DE69819782T2

DE69819782T2 - Verfahren zur immobilisierung von enzymen

Info

Publication number: DE69819782T2
Application number: DE69819782T
Authority: DE
Inventors: Würtz Morten CHRISTENSEN; Ole Kirk; Christian Pedersen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2018-12-17
Also published as: ATE254170T1; CN1152135C; AU1556699A; DK1042458T3; EP1042458A1; JP4307713B2; EP1042458B1; CN1283226A; WO1999033964A1; DE69819782D1; JP2002500007A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung eines immobilisierten Enzyms zur Verwendung in einem hauptsächlich organischen Medium im Wesentlichen ohne freies Wasser und Verwendung der Zubereitung eines immobilisierten Enzyms für eine organische Synthese.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist bekannt, immobilisierte Enzyme für eine organische Synthese zu verwenden.
Die üblichsten immobilisierten Enzyme sind Lipasen, die für Veresterungsreaktionen in hauptsächlich organischen Medien im Wesentlichen ohne freies Wasser verwendet werden.
EP 140542 B2 beschreibt ein Verfahren, in welchem eine enzymhaltige Flüssigkeit mit einen Träger aus einem schwachen Anionenaustauscherharz durch Dispergieren des Trägers in der Flüssigkeit und Mischen durch Rühren mit einem Magnetrührer in Kontakt gebracht wird, wodurch das Enzym auf dem Träger immobilisiert wird. Der Immobilisierung folgt anschließend Vakuumtrocknen des Enzym-Trägers.
WO 95/22606 beschreibt ein Verfahren, in welchem eine enzymhaltige Flüssigkeit mit einem porösen Siliciumdioxidträger durch Zerstäuben der Flüssigkeit auf dem Träger in einem Mischer in Kontakt gebracht wird, wonach anschließend über Nacht bei Umgebungsbedingungen getrocknet wird.
In auf dem Fachgebiet beschriebenen, industriellen Immobilisierungsverfahren wird der Träger oder das Trägermaterial in ein säulenförmiges Adsorptionsgefäß gegeben und eine enzymhaltige Flüssigkeit umgepumpt, bis eine ausreichende Adsorption des Enzyms auf dem Träger erhalten wird. Nach dem Adsorptionsschritt wird die Säule durch manuelles Schaufeln des Enzym-Träger-Produkts in Trockenschalen entleert. Dieses Produkt wird dann getrocknet, indem die Trockenschalen bei Raumtemperatur für eine Dauer von 14–16 Stunden unter Vakuum gesetzt werden.
WO 94/26883 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von staubfreien Enzymkörnern durch Adsorbieren des Enzyms auf einem porösen Material, wobei das Material NaCl, Soda und Siliciumdioxid einschließt, und gegebenenfalls Beschichten des Produkts mit einer Außenschutzschicht. Im Allgemeinen sollte eine Immobilisierung von Enzymen nicht mit einer Granulierung von Enzymen verglichen werden, da eine Granulierung einem völlig anderen Zweck, d. h. dem Bereitstellen eines vorzugsweise nicht staubenden Freisetzungsmaterials, von welchem ein Enzym an eine wässrige Lösung durch Zermahlen des Korns und/oder Lösen des Enzyms in der wässrigen Phase freigesetzt wird, dient. Bei Enzymimmobilisierung handelt es sich um eine Immobilisierung eines Enzymprodukts auf einem Träger, auf welchem das Enzym fixiert und noch funktionell ist, wobei das Enzym an das Lösungsmittel, mit welchem es eingesetzt wird, nicht abgegeben wird.
Auf dem Fachgebiet bekannte Immobilisierungsverfahren sind in der Kapazität beschränkt, da sie mühsame und manuelle Schritte beinhalten und Schwermaschinenanlagen (z. B. Vakuumräume) erfordern, was wiederum eine unflexible Herstellung und teure Produkte bedeutet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Beispiel einer durch Lipase katalysierten Säurehydrolyse, wobei ein erster Reaktant (Reaktant 1) mit einem zweiten Reaktanten (Reaktant 2), z. B. einer freien Fettsäure, umgesetzt wird, wobei die Substituenten R1 und R2 in der Umsetzung vertauscht werden. Als Beispiel für R1 und R2 kann folgendes gelten:
R2 = -(CH₂)₁₆-CH₃
2 zeigt ein Beispiel einer durch eine Lipase katalysierten Umesterung, wobei ein erster Reaktant (Reaktant 1), z. B. ein Triglycerid, mit einem zweiten Reaktanten (Reaktant 2), z. B. einem anderen Triglycerid umgesetzt wird, wobei die Substituenten R1 und R2 in der Umsetzung vertauscht werden. Als Beispiel für R1 und R2 kann folgendes gelten:
R2 = -(CH₂)₁₆-CH₃
3 zeigt ein Beispiel einer durch eine Lipase katalysierten Alkoholyse, wobei ein erster Reaktant (Reaktant 1), z. B. ein Triglycerid, mit einem zweiten Reaktanten (Reaktant 2), z. B. einem Alkohol umgesetzt wird, wobei die Substituenten R1 und R2 in der Umsetzung vertauscht werden. Als Beispiel für R1 und R2 kann folgendes gelten:
R2 = -(CH₂)₁₆-CH₃
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein alternatives Verfahren zur industriellen Immobilisierung von Enzymen mittels einer Standard-Mehrzweck-Verfahrensapparatur bereit, das die Kapazität erhöht und Laborkosten reduziert.
Folglich stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung eines immobilisierten Enzyms zur Verwendung in einem hauptsächlich organischen Medium im Wesentlichen ohne freies Wasser bereit, das in einem ersten Aspekt

