RU2818272C1 - Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных волокнах ВИОН КН-1 в Н-форме - Google Patents
Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных волокнах ВИОН КН-1 в Н-форме Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818272C1 RU2818272C1 RU2023119829A RU2023119829A RU2818272C1 RU 2818272 C1 RU2818272 C1 RU 2818272C1 RU 2023119829 A RU2023119829 A RU 2023119829A RU 2023119829 A RU2023119829 A RU 2023119829A RU 2818272 C1 RU2818272 C1 RU 2818272C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- buffer
- lipase
- solution
- immobilized
- cation exchanger
- Prior art date
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 75
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 title claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 21
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 abstract description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000002638 heterogeneous catalyst Substances 0.000 abstract description 3
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 10
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 10
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 10
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 102100021851 Calbindin Human genes 0.000 description 6
- 101000898082 Homo sapiens Calbindin Proteins 0.000 description 6
- 101001021643 Pseudozyma antarctica Lipase B Proteins 0.000 description 6
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Substances CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJOWMORERYNYON-UHFFFAOYSA-N 5-ethenyl-2-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=C(C=C)C=N1 VJOWMORERYNYON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122930 Alkalising agent Drugs 0.000 description 1
- 241000228195 Aspergillus ficuum Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000146387 Chromobacterium viscosum Species 0.000 description 1
- 102100031375 Endothelial lipase Human genes 0.000 description 1
- 101710158368 Extracellular lipase Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 229940127470 Lipase Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 108010048733 Lipozyme Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical group C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XERQKTRGJIKTRB-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CN=CN1 XERQKTRGJIKTRB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101710128940 Triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000922 anti-bactericidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010090785 inulinase Proteins 0.000 description 1
- IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N isocyanate group Chemical group [N-]=C=O IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N lipoamide Chemical compound NC(=O)CCCCC1CCSS1 FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 108020002447 serine esterase Proteins 0.000 description 1
- 102000005428 serine esterase Human genes 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 108010079522 solysime Proteins 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на ионообменных волокнах. Способ предусматривает адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; при этом перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии ионообменных волокон ВИОН КН-1 в буфере 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и декантации внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Способ позволяет получить иммобилизованную липазу с более высокой гидролазной активностью, расширить число носителей, используемых для стабилизации липазы. Кроме того, гетерогенный катализатор включает только иммобилизованную липазу и полностью отмыт от ее неиммобилизованной формы. 3 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для реакций трансэтерификации и гидролиза молочного жира.
Применение гидролитических ферментов в пищевой промышленности и медицине помогло усовершенствовать многие существующие способы производства продуктов питания и лекарственных препаратов.
Липаза (КФ 3.1.1.3) - сериновая эстераза, которая катализирует гидролиз сложноэфирных связей триглицеридов до ди- и моноглицеридов, глицерина и жирных кислот.Липазы широко доступны и повсеместно присутствуют в тканях животных и растений, а также в различных микроорганизмах. Активный центр липазы является частью каталитической триады, которая включает Ser-His-Asp/Glu и ксианионное отверстие. Во многих липазах доступ к активному центру контролируется lid-доменом, образованным поверхностной петлей. Домен lid претерпевает конформационное изменение в присутствии ингибитора [Е. D. Yushkova, Е. A. Nazarova, А. V. Matyuhina et al. Application of Immobilized Enzymes in Food Industry // Journal of agricultural and food chemistry Microb Cell Fact. - 2019. V. 67, №42. - P. 11553-11567].
Большинство липаз проявляют высокую активность при рН 4,0-8,0. На каталитическую способность липазы могут влиять ионы некоторых металлов и органические растворители. Chromobacterium viscosum, и Rhizophus sp.продуцируют внеклеточные липазы, активные при кислом рН, а P. nitroaeducens - щелочную липазу активную при сильнощелочном рН. Оптимальная температура для большинства липаз составляет от 30 до 50°С. Фермент обладает высокой субстратной специфичностью [Tian-Tian Liu, Xiao-Tian Liu, Qing-Xi Chen, Yan Shi. Lipase Inhibitors for Obesity: A Review // Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2020. V. 128.-P. 110314-110323].
Липазы находят широкое применение в промышленности в реакциях трансэтерификации и гидролиза, а также в фармацевтических препаратах. Они также используются в целлюлозно-бумажной промышленности для удаления смолы из получаемой целлюлозы при изготовлении бумаги, в пищевой промышленности в качестве биосенсоров для количественного определения триацилглицерина при производстве жиров, масел и безалкогольных напитков [Payel Choudhury, Biswanath Bhunia. Industrial application of lipase: a review // Biopharm Journal. - 2015. V. 1, №2. - P. 41-47].
