JP4307713B2 - 酵素の固定化方法 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は本質的に自由水を欠く主に有機性の培体中での使用のための固定化酵素調製物の製造方法、及び有機合成のための固定化酵素調製物の使用に関する。
発明の背景
固定化酵素は有機合成のために使用されることが知られている。
【０００２】
最も一般的な固定化酵素は、本質的に自由水を欠く主に有機性の培体中でのエステル化反応のために使用されるリパーゼである。
欧州特許第１４０５４２号Ｂ２は、酵素を含む液体が、担体を前記液体中に分散させること、及び磁気撹拌器での撹拌により混合することによって弱陰イオン交換樹脂担体との接触をもたらし、それによって酵素が担体上に固定化される方法を記載している。固定化は、その後に酵素−担体の真空乾燥が続く。
【０００３】
国際公開第９５／２２６０６号は、酵素を含む液体が、混合器中で前記液体を担体上に噴霧すること、その後に続けて環境条件で一晩の乾燥をすることにより、多孔性シリカ担体との接触をもたらす方法を記載している。
従来技術において記載されている工業的固定化方法において、前記担体又は支持材料はカラム形の吸着容器内に据えられ、そして酵素を含む液体は、担体上への酵素の十分な吸着が得られるまで再循環する。次の吸着段階で、酵素−担体産物を盆の中にすくい取ることによってカラムを空にする。前記産物を次に真空下室温で１４〜１６時間の周期で盆に据えることによって乾燥させる。
【０００４】
国際公開第９４／２６８８３号は、酵素をＮａＣｌ、ソーダ、及びシリカを含み、保護的な外層によって前記産物を任意にコートしている多孔性材料上に吸収させることにより、粉じんの無い酵素顆粒の製造方法を記載している。一般的に酵素の固定化は、顆粒化が完全に異なる目的を達成するので酵素の顆粒化と比較されるべきではなく、すなわち、それが水層中での顆粒の崩壊及び／又は酵素の溶解により、水溶液に運ばれうる酵素を供給するための、非飛散性の材料を提供するからである。酵素の固定化は、酵素産物を、その酵素が固定されるが機能的であり、そしてその酵素がそれを適用した溶媒に遊離しないように、担体上に固定化することに関する。
【０００５】
当業界で知られた固定化方法は、困難な及び手動の段階を含み、そして大変な設備投資を必要とし（例えば真空室）、これは、今度は柔軟性のない製造法及び製品が高価なことを意味する。
発明の要約
本発明は、標準的な多目的の製造装置によって有意に能力を増大し、そして人件費を減少させる、工業的な酵素の固定化のための、代わりの方法を提供する。
【０００６】
このように本発明は、本質的に自由水を欠く主に有機性の培体中での使用のための、固定化酵素調製物の製造方法を提供し、これは第１の観点において：
ａ）流動床において特定の多孔性担体を流動化すること、
ｂ）酵素を担体に固定するために、酵素を含む液体培体を噴霧によって流動床に導入すること、及び
ｃ）流動床中の担体から液体培体の揮発性成分を除去すること、
を含んで成る。
【０００７】
第２の観点において、本発明は：
ａ）担体に酵素を吸着させるために、その酵素を含む液体培体を実質的に疎水性の表面を有する特定の多孔性担体と接触させること、
ｂ）過剰な液体の吸収によって担体の凝集を抑制するために、吸湿性物質を導入すること、及び
ｃ）流動床中の前記産物から、液体培体の揮発性成分及び吸湿性物質を除去すること、
を含んで成る。
【０００８】
終わりに、第３の観点において、本発明は：
ａ）担体に酵素を固定するために、噴霧によって酵素を含む液体培体の酵素を実質的に親水性の表面を有する特定の多孔性担体上に導入すること（ここで前記液体は、前記担体の凝集が実質的に起きないような量で導入される）、
ｂ）流動床中の前記産物から、液体培体の揮発性成分を除去すること、
を含んで成る。
発明の詳細な説明
担体