(a) Fluidisieren eines teilchenförmigen porösen Trägers in einer Wirbelschicht,
(b) Einbringen eines enzymhaltigen flüssigen Mediums durch Zerstäubung in die Wirbelschicht, so dass das Enzym auf dem Träger adsorbiert wird, und
(c) Entfernen von flüchtigen Bestandteilen des flüssigen Mediums von dem Träger in der Wirbelschicht

In einem zweiten Aspekt umfassen die Verfahren

(a) In-Kontakt-bringen eines enzymhaltigen flüssigen Mediums mit einem teilchenförmigen porösen Träger mit einer im Wesentlichen hydrophoben Oberfläche, so dass das Enzym auf dem Träger adsorbiert wird, und
(b) Einbringen einer teilchenförmigen hygroskopischen Substanz, so dass Agglomeration des Trägers durch Absorbieren von überschüssiger Flüssigkeit unterdrückt wird, und
(c) Entfernen von flüchtigen Bestandteilen des flüssigen Mediums und der hygroskopischen Substanz aus dem Produkt in einer Wirbelschicht.

Schließlich umfassen die Verfahren in einem dritten Aspekt

(a) Einbringen eines enzymhaltigen flüssigen Mediums durch Zerstäubung auf einen teilchenförmigen porösen Träger mit einer im Wesentlichen hydrophilen Oberfläche, so dass das Enzym auf dem Träger adsorbiert wird, wobei die Flüssigkeit in einer solchen Menge eingebracht wird, dass im Wesentlichen keine Agglomeration des Trägers auftritt, und
(b) Entfernen von flüchtigen Bestandteilen des flüssigen Mediums aus dem Produkt in einer Wirbelschicht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Der Träger
In der Ausführungsform der Erfindung ist der Träger ein teilchenförmiges poröses Material. Die Teilchen können geeigneterweise eine diametrische Größe von 200–1000 μm, vorzugsweise 400–700 μm, einen Oberflächenbereich von 20–1000 m²/g, vorzugsweise 100–700 m²/g und eine Porengröße von 10–500 nm, vorzugsweise 100–300 nm aufweisen.
Die Trägerteilchen können ein anorganisches, organisches oder sowohl ein anorganisches als auch ein organisches Material umfassen. Der Träger kann ferner eine hydrophile oder hydrophobe Oberfläche aufweisen.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Träger ein anorganisches Material mit einer im Wesentlichen hydrophilen Oberfläche, der im Wesentlichen in hydrophilen oder hydrophoben Flüssigkeiten oder Gemischen davon unlöslich ist. Bevorzugte Träger können auf der Basis von Siliciumdioxiden (z. B. Celite von Manville, USA), Zeolithen (z. B. Wessalith MS 330 von Degussa, Deutschland), Aluminiumoxiden, Keramiken (z. B. wie in Yoshihiko Hirose et al. (Proceedings from 3^rd International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations, La Grande Motte, France, 1997, S. 238) offenbart) und Kaolinen (z. B. Kaolinen, die wie in US-Patent Nr. 5,614,401 offenbart einer Säure-, Hydrothermal- und Backbehandlung unterzogen wurden) vorliegen.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung umfassen die Trägerteilchen ein wie in der ersten Ausführungsform beschriebenes, hydrophiles anorganisches Material, das mit organischen Einheiten beschichtet ist und folglich eine im Wesentlichen hydrophobe Oberfläche aufweist, z. B. wie in JP 09000257-A beschrieben, wobei ein säurebehandelter Kaolinträger mit N-Phenyl-gammaaminopropyltriomethoxysilan beschichtet ist. Weitere Träger sind in JP 08126489-A beschrieben, wobei ein wasserunlöslicher Träger mit einem Polymer beschichtet ist, das mit Enzymen eine Disulfidbindung bildet. Eine dritte An von Trägern ist in Biotechnology Techniques, Bd. 3, Nr. 5, 345–348 beschrieben, wobei ein Keramikträger mit einem Polyethylenamin, Polyethylenimin oder 3-Aminopropyltriethoxysilan beschichtet ist, wobei es alle drei Oberflächenarten ermöglichen, dass ein Enzym über Glutaraldehydkupplung kovalent gebunden ist.
In einer dritten Ausführungsform der Erfindung umfassen die Trägerteilchen ein organisches Polymerharz mit einer im Wesentlichen hydrophoben Oberfläche. Das Harz kann ein adsorbierendes Harz, vorzugsweise ein Polyacrylat, ein Polymethacrylat (z. B. Polymethylmethacrylat), ein mit Divnylbenzol vernetztes Polystyrol, ein Polyurethan oder ein Polypropylen sein, oder das Harz kann ein Ionenaustauscherharz, vorzugsweise ein Anionenaustauscherharz, z. B. ein schwach basisches Anionenaustauscherharz sein. Ein bevorzugtes Anionenaustauscherharz ist ein phenolartiges Duolite-Harz von Rohm & Haas.
