WO2008151824A1 - Immobilisierung von enzymen auf bleicherden - Google Patents

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WO2008151824A1
WO2008151824A1 PCT/EP2008/004784 EP2008004784W WO2008151824A1 WO 2008151824 A1 WO2008151824 A1 WO 2008151824A1 EP 2008004784 W EP2008004784 W EP 2008004784W WO 2008151824 A1 WO2008151824 A1 WO 2008151824A1
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WO
WIPO (PCT)
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enzyme
granules
acid
water
activated
Prior art date
Application number
PCT/EP2008/004784
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ulrich Sohling
Kirstin Suck
Friedrich Ruf
Agnes Haimerl
Original Assignee
Süd-Chemie AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Süd-Chemie AG filed Critical Süd-Chemie AG
Publication of WO2008151824A1 publication Critical patent/WO2008151824A1/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/003—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
    • B01J31/1616—Coordination complexes, e.g. organometallic complexes, immobilised on an inorganic support, e.g. ship-in-a-bottle type catalysts

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of a solid enzyme complex, a solid enzyme complex as obtained by this process, and to its use in enzyme-catalyzed reactions.
  • the enzymes are bound on a carrier.
  • the binding can be done in different ways. Physical binding can be achieved by adsorption of the enzyme on the surface of the support. Binding occurs via hydrophobic interactions or by ionic forces, with charged groups of the enzyme interacting with oppositely charged groups on the surface of the support.
  • the advantage of this method is its ease of execution and the relatively low influence on the activity of the enzyme.
  • the disadvantage is that the enzymes can be displaced relatively easily from the surface of the carrier again.
  • An irreversible binding of the enzyme can be achieved by forming a covalent bond between the enzyme and the carrier.
  • the activity of the enzyme is lowered, since the enzyme may for example be fixed on the surface, that the active center is no longer accessible.
  • the stability of the enzyme / carrier complex can be further increased by the enzymes are crosslinked by at least bifunctional molecules. This results in larger aggregates, which have a lower solubility.
  • the control of immobilization is very difficult in this method.
  • a clear deactivation of the enzyme must usually be purchased, since its conformation is greatly altered or the active center is no longer freely accessible.
  • the enzyme is entrapped in a spherical or tubular matrix.
  • the matrix must be permeable to the educts and products of the catalyzed reaction, but not to the enzymes.
  • natural polymers such as alginates, gelatin or agar, or even syn- thetician polymers, such as polyacrylamide or polyvinyl alcohol used.
  • the enzyme is protected from being inactivated by the solvent in reactions in organic media.
  • a disadvantage that must be taken into account is that the matrix can act as a diffusion barrier for the starting materials and products of the enzyme-catalyzed reaction.
  • DE 2 154 672 describes a process for preparing a solid enzyme complex, wherein an enzyme in an aqueous buffer solution is brought into contact with a carrier which has been previously modified with a binder. Benetonite which has been treated with cyanuric chloride as binder is preferably used as the carrier.
  • the immobilization of the enzyme occurs very rapidly, i. within a few minutes, and is carried out at temperatures of less than 40 ° C, preferably at about 0 ° C, so that the thermal load of the enzyme remains low.
  • US Pat. No. 6,180,378 describes solid complexes in which an enzyme is immobilized on a sheet silicate.
  • the phyllosilicate is first delaminated in water.
  • the ions of the layered silicate can also initially be exchanged for sodium or alkylammonium ions.
  • the enzyme and a crosslinking agent, such as tetraethyl orthosilicate are then added to the suspension of the delaminated phyllosilicate. As the reaction progresses, larger aggregates form, with the enzyme trapped in interlayers of the layered silicate.
  • the solid can be washed neutral with a suitable buffer and then dried.
  • No. 5,279,948 describes an enzyme immobilized on a polymer which can also be used, for example, in columns.
  • the polymer used is either a homopolymer of 1-aminoethylene or a copolymer of 1-aminoethylene and N-vinylformamide.
  • the polymer is added to an aqueous solution of the enzyme and then a crosslinking agent is added which can react with amino groups.
  • Suitable crosslinking agents are, for example, glutaraldehyde, diisocyanates and polyazetidine.
  • a precipitate is obtained which is separated from the liquid medium and dewatered to give a paste-like mass which can be made into particles of a desired size.
  • the preparation of such an immobilized in a solid matrix enzyme is relatively expensive.
  • the acid-activated bentonite was suspended at a certain temperature in a solution of diastase adjusted to a pH of 6.9.
  • the enzyme was then adsorbed on the support for 90 minutes and the complex of immobilized enzyme and acid-activated bentonite separated from the suspension by centrifugation.
  • the adsorbed amount of enzyme was determined in each case by determining the amount of enzyme remaining in the supernatant from the difference to the amount of enzyme used.
  • the bleaching earths still contained about 40% by weight of oil, which could be almost completely removed by the enzymatic treatment, so that the reprocessed bleaching earth can be used again for bleaching oils or can be landfilled without problems.
  • the enzyme was reacted in a phosphate buffer (pH 7) at 4 ° C. with the sepiolite present in the sodium form and the solid was separated by centrifuging. The separated pellet was washed with buffer, sodium chloride being added in the second washing step to separate weakly bound enzyme from the clay. / Then the enzyme activity was determined.
  • a phosphate buffer pH 7
  • the clay minerals used were illite, kaolinite, montmorillonite, palygorskite and an undefined soil sample.
  • the adsorbed amount of enzyme could be increased by coating the minerals with aluminum hydroxide. After adsorption of the enzyme, the crystal structure of the clay minerals does not show any widening of the layer distance, so that, according to the authors, no enzyme is incorporated into the intermediate layers of the crystal structure.
  • the enzymes are immobilized on clay minerals, in particular bentonite, which are present in an aqueous buffer solution in colloidal form.
  • clay minerals in particular bentonite
  • such a finely divided suspension is not suitable for industrial applications because the fine particles are difficult to separate from the reaction medium after the end of the reaction.
  • US 5,342,768 describes a particulate immobilized lipase consisting essentially of a thermostable lipase isolated from a microorganism selected from the group of species of the genus Humicola, Candida antarctica and Rhizomucor miehei and adsorbed on particles of a macroporous support ,
  • the support consists of at least 65% of silica gel or silicates, wherein at least 90% of the particles have a particle size between 100 and 1000 microns and wherein at least 80% of the pores of the particles have a diameter which is 12 to 45 times the diameter of a lipase mole - k ⁇ ls corresponds, and wherein the water content of the particulate immobilized lipase is between 1 and 20%.
  • the particulate carrier is added to an aqueous solution of the lipase.
  • the loaded carrier particles are separated, optionally washed and dried to the specified water content.
  • the object of the invention was to provide a process for the preparation of a solid enzyme complex which can be carried out simply and inexpensively and in which a solid enzyme complex is obtained which can be used in industrial processes and which has a high activity when used and has a long half-life.
  • the swelling ability of the layer mineral is lost to decay into primary particles, so that the Granules or the solid enzyme complex produced therefrom, for example, problems in the form of a column or packing ready ⁇ let, which may then be passed through by an aqueous solution of the enzyme substrates.
  • the solid enzyme complex let easily removed from the liquid Reakti ⁇ onsmedium by this let settle for example, within a short period and the supernatant decanted liquid phase or aspirates.
  • the erfmdungsgeande method for producing a solid enzyme complex is carried out by
  • a powdered granulation mixture which is formed to at least 50 wt .-% of an acid-activated phyllosilicate;
  • the soft granules are calcined, whereby a water-resistant granules are obtained;
  • At least one enzyme is immobilized on the waterproof granules.
  • a powdery granulation mixture is provided, which is formed to at least 50 wt .-% of an acid-activated phyllosilicate.
  • acid-activated layer silicates are also known as bleaching earths.
  • These acid-activated phyllosilicates have, as a suspension in water (10% by weight), a pH of less than 7.0, preferably less than 6.0, more preferably less than 5.0.
  • the pH can be determined, for example, by means of a pH electrode.
  • the amount of acid-activated phyllosilicate is preferably chosen to be high.
  • the proportion of the acid-activated Schxchtsilikats to the granulation at least 70 wt .-%, more preferably at least 90 wt .-%.
  • the granulation mixture consists to 100% of the acid-activated phyllosilicate.
  • Further phyllosilicates be included in the granulation next to the acid-activated sheet silicate Kings ⁇ nen, eg non-activated layer silicates.
  • These non-activated sheet silicates can serve as a binder and cause a higher strength of the granules.
  • sheet silicates for example Bentomte can be used.
  • smectite phyllosilicates are bentomes, sapomites, hectorites, attapulgites or sepiolites.
  • the proportion of these non-activated sheet silicates is preferably in the range from 1 to 50% by weight, preferably in the range from 2 to 40% by weight, particularly preferably 5 to 30% by weight, particularly preferably 15 to 25% by weight. selected.
  • granulating aids or pore formers may, for example, still be present in the pulverulent granulation mixture.
  • the percentages for the pulverulent granulation mixture relate to a dry free-flowing granulation mixture, ie without an addition of liquid.
  • the pulverulent granulation mixture preferably has an average particle size in the range of less than 100 ⁇ m, more preferably in the range of 5 to 80 ⁇ m.
  • the particle size can be determined, for example, by sieve analysis.
  • the dry screen pressure on a screen of mesh size of 25 microns is preferably in the range of 50 to 65 wt .-%.
  • the powdered granulation mixture is then processed into a soft granulate.
  • a soft granulate is understood to mean a granulate which is not stable in water but decomposes again into its pulverulent constituents. To check the stability, the soft granules can be introduced into water. After a certain life, for example, one hour at room temperature, then the condition of the granules is examined. In soft, non-waterproof granules forms a haze or a fine sediment and the granules decompose partially or completely.
  • the wet sieve pressure after a standing time of one hour xn water is at most 50% by weight of the amount of granules used, preferably less than 20% by weight, preferably less than 10% by weight. It is particularly preferred that no wet sieve residue remains in water after one hour of service life.
  • the dry pulverulent granulation mixture can be pressed under high pressure into shaped bodies which, if appropriate, can be comminuted again to the desired size after shaping.
  • a highly compacting shaping can be carried out, for example, in a tablet press, an annular disc press or a briquetting press.
  • This plastic mass can then be extruded into, for example, a strand which is comminuted into a granulate of the desired size.
  • the dried lumps can then be broken and the granules of the desired size separated by sieving.
  • Granulation of the granulation mixture preferably takes place in such a way that the granulation mixture is introduced into a high-speed mixer and that an aqueous binder, for example water or water glass, is added in its entirety within a short period of time.
  • the granulation can be carried out both in a batch process and in a continuous process.
  • a so-called monosemic mixer and, for continuous granulation for example a continuously operating ploughshare mixer, as offered for example by Lodige, or a ring-layer mixer, such as a Lodige CB mixer, can be used.
  • the energy intake during kneading is generally from 0.01 to 1 kWh / kg, in particular from 0.05 to 0.5 kWh / kg of moistened granulation mixture.
  • the water content of the moist granulation mixture is preferably set to 35 to 55% by weight, preferably 40 to 50% by weight.
  • the binder used is preferably pure water. But it is also possible to use binders that remain in the granules after drying.
  • a suitable binder is, for example, water glass.
  • the solids content of the water glass is preferably 1 to 50 wt .-%, preferably 3 to 45 wt .-%, particularly preferably 5 to 40 wt .-%, particularly preferably 30 to 38 wt .-%.
  • the granulation can be conducted so that a condensation of the water glass is initiated by the acidic layer silicate, whereby silica gel is formed, which ensures a cohesion between Pn marpellen the acidic layered silicate.
  • the soft granules are then calcined.
  • the Calcmation is carried out at temperatures in the range from 300 to 900 0 C, preferably 400 to 800 0 C, particularly preferably from 500 to 700 0 C.
  • the duration of calmation depends on the amount of granules to be calcined and on the apparatus used.
  • a suitable device for example, a rotary kiln, which allows gleichconceiges heating of the granules.
  • the duration of calmation is preferably selected in the range of 5 minutes to 5 hours, preferably 10 minutes to 4 hours, more preferably 15 minutes to 2 hours.
  • the water-resistant granules preferably have a specific surface area of more than 50 m 2 / g, preferably in the range of 70 to 300 m 2 / g, particularly preferably 80 to 260 m 2 / g.
  • the pore volume of the water-resistant granules, determined by the BJH method, is preferably more than 0.25 cm 3 / g and is preferably in the range of 0.07 to 0.7 cm 3 / g, particularly preferably in the range of 0.1 to 0.6 cm 3 / g.
  • the water-resistant granules should have a sufficiently high stability so that they do not decompose even after prolonged use in water.
  • the Nasssiebruckstand is more than 90 wt .-%, preferably more than 95 wt .-%, more preferably more than 98 wt .-%.
  • a method for determining the wet sieve pressure is shown in the examples. If the powdered granulation mixture was moistened before granulation, the soft granules are preferably dried before being calcined. For this purpose, conventional devices or methods can be used. For example, drying in an oven or in a stream of hot air is possible.
  • the temperature is preferably selected in the range from 80 to 120 ° C., particularly preferably from 90 to 110 ° C.
  • the soft granules preferably have a water content of less than 35% by weight.
  • the water content is in the range of 5 to 30 wt .-%, particularly preferably 10 to 20 wt .-%.
  • an enzyme is provided which is to be immobilized on the waterproof granules to obtain a solid enzyme complex.
  • the enzyme there are no limitations on the enzyme to be provided in the form of a solid enzyme complex. All enzymes which are known to carry out enzyme-catalyzed reactions can in fact be incorporated into the solid enzyme complex.
  • the enzyme is preferably selected from the group which is formed from lipases, oxidoreductases, such as glucose oxidase or pyruvate dehydrogenase, transferases, such as hexokinase or glycogenophosphorylase, hydrolases, such as amylases, chymotrypsm, peptidases or esterases, isomerases, such as glucose isomerase , Ligases, such as carboxylases, lyases, such as aldolase or catalase.
  • the enzyme is particularly preferably a lipase, in particular from the enzyme class of the hydrolases.
  • Lipases are enzymes that cleave lipids, such as triglycerides or diglycerides, to free fatty acids and glycene.
  • Lipases (Tn acylglycerol hydrolases) catalyze the hydrolysis as well as the synthesis of esters of glycene and long-chain fatty acids.
  • Other lipase-catalyzed reactions include the transesterification of lipids and the esterification of primary, secondary and tertiary alcohols.
  • the industrial use of these enzymes is very versatile. Addition to detergents is the largest field of application for lipases. Approximately 1000 tons of enzyme are added to detergents every year.
  • lipases are used for the production of emulsifiers and flavorings.
  • lipases are used for the synthesis of glycerides and flavorings, as well as for the modification of fats.
  • Another major application for lipases is the production of bulk and fine chemicals. The use of the enzymes for stereoselective reactions is becoming increasingly important. Lipases are also used in the production of lubricants, hydraulic oils and biodiesel.
  • the water-resistant granules is preferably equilibrated to a suitable pH before the task of the enzyme.
  • the waterproof granules are preferably slurried in a suitable buffer.
  • the pH of the buffer is preferably selected in a range of 3.0 to 7.0.
  • the buffer is preferably chosen equal to the buffer in which the enzyme is dissolved or absorbed.
  • the period for the equilibration of the waterproof granules is preferably selected in the range of 5 minutes to 3 hours, preferably 30 minutes to 2 hours.
  • the buffer used to equilibrate may be replaced with fresh buffer if necessary.
  • the enzyme is preferably provided in the form of an aqueous solution.
  • the enzyme is preferably provided in a buffered solution.
  • the pH of the buffer is selected depending on the enzyme to be immobilized, and is preferably in the range of 3 to 9. The ideal range for the pH depends on the specific enzyme.
