KR910005189B1 - 아실화 폴리에틸렌이민 결합상 실리카 생성물의 술폰산 유도체 - Google Patents

아실화 폴리에틸렌이민 결합상 실리카 생성물의 술폰산 유도체 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

아실화 폴레에틸렌이민 결합상 실리카 생성물의 술폰산 유도체
본 발명은 등전점이 약 5이하인 단백질을 분리 및 정제할 때 사용 및 제조하는 신규의 결합상 실리카 생성물에 관한 것이다. 더욱 상세히 말하면 본 발명은 등전점이 약 5이하인 단백질을 분리 및 정제하는 액체 크로마토그라피의 컬럼 충전에 알맞는 고체상으로서 사용 및 제조하는 N-아실화 공유결합, 비가교 폴리에틸렌이민 결합상 실리카 생성물에 관한 것이다.
J.Chromatogr. 185, 375-392(1979)에서 알페르트 및 레그니어는 폴리에틸렌이민(PEI)을 실리카 표면에 흡착시킬 수 있으므로 다관능 옥시란에 의해 중합체층으로 가교될 인근 흡착 PEI 분자상에 충분한 제1 및 제2이미노기를 제공함을 밝혔다.
최근에, 가교 폴리에틸렌이민으로 피복된 미세립 실리카 컬럼으로 충전된 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)를 사용한 합성 올리고뉴클레오티드의 분리를 T.G.Lawson et al., Anal.Biochem.133, 85-93(1983)의 문헌에 보고하였다.
가장 최근에, 신규의 비가교 공유 결합 폴리에틸렌 이미노프로필 트리메톡시 실란 실리카겔(PEI-PrSi-Silica gel) 및 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란 조절 다공질유리(PEI-PrSi-CPG) 결합상 생성물을 휴우 램스덴이 1985년 9월 10일 발행된 미국 특허번호 4,540,486호에 단백질 혼합물의 분리 및 분석에 있어서 유용한 것으로 서술하였다. 램스덴의 비가교 공유결합 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 생성물은 본 발명에 따라 N-아실화로될 기질로 구성되기 때문에, 상기 미국특허 제4,540,486호의 발표를 기기에 참고하여 전체를 여기에 포함시킨다.
상기의 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 결합상 생성물이 단백질을 분리 및 정제하는데에 액체크로마토그라피의 컬럼 충전용 고체상으로서 매우 유용한 것으로 알게된 반면에, 이와 같은 결합상 생성물은 일부 단백질에 대하여 매우 강한 양이온 교환체가 아님이 발견되었으며 그와 같은 단백질의 분리 및 정제는 어렵거나 불가능한 것으로 표현되었다.
이점은 특히 저등전점이 약 5이하인 단백질의 분리 및 정제의 경우인 것으로 알게되었다. 예를 들면, 상기 결합상은 난알부민 및 소혈청 알부민등과 같은 단백질의 충분히 허용 가능한 분리 및 정제를 제공하지 않는다.
그러므로, 등전점이 약 5이하인 단백질을 적합하게 분리하고 일부 단백질에 대한 강한 양이온 교환체인 고체 결합상 생성물이 매우 바람직하다. 추가적으로, 2 및 그 이상의 각 pH에서 실질적으로 완전히 충전되며 허용 가능한 것보다 큰 선택도를 제공하는 고체 결합상 생성물을 제공하는 것이 매우 바람직하다.
더욱이, 지금까지 가장 강하게 단백질을 결합시키며 각 COO-위치에 인접한 SO3 -기를 도입시켜 보다 높은 능력을 제공하는 고체 결합상 생성물을 제공하는 것이 유리하다. 더욱이, 술폰산기로 인해 등전점이 5이하인 단백질을 결합하고 술폰산기 및 카르복실기로 조합된 결합강도로 인해 등전점이 5이상의 단백질을 결합하는 고체 결합상 생성물을 제공하는 것이 매우 유리하다.
