KR950004134B1 - 어피니티 크로마토그라피용 폴리에틸렌이민 매트릭스 - Google Patents

어피니티 크로마토그라피용 폴리에틸렌이민 매트릭스 Download PDF

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제이. 크레인 로라
브이. 카코드카 서닐
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제이. 티. 베이커 인코오퍼레이티드
프레드릭 디. 램
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography

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Abstract

내용 없음.

Description

어피니티 크로마토그라피용 폴리에틸렌이민 매트릭스
본 발명은 어피니티 크로마토그라피와 고정화 효소의 분야 및 어피니티 크로마토그라괴에 사용하기 위한 친화성(affinity) 매트릭스에 관한 것이다.
어피니티 크로마토그라피는 생물학적 분자의 독특하고 기본적인 생물학적 특성, 즉 그것들의 선택적이고 특이적인 고친화성 인식 및 다른 분자들과의 가역적 분자상호작용을 기초로 하는 분리 및 정제 기술이다.
대부분의 생물학적 고분자들은 특이적 리간드 또는 이팩터(effector) 분자에 대한 기질 또는 관능성 결합부위를 가지며, 이것은 그 자체가 또다른 단백질이 될 수 있다.
일반적으로, 특이적 리간드는 고체 지지체 매트릭스에 공유부착된다.
고정화 리간드에 특이적으로 결합(흡수)하게 되는 생물학적 분자를 함유하는 샘플을 고청화 리간드와 접촉하도륵 가져온다. 비흡수 및 오염성 분자들을 제거한 후, 특이적으로 결합된 분자는 이온강도 또는 용리완충액의 pH를 변화시킴으로써 이와같은 몇가지 방법들중 한가지에 의해 특이적으로 결합된 분자-리간드상호작용을 방해함으로써 고체 지지체로부터 용리된다.
이 방법에 의해, 고정화 약품, 비타민, 펩티드, 호르몬 등이 해당 수용체들을 분리하거나 단백질들을 운반하기 위해 사용될 수 있다. 고정화 단백질은 다른 상보 또는 상호작용하는 단백질을 분리하기 위해 제공될 수 있다.
마찬가지로, 이러한 방법은 세포막과 완전한 세포까지도 지니는 특이적 수용체와 같은 입상의 생물학적표본을 분리하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 방법의 사용은 폴리뉴클레오티드, 항원, 항체, 바이러스, 효소 등을 정제하는데에 또한 유용하다.
게다가, 이러한 고체기체 친화성 지지 매트릭스는 촉매등으로서 반응에 사용하기 위해 효소를 고정화시키는데 이용되었다.
지금까지, 어피니티 크로마토그라피에 가장 널리 사용된 고체매트릭스는 아가로오스, 셀룰로오스 및 가교결합된 덱스트린과 같은 다당류 기제 매트릭스이었으나, 가교결합된 폴리아크릴 아미드와 실리카 또는 미소다공성 유리비이드가 또한 사용되었다.
그러나, 대부분의 이러한 고체매트릭스로, 특히 실리카 기제의 고체 매트릭스로 고체기제물질은 관심있는 생물학적 샘플중의 분자로부터 충분히 보호되지 못하여 그 결과 고정화 리간드의 특이적 결합 파트너 이외의 물질과의 흡수 성질에 있어서의 비특이적 결합이 일어난다.
지금까지 이용된 실리카 기제 고체매트릭스로는 실란을 기에서 강한 수소결합과 흡수가 일어나고 과정을 방해한다.
더욱이, 단백질 또는 다른 관심있는 생물학적 물질을 사용해야 하는 수용액들은 실리카 매트릭스의 바람직하지 못한 가수분해를 일으키고 매트릭스로부터 원하지 않는 물질을 누출시키며 불안정한 매트릭스를 가져온다.
지금까지 사용된 어피니티 크로마트그라피에 사용된 고체지지체 매트릭스로는 일반적으로 단지 수용액에서 약 200 내지 300시간 동안 그리고 산 또는 알칼리성 pH환경에서는 그 보다는 적은 시간동안 이러한 지지체를 사용할 수 있다.
더 나아가서, 이러한 종래기술의 매트릭스는 0.1N NaOH에의 어떤 노출에도 견딜 수 없다.