  • the pH of the buffer is preferably selected in the range of 3 to 5.
  • the buffer is suitably selected in such a way that its buffer effect is as large as possible at a pH which is approximately one unit below the isoelectric point of the enzyme in question.
  • the enzyme then has a positive total charge and can be fixed by an ionic bond on the carrier.
  • the concentration of the buffer is suitably adjusted in the range of 10 to 300 mmol / l, preferably 50 to 200 mmol / l.
  • the concentration of the enzyme in the solution is preferably selected in the range of 1 to 10 mg / ml.
  • the immobilization is preferably carried out at a temperature in the range of 0 to 37 0 C, particularly preferably 4 to 10 0 C. Enzyme and water-resistant granules can be brought into contact in any desired manner.
  • the carrier can be suspended in a solution of the enzyme. But it is also possible to spray the solution of the enzyme on the carrier while it is being moved, for example.
  • the time required for the immobilization of the enzyme depends on the carrier used and the enzyme used. Preferably, the reaction time is chosen in the range of 10 minutes to 5 hours.
  • the reaction medium can still be separated from the solid enzyme complex. This can be done by conventional methods, for example by filtration or Zent ⁇ fug Schl.
  • the solid enzyme complex can then be washed to remove unbound enzyme.
  • the same buffer can be used for washing as has been used in the reaction of enzyme and water-resistant granules.
  • the solvent can also be evaporated.
  • the solvent can be distilled off under reduced pressure. Again, the temperature is chosen as low as possible in order to avoid premature deactivation of the enzyme.
  • the enzyme is preferably immobilized by non-covalent bonds on the surface of the water-resistant granules.
  • the waterproof granules and the enzyme are reacted with a coupling agent having at least two reactive groups, so that one of the groups with, for example, hydroxy groups on the surface of the waterproof granules and the other group can react with a suitable group on the enzyme, such as a hydroxy group. , an ammo or a thiol group.
  • a suitable coupling agent is, for example, cyanuric chloride.
  • Particularly suitable as coupling agents are functionalized silanes, as are commonly used for fixing enzymes on inorganic carriers.
  • This binds first functionalized alkoxy or chlorosilanes on the carrier.
  • alkoxy groups for example, methoxy or ethoxy groups are used.
  • the attachment of the functionalized silane takes place, for example, via the formation of Si-O-Si bonds with elimination of alcohol or HCl.
  • functionalized silanes which carry functional groups which can react directly with groups on the enzyme, in a second step the enzyme can be bound directly to the carrier.
  • Epoxysilanverbmdungen such as epoxyalkyltrialkoxysilane.
  • the epoxy group of the silane after application to the carrier can react directly with free NH 2 groups of the enzyme.
  • the functionalized silane is first reacted after application on the support with an activating agent.
  • an activating agent With the activation agent groups are introduced into the silane bound on the surface of the carrier, wel can react with a group on the enzyme, for example an amino group. Only after the activating agent has reacted with a group on the silane can the enzyme be attached in a further reaction step to a group of the activating agent.
  • the carrier described above obtained by thermal treatment of a clay mineral can be reacted with an ammoalkoxysilane.
  • the aminoalkoxysilane for example, reacts with a hydroxy group on the surface of the carrier.
  • a bifunctional activating agent for example a dialdehyde or a diisocyanate.
  • One functional group reacts with the amino group provided on the surface of the support and the other functional group is available for reaction with a group on the enzyme.
  • a suitable bifunctional aldehyde is, for example, glutaraldehyde.
  • the enzyme is bound via a non-covalent bond to the water-resistant granules.
  • non-covalent bonds are, for example, ionic bonds or nonspecific bonds, such as van der Waals bonds.
  • the noncovalent binding of the enzyme to the water-tight granules lessens the structure of the enzyme so that the immobilization does not interfere excessively with the activity of the enzyme.
  • the amount of the enzyme immobilized on the carrier is preferably selected to be high enough to achieve a sufficiently high activity of the solid enzyme complex.
  • the proportion of the enzyme, based on the weight of the solid enzyme complex is preferably between 3 and 35% by weight, particularly preferably 5 to 20% by weight, particularly preferably 8 to 15% by weight.
  • the enzyme contained in the solid enzyme complex is, as already explained, not subject to any particular restrictions.
  • the enzyme has a molecular weight in the range of 10 to 200 kDa.
  • an acid-activated phyllosilicate is used to prepare the water-resistant granules.
  • the acid-activated phyllosilicate is obtained by treating an acid, which has preferably been obtained from a natural source or even a synthetic phyllosilicate, with an acid.
  • Such acid-activated phyllosilicates are also known as surface-modified bleaching earths.
  • All phyllosilicates can be used as starting material. Particular preference is given to the use of layered montmorillonite / beidellite series layer silicates, such as e.g. Montmonolitone, bentonite, soda, saponite and hectorite.
  • layered montmorillonite / beidellite series layer silicates such as e.g. Montmonolitone, bentonite, soda, saponite and hectorite.
  • the activation can be carried out by conventional methods.
  • the starting material can be impregnated with the acid or suspended in the acid.
  • the activation can also be carried out, for example, by spraying an aqueous solution of the acid onto the phyllosilicate, wherein the phyllosilicate is preferably agitated. Excess water used as a solvent for the acid may be removed after activation become.
  • the amount of acid applied to the layered silicate, calculated as the anhydrous acid is preferably in the range from 1 to 10% by weight, more preferably from 2 to 6% by weight.
  • the starting materials used are weathering products of phyllosilicates which have virtually no detectable layer structure and are therefore X-ray amorphous.
  • These weathering products have a very high specific surface area of preferably more than 200 m 2 / g, preferably 210 to 280 m 2 / g, particularly preferably 220 to 260 m 2 / g, and a high pore volume of preferably more than 0.5 ml / g, preferably 0.7 to 1.1 ml / g, more preferably 0.8 to 1.0 ml / g.
  • These weathering products preferably still have a relatively high ion exchange capacity.
  • the ion exchange capacity is preferably more than 40 meq / 100 g and is more preferably in the range of 50 to 90 meq / 100 g, particularly preferably 55 to 85 meq / 100 g.
  • the weathering product preferably has a very low swelling capacity. After the weathering product has been allowed to stand in water for three days at room temperature, the sediment volume is preferably less than 15 ml / 2 g, more preferably less than 10 ml / 2 g. Room temperature is understood to mean a temperature of about 15 to 25 ° C., in particular about 20 ° C.
  • the sheet silicate is preferably not washed but merely dried.
  • the acid-activated phyllosilicate may optionally be ground to the desired grain size.
  • The- se facilitates the non-covalent binding of enzymes on the surface-activated phyllosilicates, since a binding of the enzyme via electrostatic interactions is possible, ie the enzyme is bound, for example, via ionic interactions on the surface of the carrier. This is particularly true when the enzyme is getragert at a pH value that is below ⁇ half of the isoelectric point of the enzyme.
  • the enzyme has cationic groups which can form an ionic bond by exchange with protons present in the structure of the surface-activated phyllosilicate or, for example, alkali or alkaline earths still present. In addition to these ionic bonds, hydrophobic interactions may also play a role in the binding of the enzyme to the support.
  • the acid-activated phyllosilicate is obtained by hot extraction of a phyllosilicate preferably obtained from a natural source with an acid.
  • Such acid-activated phyllosilicates are also known as highly active bleaching earths.
  • mixtures of two or more of these minerals can be used.
  • the phyllosilicate is mixed with strong acid and heated.
  • Suitable acids are, for example, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid or nitric acid, which are preferably used in concentrated form. Salt- Acid and sulfuric acid are particularly preferred.
  • the amount of acid is preferably chosen in the range from 50 to 200% by weight, based on the phyllosilicate used.
  • the suspension is heated to a temperature of more than 80 0 C, preferably more than 90 0 C, preferably at boiling heat. The duration of the extraction depends on the starting material and the desired degree of activation.
  • the suspension is preferably heated for 3 to 20 hours, more preferably for 4 to 15 hours.
  • the porosity of the acid-activated phyllosilicates can be influenced. By a more intensive extraction, in particular, the porosity in the range of pores with a diameter of less than 50 nm can be increased.
  • the solid is separated off, for example by filtration of the hot suspension.
  • the acid-activated phyllosilicate is then preferably washed free of acid with water and then dried. Possibly. For example, the acid-activated phyllosilicate can be ground again.
  • the degree of activation of the acid-activated phyllosilicate is preferably selected such that at least 10% by weight, preferably at least 20% by weight, particularly preferably 40 to 80% by weight, of the aluminum present in the starting material is removed.
  • the acid-activated phyllosilicate obtained by extraction with hot acid preferably contains from 2 to 15% by weight, preferably from 5 to 12% by weight, of aluminum, calculated as Al 2 O 3 .
  • the silicate content, calculated as SiC> 2 , of the acid-activated phyllosilicate is 85 to 98% by weight, preferably 88 to 95% by weight.
  • the acid-activated phyllosilicate produced by extraction with hot acid preferably has an average pore diameter, determined by the BJH method (DIN 66131) between 2 and 25 nm, more preferably between 4 and 10 nm.
  • the pore volume of the acid-activated layer silicate, determined by the CCl 4 method, of pores having a diameter of up to 80 nm is between 0.15 and 0.8 ml / g, particularly preferably 0.2 to 0.7 ml / g, of pores having a diameter of up to 25 nm between 0.15 and 0.45 ml / g, more preferably 0.18 to 0.4 ml / g, for pores having a diameter of up to 14 nm in between 0.02 and 0.3 ml / g, particularly preferably 0.05 to 0.2 ml / g, and of pores having a diameter of 25 to 80 nm between 0.02 and 0.3 ml / g, particularly preferably 0 , 05 to
  • the BET surface area of the acid-activated phyllosilicate produced by extraction with hot acid is preferably 50 to 800 m 2 / g, more preferably 100 to 600 m 2 / g, particularly preferably 130 to 500 m 2 / g.
  • Extraction with acid decreases the ion exchange capacity of the phyllosilicates.
  • the ion exchange capacity is less than 30 meq / 100 g.
  • the ion exchange capacity of the acid-activated phyllosilicate is particularly preferably in the range from 5 to 25 meq / 100 g.
  • the cation exchange capacity is only slight. Therefore, if the enzyme is adsorbed on such a carrier, the binding is believed to be primarily due to nonspecific interactions, such as van der Waals compounds, as well as hydrogen bonding between groups on the enzyme and Si-OH groups provided on the surface of the carrier.
  • the solid enzyme complex prepared by the process according to the invention is particularly suitable for use as a sealant as well as for use in batchwise processes.
  • the subject of the invention is therefore also a firm En- zymkomplex, as obtained by the method described above.
  • the solid enzyme complex comprises a water-resistant granules of an acid-activated phyllosilicate on which at least one enzyme is immobilized.
  • the particle size of the waterproof granules is preferably selected in the range of 100 ⁇ m to 1.2 mm.
  • any enzymes can be immobilized per se.
  • Exemplary enzymes have already been discussed in the description of the method of preparation.
  • the enzymes are non-covalently bound to the waterproof granules, i. the immobilization takes place via physical interaction between the surface of the water-resistant granules and the enzyme, for example via ionic bonds, hydrogen bonds or via hydrophobic interactions. Further details on the properties of the solid enzyme complex have already been discussed in the process.
  • the invention also relates to the use of the above-described solid enzyme complex for enzyme-catalyzed reactions.
  • the reactions can be carried out per se under known conditions and in known devices.
  • the reactions can be carried out in suspension, for which purpose the solid enzyme complex is slammed in a, preferably buffered, solution of the substrate to which other conventional components such as coenzymes, ATP, etc. may be added.
  • the surface area and the pore volume were determined with a fully automatic nitrogen porosimeter from the company Mikromentics, type ASAP 2010.
  • the sample is cooled in a high vacuum to the temperature of liquid nitrogen. Subsequently, nitrogen is continuously metered into the sample chamber. By detecting the adsorbed amount of gas as a function of pressure, an adsorption isotherm is determined at a constant temperature. After pressure equalization, the analysis gas is gradually removed and a desorption isotherm is recorded.
  • the pore volume is also determined from the measurement data using the BJH method (EP Barret, LG Joiner, PP Haienda, J. Am. Chem Soc 73 (1951, 373)), which also takes into account effects of capillary condensation
  • Pore volumes of certain pore-size areas are determined by summation of incremental pore volumes obtained from the BJH adsorption isotherm analysis.
  • the total pore volume according to the BJH method refers to pores with a diameter of 1.7 to 300 nm.
  • the micropore volume is determined by allowing carbon tetrachloride vapor to act on the clay material and determining the weight gain caused by the adsorption of carbon tetrachloride. To detect pores of a certain diameter, the vapor pressure of the carbon tetrachloride is reduced by the addition of certain amounts of paraffin to the liquid carbon tetrachloride.
  • the desiccator connected to the graduated cold trap, pressure gauge and vacuum pump is then evacuated to boiling the contents. 10 ml of carbon tetrachloride are evaporated and collected in the cold trap.
  • the desiccator content is allowed to equilibrate for 16 to 20 hours at room temperature, then slowly let air into the desiccator. After removing the desiccator lid is the Weighing jars closed immediately and weighed back on the analytical balance.
  • PorenvolumenimlIg Au ⁇ aageig) - A W aage (g)
  • the measurements are carried out with a device "Mastersizer” from Malvern Instruments Ltd., UK, according to the manufacturer's instructions.
  • the measurements are carried out with the intended sample chamber ("dry powder feeder") in air and the values related to the sample volume are determined.
  • the water content of the products at 105 0 C is determined using the method DIN / ISO-787/2.
  • This analysis is based on the total resolution of the clay materials or the corresponding product.
  • the individual components with conventional specifi ⁇ rule of analysis are such as ICP analyzed and quantified ⁇ ed.
  • the clay material to be examined is dried at 105 ° C. over a period of 2 hours. Thereafter, the dried clay material is reacted with an excess of aqueous 2N NH 4 Cl solution for 1 hour under reflux. After a service life of 16 hours at room temperature, it is filtered, whereupon the filter cake is washed, dried and ground and the NH 4 content in the clay material is determined by nitrogen determination (CHN analyzer "Vario EL III" from Elementar in Hanau) according to the manufacturer's instructions. The proportion and type of exchanged metal ions is determined in the filtrate by ICP spectroscopy.
  • a graduated 100 ml graduated cylinder is filled with 100 ml of distilled water. 2 g of the substance to be measured are added slowly and in portions, each about 0.1 to 0.2 g with a spatula on the surface of the water. After a drop of added portion, the next portion is added. After the 2 g of substance have been added and dropped to the bottom of the measuring cylinder, the cylinder is allowed to stand for one hour at room temperature. Then the height of the sediment volume in ml / 2g is read off the graduation of the measuring cylinder. For the determination of the sediment volume after 3 tägi- ger storage in water of the sample preparation is sealed with Parafilm ® and vibration-free for 3 days at room temperature ditched. Then the sediment volume is read off the graduation of the measuring cylinder.
  • the methylene blue value is a measure of the internal surface of the clay materials.
  • the test of the clay material is carried out in the same way as for the test bentonite. From the used amount of methylene blue solution, the inner surface of the clay material can be calculated.
  • 381 mg methylene blue / g clay correspond to a content of 100% montmorillonite according to this method.
  • a 5% suspension is prepared by stirring an appropriate amount of the clay material to be examined at about 930 rpm for about 5 minutes in water.
  • the suspension is stirred for a further 15 minutes at about 1865 rpm and the suspension is then poured through a sieve of the desired mesh size.
  • the residue is washed with tap water until the wash water runs clear.
  • the sieve with the residue is then placed in an ultrasonic bath for 5 minutes to remove residual fines.
