ES2868093T3

ES2868093T3 - Medio y dispositivos de cromatografía

Info

Publication number: ES2868093T3
Application number: ES13844612T
Authority: ES
Inventors: Feng Gu; Ning Mu
Original assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2013-09-16
Publication date: 2021-10-21
Anticipated expiration: 2033-09-16
Also published as: CA2885263A1; KR102196230B1; WO2014058570A1; HK1205044A1; JP6360482B2; PL2812091T3; EP2812091A4; CN104968403A; EP2812091B1; EP2812091A1; BR112015005937A2; US20140367338A1; US11628381B2; RU2015114330A; IN2015DN02055A; MY178616A; KR20150053873A; SG11201404681VA; JP2015535929A; AU2013330344B2

Abstract

Un medio de cromatografía que comprende partículas inorgánicas porosas que tienen una superficie funcionalizada, teniendo dichas partículas inorgánicas porosas una mediana de tamaño de poro de al menos 30 nm (300 Angstrom (Å)); una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos 0,8; y dicha superficie funcionalizada comprende al menos una molécula que tiene un peso molecular superior a 300 g/mol; en donde dichas partículas inorgánicas porosas tienen uno o más ligandos unidos a la superficie funcionalizada, y dichos uno o más ligandos comprenden grupos ácido sulfónico, amonio cuaternario, dietil aminoetilo, carboxil metilo; colorantes sintéticos; compuestos alquílicos; proteínas; lectinas; anticuerpos; antígenos, enzimas o combinaciones de los mismos; y en donde "mediana de tamaño de poro" es el diámetro de poro en el que reside el 50 % del volumen de poro intrapartícula; "distribución de tamaño de poro" significa la abundancia relativa de cada tamaño de poro en un volumen representativo de partículas inorgánicas porosas; la "amplitud" se mide restando el tamaño de poro d10, en donde dicho tamaño de poro d10 es el diámetro de poro por debajo del cual reside 10 % del volumen de poro, del tamaño de poro d90, en donde dicho tamaño de poro d90 es el diámetro de poro por debajo del cual reside 90 % del volumen de poro, según se mide por porosimetría de mercurio; y la "amplitud relativa" se define como la relación de (d90-d10)/d50.

Description

DESCRIPCIÓN

Medio y dispositivos de cromatografía

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un medio de cromatografía, a dispositivos de cromatografía que contienen medios de cromatografía y a métodos para fabricar dispositivos de cromatografía.

Antecedentes de la invención

Existe una necesidad en la técnica de aumentar la productividad y la eficiencia del proceso en las operaciones cromatográficas. En EP-1 690 867 A1 se describe un medio de cromatografía que comprende partículas de sílice porosa que tienen una superficie funcionalizada con grupos orgánicos, teniendo dichas partículas de sílice un tamaño de poro promedio de 30 nm y un área de superficie específica de 140 m2/g.

Sumario de la invención

La presente invención aborda algunas de las dificultades y los problemas analizados anteriormente mediante la introducción de un medio de cromatografía y dispositivos de cromatografía que contienen dicho medio de cromatografía. Los dispositivos de cromatografía descritos permiten una operación cromatográfica más eficiente, productiva y/o ecológica debido a una o más de las siguientes ventajas sobre las operaciones cromatográficas convencionales: eliminación de una etapa de empaque del dispositivo por parte del usuario; eliminación de etapas de clean-in-place (limpieza in situ - CIP); eliminación de las etapas de clean-in-place (limpieza in situ - CIP) utilizando solución de hidróxido de sodio; eliminación de cualquier etapa de validación por parte del usuario; y el uso de un dispositivo de cromatografía que comprende material biodegradable.

El medio de cromatografía de la presente invención incluye partículas inorgánicas porosas que tienen una superficie funcionalizada y que tienen una mediana de tamaño de poro de al menos aproximadamente 300 Angstrom (Á), o al menos de aproximadamente 300 Á hasta aproximadamente 3000 Á. (10 Á = 1 nm) Las partículas inorgánicas porosas pueden tener una mediana de tamaño de poro de al menos aproximadamente 400 Á (o al menos aproximadamente 500 Á; o al menos aproximadamente 600 Á; o al menos aproximadamente 700 Á; o al menos aproximadamente 800 Á; o superior a aproximadamente 1000 Á). En otra realización ilustrativa, las partículas inorgánicas pueden tener un área de superficie BET de al menos aproximadamente 20 m2/g, o al menos aproximadamente 25 m2/g, o aproximadamente 30 m2/g, hasta aproximadamente 2000 m2/g. Las partículas inorgánicas pueden tener un área de superficie BET de al menos aproximadamente 20 m2/g, o al menos aproximadamente 25 m2/g, al menos aproximadamente 30 m2/g, o al menos aproximadamente 35 m2/g. Según la invención, las partículas inorgánicas tienen una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,8, al menos aproximadamente 0,9, al menos aproximadamente 1,0, o al menos aproximadamente 1,1. Las partículas inorgánicas pueden tener una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de hasta aproximadamente 2,0. Según la invención, las partículas tienen una superficie funcionalizada que comprende al menos una molécula que tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 300 g/mol, o al menos aproximadamente 400 g/mol, o al menos aproximadamente 500 g/mol, hasta aproximadamente 500.000 g/mol. En otra realización no reivindicada, las partículas pueden comprender sílice que tiene una pureza de al menos aproximadamente el 93 % en peso de SiÜ2, o al menos aproximadamente el 93 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 94 % en peso de SiÜ2 al menos aproximadamente el 95 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 96 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 97 % en peso de SiÜ2, o al menos aproximadamente el 98 % en peso de SiÜ2 hasta 100 % en peso de SiÜ2 basada en el peso total de la partícula.

En otra realización ilustrativa, los dispositivos de cromatografía de la presente invención comprenden una carcasa; y el medio de cromatografía de la invención se coloca dentro de la carcasa.

La presente invención también se refiere a métodos para fabricar dispositivos de cromatografía. Según la invención, el método para fabricar un dispositivo de cromatografía comprende incorporar un medio de cromatografía según la presente invención en una carcasa de dispositivo.

Estas y otras características y ventajas de la presente invención se harán evidentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las realizaciones descritas y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La presente invención se describe adicionalmente con referencia a las figuras adjuntas, en donde:

la Fig. 1 representa una vista de un dispositivo de cromatografía ilustrativo de la presente invención;

la Fig. 2 representa una vista de un sistema de cromatografía ilustrativo que comprende la columna de cromatografía mostrada en la Fig. 1 ;

la Fig. 3 representa un gráfico de distribución de tamaño de poro de una realización ilustrativa del medio de cromatografía de la presente invención;

la Fig. 4 representa un esquema de reacción de una realización ilustrativa del medio de cromatografía de la presente invención;

la Fig. 5 representa un esquema de reacción de una realización ilustrativa del medio de cromatografía de la presente invención;

la Fig. 6 representa un esquema de reacción de una realización ilustrativa del medio de cromatografía de la presente invención;

la Fig. 7 representa un esquema de reacción de una realización ilustrativa del medio de cromatografía de la presente invención;

la Fig. 8 representa un esquema de reacción de una realización ilustrativa del medio de cromatografía de la presente invención;

la Fig. 9 representa un esquema de reacción para la preparación de una realización ilustrativa del medio de cromatografía de la presente invención;

la Fig. 10 representa un esquema de reacción para la preparación de una realización ilustrativa del medio de cromatografía de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Para promover una comprensión de los principios de la presente invención, se presentan a continuación descripciones de realizaciones específicas de la invención y se usa un lenguaje específico para describir las realizaciones específicas. No obstante, se comprenderá que no se pretende ninguna limitación del alcance de la invención mediante el uso de lenguaje específico. Se contemplan alteraciones, modificaciones adicionales, y dichas aplicaciones adicionales de los principios de la presente invención analizados como normalmente se le ocurriría a un experto en la técnica a la que pertenece la invención.

Cabe señalar que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un” , “una” , “él” y “ la” incluyen referentes en plural, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. De este modo, por ejemplo, la referencia a “un óxido” incluye una pluralidad de dichos óxidos y la referencia a “óxido” incluye la referencia a uno o más óxidos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

“Aproximadamente” que modifica, por ejemplo, la cantidad de un ingrediente en una composición, las concentraciones, los volúmenes, las temperaturas de proceso, los tiempos de proceso, las recuperaciones o los rendimientos, las velocidades de flujo y los valores similares, y los intervalos de los mismos, empleados en la descripción de las realizaciones de la descripción, se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, a través de procedimientos típicos de medición y manipulación; a través de un error involuntario en estos procedimientos: a través de diferencias en los ingredientes usados para realizar los métodos; y otras consideraciones similares. El término “ aproximadamente” también abarca cantidades que difieren debido al envejecimiento de una formulación con una concentración o mezcla inicial particular, y las cantidades que difieren debido a la mezcla o el procesamiento de una formulación con una concentración o mezcla inicial particular. Tanto si se modifican o no por el término “aproximadamente” , las reivindicaciones adjuntas incluyen equivalentes a estas cantidades.

Como se usa en la presente descripción, el término “ biomolécula” significa cualquier molécula que es producida por un organismo vivo, incluidas moléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos; y pequeñas moléculas tales como metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales. Los ejemplos de biomoléculas incluyen células y residuos celulares; anticuerpos, proteínas y péptidos; ácidos nucleicos, tales como ADN y ARN; endotoxinas; virus; vacunas y similares. Otros ejemplos de biomoléculas incluyen aquellos citados en WO 2002/074791 y en US-5.451.660.

Como se usa en la presente descripción, “óxidos inorgánicos” se define como compuestos binarios de oxígeno donde el componente inorgánico es el catión y el óxido es el anión. El material inorgánico incluye metales que también pueden incluir metaloides. Los metales incluyen aquellos elementos situados a la izquierda de la línea diagonal que va del boro al polonio en la tabla periódica. Los metaloides o semimetales incluyen aquellos elementos que se encuentran a la derecha de esta línea. Los ejemplos de óxidos inorgánicos incluyen sílice, alúmina, titania, circonia, etc., y mezclas de las mismas.

