DK173826B1 - Fast-fase-ekstraktionsproces til rensning og fraskillelse af protein fra en prøve - Google Patents

Description

DK 173826 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fast-fase-eks-traktionsproces til rensning og fraskillelse af protein fra en prøve, især proteiner med et isoelektrisk punkt på under ca. 5, og denne proces er ejendommelig ved det i krav l's 5 kendetegnende del angivne, idet foretrukne udførelsesformer for processen er angivet i krav 2-9.

Silicaproduktet med bundet fase, en fremgangsmåde og et mellemprodukt til fremstilling deraf samt en chromatogra-fisk søjle pakket med produktet er genstand for DK-PA 1987 10 01140. _____

Alpert og Regnier, J. Chromatogr. 185, 375-392, (1979) har vist, at polyethylenimin (PEI) kan adsorberes til silica-overflader, hvorved der tilvejebringes tilstrækkeligt med primære og sekundære iminogrupper på 15 tilstødende adsorberede PEI-molekyler til, at de kan tværbindes af polyfunktiorielle oxiraner til et polymert lag.

Fornylig er adskillelsen af syntetiske oligo-nucleotider ved højtryksvæskechromatografi (HPLC) med 20 søjler af mikropartikelformigt silica overtrukket med tværbundet polyethylenimin blevet beskrevet i litteraturen af T.G. Lawson et al., Anal. Biochem. 133, 85-93 (1983).

Senere er hidtil ukendte produkter med bundet fase af covalent bundet polyethyleniminopropyl-trimethoxy-25 silan-silicagel (PEI-PrSi-silicagel) og polyethylenimino- propyl-trimethoxysilan - (glas med kontrolleret porestørrelse) (PEI-PrSi-CPG) blevet beskrevet i US patentskrift nr.

4.540.486 som anvendelige til adskillelse og analyse af proteinblandinger.

30 Da de ovennævnte ikke-tværbundne covalent bundne PEI-PrSi-silicagel- og PEI-PrSi-CPG-produkter udgør grundlaget, der skal N-acyleres, skal der henvises til det nævnte US patentskrift nr. 4.540.486 i sin helhed.

Selvom de nævnte PEI-PrSi-silicagel- og PEI-PrSi-CPG-35 -produkter har vist sig at være ganske anvendelige som faste faser til søjlepakning ved væskechromatografi til adskil- 2 DK 173826 B1 lelse og rensning af proteiner, har disse produkter med bundet fase vist sig ikke at være tilstrækkelig stærke kationbyttere for visse proteiner, og derfor har adskillelsen og rensningen af sådanne proteiner været 5 vanskelig eller umulig. Dette har især været tilfældet ved adskillelse og rensning af proteiner med lave iso-elektriske punkter, dvs. under ca. 5. F.eks. giver de nævnte bundne faser ikke en tilstrækkeligt acceptabel adskillelse og rensning af sådanne proteiner som f.eks.

10 ovalbumin og kvægserumalbumin.

Det har derfor været særdeles ønskeligt at tilvejebringe faste produkter med bundet fase, der vil muliggøre en passende adskillelse af proteiner med isoelektriske punkter på under ca. 5 og er stærke kationbyttere for visse 15 proteiner. Desuden har det været særdeles ønskeligt at tilvejebringe sådanne faste produkter med bundet fase, der i det væsentlige er fuldstændigt ladede ved forskellige pH-værdier fra 2 og derover, og som giver en større grad af selektivitet end hidtil muligt. Endvidere har det været 20 fordelagtigt at tilvejebringe faste produkter med bundet fase, der binder proteiner mere stærkt end hidtil og giver en højere kapacitet ved indføring af SO3" grupper ved hver COO"-placering. Endvidere har det været særdeles fordelagtigt at tilvejebringe faste produkter med bundet fase, der binder 25 proteiner med isoelektriske punkter på mindre end 5 på grund af sulfonsyregruppen og også binder proteiner med isoelektriske punkter på over 5 på grund af de kombinerede bindingsstyrker af både sulfonsyre- og carboxylsyregruppen.