  • the remaining residue is washed briefly with tap water and the ultrasonic treatment is repeated, if necessary, until during the ultrasound treatment no more fines pass into the water.
  • the sieve is then dried to constant weight. For weighing, the residue left on the sieve is transferred to a weighed porcelain dish.
  • 105 to 115 g of the granules are placed on a sieve of mesh size 0.15 mm and sieved finely divided portions of the granules.
  • the sieve is again 15 mm. shaken and weighed again the material that has accumulated in the drip tray. From the sum of the sieve passes results Brech Kingssiere for 30 mm.
  • Em at the 1000 ml markx réelle truncated graduated cylinder is weighed. Then, the sample to be examined is filled by means of a Pulvertrichters so in a train in the measuring cylinder that forms a debris cone above the conclusion of the measuring cylinder. The debris cone is scraped off with the aid of a ruler, which is guided over the opening of the measuring cylinder and weigh the filled graduated cylinder again. The difference corresponds to the waste weight.
  • the protein quantification according to the modified Lowry protocol is based on the reaction of proteins with copper sulfate and copper tartrate in alkaline solution, which leads to the formation of a four-tame copper-protem complex.
  • 100 ⁇ l of the protein / enzyme solution are pipetted into a cavity of a 96-well plate.
  • 100 ⁇ l Lowry reagent is pipetted in and the mixture is homogenized.
  • 50 ⁇ l of Folm-Ciocalteu reagent are added and the mixture is rehomogenized.
  • 30 minutes after addition of the Folm-Ciocalteu reagent the absorbance is measured against a blank value at 750 nm in the plate photometer.
  • Bicmchonylic acid serves as a detection system in the BCA method.
  • complex formation of protein with Cu 2+ ions in alkaline solution occurs.
  • the Cu 2+ ions of the complex xes are reduced to Cu 4 ions, which can be detected by complex formation with BCA by absorption measurement at 562 nm.
  • 25 ⁇ l of the enzyme / protein solution are pipetted into a well of a 96-well plate.
  • 200 ⁇ l of working reagent are pipetted in and the mixture is homogenized. After incubation for 30 minutes at 37 ° C., the absorbance at 550 nm is measured in the plate photometer.
  • Bleaching earth 1 is a 5% H 2 SO 4 surface-activated bleaching earth.
  • Bleaching earth 2 is a highly activated bleaching earth digested by extraction with hot HCl.
  • Table 1 Physical properties of sour activated bleaching earths used as starting material a) shaping by wet granulation
  • the quantities of bleaching earths 1 and 2 indicated in Table 2, 5 were initially introduced into an Eirich Intensive Mixer R02E and water was metered in via a funnel as agglomerating agent.
  • the low setting for the rotational speed of the plate as well as the maximum rotational speed for the whirl beer were chosen.
  • the agglomeration parameters were chosen below such that more than 50% of the granules were in a particle size range of 0.4 to 1.4 mm.
  • the granules were sieved off appropriately after granulation and drying. The granules were then dried in a drying oven to a maximum water content of 15% by weight.
  • the dried granules were transferred to an oven and calcined at 600 ° C for one hour.
  • the properties of the soft granules obtained before the heat treatment and of the water-resistant granules obtained after the calcination are summarized in Tables 3 and 4 for the surface activated bleaching earths and in Tables 5 and 6 for the highly activated bleaching earths.
  • Laundrosil ® DGA alkaline activated bleaching earth (Sud-Chemie AG, Kunststoff)
  • Table 3 Properties of the granules before calcination
  • Table 4 Properties of the granules after calcining
  • Table 5 Wet granulation of highly activated bleaching earths
  • the resulting granules are calcined for one hour at 600 0 C.
  • the properties of the pellets are also placed ⁇ leads in Table 8 below.
  • the granules have a high mechanical stability and, on the other hand, still have a high porosity.
  • Table 8 physical properties of acid-activated bleaching earths used as starting material and the granules produced therefrom
  • a granulate of bleaching earth 2 was prepared analogously to the abovementioned conditions.
  • the properties of the granules are summarized in Table 9 Table 9: Physical properties of a granulate made from bleaching earth 2
  • Example 2 Supports lipase on thermally treated clay minerals
  • the lipase was immobilized once on the pulverulent and once on the granulated bentonite.
  • a lipid from Candida rugosa (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, Germany) was used.
  • the lipase from the organism Candida rugosa a yeast fungus, has a size of about 60-65 kDa and an isoelectric point of 5.2.
  • Lipases from the organism Candida rugosa belong to the nonspecific lipases which have no regiospecific properties and thus hydrolyze all ester bonds.
  • Example 1 In each case 25 mg of the powdered bentonites 1 and 2 used as starting material in Example 1 are equilibrated in 10 ml of 50 mM Na acetate buffer (pH 4). The carrier suspended in the buffer is sonicated for 30 minutes and shaken at 15 rpm for 30 minutes in an overhead mixer. The suspension is then centrifuged at 3219 g and 10 0 C for 10 minutes and the supernatant discarded.
  • a stock solution of the lipase is prepared at a concentration of 2 mg / ml in 50 mM sodium acetate buffer (pH 4).
  • the amount of enzyme adsorbed on the carrier was calculated from the difference between the amount of enzyme used and the sum of the amount of enzyme measured in the supernatant or in the wash water. All experiments are carried out in triplicate. After the supernatant is completely removed, the carrier loaded with the enzyme is taken up in 1-3 ml of distilled water and the suspension is used for the activity tests. Activity determination of the stored lipase (Candida rugosa)
  • the activity of the enzyme is determined by the NaOH consumption. Unit-Definition
  • One unit hydrolyzes 1.0 ⁇ M fatty acid (from triglycerides) in one hour at pH 7.7 and 37 ° C.
  • Table 10 shows the results of the adsorption and activity of the supported enzyme lipase ⁇ Candida rugosa).
  • the activity calculation of the stored enzyme / mg was based on the adsorbed amount, which was calculated from the mean of the BCA and Lowry measurements of the supernatant
  • the acid-activated phyllosilicates are suitable for carrying lipase.
  • the powders (not according to the invention) show a high binding capacity for the lipase.
  • 25 mg of the powdered bleaching earth binds 2 13.9 mg of lipase.
  • the relative activity of the lipase on the carriers is indeed reduced compared to the activity in solution. However, it is still more than 30% of the activity in solution for the two powders.
  • the granulation makes it possible to produce stable granules from these powders which have a reduced, but still high binding capacity for lipase. This is caused by the fact that the enzymes are adsorbed usually only on the outer shell of the granules and the interior of the granules for adsorption and diffusion are not accessible.
  • the granules produced by extrusion and subsequent calcination at 600 0 C a binding capacity of more than 20% enzyme based on the carrier material.
  • the granules still show a good activity of the adsorbed lipase.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines festen Enzymkomplexes. Dabei wird eine pulverförmige Granuliermischung, die zu zumindest 50 % aus einem sauer aktivierten Schichtsilikat besteht, zunächst granuliert und dann calciniert, um ein wasserfestes Granulat zu erhalten. Auf dem wasserfesten Granulat können dann Enzyme immobilisiert werden. Ferner wird ein mit dem Verfahren erhältlicher fester Enzymkomplex sowie dessen Verwendung in enzymatisch katalysierten Reaktionen beschrieben.

Description

IMMOBILISIERUNG VON ENZYMEN AUF BLEICHERDEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines festen Enzymkomplexes, einen festen Enzymkomplex, wie er mit diesem Verfahren erhalten wird, sowie dessen Verwendung in enzymkatalysierten Reaktionen.
Wegen ihrer hohen Selektivität sowie des relativ geringen Energiebedarfs gewinnen enzymatisch katalysierte Reaktionen zunehmende Bedeutung auch für in industriellem Maßstab durchgeführte Synthesen. Sind die Herstellungskosten der Enzyme jedoch hoch, ist es erforderlich, dass diese wiederholt eingesetzt werden können. Sie müssen sich daher kostengünstig aus der Reaktionsmischung abtrennen lassen. Methoden wie Chromatographie oder UIt- rafiltration sind im Allgemeinen jedoch für industrielle Verfahren zu teuer. Man versucht daher, die Enzyme in geeigneter Weise zu immobilisieren. Dazu stehen im Wesentlichen zwei Verfahren zur Verfugung.
Beim ersten Verfahren werden die Enzyme auf einem Trager gebunden. Die Bindung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Eine physikalische Bindung kann durch Adsorption des Enzyms auf der O- berflache des Tragers erreicht werden. Die Bindung erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen oder durch ionische Kräfte, wobei geladene Gruppen des Enzyms mit entgegengesetzt geladenen Gruppen auf der Oberflache des Tragers in Wechselwirkung treten. Vorteil dieser Methode ist ihre einfache Ausführbarkeit sowie der relativ geringe Emfluss auf die Aktivität des Enzyms. Nachteilig ist jedoch, dass die Enzyme relativ leicht wieder von der Oberflache des Tragers verdrangt werden können. Eine irreversible Bindung des Enzyms kann erreicht werden, indem eine kovalente Bindung zwischen Enzym und Trager ausgebildet wird. Hier muss jedoch in Kauf genommen werden, dass unter Umstanden die Aktivität des Enzyms erniedrigt wird, da das Enzym beispielsweise so auf der Oberflache fixiert sein kann, dass das aktive Zentrum nicht mehr zugänglich ist. Schließlich kann die Stabilität des Enzym/Trager-Komplexes noch erhöht werden, indem die Enzyme durch zumindest bifunktionelle Moleküle vernetzt werden. Es entstehen dabei größere Aggregate, die eine geringere Loslichkeit aufweisen. Die Kontrolle der Immobilisierung ist bei diesem Verfahren jedoch sehr schwierig. Ferner muss meist eine deutliche Deaktivierung des Enzyms m Kauf genommen werden, da dessen Konformation stark verändert wird oder das aktive Zentrum nicht mehr frei zugänglich ist.
Beim zweiten Verfahren wird das Enzym in einer kugel- oder schlauchförmigen Matrix eingeschlossen. Die Matrix muss für die Edukte und Produkte der katalysierten Reaktion durchlassig sein, nicht jedoch für die Enzyme. Für diese Technik werden natürliche Polymere, wie z.B. Alginate, Gelatine oder Agar, oder auch syn- thetische Polymere, wie Polyacrylamid oder Polyvinylalkohol verwendet. Bei dieser Methode wird das Enzym bei Reaktionen in organischen Medien vor der Inaktivierung durch das Losungsmittel geschützt. Als Nachteil muss jedoch in Kauf genommen werden, dass die Matrix als Diffusionsbarriere für die Edukte und Produkte der enzymkatalysierten Reaktion wirken kann.
Schichtsilikate sind bereits als Trager für die Immobilisierung von Enzymen vorgeschlagen worden. So wird in der DE 2 154 672 ein Verfahren zur Herstellung eines festen Enzym-Komplexes beschrieben, wobei ein Enzym m einer wassrigen Pufferlosung mit einem Trager in Kontakt gebracht wird, der zuvor mit einem Bindemittel modifiziert worden ist. Als Trager wird bevorzugt Ben- tonit verwendet, der mit Cyanurchlorid als Bindemittel behandelt wurde. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgt sehr rasch, d.h. innerhalb weniger Minuten, und wird bei Temperaturen von weniger als 40 °C, vorzugsweise bei etwa 0 °C durchgeführt, sodass die thermische Belastung des Enzyms gering bleibt.
In der US 6,180,378 werden feste Komplexe beschrieben, in welchen ein Enzym auf einem Schichtsilikat immobilisiert ist. Zur Immobilisierung wird das Schichtsilikat zunächst in Wasser dela- miniert . Dazu können die Ionen des Schichtsilikats auch zunächst gegen Natrium- oder Alkylammoniumionen ausgetauscht werden. Zur Suspension des delammierten Schichtsilikats wird dann das Enzym sowie ein Vernetzungsagens, wie Tetraethylorthosilikat, gegeben. Im Lauf der Reaktion bilden sich größere Aggregate, wobei das Enzym in Zwischenschichten des Schichtsilikats eingeschlossen ist. Der Feststoff kann mit einem geeigneten Puffer neutral gewaschen und dann getrocknet werden. Beim Trocknen muss darauf geachtet werden, dass die Bedingungen ausreichend milde gewählt werden, sodass die Struktur des Schichtsilikats nicht zerstört und das Enzym nicht denaturiert wird. Beim Trocknen unter reduziertem Druck bleibt die Aktivität des Enzyms weitgehend erhal- ten, während beim Gefriertrocknen eine deutliche Deaktivierung eintritt. Im Feststoff bilden sich Makroporen aus, die eine Diffusion des Substrats zu den aktiven Zentren der Enzymmoleküle ermöglichen.
In der US 5,279,948 wird ein auf einem Polymer immobilisiertes Enzym beschrieben, das sich beispielsweise auch in Säulen verwenden lässt. Als Polymer wird entweder ein Homopolymer aus 1-Aminoethylen oder ein Copolymer aus 1-Aminoethylen und N-Vinylformamid verwendet. Das Polymer wird zu einer wässrigen Lösung des Enzyms gegeben und dann ein Vernetzungsmittel zugefügt, welches mit Aminogruppen reagieren kann. Geeignete Vernetzungsmittel sind beispielsweise Glutaraldehyd, Diisocyanate und Polyazetidin. Es wird ein Niederschlag erhalten, der vom flüssigen Medium abgetrennt und entwässert wird, sodass eine pastenartige Masse erhalten wird, die sich zu Partikeln einer gewünschten Größe verarbeiten lässt. Die Herstellung eines derartigen in einer festen Matrix immobilisierten Enzyms ist jedoch relativ aufwendig.
A. K. Bajpai et al, Colloid. Polym. Sei. (2002) 280 ; 892 - 899 berichten über die Immobilisierung von Diastase auf sauer aktivierten Bentoniten. Für die Immobilisierung wurde der sauer aktivierte Bentonit bei einer bestimmten Temperatur in einer Lösung der Diastase suspendiert, die auf einen pH-Wert von 6, 9 eingestellt war. Das Enzym wurde dann während 90 Minuten auf dem Träger adsorbiert und der Komplex aus immobilisiertem Enzym und sauer aktiviertem Bentonit durch Zentrifugieren von der Suspension abgetrennt. Die adsorbierte Enzymmenge wurde jeweils durch Bestimmung der im Überstand verbliebenen Enzymmenge aus der Differenz zur eingesetzten Enzymmenge bestimmt.
H. Yagar et al . , Turk. J. Chem. 26 (2002) 751 - 758, berichten über die nicht-kovalente Immobilisierung von aus Quitte isolier- ter Polyphenoloxidase auf Bentomt. Die Immobilisierung wurde durch einfache Adsorption bei einem pH von 6,8 erreicht.
P. V. Lara et al . , Enzyme and Microbial Technology 34 (2004) 270
- 277, untersuchten die katalytische Aktivität verschiedener Lipasen bei der Aufarbeitung gebrauchter Bleicherden. Die Bleicherden enthielten noch etwa 40 Gew.-% Ol, welches durch die enzymatische Behandlung nahezu vollständig entfernt werden konnte, sodass die wieder aufbereitete Bleicherde erneut zum Bleichen von Ölen eingesetzt werden kann bzw. sich ohne Probleme deponieren lasst.
S. Gopmath et al., React. Kinet . Catal. Lett . VoI 88, No. 1, 3
- 9 (2006) , untersuchten die Leistungsfähigkeit von auf Montmo- rillomt immobilisierten Enzymen, wobei diese entweder als Packung m einem Reaktor bereitgestellt oder batchweise eingesetzt wurden. Zur Immobilisierung wurden die Enzyme entweder auf dem Montmonllonit adsorbiert oder auf diesem kovalent gebunden. Als Trager wurde ein Montmonllonit KlO verwendet, welcher einer hoch aktiven sauren Bleicherde entspricht.
