DE102004028267A1 - Sorptionsmittel für Nukleinsäuren, enthaltend säureaktiviertes Schichtsilicat - Google Patents

Sorptionsmittel für Nukleinsäuren, enthaltend säureaktiviertes Schichtsilicat Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung oder Gewinnung von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aus einem wässrigen oder alkoholischen Medium mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei das Sorptionsmittel mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfasst, eine Zusammensetzung, enthaltend das vorstehende Sorptionsmittel sowie dessen bevorzugte Verwendungen.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung, Abreicherung, Entfernung, Gewinnung oder Auftrennung von Nukleinsäuremolekülen mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei das Sorptionsmittel mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfasst. Bevorzugte Verwendungen eines solchen Sorptionsmittels werden ebenfalls offenbart.
  • Die Abtrennung bzw. Aufreinigung von Biomolekülen hat eine immer weiter steigende technische und wissenschaftliche Bedeutung. So sind Trennprozesse zur Aufreinigung oder Abreicherung von DNA einerseits für die Grundlagenforschung von Bedeutung, wobei genetisches Material z.B. isoliert und gereinigt werden muss, um genetisch modifizierte Organismen zu erzeugen. Dies wird derzeit aber auch immer mehr in industrieller Anwendung durchgeführt. So werden bereits einige in der Medizin verwandte Wirkstoffe gentechnisch hergestellt.
  • Ein weiteres Anwendungsfeld für solche Trennprozesse bzw. die dazu eingesetzten Adsorbentien stellt die Abreicherung von DNA in Abwässern dar, insbesondere bei Produktionsprozessen mit genetisch modifizierten Organismen, wie z.B. Bakterien oder Pilzen.
  • Im Stand der Technik sind bereits eine Vielzahl von Adsorbentien bekannt, insbesondere solche, die auf silanisierten Silicatpartikeln (Kieselgel) oder funktionalisierten Cellulosen basieren.
  • In der US-A 4,029,583 wird ein zur Trennung von Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren geeignetes chromatographisches Trägermaterial aus Silicagel beschrieben, welches einen Hohlraumdurchmesser von bis zu 50 nm aufweist, und an das mittels eines Silanisierungsreagenzes eine stationäre Phase mit Anionen- oder Kationenaustauscher bildenden Gruppen gebunden ist, die mit den zu trennenden Substanzen in Wechselwirkung treten. Das silanisierte Silicagel wird mit Wasser in Berührung gebracht, wobei die Gefahr besteht, dass die stationäre Phase polymerisiert und die Poren des Trägermaterials schließt.
  • Gemäss der EP-B 0 104 210 können Nukleinsäuregemische mit hoher Auflösung und bei hoher Durchsatzgeschwindigkeit in ihre Bestandteile aufgetrennt werden, wenn ein chromatographisches Trägermaterial verwendet wird, bei dem der Durchmesser der Hohlräume das ein- bis zwanzigfache der größten Abmessung der jeweils zu isolierenden Nukleinsäure oder der größten Abmessung der größten aller im Gemisch enthaltenen Nukleinsäuren beträgt. Zur Herstellung des chromatographischen Trägermaterials wird dieses zunächst mit einem Silanisierungsreagenz umgesetzt, welches eine flexible Kettengruppe aufweist, die ihrerseits wiederum durch Reaktion mit einem Anionen- oder Kationenaustauscher bildenden Reagenz zum fertigen Trägermaterial umgewandelt wird.
  • Die EP 0 496 822 (WO 91/05606, DE 393 50 98 ) beschreibt ein chromatographisches Trägermaterial, dessen Hohlräume die ein- bis zwanzigfache Größe der größten Abmessung der zu trennenden Nukleinsäuren aufweisen, welches dadurch erhältlich ist, dass ein Ausgangsträgermaterial einer Hohlraumgröße von 10 bis 1000 nm, einer spezifischen Oberfläche von 5 bis 800 m2/g und einer Korngröße von 3 bis 500 μm mit einem Silanisierungsreagenz umgesetzt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Silanisierungsreagenz mindestens eine bereits mit einem primären oder sekundären Hydroxyalkylamin umgesetzte reaktive Gruppe aufweist oder eine mit einem Hydroxyalkylamin umsetzbare reaktionsfähige Gruppe wie eine Epoxygruppe oder Halogenatome enthält, die in einer weiteren Reaktionsstufe mit einem Hydroxyalkylamin zur Reaktion gebracht wird.
  • Der Artikel von T. G. Lawson et al., "Separation of synthetic oligonucleotides on columns of microparticulate", Analytical Biochemistry (1983), 133(1), 85-93, beschreibt die Trennung von synthetischen Oligonukleotiden an Säulen basierend auf mikropartikulärem Siliciumdioxid oder Kieselgel, welches mit vernetztem Polyethylenimin beschichtet wurde. Die Beschichtung wurde hierbei durch ein Durchpumpen der Polyethyleniminlösung durch die Kieselgelsäule erzielt. Das in diesem Artikel beschriebene Verfahren lässt sich nur für Kleinmengen einsetzen. Weiterhin bezieht sich dieser Artikel nur auf mit Polyethylenimin modifizierte Kieselgelpartikel.
  • Weitere Adsorbentiensysteme sind in der US 2003003272 , der EP 1 162 459 und der EP 281 390 beschrieben. Der Artikel "Nukleinsäureaufreinigung durch Kationen-Komplexierung" von Prof. Dr. Michael Lorenz, Molzym GmbH & Co. KG, Bremen in Laborwelt Nr. 4/2003, Seite 40, beschreibt ein neues Verfahren zur Nukleinsäureaufreinigung mit speziellen Mini Spin Säulen. Lt. Angaben des Artikels beruhen diese auf einer Matrix, in der ein Tonmineral mit Sand vermischt wurde. Zur Art der Tonminerale ist nichts ausgesagt.
  • Nachteilig an den Sorptionssystemen des Standes der Technik ist, dass sie entweder verhältnismäßig teuer sind oder in der Bindungskapazität, der Bindungskinetik und/oder der Wiedergewinnungsrate der absorbierten Nukleinsäure(n) nicht den Anforderungen entsprechen. Aufgrund der steigenden Bedeutung der Abtrennung oder Aufreinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Medien besteht ein ständiger Bedarf nach verbesserten Sorptionsmitteln für Nukleinsäuren.
    •
  • Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Sorptionsmittel für Nukleinsäuren bereitzustellen, das in einem Verfahren zur An- oder Abreicherung, zur Entfernung oder Gewinnung, oder zur Auftrennung von Nukleinsäuren vorteilhaft eingesetzt werden kann und die Nachteile des Standes der Technik vermeidet.
  • Erstaunlicherweise wurde nun gefunden, dass sich zur Lösung dieser Aufgabe besonders vorteilhaft Sorptionsmittel verwenden lassen, die mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfassen. Solche säureaktivierten Schichtsilicate zeigen eine überraschend hohe Bindekapazität für Nukleinsäuren, die diejenige von kommerziellen Adsorptionssystemen des Standes der Technik noch übertrifft. Weiterhin zeigen sie eine beson ders rasche Bindungskinetik. Vorteilhaft ist außerdem, dass sich die gebundene Nukleinsäure praktisch quantitativ wieder von dem Sorptionsmittel entfernen lässt.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Sorption, An- oder Abreicherung, Entfernung, Gewinnung oder Auftrennung von mindestens einem Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise aus einem polaren, insbesondere einem wässrigen oder alkoholischen Medium mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei das Sorptionsmittel mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfasst.
