。
無機質の固体はポリアミンに浸漬したり、あるいはアミ
ノアルキルシランにょうなアミノ基を含む試薬と反応さ
せることによってアミノ化される。この発明を実施する
のに適しているポリアミンの中にはエチレンジアミン、
ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テト
ラエチレンペンタミン、ペンタエチレンへキサミン、ポ
リエチレンイミン等のようなポリエチレンアミン類があ
る。他のポリアミンの例にはへキサメチレンテトラミン
、フェニレンジアミン、エビアミン等が含まれる。この
発明の目的のためのエビアミンは２から約１０ケの炭素
原子を持つアルキレンジアミンとポリ（エビクロロヒド
リン）との反応生成物である６ 浸漬は適当などんな方法ででも行える。例えば、ある適
切な方法は担体に所望量のポリアミンを含む液を混合し
て接触させ、蒸発によって溶媒を除くことである。一般
にポリアミンの水溶液が使われるが、もしポリアミンが
水に不溶性または極く僅かしか溶けないならば、一部水
を含むあるいは無水の溶媒を使用するのが有効である。
無機の酸化物と同様、ポリアミンもパイロジエン・フリ
ーになるように調製される。
ポリアミンを含浸した無機担体は、ポリアミンを架橋す
べく多官能性試薬と任意的に反応せしめられ、これによ
ってポリアミンは無機酸化物により確実に付着する。ポ
リアミンの殆どあるいはある部分を架橋するために使用
される多官能性試薬はモル比で大兄０．０５から１であ
るが、最大で大兄０．５のモル比とするのが最も普通で
ある。多官能性試薬もパイロジエン・フリーになるよう
に処理される。
使用可能な多官能性試薬には、ＯＨＣ（ＣＨｓ　）ｎｃ
Ｈｏの式で表わされるジアルデヒド、ｘｏｃ　（ｃｎｚ
　）　ｎｃＯＸの式（Ｘはハロゲン、特に塩素または臭
素）で表わされるジカルボン酸ハライド、ＯＣＮ　（Ｃ
）Ｉｚ　）ｎＮｃ。
の式（ｎは２から１０ぐらいまでの整数）で表わされる
ジイソシアネート等が含まれる。フタルアルデヒドやト
ルエンジイソシアネート等のような芳香族ジアルデヒド
やジイソシアネートも使用可能である。ポリアミンを含
浸した酸化物と多官能性試薬との反応は１通常単に両者
を数時間、室温またはその近辺の温度で混合することに
よって生起する。多官能性試薬が水に十分溶ける場合に
は、その水溶液が使われる。それ以外は非反応性の有機
溶媒の溶液が使われる。多官能性試薬の溶液は重量で約
１０％までの濃度で使用できるが２通常の溶液濃度はｏ
、ｏｏｓから０．５％のオーダーである。多官能性試薬
もパイロジエン・フリーに調製される。
ポリアミンと多官能性試薬との反応が完遂した時点で、
過剰の反応液を傾斜法で除去し、次いで付着している未
反応試薬を除くために、多官能性試薬の使われた溶媒を
大量に用いて固体を洗浄する。架橋剤で架橋されたポリ
アミンにより被覆された支持体は、乾燥して貯蔵するこ
とができるほか、オートクレーブで処理するか放射線を
照射して保管することができ、または適当な抗体と直ち
に反応させることができる。
この発明の変型においては、アミノ化された支持体を得
るために、無機酸化物がアミノ基をもった試薬と反応せ
しめられる。この反応を行うための最も一般的な方法は
、無機酸化物としてガラスを使用した場合、適当なシリ
ル化剤によってω−アミノアルキルシリル基を導入する
方法である。導入されるアミノアルキルシリル基の例は
β−アミノエチルシリル、γ−アミノプロピルシリル、
δ−アミノブチルシリル等である。これらに対応するシ
リル化剤は公知であって、これにはハロゲン化シリルや
シリルエーテル類が含まれる。
この発明のもう一つの態様では、芯となる支持体がアミ
ノ性の官能基を持ったポリハイドロキシ有機体である。
これらの例にはアミノエチルセルロース、キトサン（キ
チンの脱アセチル化物）、セルロース、デンプンその他
の多糖類全般のω−アミノアルキルシリル化物が含まれ
る。
上述の記載に従って調製されたところの、アミノ化した
芯となる支持体は、抗体または抗体断片と支持体を結合
させるアミド結合の形成を促進する縮合剤の存在下に、
抗体または抗体の断片と接触せしめられる。既述のとお
り、支持体のアミノ基と抗体のカルボキシル基とが反応
してアミド結合を形成し、支持体と抗体とが共有的に結
合する。用いられる縮合剤は特にアミド結合の形成を促
進する脱水剤で、ペプチド合成に一般的に使われるよう
なものである。そのような縮合剤の例には、カルボジイ
ミド類、特にＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２
−モノホリノエチル）カルボジイミドのメト−ｐ−トル
エンスルホン酸塩、Ｎ−エチル−５−フェニル−イソ−
