DK173805B1

DK173805B1 - Silicaprodukt med bundet fase, fremgangsmåde og mellemprodukt til fremstilling deraf samt chromatografisk søjle pakket med produktet

Info

Publication number: DK173805B1
Application number: DK198701140A
Authority: DK
Inventors: Hugh E Ramsden; David R Nau
Original assignee: Mallinckrodt Baker Inc
Priority date: 1986-03-06
Filing date: 1987-03-05
Publication date: 2001-11-05
Also published as: DK114087D0; US4661248A; ATE52711T1; KR870008932A; EP0237301A3; IL81740A0; KR910005189B1; EP0237301A2; CA1291593C; EP0237301B1; DE3762706D1; IE59567B1; JPS62235207A; JPH0647454B2; IL81740A; IE870190L; AU6857587A; DK114087A; NZ219033A; AU586533B2

Description

i DK 173805 B1

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt silicaprodukt med bundet fase som angivet i krav 1-7, hvilket produkt kan anvendes ved adskillelse og rensning af proteiner, især proteiner med et isoelektrisk punkt på under ca.

5 5. Opfindelsen angår også en chromatografisk søjle som an givet i krav 8 samt en fremgangsmåde til fremstilling af det omhandlede silicaprodukt som angivet i krav 9-10 og et mellemprodukt som angivet i krav li til fremstilling af det omhandlede silicaprodukt. Opfindelsen angår nærmere bestemt 10 sulfonsyrederivater af silicaprodukter med bundet fase af N-acyleret, covalent bundet, ikke-tværbundet polyethylenimin, som kan anvendes som faste faser, som er egnede til søjlepakning ved væskechromatografi til adskillelse og rensning af proteiner, især proteiner med et isoelektrisk punkt under 15 ca. 5, og fremstillingen af disse.

Alpert og Regnier, J. Chromatogr. 185, 375-392, (1979) har vist, at polyethylenimin (PEI) kan adsorberes til silica-overflader, hvorved der tilvejebringes tilstrækkeligt med primære og sekundære iminogrupper på 20 tilstødende adsorberede PEI-molekyler til, at de kan tværbindes af polyfunktionelle oxiraner til et polymert lag.

For nylig er adskillelsen af syntetiske oligo-nucleotider ved højtryksvæskechromatografi (HPLC) med 25 søjler af mikropartikelformigt silica overtrukket med tværbundet polyethylenimin blevet beskrevet i litteraturen af T.G. Lawson et al., Anal. Biochem. 133, 85-93 (1983).

Senere er hidtil ukendte produkter med bundet fase af covalent bundet polyethyleniminopropyl-trimethoxy-30 silan-silicagel (PEI-PrSi-silicagel) og polyethylenimino- propyl-trimethoxysilan- (glas med kontrolleret porestørrelse) (PEI-PrSi-CPG) blevet beskrevet i US patentskrift nr.

4.540.486 som anvendelige til adskillelse og analyse af proteinblåndinger.

35 2 DK 173805 B1

Da de ovennævnte ikke-tværbundne covalent bundne PEI-PrSi-silicagel- og PEI-PrSi-CPG-produkter udgør grundlaget, der skal N-acyleres ifølge opfindelsen, skal der henvises til det nævnte US patentskrift nr. 4.540.486 5 i sin helhed.

Selvom de nævnte PEI-PrSi-silicagel- og PEI-PrSi-CPG--produkter har vist sig at være ganske anvendelige som faste faser til søjlepakning ved væskechromatografi til adskillelse og rensning af proteiner, har disse produkter med 10 bundet fase vist sig ikke at være tilstrækkelig stærke kationbyttere for visse proteiner, og derfor har adskillelsen og rensningen af sådanne proteiner været vanskelig eller umulig. Dette har især været tilfældet ved adskillelse og rensning af proteiner med lave iso-15 elektriske punkter, dvs. under ca. 5. F.eks. giver de nævnte bundne faser ikke en tilstrækkeligt acceptabel adskillelse og rensning af sådanne proteiner som f.eks. ovalbumin og kvægserumalbumin.