  • Die hier offenbarten Sorptionsmittel sind somit sowohl geeignet Nukleinsäuren aufzutrennen, als auch aus entsprechenden Lösungen/Medien an- oder abzureichern, um sie zu gewinnen oder zu entfernen: Die fast quantitative Widerfindungsrate bei Elution mit geeigneten, in der Regel hochsalzhaltigen Puffern zeigt, dass es auch möglich ist, die gebundene Nukleinsäure wieder zurückzugewinnen. Die Einsatzgebiete für solche Sorptionsmittel sind vielfältig. Ohne dass diese Erfindung auf die folgenden Beispiele beschränkt ist, sollen einige möglichen Anwendungen angeführt werden: Denkbar ist z.B. eine Abtrennung von Nukleinsäuren aus einem Vielstoffgemisch oder die Abreicherung von DNA aus Abwässern aus biotechnologischen Produktionsrückständen mit genetisch modifizierten Organismen. Allgemein kann das erfindungsgemäße Sorptionsmittel auch für alle molekularbiologischen, mikrobiologischen oder biotechnologischen Methoden im Zusammenhang mit Nukleinsäuren, insbesondere deren An- oder Abreicherung, Auftrennung, transienter oder permanenter Immobilisierung oder sonstiger Verwertung eingesetzt werden. Beispielhafte Methoden und Verfahren finden sich in einschlägigen Lehrbüchern wie Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Press 2001 und sind dem Fachmann geläufig. Auch im Rahmen der chromatographischen Auftrennung von Nukleinsäuren kann das vorliegende Sorptionsmittel eingesetzt werden. Unter Nukleinsäuren sind dabei in erster Linie DNA- und RNA-Spezies zu verstehen, einschließlich von genomischer DNA und cDNA sowie deren Fragmente, mRNA, tRNA, rRNA sowie weitere Nukleinsäurederivate natürlichen oder synthetischen Ursprungs mit beliebiger Länge.
  • Ein weiterer Bereich stellt die Auftrennung von Nukleinsäure-Gemischen, beispielsweise über eine das erfindungsgemäße Sorptionsmittel enthaltende Matrix (Träger), dar. Die erfindungsgemäßen Adsorbentien sind jedoch prinzipiell auch geeignet für die Abtrennung oder Aufreinigung von Proteinen und anderen Biomolekülen. Unter Biomolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das als Bausteine Nukleotide bzw. Nukleoside (Nukleobasen), Aminosäuren, Monosaccharide und/oder Fettsäuren aufweist. Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Bezugnahme in der Beschreibung auf "Nukleinsäure(molekül)" also auch andere Biomoleküle. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung zur Sorption von Nukleinsäuren.
  • Als Ausgangsstoffe für die erfindungsgemäß eingesetzten Schichtsilicate können alle natürlichen oder synthetischen Schichtsilicate oder deren Mischungen verwendet werden, die sich durch eine Säure aktivieren lassen, d.h. in denen Kationen in den Zwischenschichten gegen Protonen ausgetauscht werden können. Solche Schichtsilicate sind dem Fachmann geläufig und umfassen insbesondere die smektitischen oder montmorillonithaltigen Schichtsilicate, wie Bentonit. Allgemein können sowohl sogenannte naturaktive als auch nicht-naturaktive Schichtsilicate verwendet werden, insbesondere di- und trioktaedrische Schichtsilicate der Serpentin-, Kaolin- und Talkpyrophylitgruppe, Smektite, Vermiculite, Illite und Chlorite sowie solche der Sepiolith-Palygorskit-Gruppe, wie z.B. Montmorillonit, Natronit, Saponit und Vermiculit oder Hectorit, Beidellit, Palygorskit sowie Wechsellagerungsminerale (mixed layer mineral). Natürlich können auch Gemische aus zwei oder mehreren der vorstehenden Materialien eingesetzt werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäß eingesetzte Schichtsilicat auch noch weitere Bestandteile enthalten (auch z.B. nicht säureaktivierte Schichtsilicate), welche die vorgesehene Verwendung des säureaktivierten Tones, insbesondere dessen Sorptionsfähigkeit nicht beeinträchtigen oder sogar nützliche Eigenschaften aufweisen.
  • Besonders bevorzugt sind Schichtsilicate aus der Montmorillonit/Beidellit Reihe wie z.B. Montmorillonit, Bentonit, Natronit, Saponit und Hectorit.
  • Als besonders brauchbar haben sich auch Verwitterungsprodukte von Tonen mit einer spezifischen Oberfläche von mehr als 200 m2/g, einem Porenvolumen von mehr als 0,5 ml/g und einer Ionenumtauschfähigkeit von mehr als 40 meq/100g in säureaktivierter Form erwiesen. Besonders bevorzugt werden nach dieser speziellen Ausführungsform zur Säureaktivierung Rohtone, deren Ionenumtauschfähigkeit über 50 meq/100g, vorzugsweise im Bereich von 55 bis 85 meq/100g liegen. Die spezifische BET-Oberfläche liegt besonders bevorzugt im Bereich von 200 bis 280 m2/g, insbesondere zwischen 200 und 260 m2/g. Das Porenvolumen liegt vorzugsweise im Bereich von 0,7 bis 1,0 ml/100g, insbesondere im Bereich von 0,80 bis 1,0 ml/100g. Die Säureaktivierung solcher Rohtone kann wie hierin näher spezifiziert durchgeführt werden. Solche Tone sind beispielsweise in der DE 103 56 894.8 der gleichen Anmelderin beschrieben, die diesbezüglich ausdrücklich durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird.
  • Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch gefunden, dass insbesondere die zweischichtigen und die dreischichtigen Schichtsilicate bereits ohne Säureaktivierung vorteilhaft zur Sorption von Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen verwendet werden können. Besonders bevorzugt sind dabei die smektitischen Schichtsilicate (s.o.) wie Bentonit. Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann also ein nicht aktiviertes Schichtsilicat anstelle des säureaktivierten Schichtsilicats, oder eine Mischung aus beiden als erfindungsgemäßes Sorptionsmittel eingesetzt werden. Ansonsten gelten die in Bezug auf das Verfahren und die Verwendung des Sorptionsmittels genannten Angaben in der vorliegenden Beschreibung entsprechend.
  • Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform basiert das erfindungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel jedoch auf einem säureaktivierten Schichtsilicat, d.h. mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 75%, insbesondere mindestens 90 oder sogar 95% des erfindungsgemäßen Sorptionsmittels bestehend aus einem (oder mehreren) säureaktivierten Schichtsilicaten, wie hierin definiert. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Sorptionsmittel im Wesentlichen oder vollständig aus mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat. Das erfindungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel kann jedoch auch mit anderen dem Fachmann geeignet erscheinenden Sorptionsmitteln oder weiteren Komponenten zusammen eingesetzt werden, beispielsweise im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 1.
  • Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist das säureaktivierte Schichtsilicat einen durchschnittlichen Porendurchmesser, bestimmt nach der BJH-Methode (DIN 66131), zwischen etwa 2 nm und 25 nm, insbesondere zwischen etwa 4 und etwa 10 nm auf.
  • Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt das Porenvolumen, bestimmt nach der CCl4-Methode gemäß Methodenteil, von Poren bis 80 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,80 ml/g, insbesondere zwischen etwa 0,2 und 0,7 ml/g. Die entsprechenden werte für Poren bis zu 25 nm Durchmesser liegen im Bereich zwischen etwa 0,15 und 0,45 ml/g, insbesondere 0,18 bis 0,40 ml/g. Die entsprechenden werte für Poren bis zu 14 nm liegen im Bereich zwischen etwa 0,10 und 0,40 ml/g, insbesondere etwa 0,12 bis 0,37 ml/g. Die Porenvolumina für Poren zwischen 14 und 25 nm Durchmesser können beispielsweise zwischen 0,02 und 0,3 ml/g liegen. Das Porenvolumen von Poren mit 25 bis 80 nm kann beispielsweise im gleichen Bereich liegen.
  • Über die Bedingungen bei der Säureaktivierung der Schichtsilicate, d.h. insbesondere die Menge bzw. Konzentration der eingesetzten Säure, der Temperatur und der Dauer der Säurebehandlung, kann auch die Porosimetrie der säureaktivierten Schichtsilicate gezielt beeinflusst werden kann. So kann z.B. durch eine stärkere Säureaktivierung mit einer erhöhten Säuremenge oder bei einer erhöhten Temperatur über eine längere Zeitdauer eine größere Porosität der Schichtsilicate bewirkt werden, vor allem im Bereich der kleineren Poren mit einem Durchmesser von weniger als 50 nm, insbesondere weniger als 10 nm, bestimmt nach der CCl4-Methode gemäß Methodenteil. So kann durch eine Erhöhung der zur Säureaktivierung verwendeten Säuremenge das Mikroporenvolumen des Schichtsilicats gesteigert werden. Gleichzeitig nimmt die Kationenaustauschkapazität ab. Somit kann für die jeweils interessierende Nukleinsäurespezies die Sorptionsfähigkeit des säureaktivierten Schichtsilicats bzw. dessen Ab- und Desorptionsrate über die Säureaktivierung im Einzelfall, anhand routinemäßi ger Untersuchung einer Reihe unterschiedlich säureaktivierter Schichtsilicate, optimiert werden. Beispielsweise können über die Säureaktivierung die Poren/Hohlräume in den erfindungsgemäßen Sorptionsmitteln in der gemäß EP 0 104 210 oder US 4,029,583 (s.o.) vorgesehenen Weise modifiziert werden.
  • Die erfindungsgemäß eingesetzten säureaktivierten Schichtsilicate werden allgemein dadurch hergestellt, dass man Schichtsilicate mit mindestens einer Säure behandelt. Dazu werden die Schichtsilicate mit der (den) Säure(n) in Kontakt gebracht. Im Prinzip kann dabei jedes dem Fachmann geläufige Verfahren zur Säureaktivierung von Schichtsilicaten verwendet werden, einschließlich der in der WO 99/02256, der US-5,008,226 und der US-5,869,415 beschriebenen Verfahren, die insoweit ausdrücklich durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen werden. Es können allgemein beliebige organische oder anorganische Säuren oder deren Gemische verwendet werden. Beispielsweise kann ein Aufsprühen von Säure nach einem sogenannten SMBE Prozess (Surface Modified Bleaching Earth) erfolgen. Hier findet die Aktivierung an der Oberfläche der Schichtsilicate statt, ohne dass in einer Lösung bzw. Dispersion gearbeitet wird.
  • Bei einer ersten Ausführungsform wird somit die Aktivierung des Schichtsilicats in wässriger Phase durchgeführt. Dazu wird die Säure als wässrige Lösung mit dem Schichtsilicat in Kontakt gebracht. Es kann dabei so vorgegangen werden, dass zunächst das Schichtsilicat, welches vorzugsweise in Form eines Pulvers bereitgestellt wird, in Wasser aufgeschlämmt wird. Anschließend wird die Säure (z.B. in konzentrierter Form) zugegeben. Das Schichtsilicat kann jedoch auch direkt in einer wässrigen Lösung der Säure aufgeschlämmt werden, oder die wässrige Lösung der Säure auf das Schichtsilicat aufgegeben werden. Nach einer vorteilhaften Ausführungsform kann die wässrige Säurelösung bei spielsweise auf ein vorzugsweise gebrochenes oder pulverförmiges Schichtsilicat aufgesprüht werden, wobei die Wassermenge bevorzugt möglichst gering gewählt wird und z.B. eine konzentrierte Säure bzw. Säurelösung eingesetzt wird. Die Säuremenge kann vorzugsweise zwischen 1 und 10 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 2 und 6 Gew.-% einer Säure, insbesondere einer starken Säure, z.B. einer Mineralsäure wie Schwefelsäure, bezogen auf das wasserfreie Schichtsilicat (atro), gewählt werden. Soweit erforderlich, kann überschüssiges Wasser abgedampft und das aktivierte Schichtsilicat dann bis zur gewünschten Feinheit gemahlen werden. Wie bereits oben erläutert, ist auch bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kein Waschschritt erforderlich, aber möglich. Nach Aufgabe der wässrigen Lösung der Säure wird lediglich, soweit erforderlich, bis zum Erreichen des gewünschten Feuchtigkeitsgehalts getrocknet. Meist wird der Wassergehalt des erhaltenen säureaktivierten Schichtsilicats auf einen Anteil von weniger als 20 Gew.-%, bevorzugt weniger als 15 Gew.-%, eingestellt.
  • Für die oben beschriebene Aktivierung mit einer wässrigen Lösung einer Säure bzw. einer konzentrierten Säure kann die Säure an sich beliebig gewählt werden. Es können sowohl Mineralsäuren, als auch organische Säuren oder Gemische der vorstehenden Säuren verwendet werden. Es können übliche Mineralsäuren verwendet werden, wie Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, wobei Schwefelsäure bevorzugt ist. Es können konzentrierte oder verdünnte Säuren bzw. Säurelösungen verwendet werden. Als organische Säuren können Lösungen von z.B. Citronensäure oder Oxalsäure verwendet werden.
  • Eine weitere bevorzugte Aktivierungsmöglichkeit stellt das Kochen der Schichtsilicate in einer Säure, insbesondere Salz- oder Schwefelsäure, dar. Hierbei lassen sich durch die geeigneten Konzentrationen an Säure und Kochzeiten unterschiedli che Aktivierungsgrade einstellen und die Porenvolumenverteilung lässt sich gezielt einstellen. Solche aktivierten Schichtsilicate werden häufig auch als Bleicherden bezeichnet. Nach dem Trocknen der Materialien werden diese nach gängigen Verfahren gemahlen.