Det har nu vist sig, at imino- og aminofunktionerne 30 af de ovennævnte produkter med bundet fase af ikke-tværbundet covalent bundet PEI-PrSi-silicagel og PEI-PrSi-CPG ifølge US patentskrift nr. 4.540.486 kan N-acyleres, og at de N-acylerede reaktionsprodukter kan omsættes yderligere med et vandopløseligt hydrogensulfit, såsom kalium- eller 35 natriumhydrogensulfit eller et vandopløseligt hydrogen-sulfit-forstadie til dannelse af sulfonsyrederivater af DK 173826 B1 3 silica-produkter med bundet fase af acyleret polyethylen-imin, der er anvendelige som faste faser til adskillelse og rensning af proteiner, især proteiner med lavt isoelek-trisk punkt.

5 Sulfonsyrederivaterne af silica-produkterne med bundet fase af acyleret polyethylenimin har formlen: > ή O SO^Na 0

> \ II I II

10 S-O-Si-CHoCHoCHo-N-frCH2CH2Ntn-C-fCH2-hjrC-CH—-C-ONa > I I I II, ^ O c = O C = O R Rx

I i I

(CH2)σ (CH2)q

\ \ <D

R-C-SC^Na R-C-S03Na

15 . I Ί I

R3--CH-C-ONa Rl-CH-C-ONa II il o o 20 ? hvori C er grundlaget af et silicagel- eller glasmateriale, n er et sådant helt tal, at polyethyleniminopropyl-silangruppen 25 har en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 400 til ca. 1800, q er et helt tal på 0 eller 1, R betyder hydrogen, —H eller —COOH, hvori x er et helt tal på 1 eller 2, og m er et helt tal på 0 eller 1, og, når R betyder hydrogen ellerH, betyder R3· 30 ——-COOH, hvori p betyder et helt tal på 0 eller 1,

4 P

og, når R betyder—COOH, betyder RA hydrogen eller H hvori y betyder et helt tal på 0 eller 1. Glasset er fortrinsvis glas med kontrolleret porestørrelse (CPG).

Sulfonsyrederivaterne fremstillet let ud fra produk-35 terne med bundet fase af ikke-tvaerbundet covalent bundet

PEI-PrSi-silicagel og PEI-PrSi-CPG ifølge det ovennævnte US

4 DK 173826 B1 patentskrift nr. 4.540.486 ved N-acylering af disse med et acyleringsmiddel, som er en syre med formlen

R

R1 - CH * C—(CH,f—COOH (II) 5 9 eller syreanhydridet eller syrehalogeniderne deraf, hvori q, R og har den ved formel I angivne betydning, til dannelse af N-acylerede PEI-PrSi-silicagel- og N-acylerede PEI-PrSi-CPG-reaktions produkter med formlen:

is I I I

(CH2)<t (CH2)q

I I

R-C R-C

, I . II

R^-CH Ri-CH 'THI) 20 hvori n, q, R og R1 har den ved formel I angivne betydning.

De N-acylerede reaktionsprodukter med formlen III omsættes derefter med et vandopløseligt hydrogensulfit eller 25 en vandopløselig hydrogensulfitdannende reaktant (et natriumhydrogensulfit-forstadium) , såsom natriummetabisulfit, i nærværelse af en oxygenkilde, til indføring af en sulfon-syregruppe på acylfunktionen og derved dannelse af de hidtil ukendte sulfonsyrederivater med formlen I .