Como se usa en la presente descripción, “ partículas inorgánicas porosas” incluye partículas compuestas de materiales inorgánicos, o combinaciones de materiales inorgánicos (p. ej., metales, semimetales y sus aleaciones; cerámica, incluidos óxidos inorgánicos; etc.) y materiales orgánicos (p. ej., polímeros orgánicos), tales como materiales compuestos, que son de naturaleza heterogénea u homogénea. Por ejemplo, los materiales compuestos heterogéneos incluyen meras mezclas de materiales, materiales estratificados, núcleo-cubierta y similares. Los ejemplos de materiales compuestos homogéneos incluyen aleaciones, materiales híbridos poliméricos orgánicos-inorgánicos y similares. Las partículas pueden tener una diversidad de formas diferentes simétricas, asimétricas o irregulares, incluida la forma de cadena, varilla o listón. Las partículas pueden tener diferentes estructuras, incluida amorfa o cristalina, etc. Las partículas pueden incluir mezclas de partículas que comprenden diferentes composiciones, tamaños, formas o estructuras físicas, o que pueden ser iguales excepto por diferentes tratamientos de superficie. La porosidad de las partículas puede ser intrapartícula o interpartícula en los casos en que se aglomeran partículas más pequeñas para formar partículas más grandes. En una realización ilustrativa, las partículas se componen de materiales inorgánicos tales como óxidos inorgánicos, sulfuros, hidróxidos, carbonatos, silicatos, fosfatos, etc., pero preferentemente son óxidos inorgánicos, que pueden formarse a través de cualquier proceso conocido, incluidos, aunque de forma no limitativa, polimerización en solución, tal como para formar partículas coloidales, a hidrólisis de llama continua, tal como para formar partículas fundidas, gelificación, tal como para formar partículas gelificadas, precipitación, atomización, templado, sol-gel y similares.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ material poroso ordenado” se refiere a partículas porosas que tienen un orden estructural con una distribución de tamaño de poro muy estrecha, de manera que la distribución de tamaño de poro tiene una amplitud relativa, como se define en la presente descripción, de menos de 0,5.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ material poroso no ordenado” se refiere a partículas porosas que poseen una distribución de tamaño de poro que no es uniforme (es decir, una distribución de tamaño de poro muy amplia que es de naturaleza multimodal), de manera que la distribución de tamaño de poro tiene una amplitud relativa, como se define en la presente descripción, superior a 0,5.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “superficie funcionalizada” significa partículas inorgánicas que se han modificado en su superficie por reacción con un compuesto funcional para alterar la humectabilidad o la selectividad de al menos una parte de la superficie de la partícula, incluida el área de superficie en la parte externa de las partículas, y/o en el área de superficie de los poros internos. La superficie funcionalizada puede usarse para formar una fase unida (covalentemente o iónicamente), una superficie recubierta (p. ej., unida C18 en fase inversa), una superficie revestida (p. ej., revestida con carbono como en EP6), una superficie polimerizada (p. ej., intercambio iónico), una superficie inherente (p. ej., material híbrido inorgánico/orgánico) o similares. Por ejemplo, la reacción de partículas inorgánicas con octadeciltriclorosilano forma una “fase inversa” mediante la unión covalente del silano a la superficie inorgánica (p. ej., C4, C8, C18, etc.). En otro ejemplo, la reacción de las partículas inorgánicas con aminopropiltrimetoxisilano seguida de la cuaternización del grupo amino forma una “fase de intercambio aniónico” . En un tercer ejemplo, una fase unida puede formarse por reacción de las partículas inorgánicas con aminopropiltrimetoxisilano seguida de la formación de una amida con un cloruro de ácido. Otras fases unidas incluyen diol, ciano, catión, afinidad, quiral, amino, C18, hydrophilic interaction (interacción hidrófila - HILIC), hydrophilic interaction (interacción hidrófila - HILIC), modo mixto, exclusión por tamaño, etc. Como parte de la fase unida o superficie funcionalizada, puede usarse un ligando para mostrar una interacción específica con la molécula o biomolécula objetivo (p. ej., ligato), tal como aquellos expuestos en US-4.895.806.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ peso molecular” se define como la masa molar de una única molécula de un compuesto o polímero particular.

Como se usa en la presente descripción, el término “cromatografía” significa el proceso de hacer pasar una mezcla disuelta en una fase móvil a través de una fase estacionaria (es decir, medio de cromatografía) alojada en una columna o cartucho u otro recipiente, que separa una molécula objetivo de otras moléculas en la mezcla y permite aislarla. Dependiendo del tipo de cromatografía usada, la molécula objetivo puede adsorberse en la fase estacionaria mientras los componentes no deseados se hacen pasar a través del dispositivo, o viceversa. La expresión “cromatografía líquida” es una forma de cromatografía donde se usa un líquido como fase móvil y un sólido o un líquido sobre un soporte sólido como la fase estacionaria. La expresión “cromatografía ultrarrápida” significa la cromatografía líquida que se realiza con una presión positiva (p. ej., hasta 2,07 MPa [300 psi]). La expresión “ high performance liquid chromatography” -(cromatografía líquida de alto rendimiento - HPLC) se refiere a la cromatografía líquida que se realiza con una presión positiva alta (p. ej., hasta aproximadamente 34,47 MPa [5000 psi]). La expresión “cromatografía preparativa” significa HPLC para el aislamiento y la purificación de un compuesto o molécula objetivo. La expresión “fast protein liquid chromatography” -(cromatografía líquida de proteínas rápida” - FPLC) es una forma de HPLC útil para la separación de biomoléculas.

Como se usa en la presente descripción, el término “ impurezas” significa materiales presentes en las partículas inorgánicas, distintos de los inorgánicos.

Como se usa en la presente descripción, el término “ irregular” aplicado a las partículas inorgánicas significa que la forma de la partícula de una partícula a la siguiente no es uniforme (es decir, forma de partícula aleatoria) con una relación de aspecto superior a 1,0.

Como se usa en la presente descripción, el término “carcasa” significa un vaso o recipiente para contener una fase estacionaria para su uso en cromatografía, e incluye cartuchos, columnas, tubos, dispositivos, lechos, bolsas y similares.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “fase estacionaria” o “ medio de cromatografía” o “soporte de cromatografía” significa un material que incluye una superficie funcionalizada (p. ej., ligandos unidos a la superficie de las partículas inorgánicas a través de algún grupo funcional) que muestra diferentes afinidades por componentes diferentes en una mezcla de muestras, que se usa en cromatografía para separar una molécula objetivo (p. ej., ligatos) de una mezcla de una o más de otras moléculas. Las fases estacionarias incluyen materiales orgánicos e inorgánicos, o híbridos de los mismos, y pueden estar en forma de partículas, monolitos, membranas, recubrimientos y similares.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “distribución de tamaño de poro” significa la abundancia relativa de cada tamaño de poro en un volumen representativo de partículas inorgánicas porosas. Como se usa en la presente descripción, “ mediana de tamaño de poro” es el diámetro de poro en el que reside 50 % del volumen de poro intrapartícula. Véase la Fig. 3.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ amplitud relativa” se define como una medida del ancho de la distribución de tamaño de poro. La “ amplitud” se mide restando el tamaño de poro d10 (es decir, el tamaño/diámetro de poro por debajo del cual reside 10 % del volumen de poro) del tamaño de poro d90 (es decir, el tamaño/diámetro de poro por debajo del cual reside 90 % del volumen de poro) según se miden por porosimetría de mercurio. La expresión “amplitud relativa” se define como la relación (d90-d10)/d50 y se representa en la Fig. 3.

La presente invención se refiere a columnas de cromatografía. La presente descripción se refiere adicionalmente a métodos para fabricar columnas de cromatografía, así como a métodos para usar columnas de cromatografía. A continuación se proporciona una descripción de columnas de cromatografía ilustrativas, métodos para fabricar columnas de cromatografía y métodos para usar columnas de cromatografía.

La Fig. 1 proporciona una vista de una columna 100 de cromatografía ilustrativa de la presente invención. Como se muestra en la Fig. 1, la columna 100 de cromatografía ilustrativa comprende una carcasa 150 de columna; y espacio 151 de lecho de medio colocado dentro de la carcasa 150 de columna. De forma deseable, el medio 151 comprende partículas inorgánicas porosas que tienen una mediana de tamaño de poro de al menos 10 Angstrom (Á). Como se muestra adicionalmente en la Fig. 1, la carcasa 150 de columna comprende típicamente un miembro 156 de carcasa tubular, un primer casquete 152 de extremo de miembro de carcasa tubular, un segundo casquete 153 de extremo de miembro de carcasa tubular opuesto al casquete 152 de extremo, una entrada 154 de columna y una salida 155 de columna. La columna 100 puede compactarse con partículas inorgánicas porosas en forma de una suspensión a través de la entrada 154 de columna, comprendiendo la entrada de columna un orificio central 157 que tiene un conducto en el mismo, y la boquilla 158. Puede usarse una amplia variedad de boquillas que facilitan la distribución y el empaquetamiento uniforme de la suspensión dentro del espacio de lecho. Los filtros 159 se colocan en la cara interior de los casquetes 152, 153 de extremo y actúan con el miembro tubular 156 para definir el espacio 151 de lecho y también para evitar la fuga del medio particulado del espacio 151 de lecho. Un canal 160 de distribución está situado transversalmente a través de la cara del primer casquete 152 de extremo y/o el segundo casquete 153 de extremo, y está en comunicación fluida con el filtro 159. El canal 160 de distribución de fluidos actúa facilitando la distribución radial del líquido. En una forma simple, el canal 160 de distribución comprende al menos una ranura circunferencial y/o radial en la cara del primer y/o segundo casquetes 152 y 153 de extremo. La ranura se coloca de forma que afecta a la distribución circunferencial y/o radial del líquido que emana de la boquilla 158 de la entrada 154. Se comprenderá que es posible una amplia variedad de capacidades de columna, que varía típicamente de 0,1 a 2000 litros, y de 0,1 a 100 litros cuando se usa la columna como columna desechable. Véase también US-2008/0017579.

La carcasa 150 de columna puede estar formada por una diversidad de materiales. Típicamente, la carcasa 150 de columna comprende un material polimérico, un material metálico, un material de vidrio, un material cerámico, o un material compuesto de los mismos, y de forma deseable, comprende un material polimérico. Los materiales poliméricos adecuados para formar la carcasa 150 de columna incluyen, aunque no de forma limitativa, cualesquiera sólidos orgánicos sintéticos o semisintéticos, tales como plástico, que sean moldeables, incluidas poliolefinas.

La carcasa 150 de columna puede formarse usando técnicas convencionales de termoformación. Por ejemplo, el miembro 156 de carcasa tubular, el primer casquete 152 de extremo del miembro de carcasa tubular y el segundo casquete 153 de extremo del miembro de carcasa tubular de la carcasa 150 de columna pueden formarse cada uno de ellos independientemente a través de una etapa de moldeado. En algunas realizaciones, el miembro 156 de carcasa tubular y uno de entre (i) el primer casquete 152 de extremo del miembro de carcasa tubular y (ii) el segundo casquete 153 de extremo del miembro de carcasa tubular de la carcasa 150 de columna se forman a través de una única etapa de moldeo (es decir, uno de los casquetes de extremo se forma integralmente en un extremo del miembro 156 de carcasa tubular).

Como se ha analizado anteriormente, el medio 151 colocado dentro de la carcasa 150 de columna puede comprender partículas inorgánicas porosas que tengan una mediana de tamaño de poro de al menos aproximadamente 300 Á. En otra realización, las partículas inorgánicas porosas tienen una mediana de tamaño de poro de al menos aproximadamente 300 Á (o al menos aproximadamente 350 Á: o al menos aproximadamente 400 Á; o al menos aproximadamente 450 Á; o al menos aproximadamente 500 Á, o al menos aproximadamente 600 Á; o al menos aproximadamente 700 Á; o al menos aproximadamente 800 Á; o superior a aproximadamente 1000 Á, o al menos aproximadamente 2000 Á, o al menos aproximadamente 3000 Á, o al menos aproximadamente 4000 Á) hasta aproximadamente 6000 Á. En algunas realizaciones, las partículas inorgánicas porosas tienen una mediana de tamaño de poro de aproximadamente 500 Á a aproximadamente 6000 Á.

En otras realizaciones, las partículas inorgánicas porosas típicamente tienen un tamaño de partícula, según se mide por una mediana de dimensión de partícula, que varía de aproximadamente 1 micrómetro (pm) a aproximadamente 150 pm. Las partículas inorgánicas porosas típicamente tienen una mediana de dimensión de partícula de aproximadamente 1 pm, más típicamente, inferior a aproximadamente 120 pm. En algunas realizaciones, las partículas inorgánicas porosas tienen una mediana de dimensión de partícula de aproximadamente 10 a aproximadamente 120 pm, de forma más deseable, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 pm.

En otra realización, las partículas inorgánicas porosas típicamente tienen una forma irregular, pero pueden tener cualquier forma (p. ej., esférica, elíptica, etc.). Independientemente de la forma, las partículas inorgánicas porosas típicamente tienen una mediana de dimensión de partícula según se analiza en la presente descripción.