따라서, 어피니티 크로마트그라피의 개발은 현재 사용되는 고체지지체 매트릭스의 이들 단점에 의해, 특히 비특이적 물질의 흡수와 매트릭스의 불안정성으로 인해 크게 억제되어 왔다. 그러므로, 비특이적 결합의 위험을 제거 또는 실질적으로 감소시키고 다양한 pH조건하에서와 수용액에서 안정한 어피니티 크로마트그라피용 고체지지체 매트릭스가 제공되는것이 요망된다.
본 발명의 개요는 다음과 같다.
공유결합된 비가교 폴리에틸렌이민 실리카기제 고체상 지지체는 수성, 신 및 알칼리성 환경에서 크게 개선된 안정성이며 비특이적 분자의 흡수를 실질적으로 감소 또는 궁극적으로 제거하는 어피니티 크로마트그라피 매트릭스를 제공함을 이제 발견하게 되었다.
본 발명의 어피니티 크로마토그라피 매트릭스를 제공하기 위해 사용된 공유결합된, 비가교의 폴리에틸렌이민 실리카 기제의 고체지지체는 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시실란의 입상 실리카겔 또는 입상의 조절된 기공유리와의 반응생성물이며 식
실리카-PrSi-PEI
로 지칭된다.
본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 실리카-PrSi-PEI는 (1) a) 약 1 내지 200, 바람직하게는 3 내지 70미크론의 평균입경과 약 0 내지 1000, 바람직하게는 약 50 내지 1000옹스트롬 단위의 평균 기공도를 갖는 입상 실리카겔이나 아니면 b) 약 1 내지 약 200미크톤의 평균입경과 약 0, 바람직하게는 약 40 내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균기공도를 갖는 입상의 조절된 기공유리의 (2) 약 400 내지 약 1800의 펑균분자량을 갖는 폴리에틸렌이미노프로필 트리에톡시실란과의 반응생성물인 공유결합된, 비가교의 폴리에틸렌이민결합된 상의 고체지지체를 의미하거나, 또는 그것의 이염기산 무수물과의 약 0.3 내지 약 1.2카르복실 밀리당량/그램을 함유하는 약산성 카르복실화 생성물을 의미한다.
이러한 실리카-PrSi-PEI생성물, 그것들의 카르복실산염 유도체 및 그 제제는 1985년 9될 10일 발행된 휴우 램스턴(Hugh Ramsden)의 미국특허 4,540,486에 개시되고 특허청구되어 있다. 이러한 생성물은 BAKERBONDR컬럼크로마토그라피 매트릭스로서 제이. 티. 메이커 인코오퍼레이티드로부터 현재 구입된다.
본 발명의 어피니티 크로마토그라피 매트릭스는 폴리에틸렌이민 부분의 1차 및 2차 아미노기가 비변성조건하에 리간드와 공유결합을 형성할 수 있고 수성 가수분해 완충 조건하에 안정한 반응성기와 반응시킨 유도된 실리카-PrSi-PEI매트릭스이다.
따라서, 본 발명의 어피니티 크로마트그라피 매트릭스는 다음 일반식으로 표시될 수 있다.
실리카 PrSi- PEI -(R) x
상기식에서 비약산성 카르복실화 지지체의 경우에 R은 두 별개의 부위에서 친핵성 치환을 당할 수 있는 어떤 화학적 반응성 부분의 잔기로서, R이 이러한 한 부위에서 PEI의 1차 및 2차 아미노기에 공유연결되는한편 어피니티 크로마토그라피 리간드에 의해 비변성 조건하에 후속 친핵성 치환에 유용하고 반응성이어서 수성 가수분해 완충조건하에 안정한 제2의 공유결합을 형성하는 다른 부위를 가지며 x는 PEI부분에서 1차 또는 2차 아미노기의 총수미만 또는 총수와 같은 정수이고 약산성 카르복실화 지지체의 경우에 R은 카르복실 히드록실의 촉진된 친핵성 치환을 할 수 있는 어떤 화학적 반응성 부분의 잔기로서, 카르복실 탄소에서 공유결합을 형성하여 이로써 충분히 친핵성인 부위를 조장하고 어피니티 크로마토그라피 리간드상의 친핵성 관능기에 의해 카르복실 탄소에서 쉽게 치환되도록 하며 x는 카르복실화 PEI부분의 카르복실기의 총수미만 또는 총수와 같은 정수이다.