현재 램스덴의 미국특허번호 제4,540,486호에 기재된 상기 비가교 공유 결합된 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 결합상 생성물의 이미노 및 아미노 작용이 N-아실화일 수 있으며 N-아실화 반응생성물은 다시 칼륨 또는 아황산수소 나트륨 또는 수용성 아황산수소염 전구 물질과 같은 수용성 아황산수소염과 반응하여 특히 등전점이 낮은 단백질을 분리 및 정제하는데 고체상으로서 유용한 아실화 폴리에틸렌이민 결합상 실리카 생성물의 술폰산 유도체를 제공하고 있음을 알게 되었다.
본 발명의 아실화 폴리에틸렌이민 결합상 실리카 생성물의 술폰산 유도체는 다음 일반식으로 구성되어 있다.
[일반식 1]
Figure kpo00001
식중
Figure kpo00002
은 실리카 겔 또는 유리의 골격이며, n은 폴리에틸렌이미노프로필 실란기가 약 400 내지 약 1800의 평균 분자량인 정수이며; q는 0 또는 1의 정수이며; 수소, -(CH2)x-H 또는 -(CH2)m-COOH로 구성되는 기로부터 선택되며, 식중 X는 1 또는 2의 정수 및 m은 0 또는 1의 정수이며; R이 수소 또는 -(CH2)x-H이면 R1은 -(CH2)P-COOH이며, 여기서 P는 0 또는 1의 정수이며, R이 -(CH2)m-COOH이면 R1은 수소 또는 -(CH2)y-H로 구성되는 기로부터 구성되며, 여기서 y는 0 또는 1의 정수이다. 유리는 바람직하게는 조절 다공질 유리(CPG)이다.
본 발명의 술폰산 유도체는 다음의 일반식
[일반식 2]
Figure kpo00003
의 산 또는 산무수물 또는 그의 산할로겐화물, 식 중 q, R 및 R1은 일반식 Ⅰ에서 정의한 바 있으며, 인 아실화제로 N-아실화하여 상기 미국특허번호 제4,540,486호에 기재된 비가교 공유결합한 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 결합상 생성물로부터 마땅히 제조되어 다음 일반식의 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 및 N-아실화 PEI-PrSi-CPG 반응 생성물을 제공하며,
[일반식 3]
Figure kpo00004
식중 n, q, R 및 R1은 일반식 Ⅰ에서 정의한 바 있다.
일반식(Ⅲ)의 N-아실화 반응생성물은 그후 산소원 존재하에서 메타아황산수소 나트륨과 같은 수용성 아황산수소염 또는 수용성 아황산수소염 생성 반응물(아황산 수소 나트륨 전구물질)과 반응하여 아실 작용기상에 술폰산 래디칼을 도입하므로써 본 발명의 일반식(Ⅰ)의 신규의 술폰산 유도체를 제공하고 있다.
종래의 원소분석 방법으로 마땅히 결정할 수 있는 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 반응물기질의 퍼센트 질소는 PEI 부분상에 이미노 및 아미노 작용기의 상대적으로 조합된 총량을 나타내고 있다. 충분한 아실화제는 실질적으로 PEI 부분상에 모든 이미노 및 아미노 작용기와 반응하는데 사용되고 있다. 통상적으로, N-아실화 단계는 불활성 비양성자성 유기용매중에 동량의 또는 다소 과량의 아실화제로 이루어진다.
대표적인 비양성자성 용매로는 예컨대, 벤젠, 톨루엔, 크실렌등과 같은 방향족 탄화수소; 히트라히드로푸란, 디옥산등과 같은 에테르, 및 헵탄등과 같은 지방족 탄화수소등이 있다. 예컨대, 3차 아민, 바람직하게는 3차 알킬아민과 같은 동량 또는 다소 과량의 산청정제를 유리하게 사용하여 아실할로겐화물을 사용할 때 아실화 반응중에 방출된 산을 추려낼 수 있다.
대표적인 아실화제로는 산, 산무수물 및 산할로겐화물, 특히 산염화물, 예컨대, 말레산, 푸마르산, 메사콘산, 시트라콘산, 글루타콘산, 이타콘산등와 같은 일반식(Ⅱ)의 산등이 있다. 특히 아실화제로서 바람직한 것으로는 이와 같은 산무수물, 특히 무수말레산등이 있다.