キサゾリウム−３′−スルホン酸塩、Ｎ−エトキシカル
ボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン等が
含まれる。
望ましい具体例では抗体または抗体断片はその親和部位
が支持体と結合しない状態で、かつ支持体表面から離れ
た向きになるよう特異な配向で支持体に共有的に結合さ
れる。このことはまず、抗体または抗体断片と抗原また
はその抗原の断片もしくはその抗原の類縁物との複合体
を形成させ、抗体の親和部位の近くにあるかもしれない
ガルボキシル基の共有結合を妨げることによって行われ
る。抗体を複合体に結合した後、ｐＨ、イオン強度、温
度などを変えることによって抗原、抗原断片またはその
類縁体を脱離されることにより、抗体の親和部位は支持
体の表面から離れた方向に向き１両方の親和基が露出す
る。遊離のカルボキシル基を持った抗原または抗原の断
片を使うと、支持体への共有結合において抗体の同じ基
と競合するだろうから。
固定化工程の間は上記の如き抗原また抗原断片の使用は
避けねばならない。
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルの抗体でよ
いが、モノクローナル抗体が好ましい、使用される抗体
にはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ。
ＩｇＧのタイプのイムノグロブリンが含まれる。
抗体と支持体との反応は一般に４℃から２５℃の間の温
度で大兄４〜２４時間の間で完結する。得られた固定化
抗体系は、付着している未結合で未反応の物質をすべて
固定化抗体系から取除くために大量の水、緩衝液、また
は塩溶液で洗われる。
精製過程でタンパク質が非特異的に結合するのを回避す
るために、支持体の全表面を不活性のタンパクまたは同
様な重合体で覆って、支持体に結合する抗体の量を限定
することが望ましい。これは抗体を活性化した支持体と
接触させる前に、不活性タンパク、例えば抗体特性を持
たないポリペプチドと混合することで達せられる。不活
性タンパクと抗体は、その溶液中の比率とほぼ同じ割合
で支持体に結合する。このようなことに利用される物質
は、ウシ血清アルブミンやポリグリシンである。
こうして調製された固定化抗体系はいろいろな方面に利
用される。例えば１反復して再使用できる免疫化学的分
析キットの一試薬となる。
別の例では血清の体外処置や血漿の精製のための浄化フ
ィルターとして使われる。また固定化抗体系はアフィニ
ティクロマトグラフィーに関する技術の吸着剤としても
使われる。固定化抗体系のいろいろ使用法はこの分野の
専門家には公知であるので、ここではその詳細を省略す
る。
上の例示は説明のためのものであり、必ずしもすべてで
はない。
以下に述べる例も単にこの発明を説明しているだけであ
り、・これで発明を限定するつもりではない。
去−施一例一 粒状のシータ・アルミナ（６０Ｘ　８０メツシユ、公称
０．１７７から０．２５０−に相当する）をパイロジエ
ン・フリーに、すなわち、ダラム染色陰性のバクテリア
とそのリポ多孔糖体の副生物が全く含まぬように調製し
た。その後の処理の間、いかなる形においても支持体の
取扱いはパイロジエン・フリーの状態に保たれるように
した。滅菌処理を用いてパイロジエン・フリーの状態を
保つようにする。滅菌法を用いて、無菌でそしてパイロ
ジエン・フリーになるように処理したポリエチレンイミ
ンの水溶液とアルミナを混合する。ポリエチレンイミン
は支持体ダラム当り約９０ｍｇのレベルで加えられる。
過剰のポリエチレンイミン溶液はシータ・アルミナから
傾斜法で分離し、残りの液体は真空蒸発で除かれる。
ポリエチレンイミンで被覆した支持体は次いで０．３（
重量）％の濃度の滅菌されたパイロジエン・フリーのグ
ルタルアルデヒド水溶液と、蒸発乾固物ダラム当りの溶
液量が約３０ｍ　Ｑになるよう混合される。約１０分後
、過剰のグルタルアルデヒド溶液を傾斜法で分離し、活
性化された支持体を滅菌したパイロジエン・フリーの０
．８５（重量）％の塩溶液でＰＨ７，０、温度４℃の条
件で３０分間洗浄する。次に塩溶液中の活性化支持体を
１２１℃で３０分間オートクレーブ処理し、　使用時ま
で室温で保管する。
インシュリンに対するモノクローナル抗体はミルシュタ
インとケーラーによって開発された方法（「ネータヤー
」２５６巻４９５〜７頁参照）を使って調製される。「
中程度に親和力のある」抗体を産生ずるハイブリドーマ
が固定化の目的に選択される。インシュリンモノクロー
ナル抗体の一部がｐＨ６，５，温度４℃の条件下で０．
８５　（重量）％の食塩水溶液でインシュリンと結合さ
れる。上述の活性化された支持体の水性スラリーのｐＨ
を塩酸で４．７から４．９の間に調整し、　インシュリ