기타 전술한 조건들을 충족하는 PEI부분의 1차 및 2차 아미노 또는 카르복실기와 반응성인 부분들의 R잔기의 예로서 다음 잔기들을 들 수 있는데,
이것들은 각각 글루타르알데히드, 염화시아누르, 에피클로로히드린, 1,4-부단티올 디글리시딜 에테르, p-니트로페닐클로로포르메이트, 에틸클로로아세테이트, 1,1-카르보닐디이미다졸, 디아조화 p-니트로벤즈알데히드 플루오르화붕소산염 및 디아조화 p-니트로벤조일클로라이드 플루오르화붕소산염으로 부터 유도된다.
본 발명의 친화성 매트릭스는 친화성 매트릭스에 공유결합하는 어떤 리간드에 결합시키기 위해 사용될 수있다.
친화성 매트릭스는 특히 반응성 아미노기를 갖는 리간드와 반응시키는데 유용하나 또한 예를들면 반응성히드록실, 술프히드릴 및 유사기들을 함유하는 리간드와 같은 다른 반응성기를 갖는 리간드와 반응시키는데 아주 유용하다.
본 발명의 친화성 매트릭스는 단백질, 효소 또는 다른 이러한 리간드의 이러한 반응성기와 쉽게 반응하여 친화성 매트릭스에 고정화된 리간드를 산출한다.
공유결합에 의해 본 발명의 진화성 매트릭스에 고정화될 수 있는 이러한 반응성기를 함유하는 리간드의 예들로는 패리크외 (Parikh, I et al.), Affinity Chromatography, C＆EN, 17-24, 32, August 26,1985에 개시된 바와 같이 본분야 공지의 항원, 항체, 효소, 억제제, 보조인자, 호르몬, 비타민, 독소, 성장인자, 글리코콘주게이트, 렉틴, 핵산 및 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 리간드 결합 친화성 매트릭스는 친화성 매트릭스에 공유결합된 리간드를 갖는 본 발명의 친화성 매트릭스로 용액중의 물질을 결합 또는 흡착함으로써 예를들어서 단백질과 같은 물질을 이러한 물질을 함유하는 용액으로 부터 정제 또는 분리하기 위해 사용된다.
분리 또는 정제할 이러한 물질중에는 예를들어서 효소, 수용체, 항체, 항원, 핵산등을 들 수 있다.
게다가, 본 발명의 친화성 매트릭스는 지금까지 언급한 바와같이 어피니티 크로마토그라피용 리간드로서나 아니면 반응촉매로서의 용도를 위한 고정화 효소로서 효소를 고정화하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 친화성 매트릭스에 고정화된 이러한 고정화 효소는 크게 활성이고 안정한 촉매이고 그것들의 적당한 특이성을 보유한다. 이러한 고정화 효소촉매는 재사용될 수 있고, 연속반응을 허용하며 더 양호한 반응조절을 제공하고 고순도 및 수율의 생성물을 가져온다.
더욱이, 이러한 고정화 효소촉매는 일반적으로 효소촉매의 손실의 감소 또는 제거로 인해 덜 오염되게 될 것이다.
이러한 고정화 효소의 사용은 다양한 효소 촉매 반응에, 예를 들면, L-아미노산의 제조공정에 폭넓은 이용분야를 발견한다.
(실시예 1)
반응용기내 25.0g의 실리카-PrSi-PEI(40μ,2.8% N,0.05meg)에 13.0g(0.128몰)의 트리에틸아민을 클로로프름 100ml와 함께 첨가하고 약 20℃에서 27.6g(0.115ml)의 염화시아누르를 첨가하였다. 반응은 매우 발열이었다. 후사 200ml의 클로로포름을 첨가하고 혼합물을 약 20℃에서 약 5½시간동안 교반하고 여과시키고 100ml 클로로포름으로 3회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=26.2g, 분석 C=10.74% ; H=2.11%, N=6.32%, Cl=5.52%.
(실시예 2)
클로로프롬 300ml를 온도계, 교반장치 및 응축기가 장치된 반응용기에 넣고 얼음과 소금으로 약 0-5℃로 냉각시켰다. 27.6g(0.15몰)의 염화시아누르를 20분간 첨가하는동안 온도는 약0-5℃ 사이로 유지시켰다.
다음에, 15.0g(0.15몰)의 트리에틸아민을 단번에 첨가하였고 현탁액은 황색으로 되고 온도는 약 25℃로 상승되었다.