  • Bei der "klassischen" Aktivierung, die erfindungsgemäß in vielen Fällen bevorzugt wird, wird bei Temperaturen um etwa 100°C bis zum Kochpunkt aktiviert. Demgegenüber wird bei dem SMBE-Verfahren üblicherweise bei Raumtemperatur gearbeitet, wobei erhöhte Temperaturen in Einzelfällen bessere Säureaktivierungen ermöglichen. Der Einfluss der Temperatur ist jedoch beim SMBE-Verfahren weit geringer als bei der "klassischen" Aktivierung (sogenanntes HBPE-Verfahren). Die Verweilzeit (Dauer der Säureaktivierung) liegt beim HBPE-Verfahren z.B. zwischen ca. 8 Stunden, z.B. bei Verwendung von Salzsäure, und 12 bis 15 Stunden z.B. bei Verwendung von Schwefelsäure. Im Unterschied zum SMBE-Verfahren wird beim HBPE-Verfahren die Schichtstruktur angegriffen, woraus Bereiche mit Kieselsäure resultieren, neben strukturell weitgehend unveränderten Arealen. Beim SMBE-Verfahren werden beispielsweise 3 Gew.-% H2SO4 aufgegeben (100 + 3). Die Analyse des aufgearbeiteten Materials ergibt dann üblicherweise Säuregehalte im Bereich von 0,4 bis 1,0%, d.h. ein Großteil der Säure wird verbraucht (Austausch H+-Ionen gegen andere Kationen etc.). Ein geringer Teil wird gegebenenfalls durch enthaltenen Kalk verbraucht. Beim SMBE-Verfahren liegen die Kontaktzeiten mit der Säure labormäßig häufig bei etwa 15 Minuten.
  • Es wurde gefunden, dass je nach verwendetem Schichtsilicat eine Aktivierung mit geringen Säuremengen bereits ausreichen kann, um überraschend gute Sorptionsmittel zu erhalten.
  • Nach einer Ausführungsform ist es bei der Säureaktivierung nicht erforderlich, dass die überschüssige Säure und die bei der Aktivierung entstehenden Salze ausgewaschen werden. Vielmehr wird nach Aufgabe der Säure, wie bei der Säureaktivierung üblich, kein Waschschritt durchgeführt, sondern das behandelte Schichtsilicat getrocknet und dann auf die gewünschte Korngröße vermahlen. Beim Vermahlen wird meist eine typische Bleicherdefeinheit eingestellt. Dabei liegt der Trockensiebrückstand auf einem Sieb mit einer Maschenweite von 63 μm im Bereich von 20 bis 40 Gew.-%. Der Trockensiebrückstand auf einem Sieb mit einer Maschenweite von 25 μm liegt im Bereich von 50 bis 65 Gew.-%.
  • Das erfindungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel kann in Form eines Pulvers, Granulats oder eines beliebig geformten Formkörpers eingesetzt werden. Bei Pulvern bietet sich der Einsatz in Form von Suspensionen des Sorptionsmittels in den das mindestens eine Nukleinsäuremolekül enthaltenden Medien an. Andererseits lassen sich durch eine gröbere Vermahlung auch Partikel einstellen, die die in der Chromatographie übliche Korngrößenverteilung zeigen, so dass sich die Materialien auch zu Schwerkraftsäulen oder Chromatographiesäulen packen lassen. Generell kann die Verwendung der Sorptionsmittel in jeder beliebigen Form einschließlich von geträgerten bzw. immobilisierten Formen erfolgen. Beispielsweise ist auch ein Einsatz bei der Auftrennung von verschiedenen Nukleinsäurekomponenten anhand ihres Molekulargewichts denkbar. Die Anwendungsform der erfindungsgemäßen Adsorbentien ist dabei nicht auf die angeführten Beispiele beschränkt.
  • Allgemein wird die Korn- bzw. Formkörpergröße des erfindungsgemäß als Sorptionsmittel verwendeten säureaktivierten Schichtsilicats also von der jeweiligen Anwendung abhängen. Alle Korngrößen bzw. Agglomeratgrößen sind hier möglich. Beispielsweise kann das säureaktivierte Schichtsilicat in Pulverform, insbesondere mit einem D50-Wert von 1 bis 1.000 μm insbesondere von 5 bis 500 μm eingesetzt werden. Typische brauchbare Granulate liegen im Bereich (D50) zwischen 100 μm bis 5.000 μm, insbesondere 200 bis 2.000 μm Teilchengröße. Bei vielen Anwendungen kann vorteilhaft auf Formkörper aus bzw. mit den säureaktivierten Schichtsilicaten zurückgegriffen werden, beispielsweise bei Chromatographiesäulen, einschließlich von Schwerkraft- oder Zentrifugationssäulen, Festphasenchromatographien, Filterpatronen, Membranen etc.
  • Nach einer besonders bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform kann, wie vorstehend erwähnt, das erfindungsgemäß eingesetzte Sorbens in immobilisierter Form vorliegen. Beispielsweise kann das Sorbens in eine Filterpatrone, eine HPLC-Patrone oder eine vergleichbare Darreichungsform eingebettet sein. Auch eine Einbettung in Gele, wie z.B. Agarosegele oder andere gelartige oder matrixartige Strukturen ist bevorzugt möglich. Solche Applikationen werden häufig im Rahmen von sogenannten Kits zur Aufreinigung von Nukleinsäuremolekülen verkauft, wie z.B. die Produkte der Firma Quiagen, wie Quiagen genomic tip oder dergleichen. Dabei wird allgemein das die interessierenden Nukleinsäuremoleküle enthaltende Medium durch eine das Sorbens enthaltende Säule bzw. Filterpatrone oder dergleichen geschickt. Anschließend kann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, um anhaftende Verunreinigungen zu entfernen. Es folgt schließlich ein Elutionsschritt zur Gewinnung der interessierenden Nukleinsäuremoleküle.
  • Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist das säureaktivierte Schichtsilicat eine BET-Oberfläche (bestimmt nach DIN 66131) von mindestens 50 bis 800 m2/g, insbesondere mindestens 100 bis 600 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 130 bis 500 m2/g, auf. Durch die hohe Oberfläche wird offenbar die Interaktion mit der Nukleinsäure erleichtert, wobei die Desorptionsmöglichkeit überraschend erhalten bleibt.
  • Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei den Nukleinsäuren um DNA- oder RNA-Moleküle in doppelsträngiger oder einsträngiger Form mit einem oder mehreren Nukleotidbausteinen.
  • In Bezug auf Nukleinsäuren ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft bei Medien, die Oligonukleotide bzw. Nukleinsäuren mit mindestens 10 Basen paaren), vorzugsweise mit mindestens 100 Basen (paaren), insbesondere mindestens 1000 Basen(paaren) enthalten. Natürlich lässt sich dass erfindungsgemäße Verfahren auch bei Nukleinsäuren zwischen 1 und 10 Basen(paaren) einsetzen bzw. bei recht großen Nukleinsäuremolekülen, wie Plasmiden oder Vektoren mit beispielsweise 1 bis 50 kB oder längeren genomischen oder c-DNA-Fragmenten. Genauso umfasst sind Restriktionsverdaute DNA- und RNA-Fragmente, synthetische oder natürliche Oligo- und Polymere aus Nukleinsäuren, Cosmide etc.
  • Von Interesse ist z.B. die chromatographische Trennung von biologischen Makromolekülen wie langkettigen Oligonukleotiden, hochmolekularen Nukleinsäuren, tRNA, 5S-rRNA, anderen rRNA-Spezies, einsträngiger DNA, doppelsträngiger DNA (z.B. Plasmide oder Bruchstücke genomischer DNA) etc. Dabei kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren überraschend eine verbesserte Auflösung bei hoher Durchsatzgeschwindigkeit erzielt werden. Die verwendeten Trägermaterialien sind dabei in einem weiten Temperaturbereich einsetzbar und zeigen eine hohe Beladbarkeit. Auch zeigt das Trägermaterial eine hohe Druckbeständigkeit und eine lange Lebensdauer.