En realizaciones adicionales, las partículas inorgánicas porosas tienen típicamente una relación de aspecto de al menos aproximadamente 1,0 según se mide, por ejemplo, usando técnicas de Transmission Electron Microscopy (Microscopía Electrónica de Transmisión - TEM). Como se usa en la presente descripción, la expresión “ relación de aspecto” se usa para describir la relación entre (i) la mediana de dimensión de partícula de las partículas inorgánicas porosas y (ii) la mediana de dimensión de partícula de sección transversal de las partículas inorgánicas porosas, en donde la dimensión de partícula de sección transversal es sustancialmente perpendicular a la dimensión de partícula más grande de las partículas inorgánicas porosas. En algunas realizaciones de la presente invención, las partículas inorgánicas porosas tienen una relación de aspecto de al menos aproximadamente 1,1 (o al menos aproximadamente 1,2, o al menos aproximadamente 1,3, o al menos aproximadamente 1,4) hasta aproximadamente 5.0. Típicamente, las partículas inorgánicas porosas tienen una relación de aspecto de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 1,5.

En algunas realizaciones, las partículas inorgánicas porosas típicamente tienen un volumen de poro según se mide por porosimetría por nitrógeno de al menos aproximadamente 0,5 cc/g. En una realización ilustrativa de la presente invención, las partículas inorgánicas porosas tienen un volumen de poro según se mide por porosimetría por nitrógeno de aproximadamente 1,0 cc/g a aproximadamente 3,0 cc/g. En otra realización ilustrativa de la presente invención, las partículas inorgánicas porosas tienen un volumen de poro según se mide por porosimetría por nitrógeno de aproximadamente 1,0 cc/g a aproximadamente 2,0 cc/g.

En otra realización, las partículas inorgánicas porosas también tienen un área de superficie según se mide por el método de adsorción de nitrógeno BET (es decir, el método Brunauer Emmet Teller) de al menos aproximadamente 20 m2/g, o al menos aproximadamente 25 m2/g, o al menos aproximadamente 30 m2/g. En una realización ilustrativa de la presente invención, las partículas porosas de óxido inorgánico tienen un área de superficie BET de aproximadamente 20 m2/g a aproximadamente 2000 m2/g, o de 25 m2/g a aproximadamente 2000 m2/g o de aproximadamente 30 m2/g a aproximadamente 1000 m2/g. En una realización ilustrativa adicional de la presente invención, las partículas porosas de óxido inorgánico tienen un área de superficie BET de aproximadamente 20 m2/g a aproximadamente 1000 m2/g, o de aproximadamente 25 m2/g a aproximadamente 1000 m2/g, o de aproximadamente 30 m2/g a aproximadamente 1000 m2/g.

Según la invención, las partículas pueden tener una superficie funcionalizada que comprende al menos una molécula que tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 300 g/mol, o al menos aproximadamente 400 g/mol, o al menos aproximadamente 500 g/mol, hasta aproximadamente 500.000 g/mol. En otra realización, las partículas pueden comprender sílice que tiene una pureza de al menos aproximadamente 93 % en peso de SiÜ2, o al menos aproximadamente 93 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente 94 % en peso de S Ó al menos aproximadamente 95 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente 96 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente 97 % en peso de SiÜ2, o al menos aproximadamente 98 % en peso de SiÜ2 hasta 100 % en peso de SiÜ2 basada en el peso total de la partícula.

Según la invención, las partículas inorgánicas porosas tienen una amplitud relativa con respecto a la distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,8, o al menos aproximadamente 0,9, o al menos aproximadamente 1.0, o al menos aproximadamente 1,1, o al menos aproximadamente 1,2, o al menos aproximadamente 1,3, o al menos aproximadamente 1,4, o al menos aproximadamente 1,5. En otras realizaciones, las partículas inorgánicas porosas típicamente tienen una amplitud relativa con respecto a la distribución de tamaño de poro de hasta aproximadamente 2,0. Véase la Fig. 3 , donde se presenta una distribución de tamaño de poro de una partícula ilustrativa.

En algunas realizaciones ilustrativas, las partículas inorgánicas porosas de la presente invención se preparan a partir de una diversidad de materiales inorgánicos porosos. En otras realizaciones, las partículas inorgánicas porosas incluyen óxidos inorgánicos precipitados porosos, geles de óxidos inorgánicos y óxidos pirógenos.

En realizaciones que comprenden geles, las partículas parentales derivan de geles de óxidos inorgánicos porosos, tales como, aunque no de forma limitativa, geles que comprenden SO2. Los geles pueden ser hidrogeles, aerogeles o xerogeles. Un hidrogel también se conoce como un acuagel que se forma en agua y como resultado sus poros se llenan de agua. Un xerogel es un hidrogel al que se le ha retirado el agua. Un aerogel es un tipo de xerogel al que se le ha retirado el líquido de manera que se minimiza cualquier colapso o cambio en la estructura del gel cuando se retira el agua.

Los geles son bien conocidos en la técnica. Véase “The Chemistry of Silica” de Iler, pág. 462 (1979). Las partículas de gel, p. ej., de gel de sílice, se distinguen de las partículas de sílice coloidal o de sílice precipitada. Por ejemplo, la sílice coloidal se prepara como una suspensión de partículas de sílice densas y no porosas. Las partículas de sílice coloidal típicamente son inferiores a 200 nm (0,2 micrómetros). Como se ha mencionado anteriormente, estas partículas no tienen porosidad interna. Por otro lado, las típicas partículas precipitadas dispersas tienen cierta porosidad interna. Sin embargo, en algunos casos, la porosidad interna en partículas típicamente precipitadas colapsa en gran medida por la presión capilar creada por los meniscos de agua que retroceden cuando se evapora el agua durante el secado. Las condiciones para fabricar sílice coloidal y sílice precipitada se conocen bien.

Los geles, por otro lado, se preparan en condiciones que promueven la coalescencia de partículas primarias (que típicamente tienen una mediana de tamaños de partículas de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nm, según se miden por transmission electron microscopy [microscopía electrónica de transmisión, es decir, TEM]) para formar una red tridimensional relativamente rígida. La coalescencia del gel se presenta a una macroescala cuando una dispersión de óxido inorgánico, p. ej., sílice, se endurece hasta formar una masa “de gel” o “gelificada” con integridad estructural.

Los métodos de preparación de geles de óxidos inorgánicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un gel de sílice se prepara mezclando una solución acuosa de un silicato de metal alcalino (p. ej., silicato de sodio) con un ácido fuerte, tal como ácido nítrico o ácido sulfúrico, realizándose la mezcla en condiciones adecuadas de agitación para formar un sol de sílice transparente que se endurece en un hidrogel, es decir, un macrogel, en menos de aproximadamente media hora. El gel resultante después se lava. La concentración de óxido inorgánico, es decir, SiO2, formado en el hidrogel está usualmente en el intervalo de aproximadamente 10 y aproximadamente 50, preferentemente entre aproximadamente 20 y aproximadamente 35, y con máxima preferencia entre aproximadamente 30 y aproximadamente 35 por ciento en peso, siendo el pH de dicho gel de aproximadamente 1 a aproximadamente 9, preferentemente de 1 a aproximadamente 4. Puede emplearse una amplia variedad de temperaturas de mezcla, siendo típicamente este intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 0C.

Los hidrogeles recién formados se lavan simplemente por inmersión en una corriente de agua en movimiento continuo, que lixivia las sales indeseables, dejando atrás aproximadamente 99,5 por ciento en peso o más de óxido inorgánico puro.

El pH, la temperatura y la duración del agua de lavado influirán en las propiedades físicas de la sílice, tales como el surface area (área de superficie - SA) y el pore volume (volumen de poro - PV). El gel de sílice lavado a 65-90 0C a pH de 8-9 durante aproximadamente 15 a aproximadamente 36 horas tendrá usualmente SA de aproximadamente 250 a aproximadamente 400 m2/g y formará aerogeles con PV de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,7 cc/gm. El gel de sílice lavado a pH de 3-5 a aproximadamente 50 a aproximadamente 65 0C durante aproximadamente 15 a aproximadamente 25 horas tendrá SA de aproximadamente 700 a aproximadamente 850 m2/g y formará aerogeles con PV de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 1,3 ml/g. Estas mediciones se generan mediante el bien conocido método de porosidad de N2. El hidrogel se seca soplando aire a una temperatura que varía de 100 a 180 °C a través del lecho de hidrogel hasta que la humedad del gel es inferior a aproximadamente 20 %, preferentemente inferior a aproximadamente 10 %, y más preferentemente inferior a aproximadamente 5 % en peso. Pueden encontrarse procesos para fabricar xerogeles en las Patentes de los EE. UU. N.° 6.565.905 y 5.622.743.

También puede usarse sílice precipitada reforzada tal como la descrita en la Patente de los EE. UU. N.° 4.157.920 para preparar la dispersión de esta invención. Por ejemplo, las sílices precipitadas reforzadas pueden prepararse acidulando en primer lugar un silicato inorgánico alcalino para crear un precipitado inicial. Después, el precipitado resultante se refuerza o se “postacondiciona” mediante silicato y ácido adicionales. El precipitado resultante de la segunda adición de silicato y ácido comprende de 10 a 70 % en peso del precipitado preparado inicialmente. Se cree que la estructura reforzada de este precipitado es más rígida que la de los precipitados convencionales como resultado de la segunda precipitación. Se cree que incluso después de la molienda, el centrifugado y el posterior secado, el silicato reforzado mantiene sustancialmente su rigidez y porosidad de red. Esto contrasta con otras sílices precipitadas, tales como aquellas descritas en US-5.030.286.

En otra realización, el óxido inorgánico comprende sílice pirógena. La sílice pirógena puede fabricarse usando los procesos descritos en el documento DE-762723. La producción de sílice pirógena también se analiza en Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, vol. A23, 1993, Capítulo 6.

Una vez formadas las partículas porosas, después se muelen. Las condiciones generales de molienda pueden variar dependiendo del material de alimentación, el tiempo de residencia, las velocidades del impulsor y la mediana del tamaño de partícula de molienda. Estas condiciones pueden variarse para obtener el tamaño deseado dentro del intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 120 micrómetros. Las técnicas para seleccionar y modificar estas condiciones para obtener las dispersiones deseadas son conocidas por los expertos en la técnica. El equipo de molienda usado para moler las partículas porosas de óxido inorgánico debe ser del tipo capaz de moler y reducir estrictamente los materiales a partículas que tengan tamaños de aproximadamente 1 a aproximadamente 120 micrómetros, p. ej., a través de acción mecánica. Dichos molinos están disponibles en el mercado, siendo los molinos de martillos y los de amasado particularmente adecuados para este fin. Los molinos de martillos imparten la acción mecánica necesaria a través de cuchillas metálicas de alta velocidad, y los molinos de amasado imparten la acción a través de agitación rápida de un medio tal como perlas de circonio o arena. También pueden usarse molinos de impacto. Tanto los molinos de impacto como los molinos de martillos reducen el tamaño de partícula por el impacto del óxido inorgánico con cuchillas metálicas. Otros molinos adecuados para el uso en esta invención incluyen, aunque no de forma limitativa, el Air Classifying Mill (Molino Clasificador de Aire - ACM) o el Fluid Energy Mill (Molino de Energía Fluida - FEM). Las partículas de óxido inorgánico molidas pueden clasificarse usando un clasificador de aire si no se realiza durante el proceso de molienda.

En una realización de la presente invención, las partículas inorgánicas porosas molidas se tratan después hidrotérmicamente a aproximadamente 100 a aproximadamente 400 0C durante aproximadamente 2 a aproximadamente 20 horas y a un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10. Como alternativa, el tratamiento hidrotérmico puede realizarse como se establece en las Pat. de los EE. UU. N.° 5.976.479; 4.732.887; y 4.104.363. Las condiciones del tratamiento hidrotérmico afectan al volumen de poro, al área de superficie, al tamaño de poro y a la integridad estructural de las partículas.

