KR890000985B1 - 이뮤노 글로부린 g의 정제 - Google Patents

이뮤노 글로부린 g의 정제 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

이뮤노 글로부린 G의 정제
본 발명에 따르면, 평균입경이 약 3 내지 약 70미크론이고 평균 기공도가 약 50 내지 약100옹스트롬 단위인 입자실리카겔 또는 평균 입경이 약 37 내지 약 177미크론 이고 평균기공도가 약 40 내지 약 100옹스트롬 단위인 입자조절된 기공 유리를 평균 분자량이 약 400 내지 약 1800인 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란과의 공유결합된 비가교 폴리에틸렌 이민 반응생성물의 카르복실화 형태를 크로마토그라피 또는 추출과정에서 고형상으로 이용하여 생물 유체로부터 실질적으로 정제된 이뮤노글로부린 G를 얻는다.
“모노클로날 항체의 정제”라는 제목의 플래쉬너(M.Flashner)의 미국특허 No. 4,469,630에는 상기한 공유 결합된 비가교 폴리에틸렌이민 반응생성물의 비카르복실화 형태를 사용하는 모노클로날 항체 IgG 형의 정제가 기술되어 있다. 현재 놀랍게도 상기 반응생성물의 카르복실화 형태는 양이온 교환 매트릭스를 형성하고 효과적으로, 선택적으로 IgG 항체를 결합하는데, 생물 유체에 존재한다는 것을 발견하였다. 또한, 미국특허 No. 4,469,630에 기술된 비카르복실화 음이온 교환 매트릭스는 대부분의 복수액(ascites fluid)단백질을 결합한 다음 선택적으로 IgG 항체를 분리시키는 한편, 여기에 사용된 카르복실화 양이온 교환 매트릭스는 대부분의 다른 단백질성 물질은 생물 유체에 미결합된채 두면서 IgG 항체를 주로 결합한다. 단백질이 본질상 같은 pH 범위에서 음이온성(양의 하전된)및 양이온성(음의 하전된)매트릭스 모두에 결합하게됨은 매우 이상하고 예측되지 않는 일이다.
본 발명을 상세히 기술하면 다음과 같다.
본 발명은, 바람직한 구체예에서, 비가교 공유결합 폴리에틸렌이민(PEI)기를 지닌 실리카겔 또는 조절된 기공유리(CPG)의 카르복실화 형태의 특수 고정 기공상 상에서 액체 컬럼 크로마토그라피를 이용하여 카르복실화 폴리에틸렌 이민 결합 실리카겔 또는 CPG 컬럼으로부터 약 pH 5.5 내지 약 pH 8.3의 수성 완충액으로 IgG 항체의 기울기 용리를 이용하여 이뮤노글로부린 G(IgG)항체를 그를 포함하는 생물 유체로부터 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 발명은 또한 고형상 추출 수단을 이용하여 고형상 매트릭스로서 상기 카르복실화 물질로 상기 IgG 항체를 생물 유체로부터 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
이후부터 때때로“카르복실화-PEI-PrSi-실리카겔”로서 일컫는 비가교 공유결합 폴리에틸렌이민기를 지니는 실리카겔의 특정한 카르복실화 형태와 편리상 이후부터 때때로“카르복실화-PEI-PrSi-CPG”로 일컫는 비가교 공유결합 폴리에틸렌이민기를 지니는 조절된 기공유리의 특정한 카르복실화 형태가 본 발명에 이용되는데, 휴 램슨(Hugh Ramsden)이 출원한 “폴리에틸렌이민결합 크로마트그라피 패킹”이라는 명칭의 동시에 계류중인 미국 특허 출원 일련번호355,368에 기술되어 있으며, 그 내용을 여기에 참고로 포함시킨다. 본 출원과의 관련 본문을 아래에 재현한다.
램슨의 미국특허 출원 355,368로부터의 발췌.
“본 발명의 비가교 공유결합된 PEI 실리카겔 및 유리제품은 다음 단계들에 따라 편리하게 제조된다 : A. 평균 입경이 약 3 내지 약 70미크론이고 평균 기공도가 약 50 내지 약 1000옹스트롬 단위인 입자실리카겔, 또는 평균 입경이 약 37 내지 177미크론 이고 평균 기공도가 약 40 내지 약 1000옹스트롬인 입자 조절된 기공유리를 비활성 유기용매 슬러리내에서 평균 분자량 약 400 내지 약 1800인 폴리에틸렌이미노 프로필 트리메톡시 실란의 저급 알칸올 용액과 반응시키는 단계, 이 반응은 주위 온도 내지 환류 온도에서 약 2 내지 약 50시간 동안 수행한다 ; B. 반응혼합물로부터 결과 고체분율을 회수하는 단계 ; 그리고 C. 상기 고체분율을 건조에 충분하고, 실간을 각각의 실리카겔 또는 조절된 충분하고, 실란을 각각의 실리카겔 또는 조절된 기공유리에 완전히 결합시키기에 충분한 온도와 시간으로 가열하는 단계.
여기서 사용한바, “공유결합”또는“공유결합된”이라는 말은 PEI기가 화학적 상호작용에 의하여 프로필-실릴(Pr-Si)결합을 가져오면서 실리카겔 또는 조절된 기공유리에 공유적으로 부착되어 있음을 의미한다. 그리고“비가교”라는 말은 인접 공유결합된 PEI 기 상의 이미노 및 아미노기가 가교되어 있지않거나 또는 가교제와 반응하지 않고 중합체층을 형성함을 의미한다. 그렇게 결합되지 않은채, 반응은 다음과 같이 두 단계로 진행하여 완결되는 것으로 생각된다.