다음에 용액을 다시 약 0-5℃로 냉각시키고 25.0g의 실리카-PrSi- PEI(40μ,2.8% N,0.05meg)를 조금씩 분할하여 약 20분 간격으로 첨가하는 동안 온도는 약 0-5℃로 유지시켰다.
반응혼합물을 그 온도에서 약 30분간 교반하고 그후 빙욕을 제거하고 혼합물을 약 22시간 교반하고 여과하고 100ml 클로로포름으로 3회 세척한 다음 약 0℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=25.4g. 분석 C=10.22% ; H=2.12%, N=5.78% ; Cl=5.59%.
(실시예 3)
25g의 실리카-PrSi-PEI(40μ,2.8% N, 0.05meg)를 클로로포름 100ml에 현탁시키고, 여기에 15.0g(0.15몰)의 트리에틸아민을 첨가하였다.
28.0g의 트리아진을 클로로포름 200ml와 함께 슬러리로 만들고 반응용기에 이동시켰다.
매우 반열의 반응이 일어났다.
혼합물을 약 20℃에서 약 5½시간동안 교반하고 여과시키고 100ml 클르로포름으로 3회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=26g. 분석 C=10.95% ; H=2.12%, N=5.96%, Cl=5.63%
(실시예 4)
반응용기에서 50.0g의 실리카-PrSi-PEI(40μ,2.8% N, 0.05meg)를 클로로프름 200ml에 현탁시키고 여기에 29.0g의 트리에틸아민을 첨가하였다. 20.0g의 염화시아누르를 점차적으로 첨가하고 염화시아누르의 나머지를 클로로포름 200ml와 함께 슬러리로 만들고 반응용기에 이동시켰다. 매우 발열의 반응이 일어났다.
혼합물을 약 20℃에서 약 5½시간동안 교반하고 여과시키고 200ml 클로르포름으로 3회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=51g. 분석: C=10.71%, H=2.14%, N=5.88% C1=5.33%
(실시예 5)
클로로포름 400ml를 응축기, 교반장치 및 온도계가 장치된 반응용기에 현탁시키고 얼음과 소금으로 약0-5℃로 냉각시켰다. 56g(0.29몰)의 염화시아누르를 15-20분동안 냉각된 클로로프름용액에 첨가하는 동안 온도는 약 0-5℃에서 유지시켰다. 50ml의 클로로포름중의 36g(0.35몰)의 트리에틸아민을 온도를 약10℃하에 유지하면서 약 30분간 적가하였다.
트리에틸아민의 첨가가 완결된 후 용액은 황색으로 변하였다. 혼합물을 약 0-℃로 냉각시키고 실시예 4에 따라 제조된 50.0g의 실리카-PrSi-PEI-트리아진을 온도를 약 10℃하에 유지하면서 첨가하였다.
실리카의 첨가는 약 10분에 완결되었다.
반응혼합물을 그 온도에서 약10분간 교반하고 그후 빙욕을 제거하고 혼합물을 약 20℃에서 약 18½시간동안 교반하고 여과하고 250ml 클로로포름으로 4회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=49g. 분석 : C=113% ; H=2.25% ; N=6.31% ; Cl=4.86%
(실시예 6)
반응용기에 250g의 실리카-PrSi-PEI(40μ,2.8% N, 0.05meg)와 100ml 25% 글루타르알데히드 용액을 혼합하였다.
혼합물을 쉐이커에서 약 4시간동안 약 20℃에서 유지시켰다. 혼합물은 담갈색으로 되었고 약 4시간 후 여과하고 100ml 탈염수로 3회 세척하고 100ml 메탄올로 3회 및 100ml 아세톤으로 3히 세척하고 악 20℃에서 진공오븐에서 하룻밤 건조시켜 일정중량으로 하였다.
수율=26g, 분석 ; C=15.43% ; H=2.48% ; N=2.34%
(실시예 7)
25g의 실리카-PrSi-PEI(40μ,2.8% N,0.05meg)를 500ml 둥근바닥 플라스크에 넣고 테트라히드로푸란 100ml중의 5.1g(0.05ml) 트리에틸아민을 첨가하고 이어서 10. 15g(0.05몰) p-니트로페닐 클로로포르메이트와 추가로 150ml의 테트라히드로푸란을 첨가하였다.
혼합물을 쉐이커에서 약 16시간동안 약 20℃에서 유지시킨 다음 여과하고 125ml 클로로포름으로 4회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=26g. 분석 : C=9.73% ; H=2.51% ; N=326%.