Las partículas porosas de óxido inorgánico pueden modificarse en su superficie para potenciar selectivamente la unión de un material deseado a la superficie de partícula de óxido inorgánico. Por ejemplo, las partículas porosas de óxido inorgánico pueden comprender adicionalmente una química de superficie en forma de uno o más restos químicos unidos a las mismas para unirse selectivamente a uno o más materiales dentro de un fluido dado procesado a través de la columna de cromatografía, lo que se denomina en la presente descripción superficie funcionalizada. Pueden unirse a la superficie de la partícula restos químicos tales como ligandos bifuncionales, etc., por ejemplo, según se describe en la Patente de los EE. UU. N.° 7.166.213 asignada a W. R. Grace & Co. - Conn. Según la invención, el medio de cromatografía incluye un ligando como parte de la superficie funcionalizada de la partícula, y típicamente se une covalentemente a la partícula a través de algún enlace. Según la invención, el uno o más ligandos comprenden grupos ácido sulfónico, amonio cuaternario, dietil aminoetilo, carboxil metilo; colorantes sintéticos; compuestos alquílicos (tales como octilo); proteínas; lectinas; anticuerpos; antígenos, enzimas o combinaciones de los mismos. Los ligatos, es decir, compuestos que pueden separarse mediante técnicas cromatográficas, incluyen una amplia variedad de biomoléculas tales como proteínas; enzimas; péptidos; anticuerpos; antígenos; lectinas; ADN; ARN; antibióticos; etc.

En una realización de la presente descripción, la superficie de las partículas de óxido inorgánico se trata en primer lugar con dos conjuntos de silanos que llevan diferentes grupos funcionales. El primer conjunto de grupos funcionales permite la polimerización de uno o más monómeros sobre la superficie de partícula a través del primer conjunto de grupos funcionales (p. ej., enlazadores), y el segundo conjunto de grupos funcionales aumenta la humectabilidad de dicha superficie. La polimerización posterior introduce grupos con carga iónica que permiten interacciones y uniones de biomoléculas.

Las columnas de cromatografía de la presente invención, tales como la columna 100 de cromatografía ilustrativa, pueden adaptarse para su uso en una aplicación determinada. Independientemente de la aplicación, las columnas de cromatografía de la presente invención, tales como la columna 100 de cromatografía ilustrativa, pueden tener un tamaño que permita que puedan insertarse en una diversidad de sistemas de cromatografía. La Fig. 2 representa una vista de un sistema 200 de cromatografía ilustrativo que comprende la columna de cromatografía mostrada en la Fig. 1.

Como se muestra en la Fig. 2 , el sistema 200 de cromatografía ilustrativo comprende los siguientes componentes: columna 100 de cromatografía, depósito 201 de disolvente, bomba 202, precolumna 203, puerto 204 de inyección, detector 206, registrador/monitor 207 y colector 208 de residuos. Aunque no se muestra en la Fig. 2 , la columna 100 de cromatografía puede usarse en combinación con otros componentes del sistema adecuados para su uso en sistemas de cromatografía, tales como el sistema 200 de cromatografía ilustrativo, en donde los otros componentes del sistema incluyen, aunque no de forma limitativa, múltiples depósitos 201 de disolvente, una bomba de vacío, un divisor de flujo, un manómetro, un desgasificador, un colector de fracciones, etc.

La presente descripción también se refiere a métodos para fabricar columnas de cromatografía. En una realización, el método para fabricar una columna de cromatografía comprende incorporar partículas porosas de óxido inorgánico en la carcasa de columna. El método para fabricar una columna de cromatografía puede comprender además una o más etapas adicionales. Las etapas adicionales adecuadas incluyen, aunque no de forma limitativa, formar la carcasa de columna a través de una etapa de termoformación (p. ej., cualquier etapa de moldeo, p. ej., moldeo por inyección); limpiar las partículas porosas de óxido inorgánico colocadas dentro de la carcasa de columna exponiendo las partículas porosas de óxido inorgánico a una solución que no sea de NaOH; validar la columna de cromatografía a través de uno o más ensayos de validación; y compactar la columna de cromatografía limpia y validada en un recipiente transportable.

En los métodos descritos, la etapa de formación de la carcasa de columna a través de una etapa de termoformación puede comprender termoformar un miembro de carcasa tubular, y al menos un casquete de extremo de miembro de carcasa tubular separado y acoplable. En algunas realizaciones, la etapa de termoformación comprende termoformar (i) un miembro de carcasa tubular que tiene un primer extremo abierto y un extremo opuesto cerrado (es decir, un casquete de extremo formado integralmente que tiene una salida de carcasa de columna en el mismo), y (ii) un primer casquete de extremo de miembro de carcasa tubular que está separado y es acoplable al extremo abierto del miembro de carcasa tubular. En otras realizaciones, la etapa de termoformación comprende termoformar (i) un miembro de carcasa tubular que tiene extremos abiertos opuestos, (ii) un primer casquete de extremo de miembro de carcasa tubular separado y acoplable a un primer extremo abierto del miembro de carcasa tubular, y (iii) un segundo casquete de extremo de miembro de carcasa tubular separado y acoplable a un segundo extremo abierto del miembro de carcasa tubular, siendo el segundo casquete de extremo de miembro de carcasa tubular acoplable al casquete de extremo de miembro de carcasa tubular opuesto al primer casquete de extremo de miembro de carcasa tubular.

La presente descripción se refiere adicionalmente a métodos para usar columnas de cromatografía. En una realización, el método para usar una columna de cromatografía de la presente invención comprende posicionar la columna de cromatografía dentro de una posición de funcionamiento de un sistema de cromatografía; y procesar un fluido a través de la columna de cromatografía. En algunas realizaciones, el método para usar una columna de cromatografía comprende procesar un fluido que contiene una o más biomoléculas a través de la columna de cromatografía. Por ejemplo, el fluido puede comprender una proteína, un péptido, un oligonucleótido o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, la fase móvil o líquido que contiene uno o más analitos (molécula objetivo) o sustancias para la separación en la columna 100 se añade a través de la entrada 154 de columna. La fase móvil que sale de la salida 158 hacia el espacio 151 de lecho se distribuirá uniformemente a través del canal 160 de distribución, pasará a través del filtro 159 y después se eluirá uniformemente a través del lecho de medio particulado 151. La fase móvil finalmente saldrá de la columna a través de la salida 155 de columna.

Los métodos descritos para usar una columna de cromatografía de la presente invención, tal como la columna 100 de cromatografía ilustrativa, ventajosamente no comprenden una etapa de limpieza in situ dentro del sistema de cromatografía (p. ej., el sistema 200 de cromatografía ilustrativo mostrado en la Fig. 2). En otras palabras, pueden realizarse múltiples ejecuciones en un sistema de cromatografía dado, tal como el sistema 200 de cromatografía ilustrativo mostrado en la Fig. 2, sin necesidad de tener una etapa de limpieza in situ. En su lugar, cuando se ha usado una columna de cromatografía determinada y es necesario limpiarla, la columna de cromatografía usada se reemplaza por una columna de cromatografía de sustitución, y el sistema de cromatografía sigue funcionando sin los retrasos asociados a una etapa de limpieza in situ.

Los métodos descritos para usar las columnas de cromatografía descritas de la presente invención también pueden comprender la etapa de proporcionar la columna de cromatografía a un usuario, en donde la etapa de provisión comprende proporcionar una columna de cromatografía precompactada y validada al usuario. Esta etapa elimina la necesidad de que el usuario realice una o más etapas de preparación de la columna, y adicionalmente permite un uso eficiente del tiempo y la capacidad de procesamiento del usuario.

Pueden ser adecuados métodos para usar columnas desechables para separar una o más biomoléculas de una muestra. Aunque no se limitan a ninguna aplicación particular, los métodos para usar columnas desechables de la presente invención pueden usarse para separar una o más biomoléculas de una muestra, en donde la una o más biomoléculas se seleccionan de al menos una proteína, péptido, oligonucleótido, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, metabolitos, virus, vacunas o cualquier combinación de los mismos.

En realizaciones ilustrativas, las partículas porosas de la presente invención pueden usarse en una diversidad de aplicaciones que incluyen todas las fases de unión mencionadas en la presente descripción, por ejemplo, tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de afinidad, la exclusión por tamaño, y similares. La cromatografía de intercambio iónico se usa frecuentemente en protocolos para el aislamiento de inmunoglobulinas. En la cromatografía de intercambio aniónico, las cadenas laterales de aminoácidos con carga negativa de la inmunoglobulina interactuarán con ligandos con carga positiva de una matriz de cromatografía. Por otro lado, en la cromatografía de intercambio catiónico, las cadenas laterales de aminoácidos con carga positiva de la inmunoglobulina interactuarán con ligandos con carga negativa de una matriz de cromatografía. La Hydrophobic interaction chromatography (cromatografía de interacción hidrófoba -HIC) es otro método descrito y usado en protocolos para el aislamiento de inmunoglobulinas. Si el objetivo es obtener un producto de inmunoglobulina de gran pureza, habitualmente se recomienda combinar la HIC con una o más etapas adicionales. En la HIC, para hacer que la inmunoglobulina se una eficazmente a la matriz de HIC, se requiere la adición de sales liotrópicas a la fase móvil. La inmunoglobulina unida se libera posteriormente de la matriz mediante la disminución de la concentración de sal liotrópica. La cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas entre una biomolécula diana y un ligando biespecífico en un principio de reconocimiento cerradura-llave. Por lo tanto, el objetivo y el ligando constituirán un par de afinidad, tal como antígeno/anticuerpo, enzima/receptor, etc. Los ligandos de afinidad basados en proteínas son bien conocidos, tal como la cromatografía de afinidad de Proteína A, Proteína G y Proteína L, que son métodos muy extendidos para el aislamiento y la purificación de anticuerpos. Es bien sabido que la cromatografía de Proteína A proporciona una especificidad excepcional, particularmente hacia anticuerpos monoclonales, y por consiguiente se obtienen purezas altas. Usados en combinación con el intercambio iónico, la interacción hidrófoba, las etapas de filtración de hidroxiapatita y/o gel, los métodos basados en Proteína A se han convertido en el método para purificar anticuerpos de elección para muchas empresas biofarmacéuticas, véase, p. ej., WO 8400773 y la Patente de los EE. UU. N.° 5.151.350.

En realizaciones ilustrativas, las partículas porosas de la presente invención pueden usarse en una diversidad de aplicaciones, tales como matrices o medios de separación de modo mixto o multimodales. La expresión medio de separación “ multimodal” se refiere a una matriz capaz de proporcionar al menos dos sitios diferentes, pero cooperativos, que interactúan con el compuesto que ha de unirse. Por ejemplo, uno de estos sitios puede proporcionar un tipo atractivo de interacción carga-carga entre el ligando y la sustancia de interés. El otro sitio puede proporcionar una interacción aceptor-donador de electrones y/o interacciones hidrófobas y/o hidrófilas. Véase, p. ej., la Pat. de los EE. UU. N.° 7.714.112. Además, las partículas porosas de la presente invención pueden usarse en adsorción en lecho expandido (véase, p. ej., la Pat. de los EE. UU. N.° 6.620.326); como parte de una membrana para mejorar el rendimiento de la purificación (véase, p. ej., US-2011/0049042); usada en aplicaciones con adsorción en lecho fluidizado (véase, p. ej., US-2005/0269257), y en cualesquiera otras aplicaciones adecuadas para la purificación o adsorción usando materiales de poro ancho.