Det er derfor særdeles ønskeligt at tilvejebringe 20 faste produkter med bundet fase, der vil muliggøre en passende adskillelse af proteiner med isoelektriske punkter på under ca. 5 og er stærke kationbyttere for visse proteiner. Desuden er det særdeles ønskeligt at tilvejebringe sådanne faste produkter med bundet fase, der i det væsentlige er 25 fuldstændigt ladede ved forskellige pH-værdier fra 2 og derover, og som giver en større grad af selektivitet end hidtil muligt. Endvidere vil det være fordelagtigt at tilvejebringe faste produkter med bundet fase, der binder proteiner mere stærkt end hidtil og giver en højere 30 kapacitet ved indføring af SO^” grupper ved hver COO -placering. Endvidere vil det være særdeles fordelagtigt at tilvejebringe faste produkter med bundet fase, der binder proteiner med isoelektriske punkter på mindre end 5 på grund af sulfonsyregruppen og også binder proteiner med 35 isoelektriske punkter på over 5 på grund af de kombinerede bindingsstyrker af både sulfonsyre- og carboxylsyregruppen.

3 DK 173805 B1

Det har nu vist sig, at imino- og aminofunktionerne af de ovennævnte produkter med bundet fase af ikke-tværbundet covalent bundet PEI-PrSi-silicagel og PEI-PrSi-CPG ifølge US patentskrift nr. 4.540.486 kan N-acyleres, og at 5 de N-acylerede reaktionsprodukter kan omsættes yderligere med et vandopløseligt hydrogensulfit, såsom kalium- eller natriumhydrogensulfit eller et vandopløseligt hydrogen-sulfit-forstadie til dannelse af sulfonsyrederivater af silica-produkter med bundet fase af acyleret polyethylen-10 imin, der er anvendelige som faste faser til adskillelse og rensning af proteiner, især proteiner med lavt isoelek-trisk punkt.

Sulfonsyrederivaterne af silica-produkterne med bundet fase af acyleret polyethylenimin ifølge opfindelsen 15 har formlen:

i » ! S

£-0-Si-CH2CH2CH2-N-CH C-ONa i Uo Uo i il

20 I I I

(CH2)q (CH2)q (I) R-C-SC>3Na R-C-S03Na

Ri-CH-C-ONa R^-CH-C-ONa

II II

25 o o hvori ζ er grundlaget af et silicagel- eller glasmateriale, 30 > n er et sådant helt tal, at polyethyleniminopropyl-silangruppen har en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 400 til ca. 1800, q er et helt tal på 0 eller 1, R betyder hydrogen, —fCH2>^ H eller —C00H' x er et helt 35 tal på 1 eller 2, og m er et helt tal på 0 eller 1, og, 4 DK 173805 B1 når R betyder hydrogen eller H, R1 betyder —COOH, hvori p betyder et helt tal på 0 eller 1, og, når R betyder—COOH, R1 betyder hydrogen eller H hvori y betyder et helt tal på 0 eller 1. Glasset 5 er fortrinsvis glas med kontrolleret porestørrelse (CPG).

Sulfonsyrederivaterne ifølge opfindelsen fremstilles let ud fra produkterne med bundet fase af ikke-tværbundet covalent bundet PEI-PrSi-silicagel og PEI-PrSi-CPG ifølge det ovennævnte US patentskrift nr.

10 4.540.486 ved N-acylering af disse med et acyleringsmiddel,

som er en syre med formlen R

R1 - CH = C—frCH24g-COOH (II) 15 eller syreanhydridet eller syrehalogeniderne deraf, hvori q, R og R1 har den ved formel I angivne betydning, til dannelse af N-acylerede PEI-PrSi-silicagel- og N-acylerede PEI-PrSi-CPG-reaktionsprodukter med formlen 20 I _

>0 OR

> i H i >-0-Si-CH2CH2CH2-N-fCH2CH2N)n-C—frCH2tq-c * CH-R1

>1 I I

>0 c = o c = o

I i I

(CH2)q (CH2)q 25 , q I ^

R-C R-C

R^-CH Ri-CH t^11) 30 hvori n, q, R og R1 har den ved formel I angivne betydning.