(실시예 8)
25g의 실리카-PrSi-PEI(40μ,2.8% N,0.05meg)를 250ml의 테트라히드로푸란에 현탁시키고 10.12g(0.1몰)의 트리에틸아민을 첨가하고 이어서 9.32g(0.01몰)의 에피클로로히드린을 첨가하였다.
혼합물을 쉐이커에서 약 19시간동안 20℃에서 유지시킨 다음 여과하고 250ml 테트라히드로푸란으로 2회세척하고 250ml 클로로프름으로 2회 및 250ml 아세톤으로 2회 세척한 다음 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=25.5g 분석 : C=7.84% ; H=1.61% ; N=2.63%
(실시예 9)
반응용기에 25g의 실리카-PrSi-PEI(40μ,2.8% N,0.05meg)을 250ml의 테트라히드로푸란에 현탁시키고 11.25g(0.055몰)의 1,4-부탄디올 글리시딜 에테르를 첨가하였다.
혼합물을 쉐이커에서 약 8시간동안 약 20℃에 둔다음 여과하고 100ml 메탄올로 3회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다. 분석 : C=7.09% , H=1.62% , N=2. 36%
(실시예 10)
실시예 9를 반복하되 생성물을 100ml 아세톤으로 3회,100ml 디에틸 이테르로 3회 세척하였다. 분석 : C=7.13% ; H=1,6l% ; N=2.75%
(실시예 11)
10(0.016ml)의 1,1'-카르보닐디이미다졸을 150ml의 아세톤에 현탁시키고 현탁액을 반응용기내 25g의 실리카-PrSi--PEI(40μ,2.8% N,0.05meg)에 첨가하였다.
추가로 100ml의 아세톤을 반응용기에 첨가하고 그것을 로터리필름증발기에서 약 18시간동안 약 30℃에서 유지시켰다. 생성물을 여과하고 250ml 아세톤으로 3회, 250ml 디에틸에테르로 1회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=26g. 분석 : C=8.99% ; H=1.72% ; N=3.98%
(실시예 12)
25g의 실리카-PrSi-PEI(C=5.92%, H=2.82%,0.05meg)를 125ml의 테트라히드로푸란에 현탁시키고 5.05g(0.05몰)의 트리에틸아민을 첨가하고 반응혼합물을 약 20℃에서 약 10분간 교반하고 그후 6.12g(0.05몰)의 에틸클로로아세테이트를 첨가하고 이어서 125ml의 테트라히드로푸란을 첨가하였다.
반응혼합뭍을 약 20℃에서 쉐이커에서 약 24시간동안 교반한 다음 여과하고 250ml 클로로포름으로 2회, 250m1 아세톤으로 2회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
분석 : C=6.61% ; H=1.67% ; N=2.80%.
(실시예 13)
2.5g(0.013ml)의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염을 50ml의 아세톤 2-프로판을(1 : 1)에 용해시켰다.
1.3g(0.011몰)의 N-히드록시숙신이미드를 100ml의 아세톤에 현탁시키고 쉐이커에 유지시켰다(이것은완전히 용액화하지 않았다). 25g의 숙시노일화 실리카-PrSi-PEI(C=11.89%, H=1.86%, N=2.69%, 카르복실기=0.95meg/g) 를 반응용기에 넣고 아세톤-2-프로판올중의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염 용액을 첨가하였다.
반응용기를 약 5분간 흔든다음 아세톤중의 N-히드록시숙신이미드용액을 첨가하고 이어서 25ml의 2-프로판올을 첨가하였다. 반응용기를 쉐이커에 약 22시간동안 유지시킨 다음 생성물을 여과하고 250ml 이소프로판올로 2회, 250ml 아세톤으로 2회 세척하고 약 80℃에서 약 4시간동안 건조시켰다.
수율=26.4g. 분석 : C=13.60% ; H=2.14% : N=3.38%.
(실시예 14)
본 발명에 따르는 디아조어피니티 크로마토그라피 매트릭스제제는 다음 과정들에 따라 제조되었다.
A) 실리카-PrSi-PEI를 메탄올에서 p-니트로벤즈알데히드와 반응시키고 결과된 생성물을 메탄올중의 수소화붕소나트륨과 반응시켰다. 생성물을 약 60℃에서 아이티온산 나트륨 용액에 현탁시켰다. 결과된 생성물을 빙냉 HBF4와 반응시키고 생성물을 여과하고 빙수로 세척하고 진공하에 건조시켜 원하는 다이오늄플루오르화붕소산염 생성물을 수득하였다.