Ferner kann der Träger wie in DE 44 29 018-A offenbart aus aufbereitetem Chitosan hergestellt sein.
Das Enzym
Das erfindungsgemäß zu immobilisierende Enzym kann jedes beliebige zur Verwendung in Medien im Wesentlichen ohne freies Wasser geeignete Enzym sein. Die am üblichsten verwendeten Enzyme sind Lipasen, und in einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann die Lipase von einem Stamm der Gattung Humicola (auch bekannt als Thermomyces), Pseudomonas, Candida oder Rhizomucor, vorzugsweise den Spezies H. lanuginosa (auch bekannt als Thermomyces lanuginosa, wie in US 4,810,414 und EP 305216 beschrieben, die hier unter Bezugnahme eingeschlossen sind), C. antarctica oder R. miehei abgeleitet sein.
Ferner kann die Lipase durch Wechselwirkung mit Triglyceriden als Substrate positionell stellenspezifisch (d. h. 1,3-spezifisch) oder nicht-spezifisch sein.
Das Enzym kann ferner während des Immobilisierungsverfahrens durch Glutaraldehydbehandlung kovalent vernetzt werden.
Das enzymhaltige flüssige Medium
Das enzymhaltige flüssige Medium ist ein hydrophiles, vorzugsweise wässriges Medium. Es kann folglich mehr als 20% Wasser, vorzugsweise mehr als 40% Wasser, stärker bevorzugt mehr als 50% Wasser, stärker bevorzugt mehr als 60% Wasser, stärker bevorzugt mehr als 70% Wasser, stärker bevorzugt mehr als 80% Wasser, stärker bevorzugt mehr als 90% Wasser, z. B. mehr als 95% Wasser enthalten. Es kann andere organische oder biologische Stoffe enthalten. Folglich kann es eine Gärbrühe oder eine Enzymkonzentratlösung, die durch Reinigen einer Gärbrühe z. B. durch Ultrafiltration oder durch Proteinausfällung, -abtrennung und -wiederauflösung in einem anderen wässrigen Medium erhältlich ist, sein. Sie kann ferner ein in einem wässrigen Medium gelöstes, im Wesentlichen reines Enzym sein. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wurde die enzymhaltige wässrige Flüssigkeit vor der Immobilisierung weder teuren Verarbeitungsschritten zum Entfernen von Wasser wie Eindampfen, noch der Zugabe von nichtwässrigen Lösungsmitteln, z. B. organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, z. B. (Poly)ethylenglykol und/oder (Poly)propylenglykol unterzogen.
Das Immobilisierungsverfahren
Enzymimmobilisierung auf Trägern mit einer hydrophilen Oberfläche
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird erwogen, dass eine Enzymimmobilisierung auf Trägern mit einer im Wesentlichen hydrophilen Oberfläche keine Adsorption des Enzyms bedingt, sondern eine Abscheidung des Enzyms in Oberflächenporen als Ergebnis von Entfernung der Flüssigkeit ist, in welcher das Enzym gelöst ist.

i. In einer Ausführungsform der Erfindung kann folglich die Enzymimmobilisierung auf einem Träger mit einer im Wesentlichen hydrophilen Oberfläche in einer Standard-Mischapparatur (z. B. Lödiger, Deutschland) durchgeführt werden, indem eine enzymhaltige Flüssigkeit durch Zerstäubung zu dem trocknen porösen und teilchenförmigen Träger unter Mischen, z. B. unter Verwendung eines mit einer Pumpe (z. B. einer Standardschlauchpumpe des Typs Watson-Marlow) verbundenen Zerstäubers eingebracht wird. Die Flüssigkeit sollte in solchen Mengen zugesetzt werden, dass im Wesentlichen keine Agglomeration des Trägers auftritt, wodurch folglich das anschließende Trocknen des Enzym-Träger-Produkts durch Fluidisieren des Produkts in einer Standard-Wirbelschichtapparatur, z. B. einer Uni-Glatt-Wirbelschichtapparatur (Glatt, Deutschland) ermöglicht wird, um damit flüchtige Bestandteile zu entfernen.
ii. In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung kann die Enzymimmobilisierung auf einem Träger mit einer im Wesentlichen hydrophilen Oberfläche alternativ in einer Standard-Wirbelschichtapparatur, z. B. einer Uni-Glatt-Wirbelschichtapparatur (Glatt, Deutschland) durchgeführt werden, indem der trockene poröse und teilchenförmige Träger fluidisiert wird und eine enzymhaltige Flüssigkeit bei Umgebungstemperatur durch Zerstäubung zu dem fluidisierten Träger, z. B. unter Verwendung eines mit einer Pumpe (z. B. einer Standardschlauchpumpe des Typs Watson-Marlow) verbundenen Zerstäubers eingebracht wird. In dieser Ausführungsform werden Immobilisierung und Trocknen gleichzeitig durchgeführt.