Ограничением для использования растворимых ферментов является их относительная нестабильность. Одним из основных средств повышения времени полужизни ферментов является их иммобилизация на полимерных носителях. В результате повышается стабильность ферментов к денатурирующим воздействиям внешней среды, что способствует многократному применению энзиматических препаратов в фармацевтической и пищевой промышленности. К соединениям, используемым в качестве нерастворимых носителей белков, предъявляются высокие требования: с одной стороны, молекула фермента после иммобилизации не должна претерпевать какие-либо структурно-функциональные изменения, с другой - она должна быть прикреплена к матрице необратимо. В качестве полимеров для иммобилизации фермента можно использовать ионообменные волокна [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах / Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. Т.5, №5. - С.704-711].
Химическими называются волокна, полученные в результате переработки природных или синтетических высокомолекулярных соединений. Химические волокна обладают рядом ценных и уникальных свойств, не присущих натуральным волокнам. Они обладают высокой прочностью, хорошей эластичностью, легкостью, несминаемостью и рядом других свойств, которые позволяют расширить область их применения [Камалова Э.Р., Камалов Р.В., Николаенко Г.Р. Высокомолекулярные соединения и производство полимерных материалов // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. Т. 16, №23. - С.95-96].
Преимуществами ионообменных волокон является степень очистки ионита -98%, скорость сорбции и регенерации в 10-15 раз выше, чем для зернистых материалов, высокая обменная емкость. Иониты обладают селективностью, устойчивостью к действию кислот и щелочей, что способствуют их применение в медицине [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. Т.5, №5. - С.704-711].
Волокнистые иониты обладают высокой удельной поверхностью, что позволяет увеличивать скорость и полноту «улавливания» сорбируемого вещества, малым сопротивлением фильтрующего слоя, что делает их перспективными хемосорбентами. Данные свойства способствуют их использованию в качестве матриц для разработки гетерогенных катализаторов на основе иммобилизованных ферментов. Иониты обладают высокой селективностью, устойчивостью к действию кислот и щелочей, что способствуют их применение в медицине [Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Волокнистые хемосорбенты вион как перспективные матрицы для иммобилизации инулиназы из Aspergillus ficuum II Вестник ВГУ. - 2019. Т.7. - С. 3-7].
Волокнистый хемосорбент ВИОН КН-1 - представляет собой слабокислотное катионнообменное хемосорбционное карбоксилсодержащее волокно с трехмерной сеткой, полученное на основе полиакрилонитрильного волокна. Функциональными группами катионита ВИОН КН-1 являются карбоксильные группы - COO- (Н+ - или Na+ -формы) [Абдулхакова З.З., Зверев О.М. Определение сорбционных свойств ионообменных волокон // Вестник Казанского технологического университета. -2013. Т.1, №11. - С.31-39]. Для него характерна высокая скорость сорбции, высокоразвитая поверхность, высокая гигроскопическая устойчивость и гидрофильность [Патент RU 2677873, МПК A61K 38/48, A61K 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019].
Волокнистый хемосорбент ВИОН АН-1 представляет собой низкоосновное анионообменное волокно. Волокнистый хемосорбент ВИОН АН-1 получен формованием сополимеров акрилонитрила с 2-метил-5-винил-пиридином [Абдулхакова З.З., Зверев О.М. Определение сорбционных свойств ионообменных волокон // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. Т. 1, №11. - С. 31-39]. Функциональные группы хемосорбента способны не только к анионному обмену, взаимодействию с кислотами и щелочами, но и сорбции ионов переходных металлов за счет донорно-акцепторного взаимодействия вакантных орбиталей последних и неподеленных s2-гибридных электронных пар атомов азота пиридинового ядра хемосорбента [Бычковская Г.И., Валова В.Д. Потенциометрическое исследование комплексообразующих свойств волокнистого хемосорбента ВИОН АН-1 // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. Т.10,№1.-С.86-92].
Волокна ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 очищают и дезинфицируют рану путем нейтрализации токсических веществ в ее области, нормализуют значения рН анализируемой среды. Применение материала эффективно при терапии пролежней и гнойных ран, позволяет сократить сроки лечения. ВИОНы обладают антибактерицидными и антигрибковыми свойствами [Патент RU 2677873, МПК А61К 38/48, А61К 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019].
В последнее время волокнистые сорбенты нашли широкое применение в защите окружающей среды от токсичных выбросов. Емкость сорбента определяет количество сорбционного материала, необходимого для данной конкретной цели [Абдулхакова 3.3., Зверев О.М. Определение сорбционных свойств ионообменных волокон // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. Т. 1, №11. -С.31-39].