  • Auch steigt der Bedarf an hochreinen Nukleinsäuren, wie z.B. hochreine Plasmid DNA für moderne biotechnologische, aber auch medizinische Entwicklung, wie z.B. auf dem Gebiet der Gentherapie. Die im Stand der Technik bekannten Protokolle zur hochreinen Aufreinigung von Nukleinsäuren sind dabei häufig kosten- und/oder zeitintensiv, nicht geeignet zum Einsatz im Großmaßstab oder für therapeutische Zwecke nicht sicher genug, da toxische Lösungsmittel oder Enzyme tierischer Herkunft, wie z.B. RNAse verwendet werden.
  • Allgemein kann das erfindungsgemäße Sorptionsmittel in jeglichen Medien eingesetzt werden. Bevorzugt sind polare Medien, in denen die interessierenden Biomoleküle bzw. Nukleinsäure in der Regel enthalten sind.
  • Unter den besonders bevorzugten wässrigen oder alkoholischen Medien werden erfindungsgemäß alle wasser- oder alkoholhaltigen Medien, einschließlich wässrig-alkoholische Medien, verstanden. Allgemein sind auch alle Medien umfasst, in denen Wasser mit anderen Lösungsmitteln vollständig mischbar bzw. vollständig gemischt ist. Anzuführen sind insbesondere Alkohole, wie Methanol, Ethanol sowie C3- bis C10-Alkohole mit einer oder mehreren OH-Gruppen oder auch Säuren. Denkbar sind also auch mit Wasser vollständig mischbare Lösemittel sowie deren Mischungen mit Wasser und Alkohol. Insbesondere handelt es sich in der Praxis hierbei um wässrige, wässrig-alkoholische oder alkoholische Medien im Zusammenhang mit einer Lösung, Suspension, Dispersion, kolloidalen Lösung oder Emulsion.
  • Typische Beispiele sind wässrige oder alkoholische Puffersysteme, wie sie in der Wissenschaft und Industrie verwendet werden, industrielle oder nicht-industrielle Abwässer, Prozessbrauchwässer, Fermentationsrückstände bzw. -medien, Me dien aus der medizinischen oder biologischen Forschung, flüssige oder fluide Altlasten und dergleichen.
  • Das erfindungsgemäße Sorptionsmittel kann weitere Komponenten enthalten, solange diese die Adsorption der Nukleinsäuren, und soweit vorgesehen, auch deren Desorption nicht inakzeptabel beeinträchtigt. Solche zusätzlichen Komponenten können, ohne hierauf beschränkt zu sein, organische oder anorganische Bindemittel (siehe unten), weitere dem Fachmann geläufige Sorptionsmittel für Biomoleküle oder andere interessierende anorganische oder organische Substanzen aus dem Medium, oder auch Trägerstoffe wie Glas, Kunststoff- oder keramische Materialien oder dergleichen umfassen.
  • So können nach einer vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform die Sorptionsmittelteilchen über ein geeignetes Bindemittel zu größeren Agglomeraten, Granulaten bzw. Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht werden. Die Form und Größe solcher übergeordneter Strukturen, die die primären Sorptionsmittel- oder Schichtsilicatteilchen enthalten, richtet sich nach der jeweils gewünschten Anwendung. Es können somit alle dem Fachmann geläufigen und im Einzelfall geeigneten Formen und Größen eingesetzt werden. Beispielsweise können in vielen Fällen Agglomerate mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm, insbesondere mehr als 50 μm bevorzugt sein. Bei einer Schüttung für Chromatographiesäulen und dergleichen kann dabei eine Kugelform der Agglomerate vorteilhaft sein. Ein möglicher Träger ist beispielsweise Calciumcarbonat, Kunststoffe oder keramische Materialien.
  • Auch kann jedes dem Fachmann geläufige Bindemittel verwendet werden, solange die An- bzw. Einlagerung der Biomoleküle in bzw. an das Sorptionsmittel nicht zu stark beeinträchtigt wird bzw. die für die jeweilige Anwendung zu erfordernde Sta bilität der Teilchenagglomerate bzw. Formkörper gewährleistet ist. Beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, können als Bindemittel verwendet werden: Agar-Agar, Alginate, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten.
  • Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a) in Kontakt bringen des vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Mediums, das das mindestens eine Nukleinsäuremolekül enthält, mit dem Sorptionsmittel,
    • b) Ermöglichen der Sorption des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls an bzw. in das Sorptionsmittel,
    • c) Abtrennen des sorbierten bzw. an das Sorptionsmittel gebundenen Nukleinsäuremoleküls zusammen mit dem Sorptionsmittel aus dem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium,
    • d) gegebenenfalls Abtrennung bzw. Desorption des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls von dem Sorptionsmittel.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur An- bzw. Einlagerung von Nukleinsäuren an bzw. in das Sorptionsmittel kann sowohl zur Anreicherung (d.h. Erhöhung der Konzentration des/der gewünschten Nukleinsäuremoleküle) als auch Anreicherung (d.h. Verringerung der Konzentration des/der gewünschten Nukleinsäuremoleküle) oder Auftrennung mehrerer unterschiedlicher Nukleinsäuremoleküle genutzt werden.
  • Wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf eine Entfernung oder Entsorgung von Nukleinsäuremolekülen abzielt, kann in einem weiteren Schritt das die Nukleinsäuremoleküle enthaltende Sorptionsmittel entsorgt werden. Die Entsorgung kann dabei beispielsweise durch thermische Behandlung zur Entfernung des die Biomoleküle enthaltenden Schichtsilicats erfolgen, wobei nach der thermischen Desintegration der Nukleinsäuremoleküle das Schichtsilicat entsorgt werden kann.
  • So ist es nach einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt möglich, Nukleinsäuren gezielt aus Medien zu entfernen. Dies spielt beispielsweise bei der Abwasseraufbereitung eine große Rolle, da hier in den meisten Staaten strenge gesetzliche Vorschriften zur Entfernung von Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen aus Abwässern bestehen.
  • Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann auch die Abreicherung bzw. Entfernung von Nukleinsäuremolekülen aus Kulturmedien durchgeführt werden. So kann es beispielsweise in Bioreaktoren aufgrund der im Medium enthaltenen hohen Konzentration an Nukleinsäuremolekülen, insbesondere hochmolekularen Nukleinsäuren, zu einem unerwünschten Anstieg der Viskosität kommen. Hier kann über das erfindungsgemäße Verfahren eine effiziente und biologisch verträgliche Entfernung der störenden Nukleinsäuremoleküle aus dem Kulturmedium erfolgen. Durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Sorptionsmittels zu dem Kulturmedium kann die Viskosität auch auf ein gewünschtes Maß eingestellt werden.