De N-acylerede reaktionsprodukter med formlen III omsættes derefter med et vandopløseligt hydrogensulfit eller en vandopløselig hydrogensulfitdannende reaktant (et 35 natriumhydrogensulfit-forstadium), såsom natriummetabisulfit, i nærværelse af en oxygenkilde, til indføring af en sulfon- 5 DK 173805 B1 syregruppe på acylfunktionen og derved dannelse af de hidtil ukendte sulfonsyrederivater med formlen I ifølge opfindelsen.

Andelen af nitrogen i de reagerende udgangsmaterialer 5 af PEI-PrSi-silicagel eller PEI-PrSi-CPG, som let kan bestemmes ved konventionel elementæranalyse, viser den relative kombinerede andel af imino- og aminofunktioner på PEI-delen. Der anvendes tilstrækkeligt med acylerings-middel til omsætning med i det væsentlige alle imino-10 og aminofunktioner på PEI-delen. I almindelighed gennemføres N-acyleringstrinnet let med en ækvivalent mængde eller et let overskud af acyleringsmidlet i et inddifferent aprotisk organisk opløsningsmiddel. Typiske aprotiske opløsningsmidler omfatter aromatiske carbonhydrider, såsom benzen, toluen 15 og xylen, ethere, såsom tetrahydrofuran og dioxan, og ali-phatiske carbonhydrider, såsom hexan og heptan. En ækvivalent mængde eller et let overskud af et syrebindende middel, f.eks. en tertiær amin, fortrinsvis en tertiær alkylamin, kan fordelagtigt anvendes til at 20 binde syren, som frigøres under acyleringsreaktionen, når der anvendes acylhalogenider.

Typiske acyleringsmidler omfatter syrer og syreanhydrider og syrehalogenider, især syrechlorider, af syrerne med formlen II, f.eks. maleinsyre, fumarsyre, 25 mesaconsyre, citraconsyre, glutaconsyre og itaconsyre.

Særlig foretrukne som acyleringsmidler er anhydriderne af disse syrer, især maleinsyreanhydrid.

I overensstemmelse hermed tilvejebringes der ifølge opfindelsen for det første en ikke-tværbundet polyethylen-30 iminfunktion (PEI), der er covalent bundet til silicagel eller glas via en propylsilylbinding (PrSi), hvor i det væsentlige alle, dvs. mere end 80% og fortrinsvis mere end 95%, af imino- og aminofunktionerne af PEI-delen er acyleret med en acylfunktion, og acylfunktionerne derefter er omsat 35 med en hydrogensulfitdanneride reaktant til dannelse af sulfonsyrederivaterne ifølge opfindelsen.

6 DK 173805 B1

Omsætningen af de N-acylerede PEI-PrSi-silicagel-og N-acylerede PEI-PrSi-CPG-reaktionsprodukter med hydrogensulfit eller et hydrogensulfit-forstadium gennemføres i nærværelse af en oxygenkilde, såsom oxygen, luft, 5 kaliumpersulfat, benzoylperoxid og lignende.

Silicagelen og glasset, som danner grundlaget af de faste silicaprodukter med bundet fase ifølge opfindelsen er silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på ca. 1 til ca. 70 Mm og en gennemsnitlig pore-10 størrelse på fra ca. 0, fortrinsvis ca. 50, til ca.

1000 A, eller glas, fortrinsvis partikelformigt glas med kontrolleret porestørrelse og med en gennemsnitlig partikeldiameter på ca. 37 til ca. 177 μπι og en gennemsnitlig porestørrelse på fra ca. 0, fortrinsvis ca. 40, 15 til ca. 1000 A, med polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 400 til ca. 1800.

Sulfonsyrederivaterne af produkterne med bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel eller PEI-PrSi-CPG med formlen I udgør hidtil ukendte og nyttige bundne faser 20 til rensning og adskillelse af proteiner ved søjlechromato-grafi og er særlig egnede i moderne HPLC-udstyr. Pakningen kan have forskellige partikelstørrelser, f.eks. fra ca.

50 til ca. 600 mesh.

De foretrukne sulfonderivater af produkter med 25 bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel med formlen I

er sådanne, der fås ved omsætning af partikelformig silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 5 til ca.

40 Mm og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 50 til ca. 330 A og polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med 30 en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 400 til ca. 600, og sådanne, der fås ud fra partikelformig silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på ca. 40 til ca. 62 Mm og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 250 til ca.