H. W. Morgan und CT. Corke, Can. J. Microbiol. Vol. 22, 1976, - s. 684 - 693, beschreiben die Adsorption von Glucoseoxidase auf verschiedenen Tonen. Für die Untersuchungen wurden Montmonllonit und Kaolimt mit einer Partikelgroße von weniger als 2 μm verwendet. Der Ton wurde in einem Natriumacetatpuffer bei 25 0C mit Glucoseoxidase umgesetzt. Das Maximum der adsorbierten Enzymmenge wurde bei einem pH-Wert beobachtet, welcher unterhalb des isoelektrischen Punktes des Enzyms lag. Zu Beginn der Adsorption zeigte das adsorbierte Enzym eine deutlich niedrigere Aktivität als das freie Enzym. Mit steigender adsorbierter Enzymmenge stieg jedoch auch dessen Aktivität und näherte sich der des freien Enzyms an. M. S. Carrasco, J. C. Rad und S. Gonzales-Carcedo, Bioresource Technology 51 (1995), 175 - 181 berichten über die Immobilisierung von alkalischer Phosphatase auf Natπumsepiolit . Die besten Bedingungen für die Immobilisierung wurden in einem Phosphatpuffer (pH 7,2) bei einer Temperatur von 4 0C, einer Enzymkonzentration von 0,25 mg/ml und einem Verhältnis von Enzym/Ton von 10 ml/g aufgefunden. Die immobilisierte Phosphatase kann dazu genutzt werden, um die biologische Verfügbarkeit von Phosphorverbindungen in Boden zu verbessern. Für die Herstellung des immobilisierten Enzyms wurde zunächst Sepiolit mit einer Partikelgroße von < 2 mm in die Natriumform überfuhrt, indem der Sepio- lit wiederholt in einer Natriumchloπdlosung aufgeschlammt wurde. Für die Immobilisierung wurde das Enzym in einem Phosphatpuffer (pH 7) bei 4 0C mit dem in der Natriumform vorliegenden Sepiolit umgesetzt und der Feststoff durch Zentrifugieren abgetrennt. Der abgetrennte Pellet wurde mit Puffer gewaschen, wobei beim zweiten Waschschritt Natriumchlorid zugesetzt wurde, um schwach gebundenes Enzym vom Ton abzutrennen. /Anschließend wurde die Enzymaktivitat bestimmt.
T. Tietjen und R. G. Wetzel, Aquatic Ecology, 37, 331 - 339, 2003, untersuchten den Emfluss der Immobilisierung von Enzymen auf Tonmineralien auf deren Aktivität. Dazu wurden verschiedene Enzyme auf Montmorillonit sowie auf einem Ton aus einer naturlichen Quelle adsorbiert, wobei eine Verringerung der Enzymaktivitat gefunden wurde. Wurden die Enzymkomplexe Sonnenlicht ausgesetzt, wurde eine Verringerung der Aktivität beobachtet, die sich jedoch nicht wesentlich von der Verringerung der Aktivität unterschied, die allein durch die Immobilisierung verursacht wurde. Für die Immobilisierung wurde eine Suspension der Tonpartikel, welche eine Partikelgroße von weniger als 2 μm aufwiesen, mit dem jeweiligen Enzym versetzt. Über die Immobilisierung von Cellυlase auf silikatischen Tonmineralien berichten A.A. S. Sinegani, G. Emtiazi und H. Shariatma- dari, J. Colloid Interface Sei. 290, 2005, 39 - 44. Als Tonmine- ralien wurden Illit, Kaolinit, Montmorillonit , Palygorskit sowie eine Undefinierte Bodenprobe verwendet . Die adsorbierte Enzymmenge konnte durch eine Beschichtung der Mineralien mit Aluminiumhydroxid gesteigert werden. Nach der Adsorption des Enzyms zeigt die Kristallstruktur der Tonmineralien keine Aufweitung des Schichtabstands, sodass nach Meinung der Autoren kein Enzym in die Zwischenschichten der Kristallstruktur eingelagert wird.
Y. Yesiloglu, Process Biochemistry, 40, 2005, 2155 - 2159 berichtet über die adsorptive Immobilisierung des Enzyms Lipase aus Candida rugosa auf Bentonit. Versuche zur Temperaturstabilität des Enzyms zeigen, dass sich die Halbwertszeit der geträger- ten Lipase im Vergleich zum ungeträgerten Enzym bei 50 0C von 17 auf 45 Minuten erhöht.
K. Buchholz und I. Mikhael, Zuckerind. 114, 1989, 558 - 561 beschreiben die Isolierung des Enzyms Tyrosinase aus Zuckerrüben durch Adsorption an Bentonit. Mit dem immobilisierten Enzym wurde anschließend die enzymatische Oxidation von Tyrosin und Dopa untersucht .
In den genannten Zitaten werden die Enzyme auf Tonmineralien, insbesondere Bentonit, immobilisiert, die in einer wässrigen Pufferlösung in kolloidaler Form vorliegen. Eine solche feinverteilte Suspension ist jedoch für technische Anwendungen nicht geeignet, da die feinen Partikel nach dem Ende der Reaktion nur schwer vom Reaktionsmedium abgetrennt werden können. Ferner ist es nicht möglich, derartig feine Tonpartikel in Form einer Säule zu packen, die sich in einem kontinuierlichen Durchflussprozess verwenden lässt. In der US 5,342,768 wird eine teilchenförmige immobilisierte Lipase beschrieben, die im Wesentlichen aus einer thermostabilen Lipase besteht, die aus einem Mikroorganismus aus der Gruppe von Spezien der Gattung Humicola, Candida antarctica und Rhizomucor miehei isoliert wurde, und die auf Partikeln eines makroporösen Trägers adsorbiert wurde. Der Träger besteht zu zumindest 65 % aus Silicagel oder Silikaten, wobei zumindest 90 % der Partikel eine Partikelgröße zwischen 100 und 1000 μm aufweisen und wobei zumindest 80 % der Poren der Partikel einen Durchmesser aufweisen, der dem 12 bis 45-fachen des Durchmessers eines Lipasemole- kϋls entspricht, und wobei der Wassergehalt der teilchenförmigen immobilisierten Lipase zwischen 1 und 20 % beträgt. Für die Adsorption wird der teilchenförmige Träger in eine wässrige Lösung der Lipase gegeben. Die beladenen Trägerpartikel werden abgetrennt, ggf. gewaschen und bis auf den angegebenen Wassergehalt getrocknet .
Über die Verwendung von Schichtsilicaten zur Abtrennung von Enzymen aus dem filtrierten Saft homogenisierter Zuckerrüben berichten C. Buttersack, K. Nowikow, A. Schaper und K. Buchholz (Zuckerind. 119 (1994) Nr. 4, S. 284-291) . Durch Adsorption an Natriumbentonit und anschließende Desorption mit einem pH-Puffer konnten auf einfache Weise Enzyme in reiner Form abgetrennt werden. Die Arbeiten zeigen die gute Eignung von Schichtmineralien zur Abtrennung bzw. Anreicherung von Proteinen bzw. Enzymen. Die Handhabung der Schichtmineralien ist jedoch kompliziert, da diese in Wasser zu einer starken Erhöhung der Viskosität der Auf- schlämmung führen und die Schichtmineralien in sehr kleine Partikel zerfallen. Es ist daher sehr schwierig, die Anreicherung von Proteinen in der Weise durchzuführen, dass das Schichtmineral in eine Säule gepackt wird, über welche dann die das Protein enthaltende Flüssigkeit geleitet wird. Ohne Hilfsmaßnahmen verstopft die Säule relativ rasch, da das Schichtmineral stark quillt. Um dennoch eine Abtrennung der Enzyme in einer Säule zu ermöglichen, schlagen die Autoren vor, den Natriumbentonit in ein Calciumalginatgel einzugießen. Das hydrierte Homogenat wird bei pH = 5,0 über die Säule gepumpt, die mit Perlen des immobilisierten Bentonits gefüllt ist. Nachdem die nicht-adsorbierte Fraktion aus der Säule ausgetreten ist, wird mit einer auf pH = 8 eingestellten Pufferlösung das Enzym eluiert. Für die großtechnische Abtrennung von Proteinen ist die Verwendung von Natriumbentonit, welcher wie von den Autoren beschrieben, in einem Calciumalginat fixiert ist, wegen der hohen anfallenden Kosten wenig geeignet.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines festen Enzymkomplexes zur Verfügung zu stellen, welches einfach und kostengünstig durchgeführt werden kann und bei welchem ein fester Enzymkomplex erhalten wird, der in technischen Prozessen eingesetzt werden kann und der bei der Anwendung eine hohe Aktivität und eine lange Halbwertszeit aufweist.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren zur Herstellung eines festen Enzymkomplexes mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.
Die gute Eignung von Schichtsilikaten als Trägermaterial zur Immobilisierung von Enzymen ist bereits bekannt. Um die Nachteile dieses Trägermaterials zu vermeiden, seine starke Quellbar- keit bzw. die Delaminierung in feine Partikel, wird beim erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines festen Enzymkomplexes ein sauer aktiviertes Schichtsilikat verwendet, wobei das Schichtsilikat in Form eines wasserfesten Granulats bereitgestellt wird. Derartige sauer aktivierte Schichtsilikate werden auch als Bleicherden bezeichnet. Die Stabilität des wasserfesten Granulats wird erreicht, indem das Granulat nach der Formgebung calciniert wird. Dadurch geht die Quellfähigkeit des Schichtminerals zum Zerfall in Primärpartikel verloren, sodass sich das Granulat bzw. der daraus hergestellte feste Enzymkomplex beispielsweise problemlos in Form einer Säule oder Packung bereit¬ stellen lasst, welche dann von einer wassrigen Losung der Enzymsubstrate durchströmt werden kann. Bei einer batchweisen Fahrweise der vom immobilisierten Enzym katalysierten Reaktion lasst sich der feste Enzymkomplex problemlos aus dem flussigen Reakti¬ onsmedium entfernen, indem man diesen beispielsweise innerhalb einer kurzen Zeitspanne absetzen lasst und die überstehende flussige Phase abdekantiert oder absaugt.
Das erfmdungsgemaße Verfahren zur Herstellung eines festen Enzymkomplexes, wird durchgeführt, indem
eine pulverformige Granuliermischung bereitgestellt wird, welche zu zumindest 50 Gew.-% aus einem sauer aktivierten Schichtsilikat gebildet ist;
die pulverformige Granuliermischung zu einem weichen Granulat granuliert wird;
das weiche Granulat calciniert wird, wobei ein wasserfestes Granulat erhalten wird; und
auf dem wasserfesten Granulat zumindest ein Enzym immobilisiert wird.
Zunächst wird eine pulverformige Granuliermischung bereitgestellt, die zu zumindest 50 Gew.-% aus einem sauer aktivierten Schichtsilikat gebildet ist. Derartige sauer aktivierte Schicht- silikate sind auch als Bleicherden bekannt. Diese sauer aktivierten Schichtsilikate weisen als Suspension in Wasser (10 Gew.-%) einen pH-Wert von weniger als 7,0, vorzugsweise weniger als 6,0, besonders bevorzugt weniger als 5,0 auf. Der pH-Wert kann beispielsweise mittels einer pH-Elektrode bestimmt werden. Bevorzugt wird die Menge des sauer aktivierten Schichtsilikats hoch gewählt. Bevorzugt betragt der Anteil des sauer aktivierten Schxchtsilikats an der Granuliermischung zumindest 70 Gew.-%, besonders bevorzugt zumindest 90 Gew.-%. Insbesondere bevorzugt besteht die Granuliermischung zu 100 % aus dem sauer aktivierten Schichtsilikat . Neben dem sauer aktivierten Schichtsilikat kön¬ nen noch weitere Schichtsilikate in der Granuliermischung enthalten sein, z.B. nicht aktivierte Schichtsilikate. Diese nicht aktivierten Schichtsilikate können als Bindemittel dienen und bewirken eine höhere Festigkeit des Granulats. Als derartige Schichtsilikate können beispielsweise Bentomte verwendet werden. Es können dabei sowohl Schichtsilikate in der Alkaliform, insbesondere Natriumform, als auch mit Erdalkalnonen als austauschbaren Kationen, insbesondere Calciumionen, verwendet werden. Beispielhafte smektitische Schichtsilikate sind Bentomte, Sapomte, Hektorite, Attapulgite oder Sepiolithe. Der Anteil dieser nicht aktivierten Schichtsilikate wird vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 Gew.-%, bevorzugt im Bereich von 2 bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 30 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 15 bis 25 Gew.-% gewählt. Außerdem können beispielsweise noch Granulierhilfsmittel oder Porenbildner in der pulverformigen Granuliermischung enthalten sein. Die Prozentangaben zur pulverformigen Granuliermischung beziehen sich auf eine trockene rieselfahige Granuliermischung, d.h. ohne einen Zusatz von Flüssigkeit .
Die pulverformige Granuliermischung weist bevorzugt eine mittlere Partikelgroße im Bereich von weniger als 100 μm, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 80 μm auf. Die Partikelgroße lasst sich beispielsweise durch Siebanalyse ermitteln. Bevorzugt betragt der Siebruckstand der pulverformigen Granuliermischung auf einem Sieb der Maschenweite 63 μm weniger als 40 Gew.-% und liegt bevorzugt im Bereich von 20 bis 30 Gew.-%. Der Trocken- siebruckstand auf einem Sieb der Maschenweite von 25 μm liegt vorzugsweise im Bereich von 50 bis 65 Gew.-%. Die pulverformige Granuliermischung wird dann zu einem weichen Granulat verarbeitet. Unter einem weichen Granulat wird dabei ein Granulat verstanden, welches m Wasser nicht stabil ist sondern wieder in seine pulverformigen Bestandteile zerfallt. Um die Stabilität zu prüfen, kann das weiche Granulat in Wasser eingebracht werden. Nach einer bestimmten Standzeit, beispielsweise von einer Stunde bei Raumtemperatur, wird dann der Zustand des Granulats begutachtet. Bei weichen, nicht wasserfesten Granulaten bildet sich eine Trübung bzw. ein feiner Bodensatz aus und das Granulat zerfallt teilweise bzw. vollständig. Bei einem weichen Granulat betragt der Nasssiebruckstand nach einer Standzeit von einer Stunde xn Wasser höchstens 50 Gew.-% der Menge des eingesetzten Granulats, vorzugsweise weniger als 20 Gew.-%, bevorzugt weniger als 10 Gew.-%. Besonders bevorzugt verbleibt nach einer Stunde Standzeit in Wasser kein Nasssiebruckstand.
Für die Granulierung können an sich beliebige Formgebungsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann die trockene pulverformige Granuliermischung unter hohem Druck zu Formkorpern ge- presst werden, die ggf- nach der Formgebung wieder auf die gewünschte Große zerkleinert werden können. Eine derartige hoch kompaktierende Formgebung kann beispielsweise in einer Tablet- tierpresse, einer Ringscheibenpresse oder einer Brikettierpresse durchgeführt werden. Es ist aber beispielsweise auch moglxch, die trockene pulverformige Granuliermischung mit Wasser anzufeuchten und zu einer plastxschen Masse zu kneten. Diese plastische Masse kann dann beispielsweise zu einem Strang extrudxert werden, der zu einem Granulat der gewünschten Große zerkleinert wird. Es ist aber auch möglich, die plastische Masse m klexnere Klumpen zu brechen und diese zunächst zu trocknen. Die getrockneten Klumpen können dann gebrochen werden und das Granulat der gewünschten Große durch Sieben abgetrennt werden. Vorzugsweise erfolgt die Granulation der Granuliermischung in der Weise, dass die Granuliermischung in einem schnell laufenden Mischer vorgelegt wird und dass ein wassriges Bindemittel, wie z.B. Wasser oder Wasserglas, innerhalb eines kurzen Zeitraums in seiner gesamten Menge zugegeben wird. Die Granulierung kann sowohl in einem Batchverfahren als auch m einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden. Für die Granulation im Batchver- fahren kann ein so genannter Einchmischer und für die kontinuierliche Granulation beispielsweise ein kontinuierlich arbeitender Pflugscharmischer, wie er z.B. von der Firma Lodige angeboten wird, oder ein Ringschichtmischer, wie ein Lodige CB Mischer, verwendet werden.