단계 1 : 실리카 히드록실과 실란상의 메톡시기가 반응하여 Si-O-Si 결합과 유리메탄올을 형성하고 약간의 잔유 메톡시기는 미반응된체 남는다 :
Figure kpo00001
단계 2 : 잔유 메톡시기와의 반응의 완결은 열 숙성의 동안에 a)와 b)에 의해 실행된다 :
Figure kpo00002
Figure kpo00003
무정형 실리카로 구성되는 실리카겔은 불규칙한 구형의(바람직한)입자 형태로, 3 내지 325(ASTM)에 이르는 메시크기로 몇가지 상용품 등으로 시중 구입된다. 그러나, 메시크기의 숫자적인 표시에 의존하기 보다는 본 발명의 목적으로 더 정확한 표시는 각각, 약 3 내지 약 70미크론과 약 50 내지 약 1000, 바람직하게는 250-500옹스크롬 단위인 실리카겔 입자의 평균 직경 및 평균 기공도이다. HPLC 크로마토그라피 컬럼을 패킹하는 데에 있어 최종 생성물 사용에 대해서는 약 3 내지 약 10미크론의 실리카겔 출발 물질이 바람직하고 저압 크로마토그라피 컬럼을 패킹하는데는 약 40 내지 약 70미크론이 바람직하다.
조절된 기공유리(CPG)는 액체 크로마토그라피에 사용하기 위한 실리카와 화학적으로 유사한 지지물질을 포함하는 규산염인데, 37-177미크론의 표균입경과 40-1000옹스트롬, 바람직하게는 40-500옹스트롬의 평균기공도를 가진 것으로 예를 들어서, 피어스 사(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois)로부터 시중구입된다.
실리카겔 또는 CPG 슬러리를 제조하기에 적합한 비활성 유기용매 중에는 예를 들어서, 헥산, 헵탄등과 같은 지방족 탄화수소 ; 예를 들어서, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등과 같은 방향족 탄화수소 ; 예를들면, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등과 같은 저급 알칸올 ; 예를들면, 염화메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소 등과 같은 염소화 메탄(주의 : 이러한 클로로 용매는 고온에서 반응할 수 있다) ; 그리고 테트라히드로푸란, 글라임, 디글라임 등과 같은 다른 비활성 용매가 있다.
일반적으로, 실리카겔 또는 CPG 그램의 용매 밀리리터에 대해 1 : 5비율이 적합한 슬러리를 제공한다. 입자 실리카겔과 CPG의 미세하고 불용성인 성질로 인하여 진용액 보다는 슬러리가 얻어진다. (N-트리메톡시실릴프로필)-폴리에틸렌이민으로도 알려져 있는 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란은 폴리에틸렌이민과 아미노프로필트리 메톡시실란의 반응 생성물이며 다음 일반식으로 나타낼 수 있다 :
Figure kpo00004
상기식에서, 본 발명의 목적으로는 n은 약 4 내지 약 37의 정수이거나 또는 평균 분자량으로 표시한다면 약 400 내지 약 1800이다.
실란(Ⅰ)은 실란을 용해시키기에 충분한 알칸올을 사용하여 저급 C1-C6알칸올 용액의 형태로 실리카겔 또는 CPG와의 반응에 사용된다. 50퍼센트 w/w 이소프로판올 용액이 바람직하다. 일반적으로, 약 25-100그램 실란, 또는 다르게는 실란의 50퍼센트 w/w알칸올 용액 약 50-200ml를 사용하여 각각 100그램 실리카겔 또는 CPG와 반응시킨다. 반응용매 시스템의 환료온도까지의 상온이 반응속도를 높이기 위해 이용될 수 있으나 반응은 주위온도에서 행할 수 있다. 반응은 쉽게 진행하여 2-50 시간내에 실질적으로 완결된다(단계 1) 반응물질의 혼합의 동안에 교반이 유리하게 사용되나 반응은 그후 더 이상의 교반이 없이도 계속될 수 있다. 무수의 조건은 중대하지 않은데 예를들어서 슬러리 용매 50ml당 약 0.1-1.0ml의 소량의 물의 존재는 불리하게 반응에 영향을 미치지는 않는다. 결과된 고형 분율을 예로써, 여과, 원심분리등의 종래의 물리적 수단에 의해 반응 혼합물로부터 회수한다. 일반적으로, 5미크론의 입도를 유지하기에 충분한 여과 수단이 적합한 한편, 원심분리는 3미크론의 입도에 적합하다. 그 다음, 회수된 고형분율을 건조와 또한 실란을 실리카겔 또는 CPG에 완전히 공유 결합시키기에 충분한 온도에서와 그러한 시간동안 열숙성시킨다.
일반적으로, 40-120℃에서 약 1-4시간이 충분함을 발견하였다. 이와같이 얻은 공유결합된, 비가교 최종 생성물은 바람직하게는 약0.5 내지 약 3.8퍼센트 질소를 포함한다. 이와같이 얻은 약 염기성 PEI-PrSi-실리카겔 또는 PEI-PrSi-CPG 생성물은 종래의 처리(예로써, S.Gupta et al., Anal. Biochem.128, 196-201(1983).