Immobilisierung auf Trägern mit einer hydrophoben Oberfläche
Ohne an einer Theorie gebunden zu sein, wird erwogen, dass eine Enzymimmobilisierung auf Trägern mit einer im Wesentlichen hydrophoben Oberfläche eine Adsorption des Enzyms auf der Oberfläche einschließt. Die Immobilisierung kann ermöglicht werden, indem das Enzym Wasserstoffbindungen, Ionenbindungen oder kovalente Bindungen mit Einheiten in der Oberfläche bildet.

iii. In einer dritten Ausführungsform der Erfindung kann folglich die Enzymimmobilisierung auf einem Träger mit einer im Wesentlichen hydrophoben Oberfläche in einer Standard-Mischapparatur durchgeführt werden, wobei eine enzymhaltige Flüssigkeit zu dem porösen und teilchenförmigen Träger in einer solchen Menge eingebracht wird, dass folglich eine Paste oder eine Aufschlämmung gebildet wird. Die Paste oder Aufschlämmung wird für eine Zeitdauer gemischt, in welcher das Enzym adsorbiert wird. Nach dem Adsorptionsschritt wird eine hygroskopische, teilchenförmige Substanz mit einer Teilchengröße, die kleiner als der Träger ist, zu der Aufschlämmung oder Paste eingebracht. Die Substanz verhindert im Wesentlichen eine Agglomeration des Enzym-Trägers durch Adsorption von überschüssiger Flüssigkeit, wodurch das anschließende Trocknen des Enzym-Träger-Produkts durch Fluidisieren des Produkts in einer Standard-Wirbelschichtapparatur, z. B. einer Uni-Glatt-Wirbelschichtapparatur (Glatt, Deutschland) ermöglicht wird, um damit flüchtige Bestandteile und gegebenenfalls die hygroskopische Substanz zu entfernen. Die hygroskopische Substanz kann eine beliebige von teilchenförmigen, fein vermahlenen, hydrophilen Bestandteilen, die überschüssige Flüssigkeit adsorbieren können, wie Siliciumdioxiden (z. B. Hyper Flow Celite), Kaolin, Aluminiumoxiden, Zeolithen oder Keramiken sein. Die Entfernung der hygroskopischen Substanz kann durch Einsetzen eines Filters mit einer geeigneten Porengröße, die den Durchgang der hygroskopischen Substanz gewährt, jedoch den Enzym-Träger zurückhält, an den oberen Teil der Wirbelschicht erzielt werden. Eine Porengröße von 100–900 μm, vorzugsweise 200–400 μm kann eingesetzt werden.
iv. In einer vierten Ausführungsform der Erfindung kann die Enzymimmobilisierung auf einem Zräger mit einer im Wesentlichen hydrophoben Oberfläche alternativ in einer Standard-Wirbelschichtapparatur, z. B. einer Uni-Glatt-Wirbelschichtapparatur (Glatt, Deutschland) durchgeführt werden, wobei der trockene poröse und teilchenförmige Träger fluidisiert wird und eine enzymhaltige Flüssigkeit bei Umgebungstemperatur durch Zerstäubung zu dem fluidisierten Träger, z. B. unter Verwendung eines mit einer Pumpe (z. B. einer Standardschlauchpumpe des Typs Watson-Marlow) verbundenen Zerstäubers eingebracht wird. In dieser Ausführungsform werden Immobilisierung und Trocknen gleichzeitig durchgeführt.