Die Energieaufnahme beim Verkneten betragt im Allgemeinen 0,01 bis 1 kWh/kg, insbesondere 0,05 bis 0,5 kWh/kg befeuchtete Granuliermischung .
Wird die pulverformige Granuliermischung zum Granulieren befeuchtet, so wird der Wassergehalt der feuchten Granuliermischung vorzugsweise auf 35 bis 55 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 50 Gew.-% eingestellt.
Als Bindemittel wird bevorzugt reines Wasser eingesetzt. Es ist aber auch möglich, Bindemittel zu verwenden, die nach dem Trocknen im Granulat verbleiben. Ein geeignetes Bindemittel ist beispielsweise Wasserglas. Der Anteil des Wasserglases wird, bezogen auf seinen Feststoffgehalt und auf die trockene pulverformige Granuliermischung, bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% gewählt. Das Modul S1O2/M2O, mit M = Na, K, wird bevorzugt im Bereich von 2,0 bis 3,5 gewählt. Der Feststoffgehalt des Wasserglases betragt vorzugsweise 1 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 3 bis 45 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 40 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 30 bis 38 Gew.-%. Bei Verwendung von Wasserglas als Bindemittel kann die Granulie- rung so gefuhrt werden, dass durch das saure Schichtsilikat eine Kondensation des Wasserglases initiiert wird, wodurch sich Kieselgel ausbildet, welches für einen Zusammenhalt zwischen Pn- marpartikeln des sauren Schichtsilikats sorgt.
Zur Stabilisierung wird das weiche Granulat anschließend calci- niert . Vorzugsweise wird die Calcmation bei Temperaturen im Bereich von 300 bis 900 0C, bevorzugt 400 bis 800 0C, besonders bevorzugt 500 bis 700 0C durchgeführt. Die Dauer der Calcmation hangt von der zu calcinierenden Granulatmenge sowie von der verwendeten Vorrichtung ab. Eine geeignete Vorrichtung ist beispielsweise ein Drehrohrofen, der ein gleichmaßiges Erhitzen des Granulats ermöglicht. Die Dauer der Calcmation wird vorzugsweise im Bereich von 5 Minuten bis 5 Stunden, bevorzugt 10 Minuten bis 4 Stunden, besonders bevorzugt 15 Minuten bis 2 Stunden gewählt.
Nach dem Calcinieren weist das wasserfeste Granulat vorzugsweise eine spezifische Oberflache von mehr als 50 m2/g, bevorzugt im Bereich von 70 bis 300 m2/g, besonders bevorzugt 80 bis 260 m2/g auf. Das Porenvolumen des wasserfesten Granulats, bestimmt nach der BJH-Methode, betragt vorzugsweise mehr als 0,25 cm3/g und liegt bevorzugt im Bereich von 0,07 bis 0,7 cm3/g, besonders bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 0,6 cm3/g.
Nach der Calcmation sollte das wasserfeste Granulat eine ausreichend hohe Stabilität aufweisen, sodass es auch bei einem längeren Einsatz in Wasser nicht zerfallt. Bevorzugt betragt der Nasssiebruckstand mehr als 90 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 95 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 98 Gew.-%. Ein Verfahren zur Bestimmung des Nasssiebruckstandes ist bei den Beispielen angegeben. Sofern die pulverformige Granuliermischung vor dem Granulieren befeuchtet wurde, wird das weiche Granulat vor dem Calcinieren bevorzugt getrocknet. Dazu können übliche Vorrichtungen bzw. Verfahren verwendet werden. Möglich ist beispielsweise ein Trocknen in einem Ofen oder in einem Warmluftstrom. Zum Trocknen wird die Temperatur bevorzugt im Bereich von 80 bis 120 0C, besonders bevorzugt 90 bis 110 0C gewählt. Nach dem Trocknen bzw. vor dem Calcinieren weist das weiche Granulat bevorzugt einen Wassergehalt von weniger als 35 Gew.-% auf. Bevorzugt liegt der Wassergehalt im Bereich von 5 bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 bis 20 Gew.-%.
Nach der Herstellung des wasserfesten Granulats wird ein Enzym bereitgestellt, welches auf dem wasserfesten Granulat immobilisiert werden soll, um einen festen Enzymkomplex zu erhalten. An sich bestehen keine Einschränkungen in Bezug auf das Enzym, welches in Form eines festen Enzymkomplexes bereitgestellt werden soll. Es können an sich alle Enzyme in den festen Enzymkomplex eingebunden werden, die für die Durchfuhrung enzymkatalysierter Reaktionen bekannt sind. Bevorzugt ist das Enzym ausgewählt aus der Gruppe, welche gebildet ist aus Lipasen, Oxireduktasen, wie Glucose-Oxidase oder Pyruvatdehydrogenase, Transferasen, wie Hexokinase oder Glykogenphophorylase, Hydrolasen, wie Amylasen, Chymotrypsm, Peptidasen oder Esterasen, Isomerasen, wie Gluco- se-Isomerase, Ligasen, wie Carboxylasen, Lyasen, wie Aldolase oder Katalase. Besonders bevorzugt ist das Enzym eine Lipase, insbesondere aus der Enzymklasse der Hydrolasen.
Lipasen sind Enzyme, die Lipide, wie Triglyceride oder Diglyce- ride, zu freien Fettsauren und Glycenn spalten. Lipasen (Tn- acylglycerin-Hydrolasen) katalysieren sowohl die Hydrolyse als auch die Synthese von Estern aus Glycenn und langkettigen Fettsauren. Weitere von Lipasen katalysierte Reaktionen sind die Umesterung von Lipiden und die Veresterung primärer, sekundärer und tertiärer Alkohole. Die industrielle Nutzung dieser Enzyme ist sehr vielseitig. Die Zugabe zu Waschmitteln ist das größte Anwendungsgebiet für Lipasen. Ca. 1000 Tonnen Enzym werden jährlich Waschmitteln zugefügt. In der Kosmetikindustrie werden Lipasen zur Hersteilung von Emulgatoren und Aromastoffen verwendet. In der Lebensmittelindustrie werden Lipasen für die Synthese von Glyceriden und Aromastoffen, sowie zur Modifikation von Fetten eingesetzt. Ein weiteres großes Einsatzgebiet für Lipasen ist die Herstellung von BuIk- und Feinchemikalien. Dabei gewinnt die Verwendung der Enzyme für stereoselektive Reaktionen immer mehr an Bedeutung. Weiter finden Lipasen Anwendung bei der Herstellung von Schmiermitteln, Hydraulikölen sowie Biodiesel.
Um eine Denaturierung des Enzyms während der Immobilisierung zu vermeiden bzw. um einen geeigneten pH-Wert für eine möglichst effiziente Adsorption des Enzyms auf dem wasserfesten Granulat bereitzustellen, wird das wasserfeste Granulat vor der Aufgabe des Enzyms bevorzugt auf einen geeigneten pH-Wert äquilibriert. Dazu wird das wasserfeste Granulat bevorzugt in einem geeigneten Puffer aufgeschlämmt . Der pH-Wert des Puffers wird bevorzugt in einem Bereich von 3,0 bis 7,0 gewählt. Der Puffer wird bevorzugt gleich zum Puffer gewählt, in welchem das Enzym gelöst bzw. aufgenommen ist. Die Dauer für die Äquilibrierung des wasserfesten Granulats wird vorzugsweise im Bereich von 5 Minuten bis 3 Stunden, bevorzugt 30 Minuten bis 2 Stunden gewählt. Vor der Immobilisierung kann der zum Äquilibrieren verwendete Puffer ggf. durch frischen Puffer ersetzt werden.
Das Enzym wird bevorzugt in Form einer wässrigen Lösung bereitgestellt. Um das Enzym zu stabilisieren, wird das Enzym bevorzugt in einer gepufferten Lösung bereitgestellt. Der pH-Wert des Puffers wird in Abhängigkeit vom zu immobilisierenden Enzym ausgewählt und liegt vorzugsweise im Bereich von 3 bis 9. Der ideale Bereich für den pH-Wert hängt vom spezifischen Enzym ab. Für Lipasen wird der pH-Wert des Puffers bevorzugt im Bereich von 3 bis 5 gewählt. Allgemein wird der Puffer geeignet in der Weise ausgewählt, dass seine Pufferwirkung bei einem pH-Wert möglichst groß ist, der ungefähr eine Einheit unterhalb des isoelektrischen Punktes des betreffenden Enzyms liegt. Das Enzym weist dann eine positive Gesamtladung auf und kann durch eine ionische Bindung auf dem Trager fixiert werden. Die Konzentration des Puffers wird geeignet im Bereich von 10 bis 300 mmol/1, bevorzugt 50 bis 200 mmol/1 eingestellt. Die Konzentration des Enzyms in der Losung wird bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 mg/ml gewählt. Um eine vorzeitige Deaktivierung des Enzyms zu verhindern, wird die Immobilisierung bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 37 0C, insbesondere bevorzugt 4 bis 10 0C durchgeführt. Enzym und wasserfestes Granulat können in an sich beliebiger Weise in Kontakt gebracht werden. So kann der Trager in einer Losung des Enzyms suspendiert werden. Es ist aber auch möglich, die Losung des Enzyms auf den Trager aufzusprühen, wahrend dieser beispielsweise bewegt wird. Die Dauer, welche für die Immobilisierung des Enzyms benotigt wird, hangt vom verwendeten Trager und vom verwendeten Enzym ab. Bevorzugt wird die Reaktionszeit im Bereich von 10 Minuten bis 5 Stunden gewählt.
Abschließend kann das Reaktionsmedium noch vom festem Enzymkomplex abgetrennt werden. Dies kann mit üblichen Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentπfugieren. Der feste Enzymkomplex kann dann noch gewaschen werden, um ungebundenes Enzym zu entfernen. Zum Waschen kann beispielsweise der gleiche Puffer verwendet werden, wie er auch bei der Umsetzung von Enzym und wasserfestem Granulat verwendet worden ist. Ist nur relativ wenig Losungsmittel, insbesondere Wasser im festen Enzymkomplex enthalten, beispielsweise weil das Enzym auf das wasserfeste Granulat aufgesprüht worden ist, kann das Losungsmittel auch verdampft werden. Dazu kann beispielsweise auch unter vermindertem Druck das Losungsmittel abdestilliert werden. Auch hier wird die Temperatur möglichst niedrig gewählt, um eine vorzeitige Deaktivierung des Enzyms zu vermeiden.
Bevorzugt wird das Enzym zwar durch nicht-kovalente Bindungen auf der Oberflache des wasserfesten Granulats inunobilisiert . Es ist jedoch auch möglich, das Enzym über kovalente Bindungen auf der Oberflache des wasserfesten Granulats zu fixieren. Dazu werden das wasserfeste Granulat und das Enzym mit einem Kopplungsmittel umgesetzt, welches mindestens zwei reaktive Gruppen aufweist, sodass eine der Gruppen mit beispielsweise Hydroxygruppen auf der Oberflache des wasserfesten Granulats und die andere Gruppe mit einer geeigneten Gruppe am Enzym reagieren kann, wie einer Hydroxy-, einer Ammo- oder einer Thiolgruppe. Em geeignetes Kopplungsmittel ist beispielsweise Cyanurchlorid.
Als Kopplungsmittel besonders geeignet sind funktionalisierte Silane, wie sie üblicherweise zur Fixierung von Enzymen auf anorganischen Tragern verwendet werden. Dabei bindet man zunächst funktionalisierte Alkoxy- oder Chlorsilane auf dem Trager. Als Alkoxygruppen werden beispielsweise Methoxy- oder Ethoxygruppen verwendet. Die Anbindung des funktionalisierten Silans erfolgt beispielsweise über die Ausbildung von Si-O-Si-Bmdungen unter Abspaltung von Alkohol oder HCl. Setzt man funktionalisierte Silane ein, die funktionelle Gruppen tragen, welche direkt mit Gruppen am Enzym reagieren können, so kann in einem zweiten Schritt das Enzym direkt an den Trager gebunden werden. Em typisches Beispiel hierfür sind Epoxysilanverbmdungen, wie Epoxy- alkyltrialkoxysilane. Hier kann die Epoxygruppe des Silans nach Aufbringen auf den Trager direkt mit freien NH2-Gruppen des Enzyms reagieren.
In einer zweiten Variante setzt man das funktionalisierte Silan nach dem Aufbringen auf dem Trager zunächst mit einem Aktivierungsagens um. Mit dem Aktivierungsagens werden Gruppen in das auf der Oberflache des Tragers gebundene Silan eingeführt, wel- che mit einer Gruppe am Enzym reagieren können, beispielsweise einer Ammogruppe. Erst nachdem das Aktivierungsagens mit einer Gruppe am Silan reagiert hat, kann das Enzym in einem weiteren Reaktionsschritt an eine Gruppe des Aktivierungsagens angebunden werden. Beispielsweise kann der oben beschriebene, durch thermische Behandlung eines Tonminerals erhaltene Trager mit einem Ammoalkoxysilan umgesetzt werden. Das Aminoalkoxysilan reagiert beispielsweise mit einer Hydroxygruppe an der Oberflache des Tragers. Durch die Fixierung des Ammoalkoxysilans werden auf der Oberflache des Tragers Ammogruppen bereitgestellt. Diese Minogruppen können dann mit einem bifunktionellen Aktivierungsagens, beispielsweise einem Dialdehyd oder einem Dusocyanat, umgesetzt werden. Dabei reagiert eine funktionelle Gruppe mit der auf der Oberflache des Tragers bereitgestellten Ammogruppe und die andere funktionelle Gruppe steht für die Reaktion mit einer Gruppe am Enzym zur Verfugung. Em geeigneter bifunktioneller Aldehyd ist beispielsweise Glutaraldehyd .
Es ist auch möglich, das Enzym durch entsprechende zumindest bifunktionelle Moleküle zu vernetzen, um dadurch das Molekulge- wicht des Enzyms zu erhohen und damit seine Loslichkeit im Reak- tionsmedium zu verschlechtern. Diese Maßnahme kann ergriffen werden, wenn das Enzym auf dem wasserfesten Granulat physikalisch adsorbiert wird. Für die Vernetzung können übliche bifunktionelle Moleküle verwendet werden.
Bevorzugt ist das Enzym über eine nicht-kovalente Bindung an dem wasserfesten Granulat gebunden. Derartige nicht-kovalente Bindungen sind beispielsweise ionische Bindungen oder nicht spezifische Bindungen, wie van-der-Waals-Bmdungen. Durch die nicht- kovalente Bindung des Enzyms auf dem wasserfesten Granulat wird die Struktur des Enzyms weniger gestört, sodass sich die Immobilisierung nicht übermäßig auf die Aktivität des Enzyms auswirkt. Die Menge des Enzyms, welche auf dem Trager immobilisiert ist, wird bevorzugt hoch gewählt, um eine ausreichend hohe Aktivität des festen Enzymkomplexes zu erreichen. Bevorzugt betragt der Anteil des Enzyms, bezogen auf das Gewicht des festen Enzymkomplexes, zwischen 3 und 35 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 20 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 8 bis 15 Gew.-%.