30 Andelen af nitrogen i de reagerende udgangsmaterialer af PEI-PrSi-silicagel eller PEI-PrSi-CPG, som let kan bestemmes ved konventionel elementæranalyse, viser den relative kombinerede andel af imino- og aminofunktioner på PEI-delen. Der anvendes tilstrækkeligt med acylerings-35 middel til omsætning med i det væsentlige alle imino- DK 173826 B1 5 og aminofunktioner på PEI-delen. I almindelighed gennemføres N-acyleringstrinnet let med en ækvivalent mængde eller et let overskud af acyleringsmidlet i et inddifferent aprotisk organisk opløsningsmiddel. Typiske aprotiske opløsningsmidler 5 omfatter aromatiske carbonhydrider, såsom benzen, toluen og xylen, ethere, såsom tetrahydrofuran og dioxan, og ali-phatiske carbonhydrider, såsom hexan og heptan. En ækvivalent mængde eller et let overskud af et syrebindende middel, f.eks. en tertiær amin, fortrinsvis en 10 tertiær alkylamin, kan fordelagtigt anvendes til at binde syren, som frigøres under acyleringsreaktionen, når der anvendes acylhalogenider.

Typiske acyleringsmidler omfatter syrer og syreanhydrider og syrehalogenider, især syrechlorider, 15 af syrerne med formlen II, f.eks. maleinsyre, fumarsyre, mesaconsyre, citraconsyre, glutaconsyre og itaconsyre.

Særlig foretrukne som acyleringsmidler er anhydriderne af disse syrer, især maleinsyreanhydrid.

I overensstemmelse hermed er der tilvejebragt for 20 det første en ikke-tværbundet polyethyleniminfunktion (PEI), der er covalent bundet til silicagel eller glas via en pro-pylsilylbinding (PrSi), hvor i det væsentlige alle, dvs. mere end 80% og fortrinsvis mere end 95%, af imino- og ami-nofunktionerne af PEI-delen er acyleret med en acylfunktion, 25 og acylfunktionerne derefter er omsat med en hydrogensulfit-dannende reaktant til dannelse af sulfonsyrederivaterne.

Omsætningen af de N-acylerede PEI-PrSi-silicagel-og N-acylerede PEI-PrSi-CPG-reaktionsprodukter med hydrogensulfit eller et hydrogensulfit-forstadium gennem-30 føres i nærværelse af en oxygenkilde, såsom oxygen, luft, kaliumpersulfat, benzoylperoxid og lignende.

Silicagelen og glasset, som danner grundlaget af de faste silica-produkter med bundet fase er silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på ca. 1 til ca. 70 μτη og en 35 gennemsnitlig porestørrelse på fra ca. 0, fortrinsvis ca.

50, til ca. 1000 Å, eller glas, fortrinsvis partikelformigt DK 173826 B1 6 glas med kontrolleret porestørrelse og med en gennemsnitlig partikeldiameter på ca. 37 til ca. 177 μτα og en gennemsnitlig porestørrelse på fra ca. 0, fortrinsvis ca. 40, til ca.

1000 Å, med polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med en 5 Sulfonsyrederivaterne af produkterne med bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel eller PEI-PrSi-CPG med formlen I udgør hidtil ukendte og nyttige bundne faser til rensning og adskillelse af proteiner ved søjlechromato-grafi og er særlig egnede i moderne HPLC-udstyr. Pakningen 10 kan have forskellige partikelstørrelser, f.eks. fra ca.

50 til ca. 600 mesh.

De foretrukne sulfonderivater af produkter med bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel med formlen I er sådanne, der fås ved omsætning af partikelformig silicagel 15 med en gennemsnitlig partikeldiameter fra ca. 5 til ca.

40 Mm og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 50 til ca. 330 A og polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 400 til ca. 600, og sådanne, der fås ud fra partikelformig silicagel med 20 en gennemsnitlig partikeldiameter på ca. 40 til ca. 62 Mm og en gennemsnitlig porestørrelse fra ca. 250 til ca.

500 Å og polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med en' gennemsnitlig molekylvægt på ca. 1000.