참조에 의해 비활성 유기 용매에서 적당한 이염기산무수물로 약산성 카르복실화 형태로 전환시킬 수 있다. 전형적인 이러한 무수물은 예를들면, 숙신산무수물, 글루타르산무수물, 디글리콜산무수물 등을 포함한다. 실질적으로 PEI 기상의 모든 이미노 및 아미노기와 반응하기에 충분한 무수물이 사용된다. 결과된 숙시노일화 생성물에 있어서 카르복실기의 수는 예를들어서, 적합한 알칼리에 대해 표준 적정에 의해 구할 수 있다. 본 발명의 목적으로는 최종 생성물 그램당 카르복실 밀리당량 약 0.3 내지 약 1.2가 바람직하다.
발췌끝
램슨의 전술한 약산성 카르복실화 PEI-PrSi-실리카겔과 카르복실화-PEI-PrSi-CPG 생성물은 예를 들어서, 숙신산무수물(바람직한), 글루타르산무수물, 디글리콜산 무수물 등과 같은 이염기산 무수물의 PEI-PrSi-실리카겔 또는 PEI-PrSi-CPG의 PEI기상의 이미노 및 아미노기와의 N-아실화 반응생성물인데, 본 발명의 크로마토그라피 및 추출 정제법에 이용된 고형상 물질이다. 램슨의 상기 카르복실화 생성물은 출발 실리카겔이 약 3 내지 약 70미크론의 평균입경과 약 50 내지 약 1000옹스트롬단위, 바람직하게는 약 250-500옹스트롬의 평균기공도를 갖는 것들이며 ; 출발 조절된 기공유리(CPG)가 약 37 내지 약 177미크론의 평균 입경과 약 40 내지 약 1000옹스트롬 단위, 바람직하게는 약 40-500옹스트롬의 평균 기공도를 갖는것들 ; 입자 실리카겔 또는 입자 CPG에 공유결합 비가교 형태로 곧이어 결합되는 출발 폴리에틸렌 이미노프로필 트리메톡시실란이 약 400 내지 약 1800의 평균분자량을 갖는것들 ; 그리고 PEI 기상의 이미노 및 아미노기에 부착된 이염기산 단편의 잔유카르복실산 기능(이 단편의 카르복실은 말단에 위치되어 있다)이 바람직하게는 카르복실화-PEI-PrSi-실리카겔 또는 카르복실화-PEI-PrSi-CPG 생성물의 그램당 약 0.3-1.2의 카르복실밀리당약을 제공하는 것들이다. 따라서, 본 발명은 액체 크로마토 그라피 패킹 또는 고형상 추출 매트릭스가 상기 입자 카르복실화-PEI-PrSi-실리카겔 또는 카르복실화-PEI-PrSi-CPG로 이루어지는 액체 크로마토그라피나 아니면 고형상 추출법을 사용함으로써 항체 IgG 형으로도 공지된 실질적으로 정제된 이뮤노글로부린 G를 그를 포함하는 생물유체, 예를들어서, 혈장, 혈청, IgG 항체를 생성하는 조직배양 세포로부터의 상징액유체, 복수액 등으로부터 얻는 방법을 제공한다.
현재 이러한 크로마토그라피 패킹 또는 고형상 매트릭스는 IgG 항체를 우선적으로(선택적으로)결합하고 생물 유체내의 대부분의 다른 단백질로부터 제거시키기 위한 액체 크로마토그라피 및 고형상 추출법에서 특히 유용하다. 그 다음, 결합된 IgG 항체는 실질적으로 정제된 형태로 고형상 매트릭스로부터 용리될 수 있거나 또는 액채 크로마토그라피에서 적당한 수성 완충액을 사용하여 기울기용리에 의해 소량의 다른 결합된 단백질로부터 더 분리 및 정제할 수 있다. 여기에 사용된바“실질적으로 정제된”은 정량적으로 회수된 IgG 항체분율에 존재하는 단백질의 70%이상의 IgG 항체임을 의미한다. 참으로, 본 발명의 바람직한 방법인 액체 크로마토그라피에서는 정량적으로 회수된 IgG 항체분율에서 단백질의 90%이상이 즉, 필수 균질도의 IgG 항체이다. 퍼센트 순도는 예를들면, 도데실황산나트륨 폴리아크릴 아미드 겔 전기영등(U.K.Laemmli, Nature, 227, 680 1970))에 의해서와 같은 기술상 공지의 방법으로 입증될 수 있다.
본 발명은 예를들어서 혈장, 혈청, 조직배양 상징액, 복수액(예를들면, 생쥐 또는 쥐 복수액)등과 같은 IgG항체를 포함하는 생물유체를 사용하기에 적합하다. 용어“이뮤노글로부린 G”또는“IgG 항체”는 모든 모노클로날 및 폴리클로날 IgG 항체 및 IgG 형의 아군(subclasses), 예를들면, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3,
Figure kpo00005
등을 포함한다. 항체를 포함하는 이러한 액체 또는 용액 또는 물질을 제조하는 방법론은 본 분야에서 통적이다(예로써,“모노 클로날 항체, 히트리도마 ; 생물 분석에 있어서의 새차원”, R.H.Kennet et al., Plenum Press 발행, New York, 1980 ; 및“효소학의 방법”, G.Galfred & C.Milstein, edited by J.J.Langone and H.Van Vunakis, Vol. 73, p.31-46, Academic Press 발행, 1981 참조).
고도의 정제된 형태로 IgG 항체의 분리는 명백히 바람직하다. 예를들면, 생체내 치료의 목적으로는 불리한 부작용을 최소화하고 의도하는 치료의 목적을 최대화하기위해 가능한한 순수하고 농축된 IgG 항체가 요구된다. 마찬가지로, 체외 진단의 목적으로 특정한 진단시험의 감도 및 특이성을 최대화하기 위해 이러한 정제되고 농축된 항체가 바람직하다.