따라서, 본 발명은 비가교 폴리에틸렌이민(PEI) 작용기 공유결합을 실질적인 모든 부분, 즉 80%이상, 바람직하게는 95%이상의 이미노 및 아미노 작용기의 PEI 부분이 아실 작용기로 아실화되는 경우에 프로필실일(PrSi) 결합을 거쳐 실리카겔 또는 유리에 제공하며, 이는 아실 작용기가 아황산수소염 생성 반응물과 반응한후 본 발명의 신규 술폰산 유도체를 제공하는 것이다.
N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 및 N-아실화 PEI-PrSi-CPG 반응 생성물과 아황산 수소염 또는 아황산수소염 전구물질과의 반응은 산소, 공기, 과황산칼륨, 과산화벤조일등과 같은 산소원 존재 하에서 이루어진다.
본 발명의 고체상 결합 실리카 생성물의 골격을 형성하는 실리카겔 및 유리는 평균 분자량이 약 400 내지 약 1800인 폴리에틸렌이미노 프로필 트리메톡시 실란과 더불어, 평균 입경이 약 1 내지 약 70미크론이고 평균 공경이 약 0, 바람직하게는 약 50, 내지 약 1000옹그스트롱 단위인 실리카겔, 또는 평균 입경이 약 37 내지 약 177미크론이고 평균 공경이 약 0, 바람직하게는 약 40 내지 약 1000옹그스트롱 단위인 유리, 바람직하게는 입자 조절 다공질 유리이다.
일반식(Ⅰ)의 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 또는 PEI-PrSi-CPG 결합상 생성물의 술폰산 유도체는 컬럼 크로마토그라피로 단백질을 정체 및 분리하는 신규의 및 유용한 결합상으로 구성되어 있으며 특히 현대식 HPLC 기구로 적합하다. 충진은 각종의 메시크기 예컨대, 약 50 내지 약 600메시로 되어 있다.
일반식(Ⅰ)의 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 결합상 생성물의 바람직한 술폰산 유도체는 평균 입경이 약 5 내지 약 40미크론이고, 평균 공경이 약 50 내지 약 330옹그스트롱 단위인 미립자 실리카겔 및 평균 분자량이 약 400 내지 약 600인 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란의 반응 생성물로부터 얻은 것; 및 평균 입경이 약 40 내지 약 62미크론이고 평균 공경이 약 250 내지 약 500옹그스트롱 단위인 미립자 실리카겔 및 평균 분자량이 약 1000인 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란으로부터 얻은 것이다.
일반식(Ⅰ)의 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 결합상 생성물의 주요 술폰산 유도체는 약 및 강이온 상호작용을 토대로 단백질을 분리한다고 믿어진다. 단백질과 주요 생성물을 분리하는 뚜렷한 이점은 통상적으로 이를 토대로 하여 분리하는 현재 이용 가능한 크로마토그라피 매트릭스는 선택도가 낮은 폭넓은 피이크(peak)를 생성하고, 약 안정성이고 저용량이며 비정량적으로 단백질을 회수하므로 놀랍고 유별나다고 생각된다. 반대로, 우수한 선택도의 예리하고 잘 정의된 피이크를 제공하는 본 발명의 크로마토그라피 매트릭스는 중대한 효소활성의 손실없이 효소분리의 경우에 있어서, 매우 안정하며, 용량이 크고 두 단백질을 정량적으로 회수한다.
더욱이, 본 발명의 신규 결합상 생성물에 따라 완충 조성물의 변화 및 완충 pH의 변화는 각종 단백질 혼합물의 비용출 농도의 변화에 따른다.
본 발명은 정상적으로 여기서 서술된 크로마토그라피 매트릭스를 그와 같은 고이온강도 수용액중의 실리카의 고유 용해도 특성으로 인해 소수성 상호 작용 크로마토그라피에 사용된 수성 고이온강도 유동상에서 가수분해적으로 불안정하다고 생각되므로 매우 놀랍다. 따라서 통상 실리카 염 매트릭스를 사용하면 반드시 컬럼 수명이 짧아진다고 생각된다.
그러나, 반대의 것은 일반식(Ⅰ)의 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 결합상 생성물의 주요 술폰산 유도체에 적용된다.