La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no deben considerarse de ninguna manera como limitaciones impuestas al alcance de la misma. Por el contrario, debe comprenderse claramente que puede recurrirse a diversas otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de la misma que, después de la lectura de la descripción de la presente descripción, puedan sugerirse a los expertos en la técnica sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen procesos según la presente descripción para preparar un medio de cromatografía que tienen superficies funcionalizadas, incluidos el intercambio iónico y la proteína A, pero puede usarse otra funcionalización de superficie. Una realización de la presente invención mostrada en los ejemplos se refiere al material de intercambio iónico basado en medio inorgánico poroso que se preparó mediante un proceso que consistió en dos etapas principales: (1) unión de sílice de poros grandes con dos silanos: (3-glicidiloxipropil)trimetoxisilano y metacrilato de 3-(trimetoxisilil) propilo para formar un intermedio inicialmente unido; y (2) polimerización en solución de monómero o monómeros iónicos, con un iniciador azoico, en la presencia del intermedio de sílice inicialmente unido para medio de intercambio aniónico fuerte (sílice Q) o medio de intercambio catiónico fuerte (sílice S).

Otra realización mostrada en los ejemplos fue un proceso para la preparación de sílice Q en donde los monómeros utilizados fueron cloruro de (3-acrilamidopropil) trimetilamonio, una pequeña cantidad de solución de cloruro de dialildimetilamonio y el iniciador es diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-metilpropionamidina) (iniciador V-50).

Otra realización mostrada en los ejemplos es un proceso para la preparación de sílice S. El proceso incluía una etapa adicional de lavado del intermedio inicialmente unido con solución de cloruro de tetrametilamonio que se añade para ayudar a la polimerización. En esta realización de polimerización, el monómero es ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico (AMPS) y el iniciador es ácido 4,4'-azobis(cianovalérico) (iniciador V-501). Esta polimerización usa un chain transfer agent (agente de transferencia de cadenas - CTA), p. ej., S,S'-Bis(a,a'-dimetil-a"-ácido acético)-tritiocarbonato, que es comercializado por ABCR GmbH KG. La función del CTA es controlar la longitud de la cadena de la polimerización y ayudar a reducir cualquier bloqueo de los poros (véase la Fig. 4). Este proceso es esencialmente una polimerización por reverse addition fragmentation chain transfer (transferencia de cadenas por fragmentación de adición inversa - RAFT), un proceso de polimerización de radicales vivos.

Se funcionalizaron muchos tipos diferentes de partículas porosas mediante estos procesos. En algunos de los Ejemplos, se utilizó gel de sílice, que eran geles de sílice que tenían un tamaño de partícula de 75 micrómetros con una mediana de tamaños de poro de 250, 500, 800, 1000 Á. Los geles de sílice se prepararon usando el siguiente procedimiento: Se pusieron 190 g de una solución de ácido sulfúrico al 19 % en un reactor equipado con un agitador superior y se enfriaron a 5 0C. Por separado, se enfriaron también 263 g de una solución de silicato de sodio (SiO2 al 22,9 %) a 5 0C. Posteriormente, la solución de silicato de sodio se añadió a la solución de ácido sulfúrico a través de una bomba a un ritmo de manera que se añadiera toda la cantidad de silicato en 15 minutos. Durante la adición, la temperatura se mantuvo a 5 0C. Una vez completada la adición, el reactor se calentó a temperatura ambiente y se dejó que el contenido se gelificara sin agitación. Tras la gelificación, la masa de gel se cortó en trozos pequeños y se sumergió en agua, para retirar el sulfato de sodio formado durante la reacción. El nivel de sulfato de sodio que quedaba en el material se comprobaba periódicamente, ya que se drenaba agua de lavado y se añadía agua dulce al gel. Cuando el nivel cayó por debajo de 1 %, el gel se suspendió en agua y el pH del líquido se ajustó a pH=9,7 y la solución se calentó a 67 °C. La temperatura se mantuvo durante 20 horas y 20 minutos. Al final del período de calentamiento, el gel se recuperó por filtración y se secó en un horno a 160 0C hasta que el contenido de humedad del gel fue inferior a aproximadamente 5 % en peso. El gel de sílice obtenido de este modo tenía un área de superficie BET por nitrógeno de 325 m2/g y un volumen de poro por nitrógeno de 1,24 cc/g. Suponiendo poros cilíndricos y usando la ecuación: Tamaño de poro (Angstrom) = 40000XPV/SA este material presenta un tamaño de poro de 153 Angstrom. Posteriormente, el gel se muele hasta obtener el tamaño de partícula deseado (75 micrómetros) usando un ACM y después se trata hidrotérmicamente en un autoclave a 300 0C hasta conseguir el tamaño de poro deseado.

Los tamaños de partícula indicados en los Ejemplos se determinaron por dispersión de luz usando un Malvern Mastersizer 2000 comercializado por Malvern Instruments Ltd. según la norma ASTM B822-10. Las distribuciones de tamaño de poro se miden por intrusión de mercurio usando un Autopore IV 9520 comercializado por Micromeritics Instrument Corp. Los volúmenes de poro a los que se hace referencia en la presente descripción representan intrusión de mercurio en poros de 10.000 A y menos. También se obtienen áreas superficiales de BET a partir del análisis de sorción de nitrógeno. El análisis elemental del contenido de carbono y azufre se realizó usando un analizador de carbono y azufre LECO SC-632 comercializado por LECO Corp. El peso molecular medio se determinó mediante análisis por CPG usando un GPCV 2000 con IR y detección viscométrica comercializado por Waters Corp. La pureza de la sílice se midió mediante inductively coupled plasma (plasma acoplado inductivamente - ICP) usando un ICPE-9000 comercializado por Shimadzu Corp.

La distribución de tamaño de poro de las partículas de gel de sílice de la presente invención se examinó mediante los métodos expuestos en la presente descripción. Como puede observarse en la Fig. 3 , las partículas porosas de la presente invención poseen una distribución amplia de tamaño de poro (es decir, una amplitud relativa grande).

La Fig. 4 muestra vías de síntesis generales para sílice Q y sílice S.

El peso molecular de las muestras de los Ejemplos 11-24 se determinó usando el siguiente procedimiento: Se pesaron 0,5 gramos de muestras de sílice funcionalizada en su superficie en un tubo de centrífuga de 50 ml y se añadieron 10 ml de agua desionizada, seguidos de 2,2 ml de ácido fluorhídrico al 48 %, y después se mezclaron minuciosamente, y las muestras se dejaron reposar 30 minutos. Después de eso, se añadió ácido bórico, 3,5 gramos, para secuestrar fluoruro libre y las muestras se pusieron en un agitador de acción de muñeca durante 60 minutos. Después de la centrifugación y la filtración a través de un filtro de 0,2 pm con vacío, el sobrenadante transparente se recogió para su análisis. Los sobrenadantes se sometieron a un análisis por gel permeation chromatography (cromatografía de permeación en gel - GPC) usando un GPCV 2000 con IR y detección viscométrica comercializado por Waters Corp. que incluía una columna protectora Ultrahydrogel y columnas 120, 250 y 1000. Las soluciones anteriores se inyectaron en nitrato potásico acuoso al 1 % en fase móvil con un sistema de HPLC Waters equipado con un detector de IR. Los pesos moleculares de las soluciones se determinaron usando polietilenglicol y óxido de polietileno como patrones de calibración. Los pesos moleculares para los polímeros anteriores estaban por debajo de aproximadamente 200-300 KD.

Los ensayos de unión estática para Q se realizaron usando Bovine Serum Albumin (Albúmina Sérica Bovina - BSA) (concentración 25 mg/ml en tampón) a un pH de 8,0 con un tampón de Tris HCl 50 mM. El tampón de unión/lavado fue Tris-HCl 50 mM a un pH de 8,0 y el tampón de elución fue 50 mM/Tris-HCl/1 M NaCl a un pH de 8,0. Las muestras de sílice secas se pesaron en viales y, después, se añadieron soluciones de proteína en tampón de unión. Después de la adsorción durante la noche, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se separó/desechó. La muestra de sílice se lavó tres veces con tampón de lavado con centrifugación y separación. Después de las etapas de lavado, se añadió tampón de elución y se repitió la elución una segunda vez. La adsorción uV/Vis se midió para la solución de elución combinada a 280 um usando un espectrofotómetro Genesys 10S Bio UV-Vis comercializado por Thermo Fisher Scientific Inc.

Los ensayos de unión estática para S se realizaron usando lisozima de clara de huevo de gallina o gammaglobulina bovina (concentración 25 mg/ml en tampón) a un pH de 4,0 con tampón HOAc 50 mM/NaOAc. El tampón de unión/lavado fue HOAc 50 mM/NaOAc a un pH de 4,0 y el tampón de elución fue NaCl 1 M en HOAc 50 mM/NaOAc a un pH de 4,0. Las muestras de sílice secas se pesaron en viales y, después, se añadieron soluciones de proteína en tampón de unión. Después de la adsorción durante la noche, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se separó/desechó. La muestra de sílice se lavó tres veces con tampón de lavado con centrifugación y separación. Después de las etapas de lavado, se añadió tampón de elución y se repitió la elución una segunda vez. La adsorción UV/Vis se midió para la solución de elución combinada a 280 um usando un espectrofotómetro Genesys 10S Bio UV-Vis comercializado por Thermo Fisher Scientific Inc.

Los ensayos de unión dinámica se realizaron usando columnas de vidrio Omni de 0,66 cm de diámetro. Para 2 ml de columna, la longitud de la columna era de alrededor de 5,8 cm. Se retiraron los finos de las muestras de sílice con agua desionizada y, después, la columna se compactó por suspensión con Akta FPLC y a una velocidad lineal de aproximadamente 4000 cm/h. Para la curva de interferencia para Q, se hizo pasar proteína BSA en tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,0 (o lisozima o gammaglobulina en tampón de HOAc 50 mM/NaOAc, pH 4,0, para S) a través de una columna con Akta a aproximadamente 500 o 1000 cm/h. Las señales de UV-Vis a 280 nm se midieron usando un UV900 comercializado por General Electric, y los cromatogramas se registraron y trazaron con Microsoft Excel. Las Dynamic Binding Capacities (Capacidades de unión dinámica - DBC) se calcularon al 5 % del punto de interferencia usando las siguientes ecuaciones:

DBC = (Volumen a una interferencia de 5 % - Volumen del Sistema) X Concentración de Proteína / Volumen de Columna

Ejemplos 1-10

Se prepararon muestras de partículas de sílice porosas unidas inicialmente tratando las partículas de sílice con agente de tratamiento 1 (vinil silano), que es metacrilato de 3-(trimetoxisililo)propilo y/o agente de tratamiento 2 (epoxi silano), que es (3-glicidoxipropil)-trimetoxisilano. Los vinil y epoxi silanos se premezclaron. Un matraz de fondo redondo se cargó con partículas porosas y la cantidad de mezcla de agente tratante se añadió en el matraz. La mezcla se dejó rodar durante la noche. Se añadió ácido sulfúrico 0,5 M en la cantidad de 1/10 de sílice (en peso). La mezcla se dejó rodar a temperatura ambiente durante 1 hora y después se calentó hasta 70 0C durante 1 hora. El matraz se dejó enfriar y después la sílice se empapó con ácido sulfúrico 1 M durante 30 minutos y después se filtró. Después, se lavó con agua desionizada cinco veces, se filtró y se secó a 70 0C durante la noche. Las muestras resultantes se sometieron a un análisis elemental (LECO) para determinar el porcentaje de carbono sobre sílice y se etiquetaron como Ejemplos 1-10, respectivamente. Los resultados de estos ejemplos se registran en la Tabla 1 a continuación:

Tabla 1

Excepto para el Ejemplo 3, se usaron cantidades iguales de dos silanos para estas funcionalizaciones y las cantidades de carbono obtenidas fueron en general proporcionales a las cantidades totales de silanos usadas. En el ejemplo 3, solo se usó vinil silano para la unión en seco. Como se demostró en la Tabla 1 anterior, la cantidad de carbono, según se mide mediante análisis elemental de las muestras de sílice limpias y secas después del proceso de unión, se usó como indicador para determinar la cantidad de grupos funcionales de superficie después de la funcionalización de la superficie.