바람직하게는, IgG 항체를 포함하는 생물유체는 방해하는 입자물질을 제거하기 위해 전처리시키고 카르복실화-PEI-PrSi-실리카겔 또는 카르복실화-PEI-PrSi-CPG 고형상 물질에 IgG 항체의 결합을 달성하기에 필요한 적당한 이온 강도 및 pH로 평형화 시킨다. 방해하는 입자 물질은 종래의 분류수단, 예를들면, 여과에 의해서 또는 입자물질을 펠릿화하기에 충분한 힘으로 원심분리에 의해서 제거할 수 있다. 생물유체의 평형화는 본 분야에 공통인 어떠한 수단에 의해서도, 예를들면,“세파덱스”라는 상호아래 시판되는 것들과 같은 적당한 형태와 기공도의 분자체상에서 적당한 완충액으로 희석 또는 적당한 완충액에 대해 투석등에 의해, 특정한 IgG 항체의 pH(모노클로날 항체가 주변에 순수 이온전하를 운반하지 않는 pH)이하이나 pH 5.5 이상인 pH로, 그리고 생물유체의 후속 처리시 용리에 사용된 낮은 이온강도 완충액의 이온강도와 같거나 또는 그 이하의 이온강도로 생물 유체를 평형화시키는 적당한 완충액으로 크로마토그라피 탈염시킴에 의하여 달성될 수 있다.
액체 크로마토그라피에 의한 필수 균질도로 정제하기 위해, 크로마토그라피에 사용하기에 적합한 크로마토그라피 컬럼을 전술한 카르복실화-PEI-PrSi-실리카겔 또는 카르복실화-PEI-PrSi-CPG 다공성 크로마토그라피 매트릭스로 충전시킨다. 적합한 강철 또는 유리 크로마토그라피 컬럼은 길이 약 5-100cm와 내경 약 1-100mm의 크기를 갖는 것들을 포함한다. 예를들면, 컬럼 패킹기법, 컬럼크기, 컬럼온도, 압력 등과 같은 적당한 크로마토그라피 파라미터의 선정은 본 분야 통상의 기술중 한가지로 쉽게 구해진다.
충전된 컬럼을 통하여 적당한 완충용액을 통과시킴으로써 크로마토그래프에서 평형화된다. 이 완충평형화 단계후, 지시된 대로 입자 물질을 미리 없애고 적당한 이온 강도 및 pH로 평형화시킬 수 있는 생물유체의 단백질성 성분의 크로마토그라피 분리를 하기 위해 컬럼을 사용한다. 생물유체 샘플을 완충액 평형화된 컬럼에 적용하여 각각의 카르복실화-PEI-PrSi-실리카겔 또는 카르복실화-PEI-PrSi-CPG 크로마토그라피 패킹물질에 IgG 항체와 소량의 오염단백질을 선택적으로 결합시킨다. 그 다음, 결합된 IgG 항체를 시간, 유속과 증가하는 이온강도 및/또는 증가하는 pH의 구배를 일으키는 구배형태의 상호의존 크로마토그래피 파라미터를 고려하여 종래의 기울기 용리기법에 의해 선택적으로 용리시킬 수 있다. 양이온성 완충액, 예를들면, 약 pH5.5 내지 약 8.3의 인산칼륨, 트리스-아세테이트, 아세트산 암모늄, 염화나트륨 등이 이러한 구배를 발생시켜 카르복실화 패킹물질로부터 선택적으로 결합 IgG를 용리하도록 사용될 수 있다.
예를들면, 약 0.1mL/분 내지 약 2L/분의 유속으로 1시간반 내지 약4시간 구배가 유리하게 형성될 수 있다. 또 다르게는, 소량의 불순물과 함께 결합된 항체는 실질적으로 순수한 형태로 결합항체를 방출시키기에 충분히 높은 이온강도의 완충액에 의해 단일단계로 용리시킬 수 있다. 이러한 선택적인 결합 및 곧 이은 단일단계 용리의 방법은 고형상 추출법으로 기술될 수 있는데 이것은 컬럼에서 상기 한 바와같이 또는 배치법으로 수행될 수 있다.
후자에서는 카르복실화-PEI-PrSi-실리카겔 또는 카르복실화-PEI-PrSi-C PG의 고형상 매트릭스를 평형화시킨 생물유체와 교반하고 ; 그 다음, 매트릭스와 유체를 기울여 따르기 또는 원심 분리와 같은 종래의 방법으로 분리시키고 곧이어 IgG 항체를 적당한 이온강도의 수성 완충액과 교반함으로써 매트릭스로부터 용리시켜 결합 IgG 항체를 방출시킨다.
분해된 단백질은 본 분야에서 통상적인 어떠한 방법으로도, 예를들면, 280nm 에서 UV 흡광도를 검사 함으로써 확인될 수 있다. 분리된 단밸질을 포함하는 용리액분율을 손으로 또는 분율수집기의 사용에 의해 수집할 수 있다. 균일한 IgG 항체를 포함하는 용리액분율은 예를들어서, 특정 항체에 대해 개발된 방사면역 측정에 의해, 다른 항체-항원 방응에 의해, 또는 풀리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서와 같은 본 분야에서 잘 확립된 수단에 의해 확인될 수 있다.