500 A og polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med en' 35 gennemsnitlig molekylvægt på ca. 1000.

7 DK 173805 B1

Det antages, at de her omhandlede sulfonsyrederivater af produkter med bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel og PEI-PrSi-CPG med formlen I adskiller proteiner på basis af både svag og stærk ionisk vekselvirkning. De klare 5 fordele ved adskillelsen af proteiner med de her omhandlede produkter vurderes som overraskende og usædvanlige, fordi i øjeblikket tilgængelige chromatografiske matrixer, der adskiller på denne basis, generelt giver brede toppe med ringe selektivitet, har ringe stabilitet, lav kapa-10 citet og giver ikke-kvantitativ udvinding af proteiner.

I modsætning hertil giver de chromatografiske matrixer ifølge opfindelsen skarpe, veldefinerede toppe med god selektivitet, er særdeles stabile, har høj kapacitet og udviser kvantitativ udvinding af både proteinmasse og, når 15 der er tale om enzymseparation, uden væsentligt tab af enzymaktivitet.

Desuden er det med de her omhandlede produkter med bundet fase muligt at ændre de relative elueringsprofiler af forskellige proteinblandinger ved at ændre puffersammen-20 sætningen og ændre puffer-pH-værdien.

Den foreliggende opfindelse er yderligere overraskende, idet man normalt ville forvente, at de beskrevne chromatografiske matrixer er hydrolytisk ustabile i vandige mobile faser med høj ionstyrke, der anvendes til chromatografi 25 med hydrofobisk vekselvirkning, på grund af de iboende opløselighedskarakteristika af silica i sådanne vandige opløsninger med høj ionstyrke. Man ville således normalt forvente, at anvendelsen af matrixer på silica-basis nødvendigvis ville medføre korte søjle-levetider. Imidlertid er det 30 modsatte tilfældet med de her omhandlede sulfonsyrederivater af produkter med bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-sili-cagel og PEI-PrSi-CPG med formlen I.

Desuden har sulfonsyrederivaterne af produkterne med bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel og 35 PEI-PrSi-CPG med formlen I den fordel, at de giver en større grad af selektivitet ved proteinseparation og 8 DK 173805 B1 -rensning, binder proteiner stærkere og giver højere kapacitet af søjler, hvori de anvendes som pakning. Endvidere er disse produkter med formlen I i det væsentlige fuldstændig ladede ved pH-værdier fra ca. 2 og derover og 5 er tilstrækkelig stærke kationbyttere til, at de let kan anvendes til adskillelse og rensning af proteiner med lave isoelektriske punkter, dvs. under ca. 5, især sådanne proteiner som ovalbumin og kvægserumalbumin.

En anden fordel ved produkterne med bundet fase 10 med formlen I er, at sådanne bundne faser let tillader ændring af pH-værdien af puffersystemet, der anvendes i proteinseparations - og -rensningstrinnene.

De N-acylerede PEI-PrSi-silicagel- og N-acylerede PEI-PrSi-CPG-reaktionsprodukter med formlen III er også 15 hidtil ukendte produkter med bundet fase, der finder anvendelse som mellemprodukter til fremstilling af sul-fonsyrederivaterne med formlen I.

I de følgende eksempler anvendes PEI-PrSi-silicagel og PEI-PrSi-CPG, fremstillet som beskrevet i de følgende 20 fremstillingseksempler, som udgangsmaterialer, og det vil forstås, at de nævnte udgangsmaterialer kun er eksempelvise, og at andre bundne faseraf PEI-PrSi-silicagel eller PEI-PrSi-CPG, ifølge den foregående beskrivelse og det ovennævnte US patentskrift nr. 4.540.486, kan anvendes i 25 de følgende eksempler til dannelse af andre sulfonsyre-derivater med formlen I ifølge opfindelsen.

Fremstillingseksempel A PEI-PrSi-silicagel 30 Til 100 g silicagel med en gennemsnitlig partikel diameter på 40 μιη og en gennemsnitlig porestørrelse på 250 A sættes under omrøring 500 ml propanol og 49,5 g (47,1 ml) polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 500, og blandingen hen-35 stilles ved stuetemperatur i ca. 48 timer. Derpå vakuumfiltreres reaktionsblandingen, og filtratet 9 DK 173805 B1 vaskes med 2 x 400 ml 2-propanol og 2 x 400 ml methanol og ovntørres derefter ved ca. 80°C i ca. 4 timer.