B) 실리카-PrSi-PEI는 테트라히드로푸란과 트리에틸아딘 중의 p-니트로벤조일 클로라이드와 반응시키고 결과된 생성물을 아이티온산 나트륨 용액에 현탁시키고 이어서 빙냉 HBF4와의 반응생성물로 처리하고 여과하고 빙수로 세척하고 진공하에 생성물을 건조시켜 원하는 디아조늄 플루오르화붕소산염 생성물을 수득하였다.
(실시예 15)
실시예 6에 따라 제조된 10g의 글루타르알데히드 PEI-실리카겔 친화성 메트릭스를 0.1M인산염(pH8.0)으로, 유출액의 pH가 세척(평헝) 완충액의 pH와 같아질 때까지 제척하였다. 25mg/ml사람 lgG용액(pH8.0인 0.1M인산염 완충액중) 20.0ml를 친화성 매트릭스에 첨가하였다.
반응부피를 작게 하기 위해 농축된 단백질 용액을 사용하고 반응이 4℃에서 밤새 진행되도록 두었다.
친화성 매트릭스를 비공유결합된 물질을 제거하기 의해 다음 순서의 완충액으로 세척하였다: 0.1M 인산염,0.1M 인산염+1.0M NaC1,0.1M 인산염. 모든 완충액의 pH를 8.0으로 조절하였다. 다음에 친화성매트릭스를 0.2M 에탄올아민(pH 8.0)으로 미반응 부위를 메우기 위해 4℃에서 1-3시간동안 세척하였다.
다음에 친화성 매트릭스를 pH 7.0인 0.1M 인산염으로 평형화시켰다. 친화성 매트릭스를 4℃에서 보관하고 0.1% 아지드화나트륨을 보존제로서 첨가하였다.
역상 HPLC에 의해서 용액중에 잔유하는 이뮤노글로부런단백질의 양을 분석함으로써 측정한 바, 96%의 이뮤노글로부린단백질이 고정화되었다.
용액중의 이 팝티드를 항체 친화성 매트릭스의 충전된 컬럼에 통과시켰을 때 특이적 항원 소마트로트로핀의 지연에 의해 측정한 바 고정화된 항체는 면역학적으로 활성이었다. 구조상 미관련 엡티드들은 컬럼에 보유되어 있지 않았다.
(실시예 16)
실시예 6에 따라 제조된 5g의 글루타르알데히드 PEI-실리카겔 친화성 매트릭스를 0.1M 아세트산염(pH8.7)으로 유출액의 pH가 세척 (평형) 완충액의 pH와 같아질 때까지 세척하였다.
30mg/ml키모트립신 용액(pH 8.7인 0.1M 아세트산염 완충액중) l0ml를 친화성 매트릭스에 첨가하였다. 반응부피를 작게 하기 위해 농축된 단백질 용액을 사용하고 반응이 5℃에서 밤새 진행되도록 두었다. 친화성 매트릭스를 비공유결합된 믈질을 제거하기 위해 pH 7.0인 0.1M 아세트산염 완충액으로 세척하였다.
친화성 매트릭스를 4℃에서 건조하게 또는 아세트산염 완충액(pH 7.0) 2-프로판올(9 :1)에 보관하였다.
역상 HPLC에 의해서 용액중에 잔유하는 효소 단백질의 양믈 분석함으로써 측정한 바,90%의 효소가 고정화되었다.
고정화 효소를 유리컬럼에 충전시키고 아미노산과 아미노산 유도체를 크로마토그라피시키기 위한 크로마토그라프 매트릭스로 사용하였다.
(실시예 17)
실시예 6에 따라 제조된 50mg의 글루타르알데히드 PEI-실리카겔 친화성 매트릭스를 0.05-0.1M 인산염(pH 7.5-8.5)으로 유출액의 pH가 세척(평헝) 완충액의 pH와 같아질 때까지 세척하였다. 0.5mg/ml갈락토오스 옥시다제 용액 (pH 7.5-8.5인 0.05-0.1M 인산염 또는 붕산염 완충액중) 2.0ml를 친화성 매트릭스에 첨가하였다. 반응부피를 작게 하기 위해 농축된 단백질 용액을 사용하고 반응이 4℃에서 밤새 진행되도록 두었다 . 친화성 매트릭스를 비공유결합된 물질을 제거하기 위해 다음 순서의 완충액으로 세척하였다. 0.1M 인산염,0.1M 인산염+1.0M NaCl,0.1M 인산염.