추가적으로, 일반식(Ⅰ)의 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 결합상 생성물의 술폰산 유도체는 단백질분리 및 정제의 보다 고도의 선택도를 제공하고, 단백질을 보다 강하게 결합하고 그들이 충전물로서 사용된 컬럼의 보다 큰 용량을 제공하는 이점을 갖고 있다. 더욱이, 이와 같은 일반식(Ⅰ)의 생성물은 실질적으로 pH가 약 2이상에서 완전히 충전되고 저등전점, 즉 약 5이하인 단백질, 특히 난알부민, 소혈청 알부민등과 같은 단백질을 분리 및 정제하는데 사용될 수 있는 매우 강한 양이온 교환체이다.
일반식( I )의 결합상 생성물에 의해 제공된 다른 이점은 그와 같은 결합상은 마땅히 단백질 분리 및 정제단계에서 사용된 완충시스템의 pH 변화에 따른다는 점이다.
일반식(Ⅲ)의 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 반응생성물 또한 일반식( I )의 술폰산 유도체를 제조하는데 중간체로서 사용하는 신규의 결합상 생성물이다.
다음의 실시예에 있어서, 다음의 제법으로 제조된 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG는 출발 반응물질로 사용되고 상기 반응물질이 단지 예시적이며 상기 서술 및 상기 미국특허 제4,540,486호에 기재된 바에 따라 기타 PEI-PrSi-Silica 겔 및 PEI-PrSi-CPG 결합상은 본 발명의 일반식( I )의 기타 술폰산 유도체를 제공하도록 다음의 실시예에 따라 사용될 수 있다.
제조 A
PEI-PrSi-Silica 겔
평균 입경이 40미크론이고 평균 공경이 250옹그스트롱인 100그램의 실리카겔에 500ml의 프로판올 및 평균 분자량이 약 500인 49.5그램(47.1ml)의 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시실란을 교반하면서 첨가하여 혼합물을 약 48시간동안 실온에서 정체하였다.
다음에 반응 혼합물을 진공 여과시키고 여액은 2-프로판올 400ml부로 2회 및 메탄올 400ml부로 2회 세척한 후 약 80℃에서 약 4시간 동안 오븐 건조시켰다. 그 생성물을 500ml의 탈이온수에 재슬러리하고 다시 여과하고 메탄올로 여러 번 세척한 후 다시 약 80℃에서 약 4시간 동안 오븐 건조하여 약 95.5그램의 공유 결합 PEI-PrSi-Silica 겔 생성물을 수율하였다.
분석치 : C; 5.08, H; 1.43, N; 2.22(%)
제조 B
PEI-PrSi-Silica 겔
평균입경이 약 5.25미크론 및 평균 공경이 약 330옹그스트롱인 100그램 실리카겔에 500ml 톨루엔, 2ml물 및 평균 분자량이 약 500인 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시실란의 50ml의 50% w/w 이소프로판올 용액을 첨가하여 혼합물을 교반하고 실온에서 약 48시간동안 정제한다. 그 후 혼합물을 여과하고 여액은 톨루엔 500ml부로 2회 및 메탄올 500ml부로 2회 세척한후 약 80℃에서 약 2시간 45분간 오븐에서 건조하였다. 생성물을 물에 재슬러리하고, 여과하고, 물 및 메탄올로 세척하고 다시 약 80℃에서 약
Figure kpo00005
시간동안 오븐 건조하였다.
수율 : 93.0그램
분석치 : C; 3.31, H; 1.30, N; 1.25(%)
제조 C
PEI-PrSi-CPG
50ml헥산중에 있는 평균 입경이 125미크론 및 평균 공경이 240옹그스트롱인 10그램 조절 다공질 유리의 슬러리에 평균 분자량이 500인 폴리에틸렌이미노 프로필 트리메톡시 실란의 50% w/w 이소프로판올 용액 19.71그램을 가한다.
혼합물을 5분간 실온에서 교반한후 약 2시간동안 환류온도로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 여과하여 50ml헥산으로 2회 및 50ml메탄올로 2회 세척하였다. 그 후 여액을 약 80℃에서 약 3시간 동안 오븐 건조하여 공유 결합된 비가교 PEI-PrSi-CPG 생성물을 수율한다.
다음의 실시예를 통해서 본 발명을 서술 및 예시한다.