Produktet genopslæmmes i 500 ml deioniseret vand, hvorefter det igen filtreres og vaskes flere gange med methanol 5 og derpå ovntørres endnu engang ved ca. 80°C i ca. 4 timer, hvorved der fås ca. 95,5 g covalent bundet PEI-PrSi-silicagel-produkt. Analyse: 5,08% C, 1,43% H og 2,22% N.

Fremstillingseksempel B 10 PEI-PrSi-silicagel

Til 100 g silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på ca. 5,25 μιη og en gennemsnitlig porestørrelse på ca. 330 Å sættes 500 ml toluen, 2 ml vand og 50 ml af en 50 vægtprocents isopropanolopløsning af polyethylen-15 iminopropyl-trimethoxysilan med en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 500, og blandingen omrøres og henstilles ved stuetemperatur i ca. 48 timer. Blandingen filtreres derefter, og filtratet vaskes med 2 x 500 ml toluen og 2 x 500 ml methanol, hvorefter det ovntørres ved ca. 80°C i ca.

20 2 timer og 45 minutter. Produktet genopslæmmes i vand, filtreres, vaskes med vand og methanol og ovntørres igen ved ca. 80°C i ca. 1 1/2 time. Udbytte: 93,0 g.

Analyse: 3,31% C, 1,30% H og 1,25% N.

25 Fremstillingseksempel C PEI-PrSi-CPG

Til en opslæmning af 10 g glas med kontrolleret porestørrelse og med en gennemsnitlig partikeldiameter på 125 Mm og en gennemsnitlig porestørrelse på 240 A i 30 50 ml hexan sættes 19,71 g af en 50 vægtprocents isopropa nolopløsning af polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med en gennemsnitlig molekylvægt på 500. Blandingen omrøres i 5 minutter ved stuetemperatur og opvarmes derefter til tilbagesvaling i ca. 2 timer. Blandingen 35 får lov at afkøle til stuetemperatur, filtreres og vaskes to gange med 50 ml hexan og to gange med 50 ml methanol.

10 DK 173805 B1

Filtratet ovntørres derefter ved ca. 80°C i ca. 3 timér til dannelse af det covalent bundne, ikke-tværbundne PEI-PrSi-CPG-produkt.

Opfindelsen illustreres i de følgende eksempler.

5

Eksempel 1

Til 50 g PEI-PrSi-silicagel-produkt fra fremstillingseksempel A i 250 ml toluen sættes 20 g maleinsyre-anhydrid under omrøring. Reaktionsblandingen opvarmes til 10 ca. 65°C i 4 1/2 time. Reaktionsproduktet filtreres, vaskes tre gange med methanol og ovntørres derefter ved ca. 80°C i ca. 1 1/2 time. Udbytte: 57,7 g. Analyse: 8,78% C, 1,47% H, 2,13% N. Titer: 0,65 mval/g. 20 g af dette reaktionsprodukt og 13 ml IN natriumhydroxidopløsning 15 blandes derefter med 9,5 g natriummetabisulfit i 100 ml vand og blandes grundigt. Reaktionsblandingen anbringes under luftens adgang i et bad med en temperatur på ca.

80°C i ca. 6 timer. Reaktionsproduktet frafiltreres, vaskes to gange med vand og to gange med methanol og 20 anbringes i en ovn ved ca. 80°C i ca. 3 1/2 time til tørring. Udbytter 20,62 g. Analyse: 7,26% C, 1,56% H, 1,94% N, 2,03% S. Titer: 0,634 mval/g sulfonsyre.

Eksempel 2 25 Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men anvendes 50 g af PEI-PrSi-silicagel-produktet fra fremstillingseksempel B i stedet for PEI-PrSi-silicagel--produktet fra fremstillingseksempel A til dannelse af det tilsvarende sulfonsyrederivat af N-acetyleret PEI-PrSi-30 -silicagel.

Eksempel 3

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men anvendes en ækvivalent mængde af PEI-PrSi-CPG-produktét fra 35 fremstillingseksempel C i stedet for PEI-PrSi-silicagel- -produktet fra fremstillingseksempel A til dannelse af det tilsvarende sulfonsyrederivat af N-acyleret PEI-PrSi-CPG.