Das im festen Enzymkomplex enthaltene Enzym ist wie bereits erläutert an sich keinen besondere Beschrankungen unterworfen. Bevorzugt weist das Enzym ein Molekulgewicht im Bereich von 10 bis 200 kDa auf.
Beim erfindungsgemaßen Verfahren wird ein sauer aktiviertes Schichtsilikat zur Herstellung des wasserfesten Granulats verwendet .
Gemäß einer ersten Ausfuhrungsform wird das sauer aktivierte Schichtsilikat erhalten, indem ein bevorzugt aus einer natürlichen Quelle gewonnenes oder auch ein synthetisches Schichtsilikat mit einer Saure belegt wird. Derartige sauer aktivierte Schichtsilikate sind auch als oberflachenmodifizierte Bleicherden bekannt.
Als Ausgangsmaterial können an sich alle Schichtsilikate verwendet werden. Besonders bevorzugt werden Schichtsilikate aus der Montmorillonit/Beidellitreihe verwendet, wie z.B. Montmonllo- nit, Bentonit, Natronit, Saponit und Hectorit .
Die Aktivierung kann nach üblichen Verfahren erfolgen. Das Ausgangsmaterial kann mit der Saure getrankt oder auch in der Saure suspendiert werden. Die Aktivierung kann beispielsweise auch erfolgen, indem eine wassrige Losung der Saure auf das Schichtsilikat aufgesprüht wird, wobei das Schichtsilikat bevorzugt bewegt wird. Überschüssiges Wasser, das als Losungsmittel für die Saure verwendet wurde, kann nach der Aktivierung entfernt werden. Die auf das Schichtsilikat aufgebrachte Sauremenge wird, berechnet als wasserfreie Saure, bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 2 bis 6 Gew.-% gewählt.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden als Ausgangsmate- rialien Verwitterungsprodukte von Schichtsilikaten eingesetzt, die nahezu keine detektierbare Schichtstruktur mehr aufweisen und daher rontgenamorph sind. Diese Verwitterungsprodukte weisen eine sehr hohe spezifische Oberflache von vorzugsweise mehr als 200 m2/g, bevorzugt 210 bis 280 m2/g, besonders bevorzugt 220 bis 260 m2/g, sowie ein hohes Porenvolumen von vorzugsweise mehr als 0,5 ml/g, bevorzugt 0,7 bis 1,1 ml/g, besonders bevorzugt 0,8 bis 1,0 ml/g auf. Diese Verwitterungsprodukte weisen bevorzugt noch eine relativ hohe Ionenaustauschkapazitat auf. Bevorzugt betragt die Ionenaustauschkapazitat mehr als 40 meq/100 g und liegt besonders bevorzugt im Bereich von 50 bis 90 meq/100 g, insbesondere bevorzugt 55 bis 85 meq/100 g. Weiter weist das Verwitterungsprodukt bevorzugt eine sehr geringe Quellfähigkeit auf. Nachdem das Verwitterungsprodukt für drei Tage bei Raumtemperatur in Wasser stehen gelassen wurde, betragt das Sedimentvolumen bevorzugt weniger als 15 ml/2 g, besonders bevorzugt weniger als 10 ml/2 g. Unter Raumtemperatur wird eine Temperatur von etwa 15 bis 25 0C, insbesondere etwa 20 0C verstanden.
Nach der Oberflachenaktivierung des Schichtsilikats wird bevorzugt das Schichtsilikat nicht gewaschen sondern lediglich getrocknet. Beim Trocknen wird vorzugsweise ein Wassergehalt im Bereich von weniger als 20 Gew.-%, bevorzugt weniger als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt ein Wassergehalt im Bereich von 5 bis 10 Gew.-% eingestellt. Das sauer aktivierte Schichtsilikat kann ggf. auf die gewünschte Korngroße vermählen werden.
Durch Belegen mit Saure oberflachenaktivierte Schichtsilikate besitzen noch eine signifikante Kationenaustauschkapazitat . Die- se erleichtert die nicht-kovalente Bindung von Enzymen auf den oberflachenaktivierten Schichtsilikaten, da eine Bindung des Enzyms über elektrostatische Wechselwirkungen möglich ist, das Enzym also beispielsweise über ionische Wechselwirkungen auf der Oberflache des Tragers gebunden wird. Dies trifft insbesondere zu, wenn das Enzym bei einem pH-Wert getragert wird, der unter¬ halb des isoelektrischen Punkts des Enzyms liegt. Das Enzym weist kationische Gruppen auf, die durch Austausch mit in der Struktur des oberflachenaktivierten Schichtsilikats vorhandenen Protonen oder beispielsweise noch vorhandenen Alkali- oder Er- dalkalnonen eine ionische Bindung ausbilden können. Neben diesen ionischen Bindungen können auch noch hydrophobe Wechselwirkungen bei der Bindung des Enzyms auf dem Trager eine Rolle spielen.
Gemäß einer zweiten Ausfuhrungsform wird das sauer aktivierte Schichtsilikat erhalten, indem ein bevorzugt aus einer natürlichen Quelle erhaltenes Schichtsilikat mit einer Saure heiß extrahiert wird. Derartige sauer aktivierte Schichtsilikate sind auch als hoch aktive Bleicherden bekannt. Als Ausgangsmaterial können an sich alle durch Saure aktivierbare Schichtsilikate eingesetzt werden. Bevorzugt können di- und trioktaedrische Schichtsilikate der Serpentin-, Kaolin- und Talkpyrophylitgrup- pe, Smektite, Vermiculite, Illite und Chlorite sowie solche der Sepiolith-Palygroskitgruppe, wie z.B. Montmorillonit, Natromt, Saponit und Vermiculit oder Hectorit, Beidellit, Palygorsikt sowie Wechsellagerungsminerale (mixed layer mmeral) verwendet werden. Natürlich können auch Gemische aus zwei oder mehreren dieser Mineralien eingesetzt werden.
Für die Aktivierung wird das Schichtsilikat mit starker Saure versetzt und erhitzt. Als Sauren sind beispielsweise Schwefelsaure, Salzsaure, Phosphorsaure oder Salpetersaure geeignet, welche bevorzugt in konzentrierter Form eingesetzt werden. Salz- säure und Schwefelsäure sind besonders bevorzugt. Die Säuremenge wird bezogen auf das eingesetzte Schichtsilikat bevorzugt im Bereich von 50 bis 200 Gew.-% gewählt. Zur Extraktion wird die Suspension auf eine Temperatur von mehr als 80 0C, bevorzugt mehr als 90 0C, vorzugsweise auf Siedehitze erhitzt. Die Dauer der Extraktion richtet sich nach dem Ausgangsmaterial sowie dem gewünschten Aktivierungsgrad. Bevorzugt wird die Suspension für 3 bis 20 Stunden, besonders bevorzugt 4 bis 15 Stunden erhitzt. Durch die Säuremenge, die Extraktionstemperatur sowie die Extraktionsdauer kann die Porosität der sauer aktivierten Schichtsilikate beeinflusst werden. Durch eine intensivere Extraktion kann insbesondere die Porosität im Bereich von Poren mit einem Durchmesser von weniger als 50 nm erhöht werden. Nach der Extraktion wird der Feststoff abgetrennt, beispielsweise durch Filtration der heißen Suspension. Das sauer aktivierte Schichtsilikat wird anschließend noch bevorzugt mit Wasser säurefrei gewaschen und dann getrocknet. Ggf. kann das sauer aktivierte Schichtsilikat erneut gemahlen werden.
Der Aktivierungsgrad des sauer aktivierten Schichtsilikats wird bevorzugt so gewählt, dass zumindest 10 Gew.-%, vorzugsweise zumindest 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 40 bis 80 Gew.-% des im Ausgangsmaterial vorhandenen Aluminiums entfernt werden. Das durch Extraktion mit heißer Säure erhaltene sauer aktivierte Schichtsilikat enthält vorzugsweise 2 bis 15 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 12 Gew.-% Aluminium, berechnet als AI2O3. Bevorzugt beträgt der Silikatanteil, berechnet als SiC>2, des sauer aktivierten Schichtsilikats 85 bis 98 Gew.-%, vorzugsweise 88 bis 95 Gew.-%.
Das durch Extraktion mit heißer Säure hergestellte sauer aktivierte Schichtsilikat weist bevorzugt einen mittleren Porendurchmesser, bestimmt nach der BJH-Methode (DIN 66131) zwischen 2 und 25 nm, besonders bevorzugt zwischen 4 und 10 nm auf. Bevorzugt liegt das Porenvolumen des sauer aktivierten Schicht- silikats, bestimmt nach der CCl4-Methode, von Poren mit einem Durchmesser von bis zu 80 nm zwischen 0,15 und 0,8 ml/g, besonders bevorzugt 0,2 bis 0,7 ml/g, von Poren mit einem Durchmesser von bis zu 25 nm zwischen 0,15 und 0,45 ml/g, besonders bevorzugt 0,18 bis 0,4 ml/g, für Poren mit einem Durchmesser von bis zu 14 nm zwischen 0,02 und 0,3 ml/g, besonders bevorzugt 0,05 bis 0,2 ml/g, und von Poren mit einem Durchmesser von 25 bis 80 nm zwischen 0,02 und 0,3 ml/g, besonders bevorzugt 0,05 bis 0,2 ml/g.
Die BET-Oberflache des durch Extraktion mit heißer Saure hergestellten sauer aktivierten Schichtsilikats, bestimmt nach DIN 66131, betragt bevorzugt 50 bis 800 m2/g, besonders bevorzugt 100 bis 600 m2/g, insbesondere bevorzugt 130 bis 500 m2/g.
Durch die Extraktion mit Saure nimmt die Ionenaustauschkapazitat der Schichtsilikate ab. Bevorzugt betragt die Ionenaustauschkapazitat weniger als 30 meq/100 g. Besonders bevorzugt liegt die Ionenaustauschkapazitat des sauer aktivierten Schichtsilikats im Bereich von 5 bis 25 meq/100 g.
Bei den durch Extraktion mit heißer Saure erhaltenen sauer aktivierten Schichtsilikaten ist die Kationenaustauschkapazitat nur noch gering. Wird daher das Enzym auf einem derartigen Trager adsorbiert, erfolgt die Bindung vermutlich in erster Linie durch unspezifische Wechselwirkungen, beispielsweise van-der-Waals- Bmdungen, sowie durch Wasserstoffbruckenbmdungen zwischen Gruppen am Enzym und auf der Oberflache des Tragers bereitgestellten Si-OH-Gruppen.
Der mit dem erfindungsgemaßen Verfahren hergestellte feste Enzymkomplex eignet sich insbesondere für eine Anwendung als Sau- lenpackung sowie für einen Einsatz in batchweise geführten Verfahren. Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein fester En- zymkomplex, wie er mit dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wird .
Der feste Enzymkomplex umfasst ein wasserfestes Granulat aus einem sauer aktivierten Schichtsilikat, auf welchem zumindest ein Enzym immobilisiert ist. Die Teilchengroße des wasserfesten Granulats wird bevorzugt im Bereich von 100 um bis 1,2 mm gewählt. Auf dem wasserfesten Granulat können an sich beliebige Enzyme immobilisiert sein. Beispielhafte Enzyme wurden bereits bei der Beschreibung des Herstellungsverfahrens diskutiert . Bevorzugt sind die Enzyme nicht-kovalent auf dem wasserfesten Granulat gebunden, d.h. die Immobilisierung erfolgt über physikalische Wechselwirkung zwischen der Oberfläche des wasserfesten Granulats und dem Enzym, beispielsweise über ionische Bindungen, Wasserstoffbruckenbindungen oder über hydrophobe Wechselwirkungen. Nähere Details zu den Eigenschaften des festen Enzymkomplexes wurden bereits beim Verfahren diskutiert.
Schließlich betrifft die Erfindung noch die Verwendung des oben beschriebenen festen Enzymkomplexes für enzymkatalysierte Reaktionen. Die Reaktionen können an sich unter bekannten Bedingungen und in bekannten Vorrichtungen durchgeführt werden. So können die Reaktionen in Suspension durchgeführt werden, wozu der feste Enzymkomplex in einer, vorzugsweise gepufferten, Losung des Substrats aufgeschlammt wird, der noch weitere übliche Komponenten, wie Coenzyme, ATP, usw. zugesetzt sein können. Es ist aber auch möglich, die enzymkatalysierte Reaktion kontinuierlich durchzufuhren, indem der feste Enzymkomplex beispielsweise in Form einer Säule gepackt wird, durch welche dann kontinuierlich eine Losung des Substrat geleitet wird.
Die Erfindung wird im Weiteren an Hand von Beispielen näher erläutert .
Es wurden die folgenden Analysenmethoden verwendet: BET-Oberflache/Porenvolumen nach BJH und BET:
Die Oberflache und das Porenvolumen wurden mit einem vollautomatischen Stickstoffporosimeter der Firma Mikromentics, Typ ASAP 2010 bestimmt.
Die Probe wird im Hochvakuum auf die Temperatur von flussigem Stickstoff abgekühlt. Anschließend wird kontinuierlich Stickstoff in die Probenkammer dosiert. Durch die Erfassung der adsorbierten Gasmenge als Funktion des Druckes wird bei konstanter Temperatur eine Adsorptionsisotherme ermittelt. Nach einem Druckausgleich wird das Analysengas schrittweise entfernt und eine Desorptionsisotherme aufgenommen.
Zur Ermittlung der spezifischen Oberflache und der Porosität nach der BET-Theoπe werden die Daten gemäß DIN 66131 ausgewertet.
Das Porenvolumen wird ferner aus den Messdaten unter Anwendung der BJH-Methode ermittelt (E. P. Barret, L. G. Joiner, P.P. Haien- da, J. Am. Chem. Soc. 73 (1951, 373) . Bei diesem Verfahren werden auch Effekte der Kapillarkondensation berücksichtigt. Porenvolumina bestimmter Porengroßenbereiche werden durch Aufsummieren mkrementeller Porenvolumina bestimmt, die aus der Auswertung der Adsorptionsisotherme nach BJH erhalten werden. Das Ge- samtporenvolumen nach der BJH-Methode bezieht sich auf Poren mit einem Durchmesser von 1,7 bis 300 nm.
Bestimmung des Porenvolumens nach der CCl4~Methode
Das Mikroporenvolumen wird dadurch bestimmt, dass man Tetra- chlorkohlenstoffdampf auf das Tonmateπal einwirken lasst und die Gewichtszunahme bestimmt, die durch die Adsorption von Tetrachlorkohlenstoff verursacht wird. Um Poren eines bestimmten Durchmessers zu erfassen, wird der Dampfdruck des Tetrachlorkohlenstoffs durch Zusatz bestimmter Mengen Paraffin zum flussigen Tetrachlorkohlenstof erniedrigt.
Reagenzien
Tetrachlorkohlenstoff (CCl4)
Paraffin (flüssig), Fa. Merk KgaA, Darmstadt, DE, Best. Nr.
7160.2500
Durchführung
1 bis 2 g des zu prüfenden Materials werden in einem kleinen Wägegläschen bei 130 0C im Trockenschrank getrocknet. Anschließend wird im Exsikkator abgekühlt, genau gewogen und das Gläschen in einen Vakuumexsikkator gestellt, der je nach dem zu messenden Mikroporenvolumen die folgenden Paraffin/ Tetrachlorkohlenstoffmischungen enthalt :
Paraffin (ml CCl4 Mikroporen (Ä)
26 184 800
47,9 162,1 390
66,5 143,5 250
82,5 127,5 180
96,4 113,6 140
108,7 101,3 115
Der mit graduierter Kühlfalle, Manometer und Vakuumpumpe verbundene Exsikkator wird nun bis zum Sieden des Inhalts evakuiert. 10 ml Tetrachlorkohlenstoff werden verdampft und in der Kühlfalle aufgefangen.