모든 완충액의 pH는 8.05로 조절되었다.
다음에 친화성 매트릭스를 0.2M 에탄올아민 또는 트리스 (pH 8.0)로 미반응부위를 메우기 위해 4℃에서 1-3시간동안 세척하였다. 다음에 친화성 매트릭스를 pH 7.0인 0.1M 인산염으로 평형화시켰다. 친화성매트릭스를 4℃에서 보관하였다.
역상 HPLC에 의해서 용액중에 잔유하는 효소 단백질의 양을 분석함으로써 측정한 바,98%의 효소가 고정화되었다. 고정화효소는 o-디아니시딘을 이용하는 비색산화-환원반응에 의해 측정한 바 활성이었다.
(실시예 18)
실시예 3에 따라 제조된 트리아진 PEI-실리카겔 친화성 매트릭스를 0.1M 인산염(pH 7.5)으로 유출액의 pH가 세척완충액의 pH와 평형화될 때까지 세척하였다.
1mg/ml 퍼옥시다제 용액 (pH 7.5인 0.1M 인산염 완충액)2.5ml를 친화성 매트릭스에 첨가하고 실온에서 4시간동안 반응하도록 두었다.
친화성 매트릭스를 비공유결합된 물질을 제거하기 위해 다음 순서의 완충액으로 세척하였다. 0.1M 인산염,0.1M 인산염 +1.0M NaCl,0.1M인산염, 모든 완충액에 대해 8.0의 pH를 사용하였다. 다음에 친화성매트럭스를 실온에서 1-3시간동안 미반응부위를 메우기 위해 0.2M 에탄올아민(pH 8.0)으로 세척하였다. 다음에 친화성 매트릭스를 pH 7.0인 0.1M 인산염으로 평형화 시켰다. 친화성 매트릭스를 4℃에서 보관하였다. 고정화 과정후 반응현탁액으로 부터 상징액의 280nm에서의 흡광도를 모니터하였다. 용액중의 54%의 효소가 흡수되었다.
고정화 효소는 당량의 용해성 효소의 활성의 55%를 나타내었다.
(실시예 19)
50nm의 글루타르알데히드 PEI 실리카겔 친화성 매트릭스를 pH 8인 0.1M 인산염 완충액으로 충분히 세척하고 같은 완충액으로 평형화시켰다.
0.8mg/ml β-갈락토시다제 용액 2.5ml를 친화성 매트릭스 현탁액에 첨가하고 고정화율을 상징액의 280ml에서의 흡광도를 모니터함으로써 측정하였다.
4℃에서 20시간후 73%의 효소가 매트릭스에 결합되었고 용해성 효소의 비활성의 40%를 나타내었다.

Claims (8)

  1. (a) 다음 일반식의 지지체
    실리카- PrSi- PEI -(R)x
    상기식에서 실리카-PrSi-PEI는 (1) a) 약 1 내지 200미크론의 평균입경과 약 0 내지 10000옹스트롬 단위의 평균기공도를 갖는 입상 실리카겔, 또는 b) 약 1 내지 약 200미크론의 평균입경과 약 0 내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균기공도를 갖는 입상의 조절된 기공유리의 (2) 약 400 내지 약 1800의 평균분자량을 갖는 폴리에틸렌 이미노 프로필 트리메톡시실란과의 반응생성물인 공유결합된 비가교 폴리에틸렌이민결합상의 고체지지체이며, 또는
    (b) 실리카-PrSi-PEI 고체지지체의, 이염기산 무수물과의 약 0.3 내지 약 1.2카르복실 밀리당샹/그램을 함유하는 약산성 카르복실화 생성물로 구성되는 군으로 부터 선택되는 고체상 지지체로서, 상기식에서 비약산성 카르복실화 지지체의 겅우에 R은 두 별개의 부위에서 친핵성 치환을 당할 수 있는 어떤 화학적 반응성 부분의 잔기로서, R이 이러한 한 부위에서 PEI의 1차 및 2차 아미노기에 공유연결되는 한편 어피니티크로마토그라피 리간드에 의해 비변성 조건하에 후속 친핵성 치환에 유용하고 반응성이어서 수성 가수분해 완충조건하에 안정한 제2의 공유결합을 형성하는 다른 부위를 가지며 x는 PEI부분에서 1차 또는 2차아미노기의 총수미만 또는 총수와 같은 정수이고 약산성 카르복실화 지지체의 경우에 R은 카르복실 히드록실의 촉진된 친핵성 치환을 할 수 있는 어떤 화학적 반응성 부분의 잔기로서, 카르복실 탄소에서 공유결합을 형성하여 이로꺼 충분히 친핵성인 부위를 조장하고 어피니티 그로마토그라피 리간드상의 친핵성 관능기에 의해 카르복실 탄소에서 쉽게 치환되도록 하며 x는 카르복실화 PEI부분의 카르복실기의 총수미만 또는총수와 같은 정수인 고체상 지지체