11 DK 173805 B1

Eksempel 4

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men anvendes en ækvivalent mængde citraconsyreanhydrid i stedet for maleinsyreanhydrid til dannelse af det til-5 svarende sulfonsyrederivat af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel.

Eksempel 5

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men anvendes en ækvivalent mængde glutaconsyreanhydrid i 10 stedet for maleinsyreanhydrid til dannelse af det til svarende sulfonsyrederivat af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel.

Eksempel 6

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men 15 anvendes en ækvivalent mængde itaconsyreanhydrid i stedet for maleinsyreanhydrid til dannelse af det tilsvarende sulfonsyrederivat af N-acyleret PEI-frSi-silicagel.

Eksempel 7 20 En standard-analysesøjle (indvendig diameter 4,6 mm, længde 250 mm) opslæmningspakkes ved højt tryk (ca. 530 kg/cm2) med sulfonsyrederivatet af PEI-PrSi--silicagel (ca. 40 pm, ca. 250 A) fremstillet ifølge eksempel 1 som den bundne fase. Opslæmningen består af 25 3,0 g af sulfonsyrederivatet af PEI-PrSi-silicagel i 25 ml methanol. Efter indpumpning af opslæmningen i søjlen pumpes der yderligere 100 ml methanol gennem søjlen ved samme tryk. Søjlen forbindes med en højtryksvæskechromatograf, og en 500 mM opløsning af natriumacetat med en 30 pH-værdi på 7 pumpes gennem søjlen med en hastighed på 1 ml/minut med et tryk på ca. 85 kg/cm , indtil der observeres en konstant basislinie ved 280 nm. En 25 mM opløsning af kaliumdihydrogenphosphat med en pH-værdi på 6 pumpes derefter gennem søjlen med ca. samme 35 hastighed, indtil der opnås en konstant basislinie.

12 DK 173805 B1 100 μΐ af en opløsning af en proteinblanding opløst i pufferen A med lavt saltindhold, der udgøres af 25 mM kaliumdihydrogenphosphat, indsprøjtes i søjlen, og proteinkomponenterne elueres ved at forøge saltkoncen-5 trationen til 500 mM natriumacetat, pH-værdi 7 (puffer B) i løbet af 30 minutter ved en hastighed på 1 ml/minut. Blandingen af proteiner indeholder 500 pg cytochrom C, 500^ug hæmoglobin,. 500^,ug lysozym og 500 ug ovalbumin. Hvert protein elueres som et koncentreret bånd, der er godt adskilt fra de 10 andre. De typiske masseudbytter for de enkelte proteiner er mere end 90% af den oprindelige mængde, f.eks.

97% af cytochrom C, 96% af hæmoglobin, 95% af lysozym og 95% af ovalbumin. Søjlen ifølge dette eksempel udviser ikke noget væsentligt tab af chromatografisk ydeevne, 15 selv efter 1000 timers chromatografisk anvendelse til proteinseparation.

Eksempel 8

En standard-analysesøjle (indvendig diameter 20 4,6 mm, længde 250 mm) opslæmningspakkes ved højt tryk 2 (ca. 30 kg/cm ) med sulfonderivatet af PEI-PrSi-silicagel (ca. 40 pm, ca. 300 A) fremstillet ifølge eksempel 1 som den bundne fase. Opslæmningen består af 3,0 g af sulfon-syrederivatet af PEI-PrSi-silicagel i 25 ml methanol.

25 Efter indpumpning i opslæmningen i søjlen pumpes der yder ligere 100 ml methanol gennem søjlen ved samme tryk.

Søjlen forbindes med en højtryksvæskechromatograf, og en 500 mM natriumacetatopløsning med en pH-værdi på 7 pumpes gennem søjlen med en hastighed på 1 ml/minut under 30 et tryk på ca. 85 kg/cm2, indtil der observeres en konstant basislinie ved 280 nm. En 25 mM kaliumdihydrogenphosphat-opløsning med en pH-værdi på 6 pumpes derefter gennem søjlen med ca. samme hastighed, indtil der opnås en konstant basislinie. 100 μΐ af en opløsning af et hybridom-35 celle-kulturmedium fortyndet fire gange i pufferen A med lavt saltindhold, der udgøres af 25 mM kaliumdihydrogenphos- DK 173805 B1 13 phatopløsning, indsprøjtes i søjlen' °9 proteinkompo-nenterne elueres ved at forøge saltkoncentrationen til 500 mM natriumacetat (puffer B) i løbet af 60 minutter ved en hastighed på 1 ml/minut. Antistoffet elueres med en 5 renhed på over 80% efter de øvrige proteinbestanddele.