Существуют способы ферментативной переэтерификации/этерификации, в которых использованы липазы, иммобилизованные на гидрофобных смолах, в присутствии водных растворов [Патент RU 2573929 С9, МПК, С12Р 7/64, C12N 9/20, CUC 3/10, опубл. 10.06.2016, Бюл. №16]. Изобретение относится к ферментативному способу получения сложных алкилэфиров жирных кислот для применения в области производства продуктов питания. В способе используют ферменты, иммобилизованные на гидрофобной смоле, смешанной с источником жирных кислот и спиртом, в присутствии водного раствора. Безусловно при использовании гидрофобных смол происходят незначительные потери ферментативной активности, но использование наиболее гидрофильных сорбентов, такие как ионообменные волокна, позволят получить более активные биокатализаторы.
Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2389792 С2, МПК C12N 9/20, C12N 11/12, опубл. 20.05.2020, Бюл. №14], включающий растворение пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе иди подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавление к фильтрату полученного раствора панкреатической липазы или микробной липазы из культуры Aspergillus niger, или их смеси с активностью не ниже 100 ед./г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие липазу, отделяют и высушивают.
В данном способе иммобилизация липазы проводится на растворимом носителе, который, безусловно, имеет свои преимущества, но может быть легко подвержен заражению микробной микрофлорой и неустойчив к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей.
Известен способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2301831, МПК C12N 9/20, C12N 11/08, опубл. 27.06.2007], включающий иммобилизацию липазы в полидиаллилдиметиламмоний хлориде при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. В отличие от него наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу в нерастворимой форме, т.е. гетерогенный биокатализатор, т.к. применяемые нами в качестве носителей ионообменные волокна не растворимы в воде.
Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 1696475 А1, МПК C12N 11/08, C12N 9/18 опубл. 07.12.1991, Бюл. №45], включающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы, в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдииэоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.
Недостатком изобретения является использование 2,4-толуолдииэоцианата в качестве бифункционального реагента, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.
Описан способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В [Патент RU 2650668 С1, МПК C12N 9/16, C12N 11/08, опубл. 13.12.2016, Бюл. №11], включающий избирательную адсорбцию липазы из Candida antarctica фракции В на гидрофобном макропористом носителе в процессе инкубации частиц носителя в водном концентрате культуральной жидкости штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4298 с удельной ферментативной активностью не менее 350 ЛЕ/мг белка и последующую ковалентную модификацию адсорбированного фермента глутаровым альдегидом, добавляемым непосредственно в инкубационную суспензию до конечной концентрации его 1,0-2,5%. Процесс инкубации продолжают в течение 30-120 мин.
Недостатком предложенного этими авторами метода является использование глутарового альдегида в качестве сшивающего агента, что ограничивает применение препарата в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине. ~
В отличие от этого изобретения предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованную липазу адсорбционным методом без дальнейшей ковал ентной модификации.
Известен способ иммобилизации липазы CALB путем адсорбции на сополимере дивинилбензола и метакрилата, выпускаемом компанией Purolite®Life Sciences под маркой Lifetech™ ECR 1030М [Basso A., Froment L., Hesseler M., Serban S. New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013. - V. 115. - P. 468-472], в котором для иммобилизации используют липазу CALB в виде водного раствора (коммерческий препарат Lipozyme®CALB L, компания Novozymes) с удельной гидролазной (лйпазной) активностью (по гидролизу трибутирина) 330 мкмоль/мг белка. Перед использованием в растворе CALB устанавливают рН 7,5 и инкубируют раствор с носителем при перемешивании в течение ночи. Затем внешний раствор отделяют вакуумной фильтрацией, носитель с адсорбированной CALB однократно промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, и высушивают в токе азота.
Описаны способы сорбции липаз на ионообменных материалах [CN108148827A, CN101712951A, CN106867989A, JPH01273588A, JPH03160992A, US5273898A, WO2015081879A1], в том числе Amberlite, Duolite, Purolite [WO2008084470A2, CN102839166A], Lewatit, Dowex [US5292649A], различных типах органических и неорганических полимерных смол [RU 2573929, CN114657169A], ковалентной иммобилизации этих же ферментов на названных типах носителей [WO2008139455A2], а также способы получения мультилипазных препаратов [WO2009069116A2]. Перечисленные выше подходы не позволяют полностью удалить несвязанную с носителем форму липазы, которая в дальнейшем может попадать в целевой продукт.
Известны способы иммобилизации липазы на различных типах носителей путем абсорбции, ионного связывания, ковалентного связывания, включения в гели, мембраны, а также способы получения иммобилизованной липазы путем комбинирования этих методов [US 2010210745 А1]. Однако ни в одном из этих способов не доказано, что получаемый иммобилизованный препарат полностью очищен от несвязавшегося фермента.