Ejemplos 11-24

Los Ejemplos 11-24 describen un proceso de preparación de materiales de intercambio aniónico fuerte. En estos Ejemplos, la sílice inicialmente unida de los Ejemplos 1-10 se trató en su superficie usando un primer monómero: Cloruro de (3-acrilamidopropil)-trimetilamonio (solución acuosa al 75 %); un monómero alternativo 1: Cloruro de [3-(metacriloilamino)propil] trimetilamonio (solución acuosa al 50 %); un monómero alternativo 2: Cloruro de [2-(Acriloilxi)etil]trimetilamonio (solución acuosa al 80 %); un segundo monómero: Cloruro de dialildimetilamonio (solución acuosa al 65 %); Iniciador V-50; y deionized water (agua desionizada - DIW) adicional.

Un matraz de fondo redondo de tres bocas se equipó con un agitador mecánico superior con cierre hermético a los gases, una entrada y salida de nitro gas y un manto calefactor con retroalimentación de termopar. La sílice y todos los reactivos, excepto el iniciador, se cargan en primer lugar en el matraz. El sistema se burbujeó con nitrógeno durante 20 minutos. Después se introdujo el iniciador. Se burbujeó nitrógeno durante otros 20 min antes de calentar gradualmente el matraz a 65 CC. La mezcla se mantuvo a 65 °C durante 2 horas con agitación superior y después se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla se vertió en solución de NaCl al 5 % en un vaso de precipitados. El matraz se aclaró con agua desionizada para desplazar completamente la sílice residual dentro del matraz. Después de agitar la mezcla con agitador superior durante unos pocos minutos, se filtró y se repitió el lavado tres veces con NaCl al 5 % y tres veces con agua desionizada. Las muestras se dejaron secar al aire, excepto por que una pequeña cantidad de sílice se secó a 900C durante la noche y después se sometió a análisis elemental del contenido de carbono. Las capacidades de unión se calcularon para la muestra según se describió anteriormente en la presente descripción. Las muestras resultantes se etiquetaron como Ejemplos 11-24. Los resultados analíticos y las capacidades de unión para estos Ejemplos se registraron en la Tabla 2 a continuación:

Tabla 2

La relación de reactivo es la cantidad de reactivo usada en la reacción en peso. Todos los monómeros usados en la Tabla 2 son soluciones acuosas, por lo que las cantidades reales se corrigen por múltiplos por concentración. Por ejemplo, en el Ejemplo 11 las cantidades de reactivos son: sílice=10 g, monómero=6,6 g, 2do monómero=0,6 g, iniciador=0,045 g, agua desionizada=65 g y la relación se calcula como 10: (6,6 x 0,75): (0,6 x 0,65): 0,045: 65 = 1:0,5:0,04:0,0045:6,5. El % de Cunión inicial es la cantidad de carbono en las muestras de sílice secas después de la etapa de unión inicial, según se mide por análisis elemental. % de Cfinal es la cantidad de carbono en las muestras de sílice purificadas y secas, según se mide por análisis elemental. Cpoli = % de Cfinal - % de Cunión inicial es la cantidad de carbono aportada por los grupos poliméricos en la superficie de la sílice. La relación Cpoli/Cunión inicial es la división de los dos números de carbono, que es una medida del carbono aportado por el polímero en comparación con el aportado por la unión inicial. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que una relación más alta es una indicación de un polímero de cadena más larga con menor número de cadenas en la superficie, y esto se prefiere frente a una relación más baja que indica una cadena más corta con más cadenas en la superficie para una mayor unión de proteínas, ya que las cadenas más largas proporcionan más flexibilidad para los polímeros unidos. Se usó bovine serum albumin (albúmina sérica bovina - BSA) como proteína modelo para todos los ensayos de unión de las muestras. Se prefieren valores de unión más altos. S significa Static binding (unión estática - SBC), donde la unión de BSA en la sílice modificada se midió en modo estático (véase el procedimiento de la medición a continuación). D significa dynamic binding (unión dinámica - DBC), donde la unión de BSA en la sílice modificada se midió en modo de flujo dinámico (véase el procedimiento de la medición a continuación). Obsérvese que n/m significa no medido.

Como puede observarse a partir de la Tabla 2, excepto por el Ejemplo 13, todas las muestras proporcionaron resultados de unión aceptables. En el Ejemplo 13, ningún polímero se unió a la superficie de la sílice. En los Ejemplos 14 y 15, el segundo monómero, cloruro de dialildimetilamonio, proporcionó una mayor unión a proteína BSA en general. En el Ejemplo 16, al aumentar la relación % de Cpolímero/% de Cunión inicial, la unión de BSA mejoró. En los Ejemplos 17, 18 y 20, se sometieron a ensayo monómeros alternativos. El monómero alternativo 1 proporcionó una unión a BSA ligeramente mayor que una muestra del primer monómero (Ejemplo 19), mientras que el monómero alternativo 2 proporcionó una unión a proteína mucho menor que el primer monómero. En el Ejemplo 21, la muestra se preparó con sílice que tenía un diámetro/tamaño de poro de 800 Á, que produjo la mayor unión a proteína BSA. El Ejemplo 22 proporcionó una mayor unión a BSA que el 23 porque tenía una relación mayor de números de carbonos. En el Ejemplo 24, se obtuvo una unión a proteína menor.

Ejemplos 25-28

Los Ejemplos 25-28 muestran otro proceso para preparar un material de intercambio aniónico fuerte. El procedimiento general para las muestras de unión inicial para los Ejemplos 25-28 (Tabla 3) fue como se indica a continuación: Se mezclaron 50 g de sílice seca con 0,6 g de vinil silano y 0,6 g de epoxi silano en un matraz de fondo redondo de 1 l seco en un Rotavap a temperatura ambiente durante toda la noche (16 horas), y después la sílice se transfirió a un vaso de precipitados de 1 l y se empapó con 500 ml de ácido sulfúrico 1 M durante 1 hora. La filtración y el lavado con 5 x 500 de agua desionizada produjeron muestras de sílice inicialmente unidas que se secaron a 70 °C durante la noche.

Ejemplos 25-27

El procedimiento del proceso de polimerización para los Ejemplos 25-27 fue como se indica a continuación: De forma similar al proceso usado en los Ejemplos 11 -24, se mezclaron 30 g de sílices secas de la etapa anterior con monómeros, iniciador y agua según la Tabla 3. Los resultados analíticos para los productos finales para los Ejemplos 25-27 se registraron también en la Tabla 3.

Ejemplo 28

El procedimiento del proceso para el Ejemplo 28 fue como se indica a continuación: En un vaso de precipitados de 250 ml se mezclaron la cantidad de reactivos descritos para el Ejemplo 28 en la Tabla 3. Se agitó para disolver todo en el agua. La solución se vertió en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 30 g de sílice inicialmente unida (0,76 % de Carbono). Se burbujeó nitrógeno gaseoso en el matraz durante 30 minutos (el matraz se agitó ocasionalmente para permitir que la sílice y la solución acuosa se mezclaran bien), y después se retiró rápidamente el tubo de gas y se selló la parte superior de los matraces con una cinta. El matraz se calentó gradualmente a 650C con un baño de agua (~30 minutos) y la temperatura se mantuvo a 650C durante 2 horas. Después, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla se vertió en 400-500 ml de solución de NaCl al 10 % en un vaso de precipitados de 1 l con cierto aclarado con agua desionizada para desplazar totalmente la sílice residual dentro del matraz. La sílice se agitó con una espátula durante unos minutos y después las partículas se dejaron sedimentar. El sobrenadante de la fase líquida superior se decantó en el residuo, y la sílice residual se mezcló con 500 ml de solución de NaCl al 5 %. Después, la muestra de sílice se lavó con 3 x 500 ml de solución de NaCl al 5 % con 3 x 500 ml adicionales de agua desionizada, cada lavado fue seguido de una filtración al vacío. La muestra final se dejó secar al aire, excepto por que una pequeña cantidad de muestra se secó a 90 °C para el análisis elemental del aporte de carbono. Los resultados analíticos y de capacidad de unión se registraron en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Los Ejemplos 29-41 demuestran un proceso para preparar materiales de intercambio catiónico fuerte.

Ejemplos 29-34

Se premezclaron vinil y epoxi silanos (2,5 g de cada uno) en un vial de centelleo de 20 ml. Se cargó un matraz de fondo redondo de 2 l con 200 gramos de sílice D1000 y la cantidad de mezcla de agente de tratamiento se añadió en el matraz gota a gota con una buena mezcla. La mezcla en el matraz se dejó rodar en un rotovap durante la noche. Se añadieron 20 ml de ácido sulfúrico 0,5 M. La mezcla se dejó rodar a temperatura ambiente durante 1 hora y después se calentó hasta 70 °C durante 1 hora. El matraz se dejó enfriar y después la sílice se empapó con 500 ml de ácido sulfúrico 1 M durante 30 minutos y después se filtró. Después, se lavó con agua desionizada cinco veces y se filtró. Se disolvieron 100 g de cloruro de tetrametilamonio en 1000 ml de metanol y la sílice se empapó en esta solución durante 1 hora y, después, la sílice se filtró y se lavó con 3 x 500 ml de metanol. La sílice se secó a 70 0C durante la noche. La muestra se sometió a análisis elemental (LECO) para determinar el porcentaje de carbono sobre sílice. Se descubrió que la muestra contenía 0,79 g de carbono por cada 100 g de muestra (0,79 %). Todas las uniones iniciales para los Ejemplos 29-34 registrados en la Tabla 4 se prepararon como se describió anteriormente en la presente descripción.

Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 500 ml se equipó con un agitador mecánico superior con cierre hermético a los gases, una entrada y salida de nitro gas y un manto calefactor con retroalimentación de termopar. La sílice inicialmente unida y tratada con cloruro de tetrametilamonio (30 g) y 37,5 g de AMPS, una pequeña cantidad de CTA y 200 ml de agua desionizada se cargaron en primer lugar en el matraz. El sistema se burbujeó con nitrógeno durante 20 minutos. Después, se introdujeron 0,15 g de iniciador V501. Se burbujeó nitrógeno durante otros 20 min antes de calentar gradualmente el matraz a 65 0C. La mezcla se mantuvo a 65 0C durante 2 horas con agitación superior y después a 80 0C durante otras 2 horas. El matraz se dejó enfriar a temperatura ambiente. La mezcla se vertió en 600 ml de solución de NaCl al 5 % en un vaso de precipitados. El matraz se aclaró con agua desionizada para desplazar completamente la sílice residual dentro del matraz. Después de agitar la mezcla con agitador superior durante unos minutos, se filtró y se repitió el lavado tres veces con 500 ml de NaCI al 5 % y tres veces con 500 ml de agua desionizada. La muestra se dejó secar al aire, excepto por que una pequeña cantidad de sílice se secó a 90 0C durante la noche y después se sometió a análisis elemental del contenido de carbono y azufre.