ン抗体溶液の一部を支持体ダラム当り抗体が０．０５　
ｇになるように添加する。次いでウシ血清アルブミンを
上記のスラリーに、支持体ダラム当り大兄０．２ｇのア
ルブミンになるように添加する。抗体のカルボキシル基
と支持体のアミノ基との結合は、スラリーを攪拌しなが
らこれに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩の溶液を支持体ダラム当り大
兄０．０１５ｇ程度のカルボジイミドになるよう加える
ことで行われる。スラリーのｐＨは直ちにほぼ３．７か
ら４．９の間に調整され、スラリーは大兄４℃〜２５℃
の温度で約２時間係たれる。
こうして得られた固定化抗体系を、次に約２０倍量（容
量）のパイロジエン・フリーの滅菌した０、８５　（重
量）％の食塩水溶液で、ｐＨ６，５、約４℃の条件下に
洗い、結合しなかったモノクローナル抗体とウシ血清ア
ルブミンを洗い流す。
それからインシュリンの結合をはずすために、この抗体
系を約２０倍量（容量）の滅菌したパイロジエン・フリ
ーの０．８５％食塩水溶液でｐＨ３，５から４．５にお
いて洗浄する。最後に固定化されたモノクローナル抗体
は、滅菌したパイロジエン・フリーの０．８５　（重量
）％の食塩水溶液中に保管される。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ基を有する多孔質または半多孔質の無機固体
    及びアミノ基の機能をもたせたポリハイドロキシ有機物
    質からなる群から選ばれるアミノ化された芯となる支持
    体と、支持体のアミノ基と抗体のカルボキシル基との反
    応で生じるアミド結合によって支持体に共有的に結合さ
    れた抗体または抗体断片とからなる固定化抗体系。 ２、ポリハイドロキシ有機物質がアミノエチルセルロー
    ス、キトサン及びアミノシリル化された多糖類からなる
    群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の固定化抗体
    系。 ３、抗体がその親和基の両方を露出した特異的な配向で
    固定されている特許請求の範囲第１項記載の固定化抗体
    系。 ４、抗体または抗体断片がモノクローナル抗体またはそ
    の断片である特許請求の範囲第１項記載の固定化抗体系
    。 ５、抗体がＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧのタイプの
    イムノグロブリンである特許請求の範囲第４項記載の固
    定化抗体系。 ６、アミノ基を有する多孔質または半多孔質の無機固体
    及びアミノ基の機能をもたせたポリハイドロキシ有機物
    質からなる群から選ばれるアミノ化された芯となる支持
    体を、アミド結合の形成を促進する縮合剤の存在下に抗
    体と反応させ、得られた固定化抗体系を回収することか
    らなる固定化抗体系の調製法。 ７、ポリハイドロキシ有機物質がアミノエチルセルロー
    ス、キトサン及びアミノシリル化された多糖類からなる
    群から選ばれる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、抗体がその親和基の両方を露出した特異的な配向で
    固定される特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、抗体がＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧのイムノグ
    ロブリンである特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０、縮合剤がＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミ
    ド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
    カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２
    −モノホリノエチル）カルボジイミドのメト−Ｐ−トル
    エンスルホン酸塩、Ｎ−エチル−５−フェニル−イソ−
    キサゾリウム−３′−スルホン酸塩及びＮ−エトキシカ
    ルボニル−３−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンか
    ら成る群から選ばれる特許請求の範囲第６項記載の方法
    。
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