본 발명 방법은 IgG 항체를 포함하는 생물유체의 총부피에 무관함을 발견하였고 고체 크로마토그라피 패킹 또는 고형상 매트릭스로서 사용된 카르복실화-PEI-PrSi-실리카겔 또는 카르복실화-PEI-PrSi-CPG의 양을 제외하고는 제한 요인이 없으며 ; 즉, 고체지지체의 용량을 능가하지 않는한 방법은 실시 가능하다. 그러므로 본 발명 방법에 따라 항체 IgG 형을 포함하는 생물유체는 액체 크로마토그라피 또는 고형상 추출법에 의해 분리되어 실질적으로 정제된 형태로 상기 항체를 제공한다.
다음의 실시예들은 예시를 위해 주어진 것이며 본 발명을 제한하지 않는다. 실시예 1-5는 램슨의 비-카르복실화 반응생성물을 설명하며 ; 실시예 6-8은 램슨의 카르복실화 반응 생성물을 설명하며 ; 실시예 9-11은 본 발명의 추출 및 정제에 있어서 이러한 카르복실화 생성물의 사용을 설명한다.
[실시예 1]
A. “실리카겔 #7024”로서 불규칙한 형태로 베이커 사(J.T Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J.)로부터 시중 구입되는 평균입경 40미크론과 평균 기공도 60옹스트롬을 가진 실리카겔 10그램의 50ml톨루엔 중의 슬러리에, 교반하면서“(N-트리메톡시 실릴프로필)-폴리에틸렌이민 PS076”으로서 페트라아크(Petrarch System s Inc., Bristol, PA)로부터 시중구입되는 평균 분자량이 400-600(500으로 가정)인 폴리에틸렌 이미노프로필 트리메톡시 실란의 50% w/w 이소프로판을 용액 19.71그램을 가한다. 혼합물을 실온(약25℃)에서 약 1시간 10분동안 교반한 다음 교반하지 않고 하룻밤(약 17시간)방치해둔다. 다시 교반을 개시하여 실온에서 5시간 40분간 더 교반하고 다시 혼합물을 하룻밤 방치해 둔다. 다음에 혼합물을 중간 후리트(fritted)된 유리 여과기 상에서 여과시킨다. 여액을 50ml 톨루엔으로 2회, 50ml 메탄올로 2회 세척하여 초과량의 실란 반응 물질의 제거를 확실히 한 다음 80-85℃에서 3시간 30분간 오븐 건조시켜 공유결합된 PEI-실리카겔 생성물 약 12그램 ; 약 3.9%N을 얻었다.
B. 실시예 Ⅰ-A의 과정을 반복하되 물 1ml를 실리카겔/실란 혼합물에 가한다. PEI 결합된 실리카겔 생성물의 수율은 약 13.3그램 ; 약 5.5% N이다.
[실시예 2]
등록상표“Vydac A”(카탈로그 No. 101 T9B5)하에 구형 실리카로서 세파라치온 그룹(Sep A Ra Tions Group, Hesperia, CA)으로부터 구입되는 평균 입경 5.25미크론 평균 기공도 330옹스트롬을 가진 실리카겔 20그램의 톨루엔 100ml와 물 2ml중의 슬러리를 제조하고 실온에서 10분간 교반시킨다. 여기에 평균 분자량 500을 가진 폴리에틸렌 이미노프로필트리 메톡시 실란의 50% w/w 이소프로판올 용액 39.4그램을 교반하면서 가하고 혼합물을 추가로 5분간 교반한다. 그 다음 혼합물을 실온에서 하룻밤 방치해둔다. 다음에 혼합물을 1.0미크론 여과기 깔때기를 사용하여 여과한다. 여액을 50ml 톨루엔으로 2회, 50ml 메탄올로 2회 세척한 다음, 깔때기상에서 풍건하고 최종적으로 80-85℃에서 약 3시간 30분간 오븐 건조시켜 PEI 결합된 실리카겔 생성물 ; 약 2.85%N을 얻었다.
[실시예 3]
상호“Fractosil 500”하에 멀크 시약 사(E.Merck Reagents, 독일)에서 구입되는 평균 입경 40-63미크론과 평균기공도 420옹스트롬을 갖는 230-400 메시 (ASTM)실리카겔 20그램의 50ml 메탄올과 1ml 물중의 슬러리를 제조하고 실온에서 5분간 교반시킨다. 평균 분자량 1800을 갖는 폴리에틸렌 이미노프로필 트리메톡시 실란의 50%w/w 이소프로판올 용액 11.2그램의 100ml 메탄올 중의 용액을 또한 따로 제조한다. 그 다음 교반하면서 5분에 걸쳐 실란 용액을 실리카겔 슬러리에 가한다. 첨가를 완결시킨후, 교반을 중지하고 혼합물을 실온에서 방치해둔다, 다음에 혼합물 중간크기 소결유리 상에서 여과한다. 여액을 진공하에 3x50ml 메탄올로 세척한 다음 80-85℃에서 약 4시간동안 오븐 건조시켜 PEI 결합 실리카겔 생성물 ; 약 1.1%N을 얻는다.
[실시예 4]
다음의 반응혼합물을 전술한 실시예의 지시에 따라 제조한다.
Figure kpo00006
각 반응혼합물을 실온에서 5분간 교반한 다음 교반하지 않고 41시간 30분간 방치해둔다. 각 혼합물을 여과하고 50ml 이소프로판올 1회, 50ml 메탄올로 2회 세척한다. 각 여액을 80-85℃에서 약 3시간 12분동안 오븐 건조시켜 각각의 PEI 결합 실리카겔 생성물을 얻는다 ; A : 1.2%N ; B : 1.0%N ; C : 0.9%N.