  • Genauso ist es in vielen Fällen erwünscht, die Konzentration an Nukleinsäuremolekülen in einem Medium zu erhöhen bzw. diese Nukleinsäuremoleküle möglichst in reiner Form zu gewinnen. Beispielsweise gehört die Gewinnung bzw. Aufreinigung gewünschter Nukleinsäuren aus Lösungen zu den Standardprozeduren in der biologischen und medizinischen Forschung. Dabei kann erfindungsgemäß in einem weiteren Schritt das Nukleinsäuremolekül von dem Sorptionsmittel wieder desorbiert bzw. ge wonnen werden, wodurch das Sorptionsmittel auch erneut eingesetzt werden kann, gegebenenfalls nach erneuter Säureaktivierung des Schichtsilicats.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung mit einem Sorptionsmittel und mindestens einem Nukleinsäuremolekül wie in der vorliegenden Beschreibung definiert, vorzugsweise in einem polaren, insbesondere in einem wässrigen oder alkoholischen Medium.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Sorptionsmittel als anorganische Vektoren zum Einbringen von Biomolekülen in Zellen oder als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt von Nukleinsäuren. So wurde überraschenderweise gefunden, dass sich die erfindungsgemäßen Sorptionsmittel auch zu einer effizienten Einschleusung dieser Biomoleküle in prokaryontische oder eukaryontische Zellen eignen. Offenbar lassen sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, in besonders vorteilhafter Weise zur Einschleusung in Zellen "verpacken". Der prinzipielle Mechanismus einer solchen Einschleusung am Beispiel von DNA-LDH-Nanohybriden ist beispielsweise in der Literaturstelle Choy et al., Angew. Chem. 2000, 112 (22), Seiten 4207-4211, sowie in der EP 0 987 328 A2 beschrieben, auf die diesbezüglich verwiesen wird und die hiermit durch Bezugnahme im Hinblick auf das Verfahren in die Beschreibung aufgenommen werden. Die Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt von Nukleinsäuren, ist als solche in der WO 01/49869 beschrieben, auf die diesbezüglich verwiesen und die hiermit durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird.
  • Methodenteil
  • Die vorliegend angegebenen BET-Oberflächen wurden nach DIN 66131 bestimmt.
  • Die angegebenen (mittleren) Porendurchmesser, -volumina und -flächen wurden unter Verwendung eines vollautomatischen Stickstoff-Adsorptionsmessgerätes (ASAP 2000, Firma Micrometrics) nach dem Standardprogramm des Herstellers (BET, BJH, t-plot und DFT) bestimmt. Die prozentualen Angaben zum Anteil bestimmter Porengrößen beziehen sich auf das Gesamtporenvolumen an Poren zwischen 1,7 und 300 nm Durchmesser (BJH Adsorption Pore Distribution Report).
  • Soweit angegeben, wurde die Porosimetrie nach der CCl4-Methode wie folgt durchgeführt:
  • Reagenzien:
    • Tetrachlorkohlenstoff (CCl4)
    • Paraffin (flüssig), Fa. Merck, (Best.Nr. 7160.2500)
  • Durchführung:
  • 1 bis 2 g des zu prüfenden Materials werden in einem kleinen Wägegläschen bei 130°C im Trockenschrank getrocknet. Anschließend wird im Exsikkator abgekühlt, genau gewogen und das Gläschen in einen Vakuum-Exsikkator gestellt, der je nach dem zu messenden Mikroporenvolumen die folgenden Paraffin/Tetrachlorkohlenstoff-Mischungsverhältnisse enthält:
    Figure 00220001
  • Der mit graduierter Kühlfalle, Manometer und Vakuumpumpe verbundene Exsikkator wird nun bis zum Sieden des Inhalts evakuiert. 10 ml Tetrachlorkohlenstoff werden verdampft und in der Kühlfalle aufgefangen.
  • Sodann lässt man den Exsikkatorinhalt 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur ausgleichen, anschließend lässt man langsam Luft in den Exsikkator. Nach Abnehmen des Exsikkatordeckels wird das Wägegläschen sofort verschlossen und auf der Analysenwaage zurückgewogen.
  • Auswertung:
  • Die Werte werden in Milligramm Tetrachlorkohlenstoff-Adsorption pro Gramm Substanz durch Gewichtszunahme errechnet. Durch Dividieren mit der Dichte des Tetrachlorkohlenstoffs ergeben sich die Porenvolumen in ml/g Substanz.
    Figure 00220002
    (Tetrachlorkohlenstoff bei 20°C, d = 1,595 g/cm3)
  • Messung des Zeta-Potentials
  • Von den zu untersuchenden Adsorbentien wurde jeweils eine wässrige Suspension mit dest. Wasser hergestellt. Die zu messende Suspension wurde jeweils auf pH 7 eingestellt. Das Zeta-Potential der Teilchen wurde mittels des Zetaphoremeters II der Firma Particle Metrix nach dem Prinzip der Mikroelektrophorese bestimmt. Dabei wurde die Wanderungsgeschwindigkeit der Teilchen in einem bekannten elektrischen Feld gemessen. Die Partikelbewegungen, die in einer Messzelle stattfinden, werden mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet. Die Wanderungsrichtung gibt Aussage über die Art der Ladung (positiv oder negativ) und die Teilchengeschwindigkeit ist direkt proportional zur elektrischen Grenzflächenladung der Teilchen bzw. zum Zeta-Potential. Die Partikelbewegungen in der Messzelle werden mittels Bildanalyse festgehalten und nach Ablauf der Messung werden die zurückgelegten Partikelbahnen berechnet und die daraus resultierende Teilchengeschwindigkeit ermittelt.
  • Unter Berücksichtung der Suspensionstemperatur und der elektrischen Leitfähigkeit wurde hieraus das Zeta-Potential (angegeben in mV) errechnet.
  • Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass gute Ergebnisse auch mit Schichtsilicaten mit negativem Zeta-Potential erzielt werden können.
  • Bestimmung der Teilchengrößenverteilung
  • Hierzu wurde ein Mastersizer der Fa. Malvern nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Zur Bestimmung der Luft werden ca. 2-3 g (1 Kaffeelöffel) von der zu untersuchenden Probe in den „Dry powder feeder" gegeben und je nach Probe auf den richtigen Messbereich eingestellt (je gröber die Probe, desto höher die Einwaage).
  • Zur Bestimmung in Wasser wird eine Probe (ca. 1 Messerspitze) ins Wasserbad gegeben bis Messbereich erreicht ist (je gröber desto höher die Einwaage), und 5 Min. im Ultraschallbad gerührt. Anschließend erfolgt die Messung.
  • Die Erfindung wird nun anhand der nachstehenden nichtbeschränkenden Beispiele näher erläutert.
    •
  • 1. Herstellung eines Sorptionsmittels
  • Ein Rohton mit einem Montmorillonitgehalt zwischen 70 bis 80% wird in Wasser aufgeschlämmt und über Zentrifugation aufgereinigt. Die erhaltene Slurry wird dann einer Säureaktivierung unterworfen. Hierbei werden die Konzentrationen so eingestellt, dass 56% Bentonit mit 44% 36 Gew.-%iger Salzsäure versetzt werden und 8 Stunden bei einer Temperatur von 95 bis 99°C gekocht wird. Anschließend wird mit Wasser so lange gewaschen, bis der Restchloridgehalt bei kleiner oder gleich 5%, bezogen auf den Feststoff liegt. Zur Analyse des Restchloridgehalts wird 10g Feststoff in 100 ml destilliertem Wasser gekocht und über einen Faltenfilter abfiltriert. Das Filtrat wird zur Bestimmung des Restchloridgehaltes mit Silbernitrat-Lösung titriert. Schließlich erfolgt eine Trocknung auf eine Restfeuchte von 8 bis 10 Gew.-%. Das erhaltene Endprodukt hat ein Gewicht von 430 bis 520 g/l. Durch ein Absieben bzw. zusätzliche Vermahlung lassen sich besonders bevorzugte Partikelgrößen einstellen.