Sodann lässt man den Exsikkatorinhalt 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur ausgleichen, anschließend lässt man langsam Luft in den Exsikkator. Nach Abnehmen des Exsikkatordeckels wird das Wägegläschen sofort verschlossen und auf der Analysenwaage zu- rϋckgewogen .
Auswertung
Die Werte werden in Milligramm Tetrachlorkohlenstoff-Adsorption pro Gramm Substanz durch Gewichtszunahme errechnet. Durch Dividieren mit der Dichte des Tetrachlorkohlenstoffs ergeben sich die Porenvolumina in ml/g Substanz
PorenvolumenimlIg) = Au^aageig)- EinWaage(g)
Einwaage(g)x DichteCCh
(Dichte Tetrachlorkohlenstoff bei 20 0C: d = 1,595 g/cm3)
Teilchengrößenbestimmung mittels dynamischer Lichtstreuung (MaI- vern)
Die Messungen werden mit einem Gerät "Mastersizer" der Firma Malvern Instruments Ltd., UK, entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Messungen werden mit der vorgesehenen Probenkammer ("dry powder feeder") in Luft durchgeführt und die auf das Probenvolumen bezogenen Werte ermittelt.
Wassergehalt :
Der Wassergehalt der Produkte bei 1050C wird unter Verwendung der Methode DIN/ISO-787/2 ermittelt.
Bestimmung des pH-Wertes einer Bentonitprobe
2 g der Probe werden in 98 ml destilliertem Wasser dispergiert. Danach wird mit einer kalibrierten Glaselektrode der pH-Wert bestimmt . Elementaranalyse :
Diese Analyse beruht auf dem TotalaufSchluss der Tonmaterialien bzw. des entsprechenden Produktes. Nach dem Auflösen der Feststoffe werden die Einzelkomponenten mit herkömmlichen spezifi¬ schen Analysemethoden, wie z.B. ICP analysiert und quantifi¬ ziert.
Ionenaustauschkapazität :
Zur Bestimmung der Kationenaustauschkapazität wird das zu untersuchende Tonmaterial über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 1050C getrocknet. Danach wird das getrocknete Tonmaterial mit einem Überschuss an wässriger 2N NH4C1-Lösung 1 Stunde unter Rückfluss zur Reaktion gebracht. Nach einer Standzeit von 16 Stunden bei Raumtemperatur wird filtriert, worauf der Filterkuchen gewaschen, getrocknet und vermählen wird und der NH4-Gehalt im Tonmaterial durch Stickstoffbestimmung (CHN-Analysator "Vario EL III" der Firma Elementar in Hanau) nach den Herstellerangaben ermittelt. Der Anteil und die Art der ausgetauschten Metallionen wird im Filtrat durch ICP-Spektroskopie bestimmt.
Bestimmung des Sedimentvolumens:
Ein graduierter 100 ml Messzylinder wird mit 100 ml destilliertem Wasser gefüllt. 2 g der zu vermessenden Substanz werden langsam und portionsweise, je etwa 0,1 bis 0,2 g mit einem Spatel auf die Oberfläche des Wassers gegeben. Nach dem Absinken einer zugegebenen Portion wird die nächste Portion zugegeben. Nachdem die 2 g Substanz zugegeben und auf den Grund des Messzylinders abgesunken sind, wird der Zylinder für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird an der Graduierung des Messzylinders die Höhe des Sedimentsvolumens in ml/2g abgelesen. Für die Bestimmung des Sedimentvolumens nach 3-tägi- ger Lagerung in Wasser wird der Probenansatz mit Parafilm® verschlossen und für 3 Tage bei Raumtemperatur erschütterungsfrei stehen gelassen. Danach wird an der Graduierung des Messzylinders das Sedimentvolumen abgelesen.
Bestimmung des Montmorillonitgehalts über die Methylenblauad- sorption
Der Methylenblauwert ist ein Maß für die innere Oberflache der Tonmateπalien .
a) Herstellung einer Tetranatriumdiphosphat-Losung
5,41 g Tetranatriumdiphosphat werden auf 0,001 g genau m ei¬ nen 1000 ml Messkolben eingewogen und unter Schuttein bis zur Eichmarke mit dest . Wasser aufgefüllt.
b) Herstellung einer 0,5 %-igen Methylenblaulosung
In einem 2000 ml Becherglas werden 125 g Methylenblau in ca. 1500 ml dest. Wasser gelost. Die Losung wird abdekantiert und auf 25 1 mit dest. Wasser aufgefüllt.
0,5 g feuchter Testbentomt mit bekannter innerer Oberflache werden in einem Erlenmeyerkolben auf 0,001 g genau eingewogen. Es werden 50 ml Tetranatriumdiphosphatlosung zugegeben und die Mischung 5 Minuten zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 10 ml 0,5 molare H2SO4 zugegeben und 80 bis 95 % des zu erwartenden Endverbrauchs an Methylenblaulosung zugegeben. Mit dem Glasstab wird ein Tropfen der Suspension aufgenommen und auf ein Filterpapier gegeben. Es bildet sich ein blau-schwarzer Fleck mit einem farblosen Hof. Es wird nun m Portionen von 1 ml weitere Methylenblaulosung zugegeben und die Tupfelprobe wiederholt . Die Zugabe erfolgt solange, bis sich der Hof leicht hellblau färbt, also die zugegebene Methylenblaumenge nicht mehr vom Testbentomt absorbiert wird. c) Prüfung von Tonmaterialien
Die Prüfung des Tonmaterials wird in der gleichen Weise durchgeführt wie für den Testbentonit . Aus der verbrauchten Menge an Methylenblaulösung lässt sich die innere Oberfläche des Tonmaterials berechnen.
381 mg Methylenblau/g Ton entsprechen nach diesem Verfahren einem Gehalt von 100 % Montmorillonit .
Bestimmung des Trockensiebrückstandes
Etwa 50 g des zu untersuchenden lufttrockenen Tonmaterials werden auf einem Sieb der entsprechenden Maschenweite eingewogen. Das Sieb wird an einen Staubsauger angeschlossen, der über ein unter dem Siebboden kreisenden Saugschlitz alle Anteile, die feiner als das Sieb sind, durch das Sieb heraussaugt. Das Sieb wird mit einem Plastikdeckel abgedeckt und der Staubsauger eingeschaltet. Nach 5 Minuten wird der Staubsauger abgeschaltet und die Menge der auf dem Sieb verbliebenen gröberen Anteile durch Differenzwägung ermittelt.
Bestimmung des Nasssiebrϋckstandes
Es wird zunächst eine 5 %-ige Suspension hergestellt, indem eine entsprechende Menge des zu untersuchenden Tonmaterials bei ca. 930 UpM ca. 5 Minuten in Wasser eingerührt wird. Die Suspension wird für weitere 15 Minuten bei ca. 1865 UpM gerührt und die Suspension dann durch ein Sieb der gewünschten Maschenweite gegossen. Der Rückstand wird so lange mit Leitungswasser gewaschen, bis das Waschwasser klar abläuft. Das Sieb mit dem Rückstand wird dann für 5 Minuten in ein Ultraschallbad gesetzt, um restliche Feinanteile zu entfernen. Der verbliebene Rückstand wird kurz mit Leitungswasser gewaschen und die Ultraschallbehandlung ggf. wiederholt, bis während der Ultraschallbehandlung keine Feinstoffe mehr in das Wasser übertreten. Das Sieb wird dann bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Zum Auswiegen wird der auf dem Sieb verbliebene Ruckstand in eine gewogene Porzellanschale überfuhrt.
Bestimmung der mechanischen Stabilität
105 bis 115 g des Granulats werden auf ein Sieb der Maschenweite 0,15 mm gegeben und feinteilige Anteile des Granulats abgesiebt.
100 g des von Feinanteilen befreiten Granulats werden auf ein Sieb der Maschenweite 0,15 mm gegeben, welches auf einer Auffangschale befestigt ist. Auf das Granulat werden 3 Gummiballe gegeben, welche einen Durchmesser von 2,9 mm aufweisen. Das Sieb wird mit einem Deckel abgedeckt, wobei zwischen Sieb und Deckel ein Abstand von 25 mm vorgesehen ist. Die aus Auffangschale, Sieb und Deckel zusammengesetzte Vorrichtung wird auf einen Ro- t ationsschuttler gegeben und dort 15 Min. geschüttelt. Anschließend wird das in der Auffangschale aufgefangene Granulat ausgewogen. Diese Zahl entspricht der Brechbarkeitszahl für 15 Mm. Schuttelzeit.
Das Sieb wird nochmals 15 Mm. geschüttelt und erneut das Material ausgewogen, welches sich in der Auffangschale angesammelt hat. Aus der Summe der Siebdurchgange ergibt sich Brechbarkeitszahl für 30 Mm.
Bestimmung des Schuttgewichts
Em bei der 1000 ml Markxerung abgeschnittener Messzylinder wird gewogen. Dann wird die zu untersuchende Probe mittels eines Pulvertrichters so in einem Zug in den Messzylinder eingefüllt, dass sich oberhalb des Abschlusses des Messzylinders ein Schuttkegel ausbildet. Der Schuttkegel wird mit Hilfe eines Lineals, das über die Öffnung des Messzylinders gefuhrt wird, abgestreift und der gefüllte Messzylinder erneut gewogen. Die Differenz entspricht dem Schuttgewicht .
Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Lowry-Methode
Die Proteinquantifizierung nach dem modifizierten Lowry- Protokoll beruht auf der Reaktion von Proteinen mit Kupfersulfat und Kupfertartrat in alkalischer Losung, welche zur Bildung eines vierzahmgen Kupfer-Protem-Komplexes fuhrt.
Im nächsten Schritt erfolgt eine Reduktion durch Zusatz des Fo- Im-Ciocalteau-Phenol-Reagenz (Enthalt Phosphomolybdat- Phosphowolframsaure), wobei eine intensive Blaufärbung auftritt. Die Konzentration des entstehenden Reaktionsproduktes wird bei 750 nm photometrisch bestimmt.
Durchfuhrung :
Die Bestimmung wurde mit Reagenzien durchgeführt, die von der Firma Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, DE gebrauchsfertig bezogen wurden.
100 μl der Protein/Enzymlosung werden m eine Kavitat einer 96- Loch-Platte pipettiert. 100 μl Lowry-Reagenz wird zupipettiert und die Mischung homogenisiert. Nach 20 Minuten werden 50 μl Folm-Ciocalteu-Reagenz zugegeben und die Mischung erneut homogenisiert. 30 Minuten nach Zugabe des Folm-Ciocalteu-Reagenzes wird die Extinktion gegen einen Blindwert bei 750 nm im Platten- photometer gemessen.
Bestimmung der Proteinkonzentration nach der BCA-Methode
Bei der BCA-Methode dient Bicmchonmsaure (BCA) als Detektions- system. Dabei kommt es zunächst zur Komplexbildung von Protein mit Cu2+-Ionen in alkalischer Losung. Die Cu2+-Ionen des Komple- xes werden zu Cu4-Ionen reduziert, welche durch Komplexbildung mit BCA durch Absorptionsmessung bei 562 nm detektiert werden können.
Durchführung :
Die Bestimmung wurde mit Arbeitsreagenzien durchgeführt, die von der Firma Pierce, Illinois, US, gebrauchsfertig bezogen wurden.
25 μl der Enzym/Protein-Lösung werden in eine Kavität einer 96- Loch-Platte pipettiert. 200 μl Arbeitsreagenz wird dazu pipettiert und die Mischung homogenisiert. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 0C wird die Extinktion bei 550 nm im Plattenphotometer gemessen.
Standardkurve für beide Proteinbestimmungen:
Standard 1 0,125 mg/ml
Standard 2 0,25 mg/ml
Standard 3 0,5 mg/ml
Standard 4 1,0 mg/ml
Standard 5 1,5 mg/ml
Standard 6 2,0 mg/ml
Blindwert nur Puffer
Beispiel 1: Herstellung der Granulate
Für die Herstellung der Granulate wurden zwei kommerziell erhältliche (Süd-Chemie AG, München, DE) Bleicherden eingesetzt. Bleicherde 1 ist eine mit 5 % H2SO4 oberflächenaktivierte Bleicherde. Bleicherde 2 ist eine durch Extraktion mit heißer HCl aufgeschlossene hoch aktivierte Bleicherde. Die Eigenschaften der Bleicherden sind in Tabelle 1 zusammengefasst . Tabelle 1 : physikalische Eigenschaften von als Ausgangsmaterial verwendeten sauer aktivierten Bleicherden
Figure imgf000036_0001
a) Formgebung durch Nassgranulation
In einem Eirich Intensivmischer R02E wurden jeweils die in Tabelle 2, 5 angegebenen Mengen der Bleicherden 1 und 2 vorgelegt und über einen Trichter als Agglomerationsmittel Wasser zudosiert. Dabei wurde die niedrige Einstellung für die Umdrehungsgeschwindigkeit des Tellers sowie die maximale Umdrehungsgeschwindigkeit für den Wirbier gewählt. Die Agglomerationsparameter wurden, wenn nicht anders angegeben, im Folgenden jeweils so gewählt, dass mehr als 50 % der Granulate in einem Teilchengro- ßenbereich von 0,4 bis 1,4 mm lagen. Dazu wurden die Granulate nach dem Granulieren und Trocknen entsprechend abgesiebt. Die Granulate wurden dann in einem Trockenschrank auf einen Wassergehalt von maximal 15 Gew.-% getrocknet. Das getrocknete Granulat wurde in einen Ofen überführt und bei 600 °C während einer Stunde calciniert. Die Eigenschaften der vor der Wärmebehandlung erhaltenen weichen Granulate sowie des nach der Calcinierung erhaltenen wasserfesten Granulats sind in Tabellen 3 und 4 für die oberflachenaktivierten Bleicherden sowie in Tabellen 5 und 6 für die hochaktivierten Bleicherden zusammengefasst .
Tabelle 2: Nassgranulation oberflachenaktivierter Bleicherden
Bleicherde 1 (g) Wasser (g) DGA1 (g)
400 378 0
360 372 40
320 347 80
1 Laundrosil® DGA: alkalisch aktivierte Bleicherde (Sud-Chemie AG, München) Tabelle 3: Eigenschaften der Granulate vor dem Calcinieren
Figure imgf000038_0001
Tabelle 4 : Eigenschaften der Granulate nach dem Calcinieren
Figure imgf000038_0002
Tabelle 5: Nassgranυlation hoch aktivierter Bleicherden
Bleicherde 2 (g) Wasser (g) DGA (g)
600 278 0
540 280 60
480 293 120
Tabelle 6: Eigenschaften der Granulate vor dem Calcinieren
Figure imgf000039_0001
Tabelle 7: Eigenschaften der Granulate nach dem Calcinieren
Figure imgf000040_0001
b) Formgebung durch Extrusion
Für die Herstellung von Granulaten wurden kommerziell erhältliche Bleicherden 3 und 4 sowie ein Na/Ca-Bentonit (Sud-Chemie AG, München, DE) eingesetzt. Die Eigenschaften der Ausgangsmateria- lien sind in Tabelle 8 zusammengefasst .
60 kg Bleicherde 3, 32 kg Bleicherde 2 und 8 kg Ca/Na-Bentonit werden in einem Mischer homogenisiert. Danach werden 35 kg Wasser zugesetzt und die Mischung für weitere 30 Minuten geknetet. Die plastische Masse wird in eine Ringscheibenpresse (Flachmat- rizenpresse) der Firma Amandus Kahl GmbH & Co KG, Rembek, DE mit einem Lochdurchmesser von 3 mm unter stark kompaktierenden Bedingungen zu Strangpresslmgen verformt. Ein mitlaufendes Schneidwerkzeug kürzt die Presslmge auf eine Lange von 2 bis 3 mm. Die feuchten Extrudate werden in einem Trommeltrockner getrocknet und auf eine Teilchengroße von 0,5 bis 2 mm abgesiebt. Uberkorn wird gebrochen und auf das Sieb zurückgeführt. Das erhaltene Granulat wird für eine Stunde bei 600 0C calciniert. Die Eigenschaften des Granulats sind ebenfalls in Tabelle 8 aufge¬ führt. Die Granulate weisen einerseits eine hohe mechanische Stabilität auf und besitzen andererseits noch eine hohe Porosität.