Det antages, at de nye sulfonsyrederivater af produk-25 ter med bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel og PEI-PrSi-CPG med formlen I adskiller proteiner på basis af både svag og stærk ionisk vekselvirkning. De klare fordele ved adskillelsen af proteiner med de nye produkter vurderes som overraskende og usædvanlige, fordi i øjeblikket tilgæn-30 gelige chromatografiske matrixer, der adskiller på denne basis, generelt giver brede toppe med ringe selektivitet, har ringe stabilitet, lav kapacitet og giver ikke-kvantitativ udvinding af proteiner. I modsætning hertil giver de nye chromatografiske matrixer skarpe, veldefinerede toppe med god 35 DK 173826 B1 7 selektivitet, er særdeles stabile, har høj kapacitet og udviser kvantitativ udvinding af både proteinmasse og, når der er tale om enzymseparation, uden væsentligt tab af enzymaktivitet.

5 Desuden er det med de nye produkter med bundet fase muligt at ændre de relative elueringsprofiler af forskellige proteinblandinger ved at ændre puffersammensætningen og ændre puffer-pH-værdien.

Den foreliggende opfindelse er yderligere over-10 raskende, idet man normalt ville forvente, at de beskrevne chromatografiske matrixer er hydrolytisk ustabile i vandige mobile faser med høj ionstyrke, der anvendes til chromatografi med hydrofobisk vekselvirkning, på grund af de iboende opløselighedskarakteristika af silica i sådanne vandige 15 opløsninger med høj ionstyrke. Man ville således normalt forvente, at anvendelsen af matrixer på silica-basis nødvendigvis ville medføre korte søjle-levetider. Imidlertid er det modsatte tilfældet med de nye sulfonsyrederivater af produkter med bundet fase af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel og 20 PEI-PrSi-CPG med formlen I.

Desuden har anvendelsen af sulfonsyrederivaterne af produkterne med bundet fase af N-acylret PEI-PrSi-silicagel og PEI-PrSi-CPG med formlen I den fordel, at de giver en større grad af selektivitet ved proteinseparation og 25 -rensning, binder proteiner stærkere og giver højere kapacitet af søjler, hvori de anvendes som pakning. Endvidere er disse produkter med formlen I i det væsentlige fuldstændig ladede ved pH-værdier fra ca. 2 og derover og er tilstrækkelig stærke kationbyttere til, at de let kan 30 anvendes til adskillelse og rensning af proteiner med lave isoelektriske punkter, dvs. under ca. 5, især sådanne proteiner som ovalbumin og kvægserumalbumin.

En anden fordel ved anvendelse af produkterne med bundet fase med formlen I er, at sådanne bundne faser let 35 tillader ændring af pH-værdien af puffersysternet, der anvendes i proteinseparations- og rensningstrinnene.

DK 173826 B1 8

De N-acylerede PEI-PrSi-silicagel- og N-acylerede PEI-PrSi-CPG-reaktionsprodukter med formlen III er også hidtil ukendte produkter med bundet fase, der finder anvendelse som mellemprodukter til fremstilling af sul-5 fonsyrederivaterne med formlen I.

I de følgende eksempler 1-6 anvendes PEI-PrSi-sili-cagel og PEI-PrSi-CPG, fremstillet som beskrevet i de følgende fremstillingseksempler A-C, som udgangsmaterialer, og det vil forstås, at de nævnte udgangsmaterialer kun er eksem-10 pelvise, og at andre bundne faser af PEI-PrSi-silicagel eller PEI-PrSi-CPG, ifølge den foregående beskrivelse og det ovennævnte US patentskrift nr. 4.540.486, kan anvendes i de følgende eksempler til dannelse af andre sulfonsyrede-rivater med formlen I.

15

Fremstillinqseksempel A PEI-PrSi-silicagel

Til 100 g silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på 40 Mm og en gennemsnitlig porestørrelse på 20 250 Å sættes under omrøring 500 ml propanol og 49,5 g (47,1 ml) polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan med en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 500, og blandingen henstilles ved stuetemperatur i ca. 48 timer. Derpå vakuumfiltreres reaktionsblandingen, og filtratet 25 vaskes med 2 x 400 ml 2-propanol og 2 x 400 ml methanol og ovntørres derefter ved ca. 80°C i ca. 4 timer.