本発明の態様において、前記担体は特定の多孔性材料である。その粒子は、ふさわしくは直径が２００〜１０００μｍ、好ましくは４００〜７００μｍの大きさであり；２０〜１０００ｍ² ／ｇ、好ましくは１００〜７００ｍ² ／ｇの表面積を有し、そして１００〜５００nm、好ましくは１００〜３００nmの細孔サイズを有する。
【０００９】
前記担体の粒子は無機性、有機性、又は無機性及び有機性両方の材料を含みうる。前記担体は更に、親水性又は疎水性の表面を有することがある。
本発明の第１の態様において、前記担体の粒子は、親水性若しくは疎水性の液体又はそれらの混合物に本質的に不溶である、実質的に親水性の表面を有する無機性材料を含んで成る。好ましい担体はシリカ（例えばManville, USA のセライト）、ゼオライト（例えばDequssa, GermanyのWessalith MS330 ）、アルミナ、セラミック｛例えばYoshihiko Hirose等が開示したもの（3 ^rd International Symposium on Biocatalysis and Biotrans formations, La Grande Motte, France, 1997, p238 に起因）｝及びカオリン（米国特許第５，６１４，４０１号に開示された、酸、熱水及びベーキング処理にかけられたカオリン）に基づくことがある。
【００１０】
本発明の第２の態様において、前記担体の粒子は第１の態様において記載した様な親水性の無機性材料を含んで成り、そして実質的に疎水性の表面を有する有機性の部分、例えば日本特許第０９０００２５７−Ａ号に記載の様なもので覆われ、ここでは、酸処理されたカオリン担体が、Ｎ−フェニル−γ−アミノプロピルトリメトキシシランを用いてコートされた。更なる担体が日本特許０８１２６４８９−Ａ号に記載され、ここで水に不溶の担体が、酵素を用いてジスルフィド結合を形成するポリマーでコートされる。担体の第３の型が、Biotechnology Techniques vol.3 No 5 345 〜348 に記載され、ここでセラミック担体がポリエチレンアミン、ポリエチレンイミン又は３−アミノプロピルトリエトキシシランでコートされ、そして３つの表面型の全てがグルタルアルデヒド重合を経由して酵素を共有結合させている。
【００１１】
本発明の第３の態様において、前記担体の粒子は本質的に疎水性の表面を有する有機性ポリマー樹脂を含んで成る。その樹脂は吸着樹脂、好ましくはポリアクリレート、ポリメタクリレート（例えばポリメタクリル酸メチル）、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレン、ポリウレタン又はポリプロピレンであることができ、あるいはその樹脂は、イオン交換樹脂、好ましくは陰イオン交換樹脂、例えば弱塩基性陰イオン交換樹脂であることができる。好ましい陰イオン交換樹脂は、Rohm & Haas のフェノール型デュオライト（Duolite ）樹脂である。
【００１２】
更に本担体はデンマーク特許第４４２９０１８号−Ａに開示された様な、再生したキトサンから製造されうる。
酵素
本発明に従う固定化されるべき酵素は、自由水を本質的に欠く培体中での使用のために適当なあらゆる酵素であることができる。最も一般的に使用される酵素はリパーゼであり、そして本発明の特定の態様において、前記リパーゼはフミコラ（Humicola）｛サーモミセス（Thermomyces ）としても知られている｝、シュードモナス（Pseudomonas ）、カンジダ（Candida ）、リゾムコール（Rhizomucor）属の菌株、好ましくはＨ．ラヌギノサ（H. lanuginosa ）｛米国特許第４，８１０，４１４号及び欧州特許第３０５２１６号に記載されているように、引用によって本明細書に組入れるサーモミセス・ラヌギノサ（Thermomyces lanuginosa）としても知られている｝、Ｃ．アンタルクチカ（C. antarctica ）又はＲ．ミエーイ（R. miehei ）の種由来でありうる。