[실시예 5]
A. 평균입경 40미크론과 평균기공도 50옹스트롬을 가진 10그램 실리카겔의 50ml 헥산중의 슬러리에 평균 분자량 500인 PEIPr-triNeO-실란의 50% w/w i-PrOH용액 19.71그램을 가한다. 혼합물을 실온에서 5분간 교반한 다음 약 2시간동안 환류온도로 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각되도록 두고 여과 및 50% 헥산으로 2회, 50ml 메탄올로 2회 세척한다. 그 다음 여액을 80-85℃에서 약 3시간 동안 오븐 건조시켜 PEI 결합 실리카겔 생성물을 얻는다.
B. 실시예 5-A의 과정을 반복하되 동량의 조절된 기공 유리(125미크론, 240옹스트롬)를 여기에 사용된 실리카겔에 대해 치환하여 해당하는 공유결합된 비가교 PEI-PrSi-CPG 생성물을 얻는다.
[실시예 6]
실시예 2의 과정을 반복하되 125ml 톨루엔과 2.5ml 물 중의 25그램 실리카겔을 PEIPr-triMeO-실란(분자량 500)의 50% w/w i-PrOH 용액의 50그램과 반응시켜 PEI 결합된 실리카겔 생성물 약 29.4그램을 얻는다. 그 다음 이 생성물은 125ml 톨루엔과 10그램 숙신산무수물과 혼합하고 혼합물을 80℃ 수욕에서 2시간동안 회전시킨다. 이 시간 말엽에 200ml 메탄올을 가하고 혼합물을 여과한다. 회수된 숙시노일화 PEI 결합 실리카겔 생성물을 연속적으로 1×50 톨루엔, 2×50ml 메탄올 및 1×50ml 에틸에테르로 세척한다. 그 다음, 생성물을 약 80℃에서 약48분간 건조 시킨다. 1N 수산화 나트륨에 대한 생성물의 적정은 생성물 그램당 약 0.65의 카르복실 밀리당량을 가리킨다.
[실시예 7]
A. 실리카겔 500그램(40-55미크론 ; 250옹스트롬)을 톨루엔 2500ml에 슬러리로 만들었다. 이 슬러리에 이소프로판올의 50% 용액으로서 폴리에틸렌 이미노 프로필 트리메톡시 실란(평균 분자량=600)247.5그램을 가한다. 혼합물을 15분간 교반한 다음 실온에서 48.5시간동안 방치해둔다. 그 다음, 혼합물을 여과하고 고형상을 1000ml부피의 톨루엔으로 2회 세척하고 이어서 1000ml부피의 메탄올로 2회 더 세척한다. 세척한 고형상을 건조 시키고 85℃에서 오븐에서 5시간동안 숙성 시킨다. PEI-PrSi-실리카겔 생성물의 수율은 약 570그램이다. 이 PEI-PrSi-실리카겔 생성물 200 그램을 톨루엔 1000ml로 슬러리로 만들고 숙신산무수물 54그램을 가한다. 혼합물을 40℃수욕에서 회전교반기에 3시간40분간 둔 후 메탄올 200ml을 가하고 혼합물을 여과한다. 이와같이 얻은 숙시노일화-PEI-PrSi-실리카겔을 500ml 부피의 메탄올로 4회 세척하고 85℃에서 3시간 동안 오븐 건조 시킨다. 수율=217.1그램. 카르복실 타이터=0.65meg. /그램. 분석 : 10.24% C ; 1.88%H ; 및 2.75%N 실시예 7A의 과정에서 등량의 글루타르산 무수물 및 디글리콜산 무수물로 개별적으로 거기서 사용한 숙신산 무수물을 대신하여 행함으로써 해당하는 글루타로일-PEI-PrSi-실리카겔과 디글리콜로일-PEI-PrSi-실리카겔을 각각의 생성물로서 얻는다.
[실시예 8]
이소프로판올 1750ml에 슬러리로 만든 실리카겔 350그램에 이소프로판올중의 폴리에틸렌 이미노프로필 트리메톡시 실란의 50%(w/w)용액 173ml를 가한다. 혼합물을 15분간 교반한 다음 42시간 동안 방치해둔다. 그다음 혼합물을 여과하고 고체물을 750ml 부피의 이소프로판올로 2회 세척하고 이어서 750ml 부피의 메탄올로 2회 더 세척한다. 세척한 고형상를 건조시키고 오븐에서 85℃에서 3.5시간동안 숙성시킨다. PEI-PrSi-실리카겔 생성물의 수율을 약 376.3그램이다. 분석 : 1.20%N이 PEI-PrSi-실리카겔 생성물 200그램을 톨루엔 100ml로 슬러리로 만들고 숙신산무수물 54그램을 가한다. 혼합물을 40℃수욕에서 2시간 10분동안 회전시킨 후 메탄올 300ml를 가한다. 다음 반응 혼합물을 여과하고 고형상을 85℃에서 2시간동안 오븐 건조시켜 숙시노일화-PEI-PrSi-실리카겔 생성물(15-20 미크론 ; 300옹스트롬)을 얻는다. 카르복실 타이터=0.3meg./그램. 분석 : 5.07% C : 0.95%H ; 및 1.05%N.