[실시예VI]
250ml 톨루엔중에 제조 A의 PEI-PrSi-Silica 겔 생성물 50그램에 20그램의 무수말레산을 교반하면서 가한다. 반응 혼합물을 약 65℃에서
Figure kpo00006
시간 동안 가열한다. 반응 생성물을 여과하고, 메탄올로 3회 세척한 후 약 80℃에서 약
Figure kpo00007
시간동안 오븐 건조한다.
수율 : 57.7그램
분석치 : C; 8.78, H; 1.47, N; 2.13(%)
역가 : 0.65meq/gram. 본 반응 생성물 20그램 및 1N NaOH 13ml를 100ml H20 중의 메타아황산 수소나트륨 9.5그램으로 혼합한 후 완전히 혼합하였다. 반응혼합물을 약 80℃에서 온탕에 놓아 약 6시간 동안 대기에 개방한다. 반응 생성물을 여과하고 계속해서 물로 2회 및 메탄올로 2회 세척하고 약 80℃에서 약
Figure kpo00008
시간동안 오븐에 놓아 건조하였다.
수율 : 20.62그램
분석치 : C; 7.26, H; 1.56, N; 1.94, S; 2.03(%) ; 0.634meq/g 술폰산.
[실시예 2]
실시예 1의 과정을 반복하되 제조 B의 PEI-PrSi-Silica 겔 생성물 50그램을 제조 A의 PEI-PrSi-Silica 겔 생성물로 대체하여 하여 대응 술폰산 결합상 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 유도체를 수율한다.
[실시예 3]
실시예 1의 과정을 반복하되 제조 C의 PEI-PrSi-CPG 생성물 동량을 제조 A의 PEI-PrSi-Silica 겔 생성물로 대체하여 N-아실화 PEI-PrSi-CPG 결합상의 대응 술폰산 유동체를 수율한다.
[실시예 4]
실시예 1의 과정을 반복하되 무수시트라콘산 동량을 무수 말레산으로 대체하여 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 결합상의 대응 술폰산 유도체를 수율한다.
[실시예 5]
실시예 1의 과정을 반복하되 무수 글루타콘산 동량을 무수말레산으로 대체하여 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 결합상의 대응 술폰산 유도체를 수율한다.
[실시예 6]
실시예 1의 과정을 반복하되 무수 이타콘산 동량을 무수 말레산으로 대체하여 N-아실화 PEI-PrSi-Silica 겔 결합상의 대응 술폰산 유도체를 수율한다.
[실시예 7]
표준 분석 컬럼(4.6mm내경×250mm길이)은 결합상과 같이 실시예 1로부터 얻어진 PEI-PrSi-Silica 겔의 술폰산 유도체(약 40미크론;약 250옹그스롱)로 고압에서 슬러리 충전된다. 슬러리는 25ml 메탄올중에 PEI-PrSi-Silica 겔의 술폰산 유도체 3.0그램으로 구성되어 있다. 슬러리를 컬럼으로 펌프한후, 추가의 100ml메탄올을 같은 압력에서 컬럼을 통해 펌프한다. 그 컬럼은 고압 액체 크로마토그라피에 부속되어 pH 7인 500밀리몰 NaOAc용액을 정상적 기준선이 280nm에서 관찰될 때까지 1200psi, 1ml/min 유속으로 컬럼으로 펌프한다.
pH 6인 25밀리몰 KH2PO4용액을 정상적 기준선에 도달할 때까지 컬럼을 통해 같은 유속으로 펌프한다.
25mM KH2PO4로 구성된 저염완충액 A에 용해된 단백질 혼합물 용액(100마이크로리터)을 컬럼으로 주사하여 단백질 성분을 30분간 1ml/min로 염농도를 증가시키므로써 pH가 7인 500mM NaOAc(완충액 B)로 용출한다. 단백질 혼합물은 시토크롬 C 500마이크로그램; 헤모글로빈 500마이크로그램; 리소자임 500마이크로그램 및 난알부민 500마이크로그램을 포함한다.
각각의 단백질은 상호 잘 분리된 농도띠로서 용출된다. 각각의 단백질의 대표적 대량 회수는 최초량의 90%이상이며, 예컨대 97%의 시토크램 C, 96%의 헤모글로빈, 95%의 리소자임 및 95%의 난알부민이다. 본실시예의 컬럼은 단백질 분리에 크로마토그라피를 1000시간 사용후에도 크로마토그라피성능의 중대한 손실을 서술하지 않는다.