【００１３】
更に前記リパーゼは基質としてのトリグリセリドとの相互作用において、位置的に部位特異的（すなわち１，３特異的）又は非特異的である。前記酵素は更に、本固定化工程の間のグルタルアルデヒド処理によって、共有結合により架橋されうる。
酵素を含む液体培体
前記の酵素を含む液体培体は親水性培体、好ましくは水性である。この様に、それは２０％以上の水、好ましくは４０％以上の水、更に好ましくは５０％以上の水、更に好ましくは６０％以上の水、更に好ましくは７０％以上の水、更に好ましくは８０％以上の水、更に好ましくは８０％以上の水、更に好ましくは９０％以上の水、例えば９５％以上の水を含む。それは他の有機性の又は生物学的な物質を含みうる。この様に、それは発酵液又は、例えば限外濾過若しくはタンパク質沈澱、他の水性培体中での分離及び再溶解による発酵液の精製によって得られる酵素の濃縮溶液でありうる。それは更に、水性培体中に溶解した実質的に純粋な酵素でありうる。本発明の特別な態様において、前記の酵素を含む水性の液体は、固定化する前に蒸発の様な水を除去する高価な処理段階にかけられず、またそれは非水性溶媒、例えばアルコールの様な有機溶媒、例えば（ポリ）エチレングリコール及び／又は（ポリ）プロピレングリコールの添加にもかけられなかった。
固定化方法
親水性表面を有する担体上での酵素の固定化
前記の理論に拘束されること無く、実質的に親水性の表面を有する担体上での酵素の固定化は、その酵素を吸着しないことがなく、しかし前記液体の除去の結果として表面の孔における酵素の析出があり、そして前記酵素が溶解されることが予期される。
ｉ．本発明の１つの態様において、実質的に親水性の表面を有する担体上での酵素の固定化は、この様に標準的な混合装置（例えばLoediger, Germany ）内で処理されることがあり、ここで酵素を含む液体が、混合の間、例えばポンプ（例えば標準的な蠕動ワトソン−マーローポンプ）につながった噴霧器を用いて噴霧器によって乾燥した細孔及び特定の担体に導入される。
【００１４】
前記液体は、前記担体の凝集が実質的に起こらない様な量で加えられ、この様にそれに続く酵素−担体産物の乾燥が標準的な流動床装置、例えばUni-Glatt 流動床装置（Glatt, Germany）内で、前記産物の流動化によって可能にされ、それによって揮発性成分が除去されるべきである。
ii．本発明の第２の態様において、実質的に親水性の表面を有する担体上での酵素の固定化は、標準的な流動床装置、例えばUni-Glatt 流動床装置内で代わりに処理されることがあり、ここで乾燥した細孔及び特定の担体は流動化され、そして環境温度で酵素を含む液体は、例えばポンプ（例えば標準的な蠕動ワトソン−マーローポンプ）に結合した噴霧器を用いて、噴霧によって流動化した担体に導入される。この態様における固定化及び乾燥は同時に行われる。
疎水性表面を有する担体上での固定化
前記の理論に拘束されること無く、実質的に疎水性の表面を有する担体上での酵素の固定化が、前記表面上での酵素の吸着に関係することが予期される。本固定化は、前記表面における部分と前記酵素が形成する水素結合、イオン結合又は共有結合によって可能となりうる。
iii ．本発明の第３の態様において、実質的に疎水性の表面を有する担体上での酵素の固定化は、この様に標準的な混合装置内で処理されることがあり、ここで酵素を含む液体は、ペースト又はスラリーを形成する程度の量において、乾燥した細孔及び特定の担体に導入される。前記ペースト又はスラリーは、前記酵素が吸着する間混合される。吸着の段階に続いて、前記担体より粒度が小さい吸湿性のある特定の物質が前記スラリー又はペーストに導入される。