35

Claims

14 DK 173805 B1 Patentkrav ;

1. Silicaprodukt med bundet fase, kendetegnet ved, at det har formlen

5 I 0 Z-0-Si-CH2-(-CH2-CH2-NY-)n-Y (la)

10 O i hvilken Z er grundlaget af et silicagel- eller glasmateriale, n er et helt tal fra 6 til 40 (eller har en gennemsnitsværdi i dette område), og Y er en tribasisk gruppe med form-15 len R R' I I -CO-(CH2)q-C-CH (Ib)

20. I Na03S COONa i hvilken q er 0 eller 1, og én af R og R' er H, CH3 eller 25 C2H5, og den anden er C00H eller CH2COOH.

2. Produkt ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Z er en silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på fra 3 til 70 μτη og en gennemsnitlig porestørrelse på fra 5 til 100 nm, eller partikelformigt glas med kontrol- 30 leret porestørrelse og med en gennemsnitlig partikeldiameter på fra 3 7 til 177 μπι og en gennemsnitlig porestørrelse på fra 4 til 100 nm.

3. Produkt ifølge krav 2, kendetegnet ved, at Z er partikelformig silicagel med en gennemsnitlig 35 partikeldiameter på fra 5 til 40 /m og en gennemsnitlig porestørrelse på fra 5 til 33 nm, og n er et helt tal med en gennemsnitsværdi på fra 7 til 12.

4. Produkt ifølge krav 2, kendetegnet ved, at Z er partikelformig silicagel med en gennemsnitlig 40 partikeldiameter på fra 40 til 62 μιη og en gennemsnitlig porestørrelse på fra 21 til 52 nm, og n er et helt tal med en gennemsnitsværdi på fra 21 til 40. DK 173805 B1 15

5. Produkt ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at q er 0, R er H eller CH3, og R' er COOH.

6. Produkt ifølge ethvert af kravene 1-4, k e n -5 detegnet ved, at q er 1, R er H, og R' er COOH.

7. Produkt ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at q er 0, R er CH2COOH, og R1 er H.

8. Chromatografisk søjle, kendetegnet ved, at den er pakket med et produkt ifølge ethvert af de 10 foregående krav.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et produkt ifølge ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at man omsætter en covalent bundet ikke-tværbundet polyethylenimi-nopropyl-silicagel eller et ikke-tværbundet polyethylenimi- 15 nopropyl-glas med formlen (la) i krav 1 med et acylerings-middel med formlen R i , λ

20 R'-CH=C-(CH2)q COOH (Ic) eller et syreanhydrid eller syrehalogenid deraf, hvori q, R og R' har den i krav 1 angivne betydning, og om ønsket omsætter det fremkomne reaktionsprodukt 25 0 Z-0-Si-CH2- (-CH2-CH2-NY-)n-Y da' ) ,

30 I 0 hvori Y er en umættet gruppe med formlen 35 R -CO-(CH2)q-C=CH-R' (Ila), 40 hvor q er R'har den i krav 1 angivne betydning, med et vandopløseligt hydrogensulfit eller en precursor derfor i nærværelse af en oxygenkilde. 16 DK 173805 B1

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at acyleringsmidlet er maleinsyreanhydrid, og at den vandopløselige hydrogensulfit-precursor er natriummeta-bisulfit.

11. Mellemprodukt til fremstilling af produktet med formlen (la) ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen

10 I 0 Z-O-Si-CH2-(-CH2-CH2-NY-)n-Y (la' )

15 O i hvilken Z og n har den i krav 1 angivne betydning, og Y er en umættet gruppe med formlen 20 R R' I I -CO- (CH2) q-C=CH (Ha) 25 i hvilken q, R og R' har den i krav 1 angivne betydning.