Allgemeine Ausführungen für die Mischschritte i und iii
Eine Immobilisierung des Enzyms auf dem Träger in einem Mischer kann geeigneterweise bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden. Die Mischzeiten können für diese Apparaturgröße geeigneterweise 5–60 Minuten, vorzugsweise 10–30 Minuten betragen.
Allgemeine Ausführungen für die Wirbelschichtschritte i, ii, iii und iv
Ein geeigneter Luftzufuhrstrom in die Wirbelschichtapparatur hängt von der Größe und Dichte des Enzym-Trägers, der Trägermenge und der Wirbelschichtapparatur ab. Ferner weist der Luftzufuhrstrom eine obere Grenze auf, damit der Strom dazu ausreichen sollte, dass der Träger fluidisiert bleibt, jedoch nicht so kräftig sein sollte, dass der Enzym-Träger „weggeblasen" wird.
Geeignete Temperaturen der Luftzufuhr zum Entfernen von flüchtigen Bestandteilen hängt in erster Linie von der Wärmestabilität des Enzyms (der Inaktivierungstemperatur) ab. Die Temperatur kann 40–90°C, vorzugsweise 50–70°C, z. B. 60°C betragen. Eine höhere Temperatur stellt kürzere Immobilisierungs- und Trocknungszeiten bereit.
Ferner hängt der Zeitverbrauch für die Immobilisierung und/oder Trocknung des Enzym-Trägers, wenn Apparatur, Luftzufuhr und Lufttemperatur festgelegt sind, von der Menge des Enzym-Trägers ab. Das Immobilisierungs-/Trocknungsverfahren kann durch Messen der Luftzufuhrtemperatur und der Luftaustrittstemperatur überwacht werden. Während der Enzym-Träger feucht ist, ist die Luftaustrittstemperatur aufgrund der Wärmeabsorption und dem Abdampfen von flüchtigen Bestandteilen niedriger als die Zufuhrtemperatur. Typischerweise erfolgt während des Immobilisierungs-/Trocknungsverfahrens ein dauerhaftes Abdampfen, wobei sich die Austrittstemperatur auf eine Temperatur, die niedriger als die Zufuhrtemperatur ist, stabilisiert, wodurch angezeigt wird, dass das Abdampfen von flüchtigen Bestandteilen (d. h. Wärmeabsorption) mit konstanter Geschwindigkeit erfolgt. Am Ende des Immobilisierungs-/Trocknungsverfahrens beginnt die Austrittstemperatur nahe an die Zufuhrtemperatur anzusteigen, wodurch angezeigt wird, dass die Wärmeabsorption abgenommen hat und folglich die Feuchtigkeit des Enzym-Trägers entfernt wurde. Unter Verwendung einer Wirbelschicht zum gleichzeitigen Immobilisieren und Trocknen findet das Trocknungsverfahren so lange statt, wie die enzymhaltige Flüssigkeit in die Wir belschicht zerstäubt wird, und kann nach Beendigung der Zufuhr der enzymhaltigen Flüssigkeit um 5–30 Minuten verlängert werden.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist, dass die Immobilisierungsverfahren unter Einsatz von anderer größerer Standardapparatur leicht heraufgesetzt werden können. Folglich können die vorstehend angegebenen Einstellungsbereiche für die Apparatur zum Optimieren einer großtechnischen Apparatur eingestellt werden.
Verwendung einer Zubereitung eines immobilisiertem Enzyms
Im Kontext der Erfindung hergestelltes immobilisiertes Enzym kann zur Hydrolyse, Synthese oder Modifikation von organischen Substanzen in einem Medium im Wesentlichen ohne freies Wasser verwendet werden. Die Substanzen können in Nahrungsmittelprodukten wie Pflanzen- oder Tierölen/-fetten enthalten sein.
Demzufolge umfasst die Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Modifizierung einer organischen Verbindung, dass das In-Kontakt-bringen in einem Reaktionsmediums im Wesentlichen ohne freies Wasser der organischen Verbindung mit einem erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten Enzym umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein immobilisiertes Lipaseenzym, z. B. eine 1,3-spezifische Lipase für ein Umesterungsverfahren in einem Medium im Wesentlichen ohne freies Wasser verwendet. Die Umesterung kann für eine Fettsäuresubstitution verwendet werden, die das Im-Kontakt-bringen eines ersten Reaktanten und eines zweiten Reaktanten mit der immobilisierten Lipase umfasst, wodurch eine Substitutionsreaktion, z. B. wie in den 1–3 dargestellt erfolgt.
Der erste Reaktant kann ein Fettsäureester, vorzugsweise ein Triglycerid oder ein Gemisch aus Triglyceriden sein.
Der zweite Reaktant kann ein anderer Fettsäureester, der von dem ersten Reaktanten verschieden ist, vorzugsweise ein Triglycerid oder ein Gemisch aus Triglyceriden sein. Ferner kann der zweite Reaktant ein Alkohol oder eine freie Fettsäure sein.
Das Medium in dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst ein organisches Lösungsmittel oder kann im Wesentlichen aus Triglyceriden bestehen.
Die Verwendung der Erfindung kann bei der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten, z. B. Margarine oder Kakaobutterersatzstoffen angewandt werden.
Die Erfindung ist durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele Beschrieben.
BEISPIELE
Lipaseversuch
Die lipolytische Aktivität kann unter Verwendung von Tributyrin als Substrat bestimmt werden. Dieses Verfahren basiert auf der Hydrolyse von Tributyrin durch das Enzym, wobei der Laugenverbrauch als Zeitfunktion erfasst wird.
Eine Lipaseeinheit (Lipase Unit; LU) ist als die Enzymmenge definiert, die unter Standardbedingungen (d. h. bei 30°C; pH 7,0; mit Gummi arabicum als Emulgator und Tributyrin als Substrat) 1 mmol titrierbare Buttersäure pro Minute freisetzt.
Ein dieses analytische Verfahren detaillierter beschreibendes Faltblatt A 95/5 ist auf Nachfrage von Novo Nordisk A/S, Dänemark erhältlich, wobei das Faltblatt hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Umesterungsversuch