前記物質は過剰な液体の吸着によって、前記酵素−担体の凝集を防ぎ、それによって、続く前記酵素−担体産物の乾燥を、標準的な流動床装置、例えばUni-Glatt 流動床装置（Glatt, Germany）内での前記産物の流動化によって可能にし、それによって揮発性成分及び、必要ならば前記吸湿性物質を除去する。前記吸湿性物質は、過剰な液体を吸収する能力のある、親水性の、粒状の微粉砕された成分部分、例えばシリカ（例えばハイパーフローセライト）、カオリン、アルミナ、ゼオライト又はセラミックでありうる。吸湿性物質の除去は、前記吸湿性物質を通過させるが、前記の酵素−担体を保持する適当な細孔サイズを有するフィルターを流動床の上層に挿入することによって達成されうる。１００〜９００μｍ、好ましくは２００〜４００μｍの細孔サイズが使用されうる。
iv．本発明の第４の態様において、実質的に疎水性の表面を有する担体上の酵素の固定化は、標準的な流動床装置、例えばUni-Glatt 流動床装置（Glatt, Germany）内で代わりに処理されることがあり、ここで乾燥した細孔及び特定の担体は流動化され、そして環境温度で酵素を含む液体は、例えばポンプ（例えば標準的な蠕動ワトソン−マーローポンプ）に結合した噴霧器を用いて、噴霧によって流動化した担体に導入される。この態様における固定化及び乾燥は同時に行われる。
ｉ及び iii の混合段階のための共通の特徴
混合器内での担体上の酵素の固定化は、環境温度で行われうる。混合時間は、このサイズの装置のために、５〜６０分、好ましくは１０〜３０分が適当である。
ｉ， ii ， iii 及び iv の流動床段階のための共通の特徴
流動床装置内の適当な空気吸い込み流は、酵素−担体のサイズ及び密度、担体の量並びに流動床装置に依存するであろう。更に前記空気吸い込み流は、流れが酵素−担体の流動を保つのに十分であるが、酵素−担体を“噴出”しないような強さであるべきの上限を有する。
【００１５】
揮発性成分を除去するための吸い込み口の空気の適当な温度は、前記酵素の熱安定性（不活性温度）に主に依存するであろう。その温度は４０〜９０℃、好ましくは５０〜７０℃、例えば６０℃でありうる。より高い高い温度は、より短い固定化及び乾燥の時間を提供する。
更に、装置、空気吸い込み流及び空気の温度を固定する場合、酵素−担体の固定化及び／又は乾燥のための時間消費は酵素−担体の量に依存するであろう。前記固定化／乾燥の工程は、空気吸い込み口の温度及び空気吹き出し口の温度を測定することによって監視されうる。前記酵素−担体は湿気があるが、吹き出し口の温度は、熱吸収及び揮発性成分の蒸発のために吸い込み口の温度よりも低い。典型的には、定常状態の蒸発は固定化／乾燥工程の間起こり、吹き出し口の温度が、揮発性成分の蒸発（すなわち熱吸収）が一定の速度で起こることを示す、吸い込み口の温度より低い温度に固定されている。固定化／乾燥工程の終了時に、吹き出し口の温度は上昇し始め、そして吸い込み口の温度に近づき、これは、熱吸収が減少し、そしてこのように酵素−担体の湿気がなくなったことを示している。同時の固定化及び乾燥のために流動床を用いるとき、その乾燥工程は、酵素を含む液体が流動床中に噴霧されている間起こり、そしてその酵素を含む液体の吸い込みが終了した後に、適当に５〜３０分間延長されうる。
【００１６】
本発明の重要な観点は、他のより大きな標準装置を適用することによって、固定化工程を容易に拡大することができることである。このように、上記の前記装置を設定する範囲は、より大きな規模の装置を最適化するために調節されうる。
固定化した酵素調製物の使用
本発明の文脈における固定化した酵素調製物は、本質的に自由水を欠く培体内の有機物質の加水分解、合成又は修飾のために使用されうる。前記物質は、食物製品における、例えば植物又は動物油／脂肪を含んで成ることもある。
【００１７】
従って、本発明は、本質的に自由水を欠く反応培体内で有機化合物を、本発明に従って製造される固定化酵素と接触させることを含んで成る前記有機化合物の酵素的修飾方法を含む。