Produktet genopslæmmes i 500 ml deioniseret vand, hvorefter det igen filtreres og vaskes flere gange med methanol og derpå ovntørres endnu engang ved ca. 80°C i ca. 4 timer, 30 hvorved der fås ca. 95,5 g covalent bundet PEI-PrSi-silicagel-produkt. Analyse: 5,08% C, 1,43% H og 2,22% N.

Fremstillinqseksempel B PEI-PrSi-silicagel 35 Til 100 g silicagel med en gennemsnitlig partikel diameter på ca. 5,25 Mm og en gennemsnitlig porestørrelse DK 173826 B1 9 på ca. 330 Å sættes 500 ml toluen, 2 ml vand og 50 ml af en 50 vægtprocents isopropanolopløsning af polyethylen-iminopropyl-trimethoxysilan med en gennemsnitlig molekylvægt på ca. 500, og blandingen omrøres og henstilles ved stuetempe-5 ratur i ca. 48 timer. Blandingen filtreres derefter, og filtratet vaskes med 2 x 500 ml toluen og 2 x 500 ml methanol, hvorefter det ovntørres ved ca. 80°C i ca.

2 timer og 45 minutter. Produktet genopslæmmes i vand, filtreres, vaskes med vand og methanol og ovntørres igen 10 ved ca. 80°C i ca. 1 1/2 time. Udbytte: 93,0 g.

Analyse: 3,31% C, 1,30% H og 1,25% N.

Fremstillingseksempel C PEI-PrSi-CPG

15 Til en opslæmning af 10 g glas med kontrolleret porestørrelse og med en gennemsnitlig partikeldiameter på 125 Mm og en gennemsnitlig porestørrelse på 240 A i 50 ml hexan sættes 19,71 g af en 50 vægtprocents isopropanolopløsning af polyethyleniminopropyl-trimethoxysilan 20 med en gennemsnitlig molekylvægt på 500. Blandingen omrøres i 5 minutter ved stuetemperatur og opvarmes derefter til tilbagesvaling i ca. 2 timer. Blandingen får lov at afkøle til stuetemperatur, filtreres og vaskes to gange med 50 ml hexan og to gange med 50 ml methanol.

25 Filtratet ovntørres derefter ved ca. 80°C i ca. 3 timer til dannelse af det covalent bundne, ikke-tværbundne PEI-PrSi-CPG-produkt.

Eksempel 1 30 Til 50 g PEI-PrSi-silicagel-produkt fra frem stillingseksempel A i 250 ml toluen sættes 20 g maleinsyre-anhydrid under omrøring. Reaktionsblandingen opvarmes til ca. 65°C i 4 1/2 time. Reaktionsproduktet filtreres, vaskes tre gange med methanol og ovntørres derefter ved 35 ca. 80°C i ca. 11/2 time. Udbytte: 57,7 g. Analyse: DK 173826 B1 10 8,78% C, 1,47% H, 2,13% N. Titer: 0,65 mval/g. 20 g af dette reaktionsprodukt og 13 ml IN natriumhydroxidopløsning blandes derefter med 9,5 g natriummetabisulfit i 100 ml vand og blandes grundigt. Reaktionsblandingen anbringes 5 under luftens adgang i et bad med en temperatur på ca.

80°C i ca. 6 timer. Reaktionsproduktet frafiltreres, vaskes to gange med vand og to gange med methanol og anbringes i en ovn ved ca. 80°C i ca. 3 1/2 time til tørring. Udbytte: 20,62 g. Analyse: 7,26% C, 1,56% H, 1° 1,94% N, 2,03% S. Titer: 0,634 mval/g sulfonsyre.