  • 2. Charakterisierung des Sorptionsmittels
  • Die charakteristischen Daten dieses Sorptionsmittels (Adsorbens 1) und des entsprechenden Mahlgrads sind in den folgenden Tabellen angeführt. Die Charakterisierung der Oberfläche zeigt, dass in Lösungen ein negatives Zeta-Potential vorliegt. Die Oberflächenladungsdichte ist jedoch relativ klein. Hier können bei speziellen modifizierten Materialien Werte über 200 μeq/g erzielt werden.
  • Tabelle 1: Oberflächenladungsdichte und Zeta-Potential
    Figure 00250001
  • Tabelle 2: Teilchengrößenverteilung
    Figure 00250002
  • Das Adsorbens 1 wurde nach der BJH-Methode und BET-Methode (DIN 66131) bezüglich des durchschnittlichen Porendurchmes sers und der BET-Oberfläche charakterisiert. Es ergaben sich folgende Werte: Tabelle 3: BET-Oberfläche und Porendurchmesser
    Figure 00260001
  • Nach der CCl4-Methode (vgl. oben) ergaben sich folgende Werte: Tabelle 4: Porendurchmesser und Porenvolumen
    Figure 00260002
  • Um die Eignung des neuen Adsorbenstyps für eine Bindung von DNA zu testen, wurden Adsorptionsexperimente von Heringssperma DNA (Aldrich) durchgeführt.
  • Zur Konzentrationsbestimmung bei den Adsorptionsexperimenten wurde die DNA-Konzentration photometrisch bestimmt. Dabei wurde zur Messung eine Wellenlänge von 260 nm eingestellt. Zur Kalibration des Verfahrens mit dem eingesetzten DNA-Salz wurde eine Messung mit einer Konzentrationsreihe durchgeführt. Die erhaltene Kalibrationsgerade wurde zur photometri schen Bestimmung der DNA-Konzentration bei den Adsorptionsexperimenten eingesetzt.
  • Für die Adsorptionsexperimente wurde eine Heringssperma DNA-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5,63 mg/ml und 9,9 mg/l hergestellt und mittels 10mM Tris/HCL und 1mM EDTA auf pH 8 eingestellt. Anschließend wurden 0,1 g der Adsorbentien jeweils mit 5 ml der DNA-Lösung versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde 15 Minuten mit 2500 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde steril filtriert. Schließlich wurde die DNA-Konzentration im Überstand gemessen und daraus die Bindungskapazität für DNA berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle sowie in der folgenden Graphik zusammengestellt: Tabelle 5: DNA-Bindungskapazitäten
    Figure 00270001
    • BK
    = Bindungskapazität → umgerechnet in mg DNA bezogen auf 1 g der Adsorbentien
  • Um die gebundene DNA aus den Adsorbentien zurück zu gewinnen, wird mit 1,5 molarer Natriumchloridlösung in 10 mM Tris HCL pH 8,5 1 Std. eluiert (Elutionsvolumen: 100 ml), 15 min. bei 2000 rpm zentrifugiert, der Überstand steril filtriert und die Absorption gemessen.
  • Tabelle 4: Elution der gebundenen DNA
    Figure 00280001
  • Dabei wurde gefunden, dass die gebundene DNA nahezu quantitativ aus den Adsorbentien wieder zurückgewonnen werden kann. Dies zeigt den potentiellen Einsatz der neuen Adsorbentien sowohl beim Abtrennen als auch zum Auf reinigen von DNA.
  • Um die Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Adsorbentien für DNA im Vergleich zum Stand der Technik einordnen zu können, wurden analoge Bindungsversuche mit einem kommerziell erhältlichen Anionenaustauscher (Quiagen®, genomic Tip) durchgeführt. Die Matrix wurde aus der Säule entnommen und auf vergleichbare Korngröße wie das erfindungsgemäße Material vermahlen. Die Vergleichsergebnisse sind in der folgende Tabelle aufgelistet.
  • Tabelle 5: Vergleichsergebnisse zur DNA-Bindungskapazität mit kommerziell erhältlichem Adsorbens
    Figure 00280002
  • Wie der Vergleich der Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigt, weist der erfindungsgemäße Adsorbenstyp eine wesentlich höhere Bindekapazität auf als der Vergleichs-Anionentauscher. Somit werden Bindekapazitäten von Adsorbentien, die nach dem Stand der Technik komerziell erhältlich sind, erreicht bzw. übertroffen. Hinzu kommt, dass die erfindungsgemäßen Adsorbentien eine wesentlich schnellere DNA-Bindung aufweisen, weil die entsprechenden DNA Mengen bereits nach 1 Stunde gebunden sind im Vergleich zur Adsorptionszeit von 16 Stunden bei dem Vergleichsmaterial.
  • Die Daten legen nahe, dass bei den erfindungsgemäßen Adsorbentien insbesondere für große Biomoleküle die Bindestellen wesentlich besser zugänglich sind als für das Vergleichsadsorbens.
  • 4. Transfektion von NIH-3T3-Zellen mit säureaktiviertem Schichtsilicat als anorganischem Vektor
  • a) Zellkultivierung:
  • Für die Transfektionsexperimente wird die Zelllinie NIH-3T3 verwendet. Hierbei handelt es sich um adhärent wachsende Mausembryo-Fibroblasten. Die Verdoppelungszeit beträgt ca. 20 h. Die Zellen werden in dem Standardmedium DMEM (mit 4,5 g·l–1 Glukose) mit 10% NCS kultiviert. Die Kultivierung erfolgt in einem Brutschrank bei 37°C unter humidifizierter 5%-iger CO2-Atmosphäre.
  • Zum Ansetzen der Stammkultur wird die aufgetaute Zellsuspension in eine Monolayerflasche (25 cm2) mit 10 ml Medium gegeben. Eine direkte Zellzahlbestimmung ist bei adhärent wachsenden Zellen nicht möglich, eine Kontrolle der Wachstumsrate erfolgt über den Bedeckungsgrad des Kulturgefäßes. Bei ca. 90%iger Konfluenz – i.d.R. nach 3-4 Tagen – wird die Kultur umgesetzt, um das Überwachsen der Zellen (Fokibildung) zu vermeiden. Dazu wird das Medium abdekantiert, Trypsin-Lösung hinzugegeben und 10 min im Brutschrank inkubiert. Die abgelöste Zellsuspension wird mit ca. 15 ml serumhaltigen Medium vermischt, um das Trypsin zu blockieren. Die abzentrifugierten Zellen werden in frischem Medium resuspendiert und in einer Verdünnung von 1:10 neu ausgesät.
  • b) Transfektion:
  • Als anorganischer Vektor für die Transfektion von NIH-3T3-Zellen wurden die eingangs angegebenen Adsorbens-1-Proben vor der Transfektion mit dem Plasmid pQBI25-fC1 (Firma Quiagen, Heidelberg) "beladen". Dafür wurden 10 mg der jeweiligen Adsorbens-1-Probe eingewogen und zum Sterilisieren mit Ethanol gewaschen. Anschließend wurden 2 ml steriles, destilliertes Wasser hinzugegeben, kurz gevortext und 3 min bei 5000 UpM zentrifugiert. Zu dem Rückstand wurde 1,5 ml sterile Plasmid-DNA der Konzentration 1,45 ml·ml–1 gegeben und 16 h bei Raumtemperatur mit 250 UpM geschüttelt.