本発明の好ましい態様において、固定化したリパーゼ酵素、例えば１，３特異的リパーゼは、本質的に自由水を欠く培体内でのエステル交換反応のために使用される。前記エステル交換反応は第１の反応物及び第２の反応物を、例えば図１〜３に示した様な置換反応を起こす、前記の固定化したリパーゼと接触させることを含んで成る、脂肪酸の置換のために使用されうる。
【００１８】
前記の第１の反応物は脂肪酸エステル、好ましくはトリグリセリド又はトリグリセリドの混合物でありうる。
前記の第２の反応物は、前記の第１の反応物と異なる別の脂肪酸エステル、好ましくはトリグリセリド又はトリグリセリドの混合物でありうる。更に前記の第２の反応物は、アルコール又は遊離脂肪酸でありうる。
【００１９】
本発明のこの好ましい態様における前記培体は、有機溶媒を含んで成り、又はそれは本質的にトリグリセリドから成りうる。
本発明の前記使用法は食物製品、例えばマーガリン又はココアバターの代替物の製造において適用されうる。
本発明を、以下の限定しない例によって例示する。
例
リパーゼアッセイ：
本脂質分解活性は、基質としてトリブチリンを用いて決定されうる。この方法は本酵素によるトリブチリンの加水分解に基づき、そしてそのアルカリ消費が時間の関数として記録される。
【００２０】
１リパーゼ単位（LU）は、標準的な条件下（すなわち３０．０℃；pH７．０；乳化剤としてアラビアゴム及び基質としてトリブチリンを用いる）、１分当たり１mmole の滴定可能な酪酸を遊離する酵素量として定義される。
より詳細にこの分析方法を記載しているＡＦ９５／５のフォルダーはデンマークのNovo Nordiskに請求することで入手可能であり、このフォルダーは引用によって本明細書に組入れられる。
エステル交換アッセイ
ａ）２００mgのトリラウリン（Ｆｌｕｋａ）及び５７１mgのミリスチン酸（８モル当量のミリスチン酸）（Ｍｅｒｃｋ）を２０mlのヘプタンに溶解した。３mlの飽和ＮａＣｌ溶液を加え、そしてその混合物を封をした容器内で、環境温度で２４時間撹拌した。
ｂ）前記の固定化酵素（５０mg）を飽和ＮａＣｌ溶液（水の活性＝０．７５）で相平衡にしたガスを用いて、デシケーター（密封的に閉じた容器）内で２４時間水平衡した。
ｃ）０分時において、水平衡化した固定化酵素及び基質を封をした容器内で混合し、これを４０℃の振盪槽内に据えた。１００μｌの試料を、０，１０，２０，３０，４０，５０及び６０分時においてシリンジを用いて封をした容器から回収した。前記試料をアセトン／アセトニトリルの５０／５０（％Ｖ／Ｖ）混合物を用いて希釈（１：５ 体積：体積）し、そしてＨＰＬＣシステムで解析した。
【００２１】
ＨＰＬＣ系での解析：
ｄ）前記ＨＰＬＣ系を５μｍ（１２５×４mm）カラム（Ｍｅｒｃｋ）を端に取り付けたLiChrosphere 100 RPC18で装備した。５０／５０（％Ｖ／Ｖ）のイソクラティックアセトニトリル／アセトン溶液を１ml／分の流速を持つ移動相として選択した。
ｅ）２０μｌの試料を注射し、そして形成した産物〔１，２−ジラウロイル−３−ミリストイル−グリセロール（産物１）及び１，３−ジミリストイル−２−ラウロイル−グリセロール（産物２）〕を２気圧及び３０℃の温度での蒸発的な光散乱検出（Sedex 55, Sedere, Frarce）によって測定した。
ｆ）形成した産物の量を、試料の測定値と、１，２−ジラウロイル−３−ミリストイル−グリセロール及び１，３−ジミリストイル−２−ラウロイル−グリセロールの外部標準曲線を比較することによって評価した。
【００２２】
エステル交換反応工程の割合は、単位量において算出されることがあり、ここで１単位は、１分当たりのトリラウリンに組込まれた１μmoleのミリスチン酸として定義される。あるいは、エステル交換反応工程の効果を、産物１及び産物２へのトリラウリンの変換の％において示すことがあり、これは：
【００２３】
【化１】

【００２４】