Eksempel 2

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men anvendes 50 g af PEI-PrSi-silicagel-produktet fra 15 fremstillingseksempel B i stedet for PEI-PrSi-silicagel--produktet fra fremstillingseksempel A til dannelse af det tilsvarende sulfonsyrederivat af N-acetyleret PEI-PrSi--silicagel.

20 Eksempel 3

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men anvendes en ækvivalent mængde af PEI-PrSi-CPG-produktét fra fremstillingseksempel C i stedet for PEI-PrSi-silicagel--produktet fra fremstillingseksempel A til dannelse af det 25 tilsvarende sulfonsyrederivat af N-acyleret PEI-PrSi-CPG.

Eksempel 4

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men anvendes en ækvivalent mængde citraconsyreanhydrid i 30 stedet for maleinsyreanhydrid til dannelse af det tilsvarende sulfonsyrederivat af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel.

Eksempel 5

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men 35 anvendes en ækvivalent mængde glutaconsyreanhydrid i stedet for maleinsyreanhydrid til dannelse af det tilsvarende sulfonsyrederivat af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel.

DK 173826 B1 11

Eksempel 6

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men anvendes en ækvivalent mængde itaconsyreanhydrid i stedet for maleinsyreanhydrid til dannelse af det tilsvarende 5 sulfonsyrederivat af N-acyleret PEI-PrSi-silicagel.

Ekstraktionsprocessen ifølge den foreliggende opfindelse illustreres i de følgende to afsluttende eksempler 7 og 8.

10 Eksempel 7

En standard-analysesøjle (indvendig diameter 4,6 mm, længde 250 mm) opslæmningspakkes ved højt tryk (ca. 530 kg/cm2) med sulfonsyrederivatet af PEI-PrSi--silicagel (ca. 40 pm, ca. 250 Å) fremstillet ifølge 15 eksempel 1 som den bundne fase. Opslæmningen består af 3,0 g af sulfonsyrederivatet af PEI-PrSi-silicagel i 25 ml methanol. Efter indpumpning af opslæmningen i søjlen pumpes der yderligere 100 ml methanol gennem søjlen ved samme tryk. Søjlen forbindes med en højtryksvæskechromato-20 graf, og en 500 mM opløsning af natriumacetat med en pH-værdi på 7 pumpes gennem søjlen med en hastighed på 1 ml/minut med et tryk på ca. 85 kg/cm , indtil der observeres en konstant basislinie ved 280 nm. En 25 mM opløsning af kaliumdihydrogenphosphat med en pH-værdi 25 på 6 pumpes derefter gennem søjlen med ca. samme hastighed, indtil der opnås en konstant basislinie.

100 μΐ af en opløsning af en proteinblanding opløst i pufferen A med lavt saltindhold, der udgøres af 25 mM kaliumdihydrogenphosphat, indsprøjtes i søjlen, og 30 proteinkomponenterne elueres ved at forøge saltkoncentrationen til 500 mM natriumacetat, pH-værdi 7 (puffer B) i løbet af 30 minutter ved en hastighed på 1 ml/minut.

Blandingen af proteiner indeholder 500 pg cytochrom C, 500^ug hæmoglobin, 500^,ug lysozym og 500 ug ovalbumin. Hvert protein 35 elueres som et koncentreret bånd, der er godt adskilt fra de andre. De typiske masseudbytter for de enkelte proteiner 12 DK 173826 B1 er mere end 90% af den oprindelige mængde, f.eJcs.

97% af cytochrom C, 96% af hæmoglobin, 95% af lysozym og 95% af ovalbumin. Søjlen ifølge dette eksempel udviser ikke noget væsentligt tab af chromatografisk ydeevne, 5 selv efter 1000 timers chromatografisk anvendelse til proteinseparation.