[실시예 8]
표준 분석 컬럼(4.6mm내경×250mm길이)은 결합상과 같이 실시예 1로부터 얻어진 PEI-PrSi-Silica 겔 술폰산 유도체(약 40미크론; 약 300옹그스트롱)로 고압에서 슬러리 충전된다. 슬러리는 25ml 메탄올 중에 PEI-PrSi-Silica 겔의 술폰산 유도체 3.0그램으로 구성되어 있다. 슬러리를 컬럼으로 펌프한후, 추가의 100ml 메탄올을 같은 압력에서 컬럼을 통해 펌프한다. 그 컬럼은 고압 액체 크로마토그라피에 부속되어 pH 7인 500밀리몰 NaOAc 용액을 정상적 기준선이 280nm에서 관찰될 때까지 1200psi, 1ml/min 유속으로 컬럼을 펌프한다. pH가 6인 25밀리몰 KH2PO4용액을 정상적 기준선에 도달할 때까지 컬럼을 통해 같은 유속에서 펌프한다.
25mM KH2PO4로 구성된 저염 완충액 A에 4배 희석한 히브리도나 세포 배양체 용액(100마이크로리터)을 컬럼에 주사하여 단백질 성분을 60분간 1ml/min로 염농도를 증가시키므로써 500mM NaOAc(완충액 B)로 용출한다. 항체는 다른 단백질 구성성분이외의 성분중에 80%이상의 순도에서 용출된다.

Claims (50)

  1. 다음 일반식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 공유결합, 비가교 폴리에틸렌 이민 결합상 실리카의 술폰산 유도체.
    Figure kpo00009
    식중
    Figure kpo00010
    은 실리카 겔 또는 유리의 골격이며, n은 폴리에틸렌이미노프로필 실란기가 약 400 내지 약 1800의 평균 분자량을 갖는 정수이고; q는 0 또는 1의 정수이고 ; R은 수소, -(CH2)x-H 또는 -(CH2)m-COOH로 구성되는 기로부터 선택되며 여기서 X는 1 또는 2의 정수 및 m은 0 또는 1의 정수이고, R이 수소 또는 -(CH2)x-H일 때 R1은 -(CH2)p-COOH이며, 여기서 P는 0 또는 1의 정수이고, R이 -(CH|2)m-COOH일 때 R1은 수소 또는 -(CH2)y-H로 구성되는 기로부터 선택되며 여기서 y는 0 또는 1의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 결합상의 실리카 골격이 평균 입경이 약 3 내지 약 70미크론이고 평균 공경이 약 50 내지 약 1000Å인 미립자 실리카겔 또는 평균입경이 약 37 내지 약 177미크론이고, 평균 공경이 약 40 내지 약 1000Å인 미립자 조절 다공질 유리로 선택되는 것을 특징으로 하는 술폰산 유도체.
  3. 제2항에 있어서, 결합상의 실리카 골격이 평균 입경이 약 3 내지 70미크론이고, 평균 공경이 약 50 내지 1000Å인 미립자 실리카 겔인 것을 특징으로 하는 술폰산 유도체.
  4. 제2항에 있어서, 미립자 실리카 겔은 평균 입경이 약 5 내지 약 40미크론이고, 평균 공경이 약 50 내지 약 330Å이며, n은 폴리에틸렌이미노프로필실란 부분이 약 400 내지 약 600의 평균 분자량을 갖는 정수인 것을 특징으로 하는 술폰산 유도체.
  5. 제2항에 있어서, 미립자 실리카 겔은 평균입경이 약 40 내지 약 62미크론이고, 평균 공경이 약 210 내지 약 520Å이며, n은 폴리에틸렌이미노프로필 실란 부분이 약 1000의 평균 분자량을 갖는 정수인 것을 특징으로 하는 술폰산 유도체.
  6. 제3항에 있어서, q=0, R이 수소, R1이 -(CH2)p-COOH 및 P가 0인 것을 특징으로 하는 술폰산 유도체.
  7. 제3항에 있어서, q가 0, R이 -(CH2)x-H, X가 1, R1이 -(CH2)|p-COOH 및 P가 0인 것을 특징으로 하는 술폰산 유도체.