によって算出され、ここでｉはサンプルがインキュベーション容器（段階ｃ）から回収される時間を示す。
例１
揮発性液体の除去／蒸発が同時の、流動床中でのゼオライトを基にした担体上へのリパーゼの吸着
フミコラ・ラヌギノサリパーゼの４００ｇの溶液（６９３KLU ／ml）を、Uni-Glatt (Glatt, Germany ）流動床装置内の二路噴霧器を用いて１kgのゼオライト（Wessalith MS330;０．５〜０．９mm；Degussa, Germany）上に噴霧した。前記リパーゼ溶液を蠕動ポンプ（ワトソン−マーロー）を経由して適用した。１００ｍ³ ／時の空気流により吸い込み口の空気の温度は６０℃であり、そして本産物の温度は４０℃であった。固定化が終了した後、本産物を、流動床中で更に５分間乾燥した。
【００２５】
本固定化工程を分子間エステル交換アッセイで試験し、これは２４時間後に５３％のトリラウリンの変換を計測した。
例２
揮発性液体の除去／蒸発が同時の、流動床中でのシリカを基にした担体上へのリパーゼの吸着
フミコラ・ラヌギノサリパーゼ発酵溶液の９４ｇの溶液（６９３KLU ／ml）を１００ｇの脱鉱化水で希釈し、そして二路噴霧器（自家製）を用いて、Uni-Glatt (Glatt, Germany ）流動床装置内の２００ｇのセライトＲ６４８（Manville, USA ）上に噴霧した。前記リパーゼ溶液を蠕動ポンプ（ワトソン−マーロー）を経由して適用した（流速２３８ｇ／時）。吸い込み口の空気の温度及び産物の温度は例１に示したものと同一であった。固定化が終了した後、本産物を流動床中で更に５分間乾燥した。
【００２６】
本固定化工程を分子間エステル交換アッセイで試験し、これは２４時間後に１２％のトリラウリンの変換を計測した。
例３
混合器内での吸着性樹脂上へのリパーゼの吸着及びそれに続く乾燥助剤としてハイパーフローセライト（ＨＦＣ）を用いる流動床中での乾燥
フミコラ・ラヌギノサリパーゼの９４ｇの溶液（６９３KLU ／ml）を２６０ｇの脱鉱化水で希釈した。本溶液を５Ｌの混合器（Loediger, Germany ）内で２５０ｇの吸着性の樹脂（巨大多孔性ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン、Purolite AP 1090；イギリスのPurolite）に加えた。前記懸濁液を環境温度及び３０RPM で２０分間混合した。２０ｇのハイパーフローセライト（ＨＦＣ）を残査溶液に吸収させるために加え、前記混合物がUni-Glatt 装置内で流動化するようにした。例１に記載したのと同一の条件を用いて、前記混合物を２０分間乾燥した。この終わりに、前記ＨＦＣを、樹脂の粒子を維持するために流動床の上層の３００μｍのフィルターを用いて吸着性の樹脂から分離し、同時にＨＦＣは噴出した。
【００２７】
産物の活性：
０〜６０分間の本割合は３，９Ｕ／ｇ産物と計測された。
例４
揮発性液体の乾燥と同時の、流動床中での吸着性樹脂上へのリパーゼの吸着
フミコラ・ラヌギノサリパーゼ（６９３KLU ／ml）の９４ｇの溶液（６９３KLU ／ml）を２００ｇの脱鉱化水で希釈し、そして二路噴霧器を用いてUni-Glatt (Glatt, Germany ）流動床装置内の２００ｇの吸着性樹脂（巨大多孔性ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン、Purolite AP 1090；イギリスのPurolite）に噴霧した。前記リパーゼ溶液を蠕動ポンプ（ワトソン−マーロー）を経由して適用した（流速２３８ｇ／時）。吸い込み口の空気の温度及び産物の温度は、それぞれ５０℃及び３０℃であった。固定化が終了した後、本産物を流動床中で更に５分間乾燥した（流速１００ｍ³ ／時）。
【００２８】
本固定化工程を分子間エステル交換アッセイで試験し、これは２４時間後に３６％のトリラウリンの変換を計測した。
例５