(a) 200 mg Trilaurin (Fluka) und 571 mg (8 Moläquivalente) Myristinsäure (Merck) wurden in 20 ml Heptan gelöst. 3 ml gesättigte NaCl-Lösung wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde in einer verschlossenen Flasche für eine Dauer von 24 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt.
(b) Das immobilisierte Enzym (50 mg) wurde in einem Exizkkator (hermetisch geschlossenes Gefäß) für eine Dauer von 24 Stunden unter Verwendung von Gasphasenäquilibrium mit einer gesättigten NaCl-Lösung (Wasseraktivität = 0,75) Wasser-äqulilibriert.
(c) Bei T = 0 Minuten wurden das Wasser-äquilibrierte immobilisierte Enzym und Substrat in einer bei 40°C in ein Schüttelbad gesetzten, verschlossenen Flasche gemischt. Proben mit einem Volumen von 100 μl wurden aus der verschlossenen unter Verwendung einer Spritze bei T = 0, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten entnommen. Die Proben wurden mit einem Gemisch von 50/50 Vol.-% aus Aceton/Acetonitril verdünnt (1 : 5 Vol : Vol) und auf einem HPLC-System analysiert.

Analyse auf dem HPLC-System

(d) Das HPLC-System wurde mit einer an den Enden verschlossenen Säule des Typs LiChrosphere 100 RPC18 mit 5 μm (125 × 4 mm) (Merck) ausgestattet. Eine isokratische 50/50 Vol.-%ige Acetonitril/Aceton-Lösung wurde als mobile Phase mit einem Fluss von 1 ml/Minute ausgewählt.
(e) 20 μl Probe wurden injiziert und die gebildeten Produkte (1,2-Dilauroyl-3-myristoylglycerin (Produkt 1) und 1,3-Dimysteoyl-2-lauroylglycerin (Produkt 2)) durch Verdampfungslichtstreuungsbestimmung (Sedex 55, Sede re, Frankreich) bei einem Druck von 2 Bar und einer Temperatur von 30°C gemessen.
(f) Die Mengen der gebildeten Produkte wurden durch Vergleichen der Probemessungen mit externen Standardkurven von 1,2-Dilauroyl-3-myristoylglycerin und 1,3-Dimysteoyl-2-lauroylglycerin bestimmt.