Tabla 4

En los Ejemplos 29-34, se usaron las proteínas lisozima de clara de huevo de gallina (Pm de aproximadamente 17 kD) y gammaglobulina bovina (Pm de aproximadamente 140 kD) para estudios de unión estática para los materiales de intercambio catiónico. El procedimiento de ensayo fue el mismo que para la BSA para Sílice Q descrito anteriormente en los Ejemplos 11-24, con la excepción de que se usaron proteínas diferentes (todavía concentraciones de 25 mg/ml), y el tampón de unión y de lavado fue HOAc 50 mM/NaOAc a pH 4,0. El tampón de elución fue NaCl 1 M en HOAc 50 mM/NaOAc a pH 4,0. Las capacidades de unión estática para las proteínas lisozima o globulina se resumieron en la Tabla 4.

Se descubrió que, a diferencia de la sílice Q, la polimerización de AMPS requiere la implicación de una pequeña cantidad de chain transfer agent (agente de transferencia de cadenas - CTA), p. ej., S'-Bis(a,a'-dimetil-a"-ácido acético)-tritiocarbonato. Sin el CTA, la unión de proteína a las muestras de sílice fue mucho menor. Como puede observarse en la Tabla 4, la cantidad de CTA tuvo una influencia significativa no solo en la cantidad de polímero unido (según se mide por los contenidos de carbono y azufre) sino también en la capacidad de unión estática de las muestras. Cantidades mayores de CTA condujeron a cantidades menores de unión de polímero, menor unión de lisozima pero mayor unión para la proteína Globulina de tamaño mucho mayor. Sin CTA, se consiguieron cantidades de unión significativamente menores tanto para lisozima como para globulina.

Ejemplos 35 y 36

Los Ejemplos 35 y 36 muestran el tamaño de los polímeros con respecto a la cantidad de CTA usada en la polimerización (sin implicación de sílice). Un matraz de fondo redondo de tres bocas se cargó con 37,5 g (181 mmol) de AMPS, 1,4 g (18,1 mmol) de ácido metacrílico, 0,2 g (1 g para el Ejemplo 36) de CTA y 200 ml de agua desionizada. La polimerización se realizó (sin sílice) de forma similar a la descrita anteriormente. Después de la polimerización, la muestra se sometió a análisis por PCG para determinar el peso molecular de los polímeros fabricados. El PM para polímeros del Ejemplo 35 fue de 87471 y el PM para polímeros del Ejemplo 36 fue de 20678.

Ejemplo 37

En este ejemplo, se presenta un proceso alternativo para preparar la fase de intercambio catiónico fuerte. El proceso implica unir químicamente un grupo funcional que contiene un grupo azoico térmicamente lábil y además grupos hidrófilos ácido carboxílico. Como se muestra en la Fig. 5, el iniciador azoico se acopla en primer lugar con aminopropiltrimetoxisilano y después el grupo funcional se une con sílice. La polimerización transcurre con calor y en presencia de los monómeros.

Se disolvió N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 11,5 g, en 350 ml de cloruro de metileno, y la solución se enfrió con baño de hielo a aproximadamente 5 °C A la solución se le añadieron 7,78 g de 4,4'-azobis(ácido cianovalérico) (iniciador V-501), seguidos de 10 g de aminopropiltrimetoxisilano. La mezcla se agitó en frío durante 3 horas, y después se dejó calentar a temperatura ambiente en otras 2 horas. Después de la reacción, se separaron por filtración los sólidos no disueltos (en su mayoría subproducto de urea) y el filtrado se mezcló con 100 g de sílice no tratada del Ejemplo 7 (800 Á). La mezcla se puso en un matraz de fondo redondo de 1 l, se hizo rodar en un rotovap a temperatura ambiente durante la noche, y después se filtró y se lavó con 4 x 400 ml de metanol. Los sólidos se dejaron secar al aire durante la noche a temperatura ambiente. Una pequeña cantidad de muestra se sometió a análisis elemental y se obtuvo un número de carbono de 2,03 % para la muestra.

Se mezclaron 30 g de la sílice anterior con 40 g de monómero de AMPS en 200 ml de agua. Después de burbujear nitrógeno en la mezcla acuosa durante 30 min, el matraz de fondo redondo de tres bocas se calentó mientras se agitaba a 65 °C durante 2 horas con nitrógeno. Después de la reacción, la mezcla se filtró y se lavó con 3 x 500 ml de NaCl al 5 % y después 3 x 500 ml de agua desionizada. Después de que se secara la muestra, el análisis elemental de la muestra seca mostró un número de carbono de 4,23 % y un número de azufre de 1,17 %. La unión estática de proteína BSA (con un tampón de acetato de sodio 50 mM, de pH 4,0) indicó que una capacidad de unión de BSA para esta muestra era de 150 mg/ml.

Ejemplo 38

En este Ejemplo, se usó un conjunto diferente de reacciones para preparar material de intercambio catiónico fuerte. Como se muestra en la Fig. 6 , se unió en primer lugar gel de sílice con aminopropiltrimetoxisilano y después la sílice modificada se acopló con iniciador azoico con una catálisis de acoplamiento (DCC) en DMF, seguida de polimerización a mayor temperatura en presencia de monómero de AMPS.

D1000 (tamaño de partícula promedio de 75 pm con tamaño de poro promedio de 1000 Á), 200 g, se unió inicialmente con 20 g de aminopropiltrimetoxisilano con un procedimiento similar al de los Ejemplos 1-10. Después de laminación durante la noche, la sílice se empapó en 600 ml de HCl 0,1 M y después se filtró. Se realizaron tres lavados con 1 l de agua desionizada en cada etapa, seguidos de filtración al vacío. La torta de filtración de sílice se secó a 70 °C durante la noche y se determinó que la cantidad de carbono con sílice seca era de 0,80 %.

La sílice seca de anteriormente, 35 g, se mezcló con una solución de 1,92 g de DCC, 2,24 g de iniciador azoico V-501 y 0,8 g de trietilamina en 100 ml de disolvente DMF seco. La mezcla se puso en un matraz de fondo redondo de 500 ml y se hizo rodar en un rotavap a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla resultante se filtró y se lavó con 2 x 200 ml de DMF y 2 x 150 ml de acetona. Una muestra se secó en el horno y el análisis elemental mostró un contenido de carbono de 1,74 %, el resto de la sílice se dejó secar dentro de una campana de humos a temperatura ambiente durante 6 horas.

Se mezclaron 34 g de la sílice anterior con 40 g de monómero de AMPS en 200 g de agua desionizada. Después de lavar abundantemente el sistema con nitrógeno durante 20 minutos, se calentó mientras se agitaba a 65 °C y se mantuvo a esta temperatura durante 2 horas. Después de eso, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se lavó con 3 x 500 ml de NaCl al 5 %, seguido de 3 x 500 ml de agua desionizada. Después de que se secara la muestra, el análisis elemental de la muestra seca mostró un número de carbono de 5,47 % y un número de azufre de 1,69 %, y se obtuvo una capacidad de unión estática de 125 mg/ml de proteína de lisozima a pH 7,0 (50 mmol de tampón de fosfato).

Ejemplos 39 y 40

En estos ejemplos, como se muestra en la Fig. 7 , en primer lugar se sintetizó un polímero que consistía en AMPS (90 % en moles) y ácido metacrílico (10 % en moles) con un agente de transferencia de cadenas (Ejemplo 39), y después la solución polimérica se mezcló con sílice modificada con grupos aminos de superficie (sílice D1000 unida inicialmente en el Ejemplo 38), y después la mezcla se hornea a 160 0C durante varias horas para permitir la formación de enlaces amida covalentes entre el polímero y los grupos amina de la superficie (Ejemplo 40).

Ejemplo 39

En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 1000 ml (equipado con agitador mecánico, entrada y salida de nitrógeno y un termopar) se añadieron 100 g de monómero de AMPS, 4,2 g de ácido metacrílico, 1,2 g de CTA y 600 ml de agua desionizada. La mezcla se agitó y se cubrió con nitrógeno durante 20 minutos y después se añadieron 0,4 g de iniciador V-501. Después de otros 20 minutos de burbujeo de nitrógeno, el sistema se calentó gradualmente a 65 0C y se mantuvo durante 2 horas, y después a 80 0C durante otras 2 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, el polímero se analizó por SEC (usando dextranos de diferentes pesos moleculares como patrones) y se determinó que el polímero tenía un Pm de 19417 y el Mn de 15477.

Ejemplo 40

La sílice unida a aminopropilo del Ejemplo 38 (unida inicialmente), 20 g, se mezcló con 200 g de solución de polímero según se describe en el Ejemplo 39. La mezcla se ajustó a un pH de alrededor de 7 con adición de NaOH 10 M. Después se puso en una placa de cristalización de cerámica y la placa se puso en un horno de convección (horno Fisher 506G) dentro de una campana de humos. La temperatura del horno se fijó a 160 0C y la muestra se horneó dentro del horno durante 6 horas. Después de eso, se enfrió a temperatura ambiente y se mezcló con 500 ml de solución de NaCl al 10 %. La sílice se filtró y se lavó con 3 x 500 ml de solución de NaCl a 5 % y con 3 x 500 ml de agua desionizada. Se determinó que el contenido de carbono y azufre de la muestra era del 6,06 % y el 1,70 %, respectivamente. La medición de DBC de lisozima fue de 107,6 mg/ml a pH 7,0 (tampón de fosfato de sodio 50 mM).

Ejemplo 41

En este Ejemplo se promovió el crecimiento del polímero de superficie mediante una química de Ce(IV) (US-5453186). (Véase la Fig. 8). 100 g de sílice (con una mediana de tamaño de poro de 1000 Á y un tamaño de partícula medio de 70 pm se unieron en seco con 10 g de epoxisilano con un procedimiento similar al de los ejemplos 1-10 (excepto por que no se usó vinil silano). La sílice resultante tenía una medición del % de carbono de 1,69 %. Se mezclaron 30 g de esta sílice seca con 30 g de monómero de AMPS y 200 ml de agua desionizada en un matraz de fondo redondo de tres bocas. Después de retirar el oxígeno de la mezcla mediante burbujeo de nitrógeno durante 20 minutos, se añadieron 2,37 gramos de sulfato de cerio (IV) y la mezcla se agitó y calentó a 700C durante 2 horas. Después de 2 horas, la mezcla se enfrió, se filtró y se lavó en suspensión con 5 x 300 ml de ácido nítrico 1 M, seguido de 5 x 300 ml de agua desionizada. El análisis elemental indicó que el contenido de carbono y azufre de la muestra seca era de 2,27 y 0,58, respectivamente. La medición de DBC de este material con 2 ml de columna a pH 7,0 (50 ml de tampón de fosfato) para la lisozima fue de 107 mg/ml.

Ejemplos 42-43

En los Ejemplos 42 y 43, la proteína A se une a la sílice del Ejemplo 1. La sílice tenía un tamaño de partícula de 75 pm con una mediana de tamaño de partícula de 70 pm y una mediana de tamaño de poro de 1000 Á. En el Ejemplo 42 se usó una química bien conocida (p. ej., WO199009237) que implica la oxidación del grupo diol de la superficie con NaIO4 para producir un aldehído, seguida de la aminación reductora de los grupos amino en la cadena de proteína A con los grupos aldehído de la superficie (Esquema 1 de la Fig. 9). El Ejemplo 43 utilizó una química diferente. Como se muestra en el Esquema 2 de la Fig. 9, la sílice se unió en primer lugar con aminopropiltrimetoxisilano y después los grupos amino de la superficie se hicieron reaccionar con cloruro cianúrico en tolueno a 5 0C, seguido de la reacción del segundo grupo cloro con grupos aminos en la cadena de la proteína A.