揮発性液体の乾燥と同時の、流動床中でのカオリンを基にした担体上へのリパーゼの吸着
フミコラ・ラヌギノサリパーゼの９４ｇの溶液（６９３KLU ／ml）を３００ｇの脱鉱化水で希釈し、そして二路噴霧器（自家製）を用いて、Uni-Glatt (Glatt, Germany ）流動床装置内の、２００ｇのカオリン担体〔BIOFIX SC （５００〜２５０）；イギリスのECC 社〕上に噴霧した。前記リパーゼ溶液を蠕動ポンプ（ワトソン・マーロー）経由で適用した（流速２３８ｇ／時）。吸い込み口の空気の温度及び産物の温度は、それぞれ５０℃及び３０℃であった。固定化が終了した後、本産物を流動床中で更に５分間乾燥した（流速１００ｍ³ ／時）。
【００２９】
本固定化工程を分子間エステル交換アッセイで試験し、これは２４時間後に３４％のトリラウリンの変換を計測した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、第１の反応物（反応物１）が第２の反応物（反応物２）、例えば遊離脂肪酸と反応し、反応において置換基Ｒ１及びＲ２が交換される、リパーゼによって触媒される酸加水分解の例を示す。Ｒ１及びＲ２は、例として：
【化２】

でありうる。
【図２】 図２は、第１の反応物（反応物１）、例えばトリグリセリドが第２の反応物（反応物２）、例えば別のトリグリセリドと反応し、反応において置換基Ｒ１及びＲ２が交換される、リパーゼによって触媒される分子間エステル交換反応の例を示す。Ｒ１及びＲ２は例として：
【化３】

でありうる。
【図３】 図３は、第１の反応物（反応物１）、例えばトリグリセリドが第２の反応物（反応物２）、例えばアルコールと反応し、反応において置換基Ｒ１及びＲ２が交換される、リパーゼによって触媒されるアルコール分解の例を示す。Ｒ１及びＲ２は例として：
【化４】

でありうる。

Claims (5)

1. ａ）２０〜１０００ｍ^２／ｇの表面積、２００〜１０００μｍの粒径を有し、
   （１）親水性若しくは疎水性の液体又はその混合物中で不溶性であり、親水性表面を有する無機性材料、
   （２）親水性若しくは疎水性の液体又はその混合物中で不溶性であり、疎水性の表面を提供するために有機性部分で覆われた無機性材料、又は
   （３）有機性ポリマー樹脂、
   から選択される材料を含んで成る粒子状の多孔性担体を流動床中で流動化すること、
   ｂ）酵素を担体に固定するために、酵素を含む液体培体を噴霧によって流動床中に導入すること、ここで、当該液体は前記担体の凝集が起こらないような量で導入される、及び
   ｃ）流動床中の担体から液体培体の揮発性成分を除去すること、
   を含んで成る、自由水を欠く主に有機性の培体中での使用のための固定化酵素調製物の製造方法。
2. ａ）担体に酵素を吸着させるために、その酵素を含む液体培体を、親水性若しくは疎水性の液体又はその混合物中で不溶性であり、２０〜１０００ｍ^２／ｇの表面積、２００〜１０００μｍの粒径、及び疎水性表面を有する粒子状の多孔性担体と接触させること、
   ｂ）吸湿性物質を導入して、過剰な液体の吸収による担体の凝集を抑制すること、及び
   ｃ）流動床中の前記産物から、液体培体の揮発性成分及び吸湿性物質を除去すること、ここで、前記吸湿性物質は、過剰な液体を吸収する能力のある、親水性の、粒状の微粉砕された任意の成分である、を含んで成る、自由水を欠く主に有機性の培体中での使用のための、固定化酵素調製物の製造方法。
3. 段階（１）の無機性材料がシリカ、ゼオライト、アルミナ及びカオリンから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記液体培体が水性培体である、請求項１に記載の方法。
5. 前記酵素がリパーゼである、請求項１に記載の方法。

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