Tabelle 8: physikalische Eigenschaften von als Ausgangsmaterial verwendeten sauer aktivierten Bleicherden sowie des daraus hergestellten Granulats
Figure imgf000042_0001
Analog zu den oben genannten Bedingungen wurde ein Granulat aus der Bleicherde 2 hergestellt. Die Eigenschaften des Granulats sind in Tabelle 9 zusammengefasst Tabelle 9: physikalische Eigenschaften eines aus Bleicherde 2 hergestellten Granulats
Figure imgf000043_0001
Um die Stabilität der Granulate in wassπgen Medien zu testen, wurden diese 7 Tage in destilliertem Wasser sowie in unterschiedlichen Puffern gelagert. Hierzu wurden jeweils 0,5 g des Granulats in 20 ml Flüssigkeit gegeben.
Es wurden die folgenden Puffer verwendet:
Puffer pH-Wert
Citrat 3
Na-Acetat 5
HEPES 2
TRIS 9 Nach einer Woche Lagerzeit waren die erfindungsgemäßen Granulate unverändert. Es war kein Zerfall, der durch die Bildung von Trübungen oder feinem Bodensatz angezeigt wird, erkennbar. Dahinge- gegen zerfallen die Ausganggranulate, die nicht auf 600 0C behandelt wurden, unter diesen Bedingungen in feine Partikel
Beispiel 2: Trägerung von Lipase auf thermisch behandelten Tonmineralien
Die Lipase wurde jeweils einmal auf dem pulverförmigen und einmal auf dem granulierten Bentonit immobilisiert.
Für die Trägerung auf den thermisch behandelten Tonmineralien wurde eine Lipase aus Candida rugosa (Sigma-Aldrich GmbH, Tauf- kirchen, DE) verwendet. Die Lipase aus dem Organismus Candida rugosa, einem Hefepilz, hat eine Größe von ca. 60 - 65 kDa und einen isoelektrischen Punkt von 5,2. Lipasen aus dem Organismus Candida rugosa gehören zu den unspezifischen Lipasen, die keine regiospezifischen Eigenschaften aufweisen und somit alle Esterbindungen hydrolisieren .
a.) Bestimmung der Enzym-Bindekapazität im statischen System
Vorbereitung der Träger
Jeweils 25 mg der in Beispiel 1 als Ausgangsmaterial verwendeten pulverförmigen Bentonite 1 und 2 werden in 10 ml 50 mMol Na- Acetatpuffer (pH 4) äquilibriert. Der im Puffer suspendierte Träger wird 30 Minuten im Ultraschallbad behandelt und bei 15 Upm für 30 min in einem Überkopfmischer geschüttelt. Die Suspension wird anschließend bei 3219 g und 10 0C für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Bei der Immobilisierung der Lipase auf den aus den Bentoniten 1 und 2 hergestellten Granulaten wurde analog wie oben beschrieben vorgegangen, wobei jedoch jeweils die vierfache Menge aller Komponenten eingesetzt und der beladene Trager durch Dekatieren von der überstehenden Enzymlosung abgetrennt wurde.
Vorbereitung der Enzyme
Für die Beispiele wird eine Stammlosung der Lipase mit einer Konzentration von 2 mg/ml in 50 mMol Natriumacetatpuffer (pH 4) hergestellt .
Untersuchung der Enzymadsorption
Zu jeweils 25 mg der äquilibrierten Trager werden 10 ml der Enzymstammlosung gegeben und die Suspension für 30 min bei 4 0C und 15 Upm im Überkopfschuttler inkubiert . Danach wird der Feststoff bei 3219 g (10 0C) für 10 mm abzentrifugiert und der Proteingehalt im überstand nach der Lowry- und der BCA-Methode bestimmt. Anschließend wird der Feststoff erneut in 10 ml des entsprechenden Puffers suspendiert, für 5 mm bei 4 0C und 15 Upm im Uberkopfschuttler vermischt und bei 3219 g (10 0C) erneut abzentrifugiert. Bei den untersuchten Granulaten erfolgte die Abtrennung von der wassrigen Phase jeweils durch Dekantieren. Der Proteingehalt des Waschwassers wird ebenfalls bestimmt. Die auf dem Trager adsorbierte Enzymmenge wurde aus der Differenz zwischen eingesetzter Enzymmenge und der Summe der im Überstand bzw. im Waschwasser gemessenen Enzymmenge berechnet. Alle Versuche werden als Dreifachbestimmung durchgeführt. Nachdem der Ü- berstand restlos entfernt ist, wird der mit dem Enzym beladene Trager in 1 - 3 ml destilliertem Wasser aufgenommen und die Suspension für die Aktivitatstests eingesetzt. Aktivitatsbestimmunq der getragerten Lipase (Candida rugosa)
i. Messwert Lipaselόsung
In einem 50 ml Erlenmeyerkolben werden
2,5 ml destilliertes Wasser
1,0 ml TRIS-Puffer 200 mM (pH 7,7)
3, 0 ml Olivenöl
einpipettiert. Die Proben werden ca. 5 Minuten lang unter Rühren im Wasserbad bei 37 0C vorgewärmt. Dann wird 1,0 ml Lipaselosung (Stammlösung) zupipettiert und 30 Minuten unter Rühren im Wasserbad bei 37 0C inkubiert. Danach werden 3,0 ml Ethanol (95 %) zupipettiert und nach Zugabe von 50 μl Thymolphthalein-Losung wird mit 0,1 M NaOH Maßlosung bis zum Umschlag nach blau titriert .
ii. Blindwert Lipaselosung
In einem 50 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils 25 mg der in den Beispielen 1 bis 4 dargestellten Trager eingewogen und nach Aquilibrieren mit Puffer dann
3,5 ml destilliertes Wasser 1,0 ml TRIS-Puffer 200 mM 3,0 ml Olivenöl
einpipettiert. Die Proben werden 30 Minuten lang unter Rühren im Wasserbad bei 37 0C inkubiert. Danach werden 1,0 ml Lipaselosung (Stammlosung) und 3,0 ml Ethanol (95 %) zupipettiert und nach Zugabe von 50 μl Thymolphthalein-Losung wird mit 0,1 M NaOH Maßlosung bis zum Umschlag nach blau titriert. 111. Messwert getragerte Lipase
In einem 50 ml Erlertmeyerkolben werden
2,5 ml destilliertes Wasser 1,0 ml TRIS-Puffer 200 mM 3,0 ml Olivenöl
einpipettiert. Die Proben werden ca. 5 Minuten lang unter Ruhren im Wasserbad bei 37 0C vorgewärmt. Die Aktivitatsbestimmung wird im Abstand von 1 Minute angesetzt. Das auf dem Trager adsorbierte Enzym wird in 1 ml destilliertem Wasser aufgenommen und zu der Losung im Erlenmeyerkolben gegeben. Die weiteren Proben folgen jeweils im Abstand von 1 Minute. Nach Zugabe von 3,0 ml E- thanol (95 %) und 50 μl Thymolphthalemlosung wird mit 0,1 M NaOH Maßlosung bis zum Umschlag nach blau titriert.
lv. Blindwert getragerte Lipase
In einem 50 ml Erlenmeyerkolben werden
2,5 ml destilliertes Wasser 1,0 ml TRIS-Puffer 200 mM 3,0 ml Olivenöl
einpipettiert . Die Proben werden 30 Minuten lang unter Ruhren im Wasserbad bei 370C mkubiert. Das auf dem jeweiligen Trager adsorbierte Enzym wird in 1 ml destilliertem Wasser aufgenommen und zusammen mit 3,0 ml Ethanol (95 %) zur Losung in den Erlenmeyerkolben gegeben. Nach Zugabe von 50 μl Thymolphthalemlosung wird mit 1,0 M NaOH Maßlosung bis zum Umschlag nach blau titriert .
Die Aktivität des Enzyms wird über den NaOH-Verbrauch ermittelt. Unit-Definition
Eine Unit hydrolisiert 1,0 μM Fettsäure (aus Triglyceriden) in einer Stunde bei pH 7,7 und 37 0C.
Ergebnisse
In Tabelle 10 sind die Ergebnisse der Adsorption und Aktivität des geträgerten Enzyms Lipase {Candida rugosa) wiedergegeben.
OO
Figure imgf000049_0001
Zur Aktivitatsberechnung des getragerten Enzyms/mg wurde die adsorbierte Menge zugrunde gelegt, die aus dem Mittelwert der BCA und Lowry-Messungen des Überstandes berechnet wurde
Wie die Ergebnisse aus Tabelle 10 zeigen, sind die sauer aktivierten Schichtsilikate zur Tragerung von Lipase geeignet. Die (nicht erfindungsgemaßen) Pulver zeigen eine hohe Bindekapazitat für die Lipase. So binden 25 mg der pulverformigen Bleicherde 2 13,9 mg Lipase. Die relative Aktivität der Lipase auf den Tragern ist zwar gegenüber der Aktivität in Lösung herabgesetzt. Sie liegt aber bei den beiden Pulvern noch über 30 % der Aktivität in Losung.
Durch die Granulierung lassen sich aus diesen Pulvern stabile Granulate herstellen, die eine zwar reduzierte, aber immer noch hohe Bindekapazitat für Lipase aufweisen. Dies ist dadurch verursacht, dass die Enzyme in der Regel nur an der äußeren Hülle der Granulate adsorbiert werden und das Innere der Granulate für Adsorption und Diffusion nicht zuganglich sind. So zeigt insbesondere die durch Extrusion und nachfolgende Calcinierung bei 600 0C hergestellten Granulate eine Bindekapazitat von mehr als 20 % Enzym bezogen auf das Tragermaterial. Ferner zeigen die Granulate noch eine gute Aktivität der adsorbierten Lipase.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines festen Enzymkomplexes, wobei
eine pulverformige Granuliermischung bereitgestellt wird, welche zu zumindest 50 Gew.-% aus einem sauer aktivierten Schichtsilikat gebildet ist; die pulverformige Granuliermischung zu einem weichen Granulat granuliert wird;
- das weiche Granulat calciniert wird, wobei ein wasserfestes Granulat erhalten wird; und auf dem wasserfesten Granulat zumindest ein Enzym immobilisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das sauer aktivierte Schichtsilikat durch Beaufschlagen eines Schichtsilikats mit einer Saure erhalten wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das sauer aktivierte Schichtsilikat erhalten wird, indem ein Schichtsilikat mit heißer Saure extrahiert wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das sauer aktivierte Schichtsilikat einen Aluminiumgehalt, berechnet als AI2O3, von weniger als 17 Gew.-% aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das stabilisierte Granulat ein kumulatives Porenvolumen für Poren im Bereich von 1,7 - 300 nm Durchmesser, bestimmt nach dem BJH-Verfahren, im Bereich von 0,5 bis 0,7 cm3/g aufweist .
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das weiche Granulat zum Calcinieren auf eine Temperatur von zumindest 400 0C erhitzt wird. - -
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das wasserfeste Granulat einen mittleren Durchmesser im Bereich von 100 um bis 2 mm aufweist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, welche gebildet ist aus Lipasen, Reduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Iso- merasen, Ligasen, Lyasen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym für die Immobilisierung über eine kovalente Bindung an das stabilisierte Granulat gebunden wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Anteil des Enzyms, bezogen auf das Gewicht des festen Enzymkomplexes, zwischen 3 und 35 Gew.-% betragt.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das stabilisierte Granulat eine spezifische Oberflache von 50 bis 280 m2/g aufweist.
12. Fester Enzymkomplex, erhalten nach einem Verfahren gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 11 mit einem Kern aus einem wasserfesten Granulat aus einem sauer aktivierten Schicht- silikat auf welchem zumindest ein Enzym immobilisiert ist.
13. Verwendung eines festen Enzymkomplexes nach Anspruch 12 in einer enzymatisch katalysierten Reaktion.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der feste Enzymkomplex vor dem Einsatz in der enzymatisch katalysierten Reaktion auf einen pH-Wert equilibriert wird, der innerhalb eines Bereichs von ± 1 zu einem pH-Wert liegt, bei welchem das Enzym den höchsten Umsatz aufweist.
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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2461163A (en) * 1946-03-13 1949-02-08 Attapulgus Clay Company Production of invert sugar
FR2112634A5 (de) 1970-11-03 1972-06-23 Elf
DE3617840C2 (de) * 1986-05-27 2000-01-13 Bayer Ag Hydrothermal beständiger 3 Å-Zeolith A und dessen Verwendung
DK638688D0 (da) 1988-11-16 1988-11-16 Novo Industri As Partikelformet immobiliseret lipase-praeparat, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
DK589389D0 (da) 1989-11-23 1989-11-23 Novo Nordisk As Immobiliseret enzympraeparat
WO1995022606A1 (en) * 1994-02-21 1995-08-24 Novo Nordisk A/S Method for production of an immobilized enzyme preparation and use of the immobilized enzyme preparation
US6180378B1 (en) 1999-01-29 2001-01-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Immobilization of bioactive protein in phyllosilicates

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAJPAI A K ET AL: "Immobilization of diastase onto acid-treated bentonite clay surfaces", COLLOID AND POLYMER SCIENCE 2002 DE, vol. 280, no. 10, 2002, pages 892 - 899, XP002497493, ISSN: 0303-402X *
DE FUENTES I E ET AL: "Different phyllosilicates as supports for lipase immobilisation", JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS - B ENZYMATIC 20010122 NL, vol. 11, no. 4-6, 22 January 2001 (2001-01-22), pages 657 - 663, XP002497494, ISSN: 1381-1177 *
GOPINATH ET AL: "Enzymes immobilized on montmorillonite K 10: Effect of adsorption and grafting on the surface properties and the enzyme activity", APPLIED CLAY SCIENCE, ELSEVIER SCIENCE, NL, vol. 35, no. 1-2, 29 December 2006 (2006-12-29), pages 67 - 75, XP005818251, ISSN: 0169-1317 *
GOPINATH SANJAY ET AL: "Glucoamylase immobilized on montmorillonite: influence of nature of binding on surface properties of clay-support and activity of enzyme", JOURNAL OF POROUS MATERIALS, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 14, no. 2, 26 January 2007 (2007-01-26), pages 127 - 136, XP019504810, ISSN: 1573-4854 *
SANJAY G ET AL: "Glucoamylase immobilized on montmorillonite: Synthesis, characterization and starch hydrolysis activity in a fixed bed reactor", CATALYSIS COMMUNICATIONS, ELSEVIER SCIENCE, AMSTERDAM, NL, vol. 6, no. 8, 1 August 2005 (2005-08-01), pages 525 - 530, XP004977183, ISSN: 1566-7367 *
SANJAY G., SUGUNAN S.: "Acid activated montmorillonite: an efficient support for improving reusability, storage and operational stability of enzymes", J POROUS MATER, vol. 15, 29 March 2007 (2007-03-29), pages 359 - 367, XP002497492, Retrieved from the Internet <URL:http://www.springerlink.com/content/kgh4635742058024/fulltext.pdf> [retrieved on 20080926] *
SANJAY GOPINATH ET AL: "Enzymes immobilized on montmorillonite: comparison of performance in batch and packed-bed reactors", REACTION KINETICS AND CATALYSIS LETTERS, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 88, no. 1, 1 June 2006 (2006-06-01), pages 3 - 9, XP019437443, ISSN: 1588-2837 *

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