En el Ejemplo 42, se unió (3-glicidoxipropil)-trimetoxisilano (75 mg) con 15 g de la sílice del Ejemplo 1 (1000 Á) utilizando el procedimiento de unión inicial descrito en el Ejemplo 1. Después del lavado y el secado, se descubrió que aproximadamente el 0,18 % del carbono estaba unido a la superficie de la sílice. Posteriormente, se mezclaron 1,2 g de esta sílice unida inicialmente con 18 ml de tampón de HOAc 50 mM/NaOAc a pH 4,0, con NaIO40,25 M en el tampón. La mezcla se agitó a ritmo lento en un vial de centelleo de 20 ml durante la noche a temperatura ambiente. Después, la sílice se lavó con 50 ml de agua desionizada cinco veces con filtración y después se lavó con 15 ml de tampón de fosfato de sodio de 100 mM pH 8 que contenía 50 mM de NaCl. La muestra se filtró y se tomaron aproximadamente 0,2 g de muestra de sílice como control, y el resto se mezcló con 5 g de tampón de pH 8 de anteriormente, y 400 mg de solución de proteína A (la Proteína A era una Proteína A recombinante obtenida en Repligen Bioprocessing con el nombre comercial rSPA). La muestra se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y, después, se añadieron 0,16 g de NaBHsCN en 1 ml del tampón anterior. La muestra se agitó durante otras 4 horas. La muestra se lavó con 5 x 20 ml de NaCl al 5 %, seguido de 4 x 20 ml de agua desionizada. Después del secado, se midió la pérdida de peso termogravimétrica (TGA a 120-800 °C usando un TGA Q500 comercializado por TA Instruments Inc.) para la muestra y el control (la muestra siguió el mismo proceso sin proteína A). Los resultados se registraron en la Tabla 5 a continuación:

Tabla 5

La cantidad mayor de pérdida de peso de 3,30 % con respecto a la de la muestra de control, 1,19 %, indica la unión de proteína A.

En el Ejemplo 43, se unieron 50 g de la sílice (1000 Á) con 5 g de aminopropiltrimetoxisilano utilizando el procedimiento de unión inicial similar al descrito en el Ejemplo 38. Después del lavado y el secado, se determinó que la cantidad de carbono era de 2,46 % por análisis elemental. La pérdida de peso por TGA (120-800 0C) fue de 3,12 %. Posteriormente, se disolvieron 6,7 g de cloruro cianúrico en 70 ml de tolueno anhidro y la solución se agitó en un matraz de fondo redondo de tres bocas, enfriado a 5 0C en un baño de hielo. Se añadieron 22 g de la sílice unida inicialmente y 1,6 g de trietilamina (TEA). La mezcla se agitó en frío durante 3 horas. La sílice se filtró y se lavó con 3 x 300 ml de acetona y se almacenó a 4 0C. La fluorescencia de rayos X usando un Axios mAX Advanced PW 4400 comercializado por PANalytical B.V. mostró que la muestra contenía aproximadamente el 2,12 % de cloro en la superficie, lo que sugiere la unión de cloruro cianúrico. Después, se disolvió solución de proteína A, 3,6 g, en 50 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM. Se añadió la sílice anterior y la mezcla se mezcló a temperatura ambiente durante la noche. La muestra se filtró y se lavó con 3 x 500 ml de NaCl al 5 % y 3 x 500 ml de DIW. También se ejecutó un control con la misma cantidad de reactivos excepto por la presencia de soluciones de proteína A.

Como se muestra en la Tabla 6, el TGA de las muestras anteriores mostró una cantidad mayor de pérdida de calor para la muestra con proteína A reaccionada, lo que indica una unión de la proteína.

Tabla 6

Ejemplos 44-46

En los Ejemplos 44-46, se utilizaron materiales de sílice alternativos, incluidos un gel de sílice del Ejemplo 10 (250 Á), sílice precipitada fabricada mediante el proceso expuesto en WO2011/144346 y sílice endurecida al aire fabricada mediante el proceso establecido en las Pat. de los EE. UU. N.° 7.229.655; 6.555.151; 5.149.553; y 6.248.911.

Cada muestra de los Ejemplos 44-46 se trató según el siguiente proceso. Se añadieron 100 g de sílice en un matraz de botella redonda con sangría de 1 l y a la sílice se le añadieron 6,5 g de epoxi silano. La mezcla se hizo rodar en un rotovap a temperatura ambiente durante la noche (Fig.8). Después, se añadieron 10 g de ácido sulfúrico 0,5 M y la mezcla se hizo rodar a temperatura ambiente durante 1 hora, seguida de otra 1 hora a 70 °C con un baño de agua. Después de sumergir la sílice en 500 ml de ácido sulfúrico 1 M durante 30 minutos, se filtró y se lavó con 3 x 500 ml de agua desionizada y 3 x 250 ml de metanol. Después del secado, se pusieron 15 gramos de la sílice anterior en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 300 ml y también se añadieron 80 gramos de agua desionizada, junto con 15 gramos de monómero de AMPS. La mezcla agitada se sometió a burbujeo de nitrógeno durante 20 minutos y después se añadieron 3 gramos de sulfato de cerio (IV). La mezcla se calentó a 70 °C durante 2 horas y después la sílice se filtró y se lavó con 3 x 200 ml de ácido nítrico IM y 3 x 300 ml de agua desionizada y se secó. Las propiedades de la sílice resultante se registraron en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7

* Medido por análisis elemental de muestra seca. Un número mayor indica una mayor cantidad de grupos ácido sulfónico en la superficie

** Medido a pH 5 (tampón de ácido cítrico 50 mM)

Como puede observarse en la Tabla 7, la cantidad de azufre en la superficie de las partículas indicó que se había conseguido la funcionalización de la superficie y también que el material funcionalizado proporcionó una unión estática aceptable de lisozima.

Ejemplo 47

En el Ejemplo 47, se usa la sílice precipitada del Ejemplo 45, excepto por que el tamaño de partícula promedio de la sílice era de 50 micrómetros. Se trataron 40 g de la sílice con 4 g de vinil silano y 4 g de epoxi silano usando un procedimiento descrito en el Ejemplo 1. El número de carbono para el material unido después de la modificación fue del 6,4 %. La polimerización se realizó con 15 g de sílice modificada, 12,8 g de monómero Q, 1,2 g de 2do monómero, 70 mg de iniciador y 100 g de agua desionizada como se hizo en los Ejemplos 11 -24. El contenido de carbono después de la polimerización fue de 13,9 %

Ejemplos 48 y 49

En los Ejemplos 48 y 49, se usaron partículas de resina epoxi porosa (resina de polímero de polimetacrilato) (Fig. 10). Puesto que las partículas (50 pm o 100 pm de tamaño de partícula promedio) tienen grupos epoxi (se hidrolizarán para proporcionar grupos diol en medio acuoso), solo se necesitarán grupos vinilo para la modificación con polimerización de polímeros Q. Por lo tanto, se trataron 100 g de las partículas con 40 ml de alilamina (comercializada por Aldrich) en 400 ml de NMP a temperatura ambiente durante 1 hora y a 60 °C durante 1 hora. Una vez enfriada, la muestra se filtró y se lavó con 3 x 500 ml de agua desionizada, seguida de 500 ml de metanol y se secó al aire durante la noche. La polimerización de 30 g de la resina modificada anterior se realizó con el procedimiento según se describe en el Ejemplo 11. Como puede observarse en la Tabla 8, ambos ejemplos proporcionaron una unión estática aceptable de proteína BSA.

Tabla 8

Aunque la invención se ha descrito con un número limitado de realizaciones, estas realizaciones específicas no pretenden limitar el alcance de la invención según se describe y se reivindica por lo demás en la presente descripción. Puede ser evidente para los expertos en la técnica tras la revisión de las realizaciones ilustrativas de la presente descripción que son posibles modificaciones, equivalentes y variaciones adicionales. Todas las partes y porcentajes en los ejemplos, así como en el resto de la memoria descriptiva, son en peso a menos que se especifique lo contrario. Adicionalmente, cualquier intervalo de números citados en la memoria descriptiva o reivindicaciones, tal como el que representa un conjunto particular de propiedades, unidades de medida, condiciones, estados físicos o porcentajes, pretende incorporar literal y expresamente en la presente descripción por referencia o de cualquier otra manera, cualquier número que caiga dentro de dicho intervalo, incluido cualquier subconjunto de números dentro de cualquier intervalo recitado de este modo. Por ejemplo, siempre que se describa un intervalo numérico con un límite inferior, Ri, y un límite superior, Rs, se describe específicamente cualquier número R que caiga dentro del intervalo. En particular, se describen específicamente los siguientes números R dentro del intervalo: R = Ri k(Rs - Ri), donde k es una variable que varía de 1 % a 100 % con un aumento de 1 %, p. ej., k es 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 % ... 50 %, 51 %, 52 % ... 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. Además, también se describe específicamente cualquier intervalo numérico representado por dos valores cualesquiera de R, como antes se describe específicamente. Cualesquiera modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente descripción, resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos adjuntos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un medio de cromatografía que comprende partículas inorgánicas porosas que tienen una superficie funcionalizada, teniendo dichas partículas inorgánicas porosas una mediana de tamaño de poro de al menos 30 nm (300 Angstrom (Á)); una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos 0,8; y dicha superficie funcionalizada comprende al menos una molécula que tiene un peso molecular superior a 300 g/mol;

en donde dichas partículas inorgánicas porosas tienen uno o más ligandos unidos a la superficie funcionalizada, y dichos uno o más ligandos comprenden grupos ácido sulfónico, amonio cuaternario, dietil aminoetilo, carboxil metilo; colorantes sintéticos; compuestos alquílicos; proteínas; lectinas; anticuerpos; antígenos, enzimas o combinaciones de los mismos; y

en donde

“ mediana de tamaño de poro” es el diámetro de poro en el que reside el 50 % del volumen de poro intrapartícula; “distribución de tamaño de poro” significa la abundancia relativa de cada tamaño de poro en un volumen representativo de partículas inorgánicas porosas;

la “amplitud” se mide restando el tamaño de poro di0, en donde dicho tamaño de poro di0 es el diámetro de poro por debajo del cual reside 10 % del volumen de poro, del tamaño de poro dgü, en donde dicho tamaño de poro dgü es el diámetro de poro por debajo del cual reside 90 % del volumen de poro, según se mide por porosimetría de mercurio; y

la “amplitud relativa” se define como la relación de (dg0-d10)/d50.

2. El medio de cromatografía de la reivindicación 1, en donde dichas partículas inorgánicas porosas tienen un área de superficie BET de 1 m2/g a 2000 m2/g.

3. El medio de cromatografía de la reivindicación 1, en donde dichas partículas inorgánicas porosas tienen un volumen de poro, según se mide por porosimetría de mercurio, de al menos 1 cc/g.

4. El medio de cromatografía de la reivindicación 1, en donde dichas partículas inorgánicas porosas comprenden sílice, alúmina, circonia, o mezclas de las mismas.

5. El medio de cromatografía de la reivindicación 1, en donde dichas partículas inorgánicas porosas tienen una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos 0,9.

6. Un dispositivo de cromatografía que comprende una carcasa de dispositivo; y el medio de cromatografía de la reivindicación 1 colocado dentro de dicha carcasa de dispositivo.

7. El dispositivo de cromatografía de la reivindicación 6, en donde dicha carcasa de dispositivo comprende un miembro de carcasa tubular, y al menos un casquete de extremo de miembro de carcasa tubular separado y acoplable.

8. El dispositivo de cromatografía de la reivindicación 6 o 7, en donde dicha carcasa de dispositivo comprende un material polimérico, un material metálico, un material de vidrio, un material cerámico, o un material compuesto de los mismos.

9. Un método para fabricar el dispositivo de cromatografía de una cualquiera de las reivindicaciones: 6 a 8, comprendiendo dicho método las etapas de incorporar: el medio de cromatografía de la reivindicación 1 en la carcasa de dispositivo.