Eksempel 8

En standard-analysesøjle (indvendig diameter 10 4,6 mm, længde 250 mm) opslæmningspakkes ved højt tryk (ca. -30 kg/cm^) med sulfonderivatet af PEI-PrSi-silicagel (ca. 40 μπι, ca. 300 Å) fremstillet ifølge eksempel 1 som den bundne fase. Opslæmningen består af 3,0 g af sulfon-syrederivatet af PEI-PrSi-silicagel i 25 ml methanol.

15 Efter indpumpning i opslæmningen i søjlen pumpes der yderligere 100 ml methanol gennem søjlen ved samme tryk.

Søjlen forbindes med en højtryksvæskechromatograf, og en 500 mM natriumacetatopløsning med en pH-værdi på 7 pumpes gennem søjlen med en hastighed på 1 ml/minut under 2 20 et tryk på ca. 85 kg/cm , indtil der observeres en konstant basislinie ved 280 nm. En 25 mM kaliumdihydrogenphosphat-opløsning med en pH-værdi på 6 pumpes derefter gennem søjlen med ca. samme hastighed, indtil der opnås en konstant basislinie. 100 μΐ af en opløsning af et hybridom-25 celle-kulturmedium fortyndet fire gange i pufferen A med lavt saltindhold, der udgøres af 25 mM kaliumdihydrogenphos-phatopløsning, indsprøjtes i søjlen, og proteinkomponenterne elueres ved at forøge saltkoncentrationen til 500 mM natriumacetat (puffer B) i løbet af 60 minutter ved 30 en hastighed på 1 ml/minut. Antistoffet elueres med en renhed på over 80% efter de øvrige proteinbestanddele.

35

Claims (9)

1. Fast-fase-ekstraktionsproces til rensning og fra-skillelse af protein fra en prove, kendetegnet 5 ved, at den faste fase er et silicaprodukt med bundet fase med formlen o ίο I Z-0-Si-CH2-(-CH2-CH2-NY-)n-Y (la) O 15 i hvilken Z er grundlaget af et silicagel- eller glasmateriale, n er et helt tal fra 6 til 40 (eller har en gennemsnitsværdi i dette område), og Y er en tribasisk gruppe med formlen 20 R R' I I -CO-(CH2)0-C-CH (Ib) 2. i i

25 Na03S COONa i hvilken q er 0 eller 1, og én af R og R' er H, CH3 eller C2H5, og den anden er COOH eller CH2COOH.

2. Proces ifølge krav 1, kendet egne t ved, at Z er en silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på fra 3 til 70 μπι og en gennemsnitlig porestørrelse på fra 5 til 100 nm, eller partikelformigt glas med kontrolleret porestørrelse og med en gennemsnitlig partikeldiameter på 35 fra 37 til 177 μτη og en gennemsnitlig porestørrelse på fra 4 til 100 nm.

3. Proces ifølge krav 2, kendetegnet ved, at Z er partikelformig silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på fra 5 til 40 μτη og en gennemsnitlig pores-40 tørrelse på fra 5 til 33 nm, og n er et helt tal med en gennemsnitsværdi på fra 7 til 12. ’ 4. Proces ifølge krav 2, kendetegnet ved, DK 173826 B1 at Z er partikelformig silicagel med en gennemsnitlig partikeldiameter på fra 40 til 62 μιη og en gennemsnitlig porestørrelse på fra 21 til 52 nm, og n er et helt tal med en gennemsnitsværdi på fra 21 til 40.

5. Proces ifølge ethvert af kravene 1-4, kende - tegnet ved, at q er 0, R er H eller CH3, og R' er COOH,

6. Proces ifølge ethvert af kravene 1-4, kende -tegnet ved, at q er 1, R er H, og R' er COOH.

7. Proces ifølge ethvert af kravene 1-4, kende -10 tegnet ved, at q er 0, R er CH2COOH, og R' er H.

8. Proces ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at proteinet har et isoelektrisk punkt på under 5.

9. Proces ifølge krav 1-7 eller 8, kendetegnet ved, at proteinet er ovalbumin eller okseserumalbumin.