  8. 제3항에 있어서, q가 1, R이 수소, R1이 -(CH2)p-COOH 및 P가 0인 것을 특징으로 하는 술폰산 유도체.
  9. 제3항에 있어서, q가 0, R이 -(CH2)m-COOH, m이 1 및 R1이 수소인 것을 특징으로 하는 술폰산 유도체.
  10. 다음 일반식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 공유결합, 비가교 폴리에틸렌이민 결합상 실리카의 N-아실화 유도체
    Figure kpo00011
    식중
    Figure kpo00012
    은 실리카 겔 또는 유리의 골격이고, n은 폴리에틸렌이미노프로필 실란기가 약 400 내지 약 1800의 평균 분자량을 갖는 정수이고; q는 0 또는 1의 정수이고 ; R은 수소, -(CH2)x-H 또는 -(CH2)m-COOH로 구성되는 기로부터 선택되며 여기서 X는 1 또는 2의 정수 및 m은 0 또는 1의 정수이고; R이 수소 또는 -(CH2)x-H일 때 R1은 -(CH2)p-COOH이며, 여기서 P는 0또는 1의 정수이고, 및 R이 -(CH|2)m-COOH일때 R1은 수소 또는 -(CH2)4-H로 구성되는 기초부터 선택되며 여기서 y는 0 또는 1의 정수이다.
  11. 제10항에 있어서, 결합상의 실리카 골격은 평균 입경이 약 3 내지 70미크론이고 평균 공경이 약 50 내지 1000Å인 미립자 실리카겔 또는 평균 입경이 약 37 내지 약 177미크론이고, 평균 공경이 약 40 내지 약 1000Å인 미립자 조절 다공질 유리로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 N-아실화 유도체.
  12. 제11항에 있어서, 결합상의 실리카 골격이 평균 입경이 약 3 내지 약 70미크론이고 평균 공경이 약 50 내지 약 1000Å인 미립자 실리카겔인 것을 특징으로 하는 N-아실화 유도체.
  13. 제1항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  14. 제2항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  15. 제3항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  16. 제4항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  17. 제5항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  18. 제6항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  19. 제7항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  20. 제8항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  21. 제9항의 술폰산 결합상 유도체로 충전된 컬럼으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그라피용에 적합한 크로마토그라피 컬럼.
  22. 고체상으로서 제1항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  23. 고체상으로서 제2항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  24. 고체상으로서 제3항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  25. 고체상으로서 제4항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  26. 고체상으로서 제5항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  27. 고체상으로서 제6항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  28. 고체상으로서 제7항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  29. 고체상으로서 제8항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  30. 고체상으로서 제9항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 시료에서 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  31. 고체상으로서 제1항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  32. 고체상으로서 제2항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  33. 고체상으로서 제3항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  34. 고체상으로서 제4항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  35. 고체상으로서 제5항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  36. 고체상으로서 제6항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  37. 고체상으로서 제7항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  38. 고체상으로서 제8항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  39. 고체상으로서 제9항의 술폰산 결합상 유도체를 사용하여 등전점이 약 5이하인 단백질을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  40. 제31항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  41. 제32항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  42. 제33항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  43. 제34항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  44. 제35항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  45. 제36항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  46. 제37항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  47. 제38항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  48. 제39항에 있어서, 상기 단백질이 난알부민 및 소혈청 알부민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 추출방법.
  49. 공유 결합비가교 폴리에틸렌이미노프로필 실리카겔 또는 폴리에틸렌이미노프로필 조절 다공질 유리와 다음 일반식의 식 산
    Figure kpo00013
    또는 산 무수물 또는 그의 산할로겐화물, 식중 q, R 및 R1은 제1항에서 정의한 바 있으며, 을 반응시키며, 산소원 존재하에서 얻어진 N-아실화 폴리에틸렌이미노프로필 결합상 반응 생성물과 수용성 아황산 수소염 또는 수용성 아황산수소염 전구물질을 반응시키는 것을 특징으로 하는 제1항의 술폰산 결합상 유도체의 제조방법.
  50. 제49항에 있어서, 아실화 시약이 무수 말레산이고 수용성 아황산수소염 전구 물질이 메타아황산수소 나트륨인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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