Die Geschwindigkeit des Umesterungsverfahrens kann in Einheiten berechnet werden, wobei 1 Einheit als 1 μmol in Trilaurin pro Minute eingebrachte Myristinsäure definiert ist.
In einer anderen Ausführungsform kann die Wirkung des Umesterungsverfahrens %uale Umwandlung von Trilaurin zu Produkt 1 und Produkt 2 angegeben werden, was durch
berechnet wird, wobei i angibt, bei welcher Zeit die Probe von der Inkubationsflasche entnommen wird (Schritt c).
Beispiel 1
Lipaseadsorption auf einem Träger auf Zeolith-Basis in einer Wirbelschicht mit gleichzeitiger Entfernung/Abdampfung von flüchtigen Flüssigkeiten
400 g einer Lösung einer Lipase von Humicola lanuginosa (693 kLU/ml) wurde auf 1 kg Zeolith (Wessaltith MS330; 0,5–0,9 mm; Degussa, Deutschland) unter Verwendung eines Zweiwege-Zerstäubers in einer Uni-Glatt-Wirbelschichtapparatur (Glatt, Deutschland) zerstäubt. Die Lipaselösung wurde über eine Schlauchpumpe (Watson-Marlow) aufgebracht. Die Luftzufuhrtempe ratur betrug 60°C und die Produkttemperatur 40°C mit einem Luftstrom von 100 m³/Stunde. Nach Beendigung der Immobilisierung wurde das Produkt für eine zusätzliche Dauer von 5 Min. in der Wirbelschicht getrocknet.
Das Immobilisierungsverfahren wurde im Umesterungsversuch getestet, wodurch eine 53%ige Umwandlung von Trilaurin nach T = 24 Stunden gemessen wurde.
Beispiel 2
Lipaseadsorption auf einem Träger auf Siliciumdioxid-Basis in einer Wirbelschicht mit gleichzeitiger Entfernung/Abdampfung von flüchtigen Flüssigkeiten
94 g einer Lösung einer Lipasegärlösung von Humicola lanuginosa (693 kLU/ml) wurden mit 100 g demineralisiertem Wasser verdünnt und auf 200 g Celite R648 (Manville, USA) unter Verwendung eines Zweiwege-Zerstäubers (betriebsintern hergestellt) in einer Uni-Glatt-Wirbelschichtapparatur (Glatt, Deutschland) zerstäubt. Die Lipaselösung wurde über eine Schlauchpumpe (Watson-Marlow) (Fließgeschwindigkeit 238 g/Stunde) aufgebracht. Die Luftzufuhrtemperatur und die Produkttemperatur waren mit denjenigen, die in Beispiel 1 angegeben sind, identisch. Nach Beendigung der Immobilisierung wurde das Produkt für eine zusätzliche Dauer von 5 Min. in der Wirbelschicht getrocknet.
Das Immobilisierungsverfahren wurde im Umesterungsversuch getestet, wodurch eine 12%ige Umwandlung von Trilaurin nach T = 24 Stunden gemessen wurde.
Beispiel 3
Lipaseadsorption auf adsorbierendem Harz in einem Mischer und anschließendes Trocknen in der Wirbelschicht unter Verwendung von Hyper Flow Celite (HFC) als Trocknungshilfe
94 g einer Lösung einer Lipase von Humicola lanuginosa (693 kLU/ml) wurden mit 260 g demineralisiertem Wasser verdünnt. Die Lösung wurde zu 250 g adsorbierendem Harz (ein makroporöses, mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol, Purolite AP 1090; von Purolite, UK) in einem Mischer mit einem Volumen von 5 1 (Lödiger, Deutschland) gegeben. Die Suspension wurde für eine Dauer von 20 Minuten bei Umgebungstemperatur und mit RPM 30 gemischt. 200 g Hyper Flow Celite (HFC) wurden zum Adsorbieren von restlicher Flüssigkeit zugesetzt, wodurch das Fluidisieren des Gemischs in der Uni-Glatt-Apparatur ermöglicht wurde. Unter Verwendung derselben wie in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wurde das Gemisch für eine Dauer von 20 Min. getrocknet. Während dieser Dauer wurde das HFC von dem adsorbierenden Harz unter Verwendung eine Filters mit 300 μm am oberen Teil der Wirbelschicht unter Zurückhalten der Harzteilchen und Wegblasen von HFC abgetrennt.
Produktaktivität
Die Geschwindigkeit für T = 0–60 Minuten wurde als 3,9 U/g Produkt gemessen.
Beispiel 4
Lipaseadsorption auf adsorbierendem Harz in einer Wirbelschicht mit gleichzeitigem Trocknen von flüchtigen Flüssigkeiten
94 g einer Lösung einer Lipase von Humicola lanuginosa (693 kLU/ml) wurden mit 200 g demineralisiertem Wasser verdünnt und dies unter Verwendung eines Zweiwege-Zerstäubers in einer Uni-Glatt-Wirbelschichtapparatur (Glatt, Deutschland) auf 200 g adsorbierendes Harz (ein makroporöses, mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol), Purolite AP 1090; von Purolite, UK) zerstäubt. Die Lipaselösung wurde über eine Schlauchpumpe (Watson-Marlow) (Fließgeschwindigkeit 238 g/Stunde) aufgebracht. Die Luftzufuhrtemperatur und die Produkttemperatur betrugen 50°C bzw. 30°C. Nach Beendigung der Immobilisierung wurde das Produkt für eine zusätzliche Dauer von 5 Min. in der Wirbelschicht getrocknet (Fließgeschwindigkeit 100 m³/Stunde).
Das Immobilisierungsverfahren wurde im Umesterungsversuch getestet, wodurch eine 36%ige Umwandlung von Trilaurin nach T = 24 Stunden gemessen wurde.
Beispiel 5
Lipaseadsorption auf einem Träger auf Kaolin-Basis in einer Wirbelschicht mit gleichzeitigem Trocknen von flüchtigen Flüssigkeiten
94 g einer Lösung einer Lipase von Humicola lanuginosa (693 kLU/ml) wurden mit 300 g demineralisiertem Wasser verdünnt und dies unter Verwendung eines Zweiwege-Zerstäubers (betriebsintern hergestellt) in einer Uni-Glatt-Wirbelschichtapparatur (Glatt, Deutschland) auf 200 g Kaolin-Träger (BIOFIX SC (500–250; von ECC, UK) zerstäubt. Die Lipaselösung wurde über eine Schlauchpumpe (Watson-Marlow) (Fließgeschwindigkeit 238 g/Stunde) aufgebracht. Die Luftzufuhrtemperatur und die Produkttemperatur betrugen 50°C bzw. 30°C. Nach Beendigung der Immobilisierung wurde das Produkt für eine zusätzliche Dauer von 5 Min. in der Wirbelschicht getrocknet (Fließgeschwindigkeit 100 m³/Stunde).