  2. 제1항에 있어서, 실리카겔은 약 3 내지 약 70미크론의 평균입경과 약 50 내지 1000옹스트롬 단위의 평균기공도를 갖는 것을 특징으로 하는 고체상 지지체
  3. 제1항 또는 제 2 항에 있어서, R은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 지지체
  4. 효소가 어피니티 크로마토그라피 매트릭스 고체상 지지체에 고정화된 고정화 고체상효소에 있어서, 고체상 지지체는 제1항 내지 제3항중 어느하나의 고체상인 것을 특징으로 하는 고정화 고체상 효소.
  5. (a) 다음식의 매트릭스
    실리카 -PrSi-PEI -(R)x
    상기식에서 실리카-PrSi-PEI는 (1) a) 약 1 내지 200미크론의 평균입경과 약 0 내지 1000옹스트롬 단위의 평균기공도를 갖는 입상 실리카겔, 또는 b) 약 1 내지 약 200미크론의 평균입경과 약 0 내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균기공도를 갖는 입상의 조절된 기공유리의 (2) 약 400 내지 약 1800의 평균분자량을 갖는 폴리에틸렌 이미노 프로필 트리메톡시실란과의 반응생성물인 공유결합된 비가교 폴리에틸렌이민결합상의 고체지지체이며, 또는 (b) 실리카-PrSi-PEI 고체지지체의 이염기산 무수물과의 약 0.3 내지 약 1.2카르복실 밀리당량/그램을 함유하는 약산성 카르복실화 생성물로 구성되는 군으로부터 선택되는 친화성 매트릭스 공유결합된 리간드로 이루어지는 리간드 결합된 크로마토그라피 친화성 매트릭스로서, 상기식에서 비약산성 카르복실화 지지체의 경우에 R은 두 별개의 부위에서 친핵성 치환을 당할 수 있는 어떤 화학적 반응성 부분의 잔기로서, R이 이러한 한 부위에서 PEI의 1차 및 2차 아미노기에 공유연결되는 한편 어피니티크로마토그라피 리간드에 의해 비변성 조건하에 후속 친핵성 치환에 유용하고 반응성이어서 수성 가수분해 완충조건하에 안정한 제2의 공유결합을 형성하는 다른 부위를 가지며 x는 PEI부문에서 ]차 또는 2차 아미노기의 총수미만 또는 총수와 같은 정수이고 약산성 카르복실화 지지체의 경우에 R은 카르복실 히드록실의 촉진된 친핵성 치환을 할 수 있는 어떤 화학적 반응성 부분의 잔기로서, 카르복실 탄소에서 공유결합을 형성하여 이로써 충분히 친핵성인 부위를 조장하고 어피니티 크로마토그라피 리간드상의 친핵성 관능기에 의해 카르복실 탄소에서 쉽게 치환되도록 하며 x는 카르복실화 PEI부분의 카르복실기의 총수미만 또는 총수와 같은 정수인 리간느 결합된 크로마트그라피 친화성 매트릭스.
  6. 제5항에 있어서, 실리카겔은 약 3 내지 약 70미크론의 평균입경과 약 50 내지 1000옹스트롬 단위의 평균기공도를 갖는 것을 특징으로 하는 리간드 결합된 크로마토그라피 친화성 매트릭스.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, R은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드 결합된 크로마토그라피 친화성 매트릭스.
  8. 친화성 매트릭스에 공유결합된 물질에 대한 리간드를 갖는 친화성 매트릭스와 용액중의 물질익 결합시킴으로써 용액으로부터 물질을 분리 또는 정제하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 하나의 고체상 지지체를 친화성 매트릭스로 사용하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리 또는 정제방법.
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