[실시예 9]
A. 실시예 7A에서 얻은 숙시노일화-PEI-PrSi-실리카겔 200mg 샘플을 1ml 폴리프로필렌 주사기통의 2개의 폴리에틸렌 20마이크로리터 기공도 후리트(frits)사이에 채운다. pH 6.6의 0.01M 인산칼륨 완충액 2밀리리터를 상호 Baker-10SPETM시스템(J.T.Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J.)하에 시중 구입되는 진공 매니포울드에 의해 20 in.Hg의 진공에서 컬럼을 통하여 흡인시킨다. 미지 특이성의 이뮤노글로부린 G를 포함하는 히브리도마 조직배양 매체 상징액 100마이크로리터 샘플을 원심 분리에 의해 정화시킨 다음 pH6.6의 인산칼륨 완충액 400마이크로리터로 회석시킨다. 전체 500마이크로리터 샘플을 20 in. Hg의 진공 압력에서 Baker-10 SPETM시스템상의 컬럼에 적용시킨다. 용출액을 수집한다. 컬럼을 pH 6.6의 0.01M 인산칼륨 4ml로 세척하고 용출액을 수집한다. 컬럼을 pH 6.6의 0.035M 인산칼륨 2ml로 세척하고 최종적으로 pH5.6의 0.1M 인산칼륨 2ml로 세척한다. 각 세척시 용출액을 수집한다. 수집한 용출액 각각을 본질상 U.K.Laemmli, Nature,227, 680(1970)에 기술된 대로 수행하여 도데실 황상나트륨 폴리아미드겔 전기영동에 의해 분석한다. pH 6.6의 0.010M 인산칼륨 용출액은 이뮤노글로부린 G를 제외하고 알부민, 트랜스퍼린 및 원래 샘플중의 대부분의 다른 단백질을 포함한다. 대략 10% 오염 단백질과 함께 정량적으로 회수된 이뮤노글로부린 G가 pH 6.6의 0.1M 인산칼륨 용출액에서 발견된다.
B. 이뮤노글로부린 G의 유사한 회수율을 사람 혈청 100마이크로리터 샘플로 실시예 9A의 과정을 행함으로써 얻는다.
C. 실시예 7B의 글루타로일-PEI-PrSi-실리카겔과 디글리클로일-PEI-PrS i-실리카겔 등량으로 각각 실시예 9A 과정의 숙시노일-PEI-PrSi-실리카겔을 치환하여 유사한 이뮤노글로부린 G 회수율을 얻는다.
[실시예 10]
A. 25cm×0.46mm의 스테인레스 스틸 크로마토그라피 컬럼을 실시예6의 숙시노일화-PEI-PrSi-실리카겔 3.8그램으로 충전시키고 pH 6.0의 0.01M 인산칼륨완충액을 1ml/분의 유속으로 20분간 컬럼을 통하여 뿜음으로써 이 완충액으로 평형화시킨다. 사람 혈장의 0.1밀리리터 샘플을 충전시킨 컬럼에 적용하고 pH6.0의 0.01M 인산칼륨에서 pH6.8의 0.25M 인산칼륨으로 120분 선형구배를 사용하여 1ml/분의 유속으로 기울기용리에 의해 단백질 분리를 달성시킨다. 단백질 용리는 0.32흡광도 단위에서 전규모 흡광도 세트로 280nm에서 UV 흡광도를 사용하여 검출한다. 일련의 280nm 흡수피이크를 지연시간 약 2분 내지 약 50분에 이르는 범위에서 검출한다. 약 25분 지연시간에서의 단백질 피이크는 위에 개략한 바와같이 동일 구배프로화일을 사용하여 카탈로그 No. 641451하에 Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL로 부터 얻은 사람 IgG항체의 시중 구입가능시료와 상호 크로마토그라피 힘으로써 사람혈장 IgG 분율로서 확인된다. 약 25분에서 용리하는 단백질 피이크는 U.K.Laemmli, Nature, ibid.에 기술된 바와같이 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 70%순도 이상인 것으로 평가되는데, 50,000달론(IgG 중 사슬)과 25,000달론(IgG 경 사슬)의 분자량에 해당하는 두 주된 코오마씨 블루(Coomassie blue)띠와 총 오염 단백질 30%이하를 나타내는 몇개의 약한 코오마씨 블루띠를 얻는다. IgG 항체의 회수율은 90% 이상이다.
B. 실시예 10A의 과정을 2회 반복하되, 소혈청 알부민에 대해 특이성이 있는 특정 IgG항체와 양 적혈세포에 대한 특이성이 있는 IgG 항체에 있어서 IgG 항체를 포함하는 쥐 복수액 1.0ml 샘플로 거기서 이용된 사람 혈장 0.1ml 샘플을 치환한다. 전자의 시료에 대한 피이크 지연 시간은 26분이고 후자에 대해 30분이다. 양쪽 시료에서 추출된 IgG 의 분석한 퍼센트 순도와 회수율은 90%이상이다.
C. 실시예 10A의 과정을 반복하되, 미지 특이성의 IgG 항체를 포함하는 히브리도마 조직배양 매체 1.0ml 샘플로 사람혈장 0.1ml 샘플을 치환한다. 피이크 지연시간은 45분이고 분석순도 및 회수율은 각각 90%이상이다.