Das Immobilisierungsverfahren wurde im Umesterungsversuch getestet, wodurch eine 34%ige Umwandlung von Trilaurin nach T = 24 Stunden gemessen wurde.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung eines immobilisierten Enzyms zur Verwendung in einem hauptsächlich organischen Medium ohne freies Wasser, umfassend: (a) Fluidisieren eines teilchenförmigen porösen Trägers mit einer Oberfläche von 20–1000 m³/g, einer Teilchengröße von 200–1000 μm und umfassend ein Material, ausgewählt aus: (1) einem anorganischen Material, das im Wesentlichen in hydrophilen oder hydrophoben Flüssigkeiten oder Gemischen davon unlöslich ist und eine hydrophile Oberfläche aufweist, (2) einem anorganischen Material, das im Wesentlichen in hydrophilen oder hydrophoben Flüssigkeiten oder Gemischen davon unlöslich und mit organischen Einheiten beschichtet ist, so dass eine im Wesentlichen hydrophobe Oberfläche bereitgestellt wird, oder (3) einem organischen Polymerharz, in einer Wirbelschicht, (b) Einbringen eines enzymthaltigen flüssigen Mediums durch Zerstäubung in die Wirbelschicht, so dass das Enzym auf dem Träger fixiert wird, und (c) Entfernen von flüchtigen Bestandteilen des flüssigen Mediums von dem Träger in der Wirbelschicht.
Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung eines immobilisierten Enzyms zur Verwendung in einem hauptsächlich organischen Medium ohne freies Wasser, umfassend: (a) In-Kontakt-bringen eines enzymhaltigen flüssigen Mediums mit einem teilchenförmigen porösen Träger, der im Wesentlichen in hydrophilen oder hydrophoben Flüssigkeiten oder Gemischen davon unlöslich ist, mit einem Oberflächenbereich von 20–1000 m²/g, einer Teilchengröße von 200–1000 μm und einer hydrophoben Oberfläche, so dass das Enzym auf dem Träger adsorbiert wird, und (b) Einbringen einer hygroskopischen Substanz, so dass die Agglomeration des Trägers durch Absorbieren von überschüssiger Flüssigkeit unterdrückt wird, und (c) Entfernen von flüchtigen Bestandteilen des flüssigen Mediums und der hygroskopischen Substanz aus dem Produkt in einer Wirbelschicht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeit in solch einer Menge eingebracht wird, dass im Wesentlichen keine Agglomeration des Trägers auftritt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anorganische Material von Schritt (1) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Siliciumdioxiden, Zeolithen, Aluminiumoxiden und Kaolinen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anorganische Material von Schritt (2) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Siliciumdioxiden, Zeolithen, Aluminiumoxiden und Kaolinen, die mit organischen Einheiten beschichtet sind, um eine hydrophobe Oberfläche bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das organische Polymerharz von Schritt (3) ein Adsorptionsharz ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Adsorptionsharz ein Polyacrylat, ein Polymethacrylat, ein mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol, ein Polyurethan oder ein Polypropylen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das organische Polymerharz von Schritt (3) ein Ionenaustauscherharz, vorzugsweise ein Anionenaustauschharz, besonders bevorzugt ein schwach basisches Anionenaustauschharz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das flüssige Medium ein wässriges Medium ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym eine Lipase ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Lipase von einem Stamm der Gattung Humicola (auch bekannt als Thermomyces), Pseudomonas, Candida oder Rhizomucor, vorzugsweise der Spezies H. lanuginosa (auch bekannt als Thermomyces lanuginosa), C. antarctica oder R. miehi abgeleitet ist.
Verfahren zur enzymatischen Modifizierung einer organischen Verbindung, umfassend das In-Kontakt-Bringen der organischen Verbindung mit einem immobilisierten Enzym, das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–11 hergestellt wurde, in einem Reaktionsmedium im Wesentlichen ohne freies Wasser.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Modifizierung eine Umesterungsreaktion, umfassend das In-Kontakt-Bringen eines ersten Reaktanten, der ein Fettsäureester ist, eines zweiten Reaktanten, der ein anderer Fettsäureester ist, eines Alkohols oder einer freien Fettsäure mit der immobilisierten Lipase, ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der erste Reaktant ein Triglycerid ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 13 und 14, wobei der zweite Reaktant ein Fettsäureester und die Lipase positionell spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der erste und der zweite Reaktant verschiedene Triglyceride oder verschiedene Gemische von Triglyceriden sind und die Lipase positionell 1,3-spezifisch ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 13–16, wobei das Reaktionsmedium im Wesentlichen aus Triglyceriden besteht.
Verfahren nach den Ansprüchen 13–16, wobei das Reaktionsmedium ein organisches Lösungsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der teilchenförmige poröse Träger eine mittlere Porengröße von 10–500 nm aufweist.