  • Das DNA-Adsorbens-1-Hybrid wurde in 10 ml destilliertem, sterilen Wasser suspendiert. Die Transfektion mit Adsorbens-1 als Vektor wurde jeweils mit zwei verschiedenen Konzentrationen von DNA-Adsorbens-1-Hybrid durchgeführt. Die NIH-3T3-Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit einer Dichte von 1-2 105 Zellen cm–2 in 6-Loch-Platten ausgesät und im Brutschrank bei 37°C unter humidifizierter 5%-iger CO2-Atmosphäre inkubiert. Die angegebenen Mengen beziehen sich jeweils auf ein Loch der 6-Loch-Platte. Die Analyse erfolgte 48 h nach Beginn der Transfektion mit dem Fluoreszenzmikroskop. Transfizierte Zellen erkennt man an der GFP-Produktion, bei Anregung mit 474 nm leuchten sie bei Betrachtung im Fluroreszenzmikroskop grün.
  • Variante 1:
  • Direkt vor dem Versuch wurde das Medium abgenommen und 1,5 ml neues Medium hinzugegeben. 25 bzw. 100 μl der DNA-Adsorbens- 1-Suspension wurden hinzugefügt und es wurde 3 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt und weitere 45 h inkubiert.
  • Variante 2:
  • Direkt vor dem Versuch wurde das Medium abgenommen und 1,5 ml neues Medium hinzugegeben. 25 bzw. 100 μl der Suspension wurden hinzugegeben und es wurde 24 h inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt und weitere 24 h inkubiert.
  • Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Hybrids mit dem Adsorbens-1 konnten zahlreiche erfolgreich transfizierte Zellen anhand der Fluoreszenz nachgewiesen werden, so dass sich die erfindungsgemäßen DNA-Adsorbens-1-Hybride als anorganische Vektoren eignen.

Claims (31)

  1. Verfahren zur Sorption, An- oder Abreicherung, Entfernung oder Gewinnung oder Auftrennung von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aus einem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei das Sorptionsmittel mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Schichtsilicat ausgewählt ist aus der Gruppe der natürlichen oder synthetischen Schichtsilicate.
  3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat eine BET-Oberfläche von mindestens 50 m2/g, insbesondere mindestens 100 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 130 m2/g, aufweist.
  4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat, vorzugsweise in Pulverform, eine Korngröße (D50) von 1 bis 1.000 μm, insbesondere von 5 bis 500 μm, aufweist.
  5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat, vorzugsweise in Granulatform, eine Korngröße (D50) von 100 bis 500 μm, insbesondere von 200 bis 2.000 μm, aufweist.
  6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat eine Porosimetrie wie folgt aufweist: Poren bis 80 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,80 ml/g, insbesondere zwischen etwa 0,2 und 0,7 ml/g; Poren bis zu 25 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,45 ml/g, insbesondere 0,18 bis 0,40 ml/g; Poren bis zu 14 nm zwischen etwa 0,10 und 0,40 ml/g, insbesondere etwa 0,12 bis 0,37 ml/g, jeweils bestimmt nach der CCl4-Methode.
  7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mittlere Porendurchmesser nach der BJH-Methode des säureaktivierten Schichtsilicats zwischen 2 und 25 nm, insbesondere zwischen 4 und 20 nm, liegt.
  8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus Mono-, Oligo- und Polynukleotiden oder deren. Mischungen.
  9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus Ribonukleinsäuren (RNA) und Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder deren Mischungen.
  10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül mindestens 10 Nukleotidbausteine, vorzugsweise mindestens 100 Nukleotidbausteine und besonders bevorzugt mindestens 1000 Nukleotidbausteine aufweist.
  11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül um eine kolloidale Lösung, Suspension, Dispersion, Lösung oder Emulsion handelt.
  12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) in Kontakt bringen des vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Mediums, das das mindestens eine Nukleinsäuremolekül enthält, mit dem Sorptionsmittel, b) Ermöglichen der Sorption des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls an bzw. in das Sorptionsmittel, c) Abtrennen des sorbierten bzw. an das Sorptionsmittel gebundenen Nukleinsäuremoleküls zusammen mit dem Sorptionsmittel aus dem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium, d) gegebenenfalls Abtrennung bzw. Desorption des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls von dem Sorptionsmittel.
  13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorptionsmittel im wesentlichen aus mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat besteht.
  14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säureaktivierung des Schichtsilicats mit einer anorganischen oder organischen Säure erfolgt.
  15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säureaktivierung des Schichtsilicats mit einer Säuremenge (wasserfrei) von 1 bis 35 Gew.-%, bezogen auf das Schichtsilicat, vorzugsweise bei erhöhter Temperatur erfolgt.
  16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem wässrigen oder alkoholischen Medium um eine DNA- oder RNA-Lösung, ein Fermentationsmedium, einen Fermentationrückstand aus der Zellkultur, Brauchwasser oder ein Abwasser handelt.
  17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt das Sorptionsmittel zusammen mit dem Nukleinsäuremolekül entsorgt wird.
  18. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt das mindestens eine Nukleinsäuremolekül von dem Sorptionsmittel wieder desorbiert bzw. wieder gewonnen wird, wodurch das Sorptionsmittel gegebenenfalls erneut eingesetzt werden kann.
  19. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption oder Wiedergewinnung des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls in einer Hochsalz-Pufferlösung, vorzugsweise mit mehr als 1 M NaCl erfolgt.
  20. Zusammensetzung mit einem Sorptionsmittel wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert und mindestens einem Nukleinsäuremolekül wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert in einem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium, enthaltend mindestens ein Nukleinsäuremolekül.
  21. Verwendung von mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat als Sorptionsmittel für Nukleinsäuren.
  22. Verwendung eines Sorptionsmittels wie in einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 13 definiert, oder der Zusammensetzung gemäß Anspruch 18 als anorganischer Vektor zur Einbringung von Nukleinsäuremolekülen in Zellen, oder als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Nukleinsäuren.
  23. Verwendung eines Sorptionsmittels wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert als Sorptionsmittel zur An- bzw. Abreicherung von Nukleinsäuremolekülen gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 17, insbesondere zur Entfernung oder Aufreinigung von Nukleinsäuren aus wässrigen oder alkoholischen Medien.
  24. Verwendung gemäß Anspruch 21 zur Senkung oder Einstellung der Viskosität des Mediums.
  25. Verwendung gemäß Anspruch 21 oder 22 bei der Herstellung bzw. Aufreinigung von biotechnologisch hergestellten Stoffen und Wirkstoffen.
  26. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorptionsmittel teilchenförmig vorliegt und gegebenenfalls mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht ist.
  27. Verwendung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bindemittel um Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten handelt.
  28. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorptionsmittel teilchenförmig vorliegt und gegebenenfalls mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht ist.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bindemittel um Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten handelt.
  30. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorptionsmittel teilchenförmig vorliegt und gegebenenfalls mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufge bracht ist.
  31. Zusammensetzung gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindemittel Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten ist.
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