[실시예 11]
A. 히브리도마 조직배양 매체 상징액 1.0 밀리리터와 pH6.0의 0.01M 인산칼륨 완충액 3.0ml를 실시예 8로부터의 숙시노일화-PEI-PrSi-실리카겔 결합상 30. 0mg을 가한다. 이 혼합물을 1분간 흔든다. 결합상을 1시간 동안 가라앉게두고 결과 상징액을 따라 낸다. 고형잔사를 pH 6.0의 0.01M 인산칼륨 완충액 10ml 중에서 흔듦으로써 재 현탁시키고 1시간동안 가라앉게둔다. 그 다음 이 두번째 상징액을 따르고 그로부터의 고형잔사를 pH 6.8의 0.125M 인산칼륨 완충액 1.0ml 중에 흔듦으로써 재 부유시키고 이 혼합물을 다시 1시간동안 가라앉힌다. 결과 상징액을 따른다. 세 상징액 유체 각각을 HPLG 크로마토그라피와 앞서 기재한 도메실 황산나트륨 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석한다. 유체 상징액을 90%순도 이상으로 원래 샘플내에 존재하는 IgG 항체의 75%이상을 포함하는 것이 발견된다. 다른 두 상징액은 IgG항체의 5%이하를 포함하는 것으로 발견된다. pH 6.8 의 0.125M 인산칼륨 완충액을 재추출함으로써 고체상 물질로부터 추가로 IgG 가 또한 회수될 수 있다.
B. 실시예 11A의 과정을 되풀이하되 실시예 5B의 숙시노일화-PEI-PrSi-CPG 등량으로 거기서 사용한 숙시노일화-PEI-PrSi-실리카겔을 치환하여 실질적으로 같은 결과를 얻는다.

Claims (12)

  1. 크로마토그라피 패킹 또는 고형상 매트릭스가, 각각, 약 3 내지 약 70미크론의 평균 입경과 약 50 내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균 기공도를 갖는 입자 실리카겔, 또는 약 37 내지 약 177미크론의 평균입경과 약 40 내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균 기공도를 갖는 입자조절 기공유리의 약 400 내지 약 1800의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란과의 카르복실화 공유결합된 비가교 폴리에틸렌이민 반응 생성물로 필수적으로 구성되는 액체 크로마토그라피 또는 고형상 추출법을 구성되는 액체 크로마토그라피 또는 고형상 추출법으로 사용함으로써 생물 유체 샘플로부터 이뮤노글로부린 G를 분리 및 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 이뮤노글로부린 G를 포함하는 생물유체 샘플로부터 실질적으로 정제된 이뮤노글로부린 G를 얻는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 카르복실화 반응생성물은 생성물 그램당 약 0.3 내지 약 1.2의 카르복실 밀리당량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 생물유체는 혈장, 혈청, 조직배양 상징액 또는 복수액인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 크로마토그라피 패킹 또는 고형상 매트릭스가, 각각, 약 3 내지 약 70미크론의 평균 입경과 약 50 내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균 기공도를 갖는 입자실리카겔의 약 400 내지 약 1800의 평균분자량을 갖는 폴리에틸렌이미노 프로필 프리메톡시 실란과의 카르복실화 공유결합된 비가교 폴리에틸렌이민 반응 생성물로 필수적으로 구성되는 액체 크로마토그라피 또는 고형상 추출법을 사용함으로써 생물유체 샘플로부터 이뮤노글로부린 G를 분리 및 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 이뮤노글로부린 G를 포함하는 생물유체 샘플로부터 실질적으로 정제된 이뮤노글로부린 G를 얻는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 카르복실화 반응생성물은 생성물 그램당 약 0.3 내지 약 1.2의 카르복실 밀리당량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생물 유체는 혈창, 혈청, 조직배양 상징액 또는 복수액인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 크로마토그라피 패킹 또는 고형상 매트릭스가, 각각, 약 37 내지 약 177미크론의 평균 입경과 약 40 내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균 기공도를 갖는 입자조절기공 유리의 약 400 내지 약 1800의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌이미노 프로필 트리메톡시 실란과의 카르복실화 공유결합된 비가교 폴리에틸렌이민 반응생성물로 필수적으로 구성되는 액체 크로마토그라피 또는 고형상 추출법을 사용함으로써 상기 샘플로부터 상기 이뮤노글로부린 G를 분리 및 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 이뮤노글로부린 G를 포함하는 생물유체 샘플로부터 실질적으로 정제된 이뮤노글로부린 G를 얻는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 카르복실화 반응생성물은 생성물 그램당 약 0.3 내지 약 1.2의 카르복실 밀리당량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생물유체는 혈장, 혈청, 조직배양 상징액 또는 복수액인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. a. 이뮤노글로부린 G를 포함하는 생물유체 샘플을 후속 크로마토그라피 분리 및 회수 단계에서 기울기 용리에서 사용된 더 낮은 이온강도 완충액의 이온강도와 같거나 또는 그 이하의 이온강도로, 그리고 특정 이뮤노글로부린 G의 pI보다 더 큰 pH 로 평형화시키는 단계와, b. 약 3 내지 약 70미크론의 평균 입경과 약 50내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균 기공도를 갖는 입자 실리카겔 또는 약 37 내지 약 177미크론의 평균 입경과 약 40 내지 약 1000옹스트롬 단위의 평균 기공도를 갖는 입자 조절 기공유리의 약 400 내지 약 1800의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 이미노프로필 트리메톡시 실란과의 카르복실화 공유결합된 비가교 반응생성물로 필수적으로 구성되는 액체 크로마토그라피를 사용함으로써 상기 샘플로부터 상기 이뮤노글로부린 G를 분리 및 회수하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 이뮤노글로부린 G를 포함하는 생물유체 샘플로부터 실질적으로 정제된 이뮤노글로부린 G를 얻는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 카르복실화 반응 생성물은 생성물 그램당 약 0.3 내지 약 1.2의 카르복시 밀리당량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 생물유체는 혈장, 혈청, 조직배양 상징액 또는 복수액인 것을 특징으로 하는 방법.
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