В качестве прототипа служил способ, описанный в патенте [US5292649A], согласно которому 1 г макропористой слабокислотной катионообменной смолы Lewatit CNP 80 производства Bayer AG смешивали с 50 мг 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-и-толуолметосульфоната и 10 мл воды. Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре, при этом значение рН доводили до 4-5 добавлением 6 М HCl. После стабилизации значения рН полученную реакционную смесь тщательно промывали для удаления избытка 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-и-толуолметосульфоната. Затем к смеси добавляли 2 мл 1/15 М буфера Mcllvaine с рН 4 и 50 мкл раствора липазы (1450 единиц) и полученную смесь оставляли на ночь в прохладной комнате для проведения реакции. В результате была получена липаза, иммобилизованная на Lewatit CNP 80.
В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу с более высокой гидролазной активностью. Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для стабилизации липазы. Кроме того, гетерогенный катализатор включает только иммобилизованную липазу и полностью отмыт от ее неиммобилизованной формы.
Технический результат заявленного изобретения заключается в получении гетерогенного, нерастворимого в воде биокатализатора на основе липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной адсорбционным методом на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме, включающего только иммобилизованную (стабилизированную) липазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего более высокой удельной активностью, равной 20184 мкмоль/мг, по сравнению с прототипом, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменном волокне ВИОН КН-1 в Н-форме, включающем адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника, в процессе инкубации липазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; согласно изобретению в качестве носителя используют катионообменник ВИОН КН-1, перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г катионообменного волокна ВИОН КН-1 в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и, предшествующего ей, выдерживания катионообменника используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных волокнах.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в мкмоль жирных кислот) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных волокнах.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных волокнах.
Пример реализации способа
В качестве объекта исследования была выбрана липаза из поджелудочной железы свиньи, фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил трибутирин фирмы Acros. В качестве носителей для иммобилизации были рассмотрены ионообменные волокна ВИОН АН-1, ВИОН КН-1 фирмы ООО «ЛИРСОТ» со следующими характеристиками: линейная плотность волокна - 0,4-0,7 текс, длина волокна - 52±8 мм, удельная разрывная нагрузка - не менее 5,0 сН/текс, удлинение при разрыве - 20-45%, полная статическая обменная емкость по 0,1 нормальной HCl для ВИОН АН - не менее 1,8 мг-эквивалент/г, полная статическая обменная емкость по 0,1 нормальной HCl для ВИОН КН - не менее 3,5 мг-эквивалент/г.
Для подготовки ионообменных волокон к иммобилизации их помещали в дистиллированную воду. После набухания обрабатывали растворами HCl переменной концентрации (0,5; 1,0; 1,5; 1,0; 0,5 моль/л), процесс проводили в статических условиях. После отмывки дистиллированной водой осуществляли попеременную четырехкратную обработку 1 моль/л растворами NaOH и НС1 с промежуточной промывкой дистиллированной водой. Каждый этап составлял не менее 20 мин. После очистки ионообменные волокна ВИОН КН-1 переводили в Н-форму, а ВИОН АН-1 - в ОН-форму. Подготовленный таким образом носитель высушивали при комнатной температуре до постоянной массы и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Холявка М.Г. Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / М.Г. Холявка, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. -161 с].
Иммобилизацию липазы на матрице ионообменных волокон осуществляли адсорбционным методом. 1 г предварительно кондиционированных ионообменных волокон в Н-форме оставляли на 12 ч при комнатной температуре в 20 мл 0,05М фосфатного буфера с рН 5,8. После чего 10 мл раствора липазы в 0,05М фосфатном буфере с рН 5,8 в концентрации 1 мг/мл добавляли к суспензии носителя и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, внешний раствор декантировали, осадок промывали до отсутствия белка в промывных водах с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 грамма полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Контроль наличия или отсутствия белка в промывных водах осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм
Содержание белка в иммобилизованных препаратах липазы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].
Определение каталитической активности липазы проводили на субстрате трибутирине [Беленова А.А. Исследование закономерностей гидролиза трйглицеридов свободной и иммобилизованной липазой: дис.к.б.н. 03.01.02 / Беленова А.С.- Воронеж, 2011. - 162 с]. Реакционную смесь объемом 2 мл, содержащую 0,5 мл эмульсии субстрата в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере, рН 6,5, инкубировали при 37°С с образцом иммобилизованного фермента в течение 15 мин. Отбирали 1 мл реакционной смеси и добавляли 1 мл 0,1 М HCl в этаноле для остановки реакции. Далее для количественного определения образующихся в ходе гидролиза жирных кислот к этой смеси добавляли 5 мл гексана, встряхивали, и после расслоения из гексанового слоя отбирали 1 мл пробы и вносили в пробирку с 3 мл цветного реагента родамина 6Ж. Интенсивность образующейся окраски измеряли через 20 мин при длине волны 515 нм. Для определения содержания жирных кислот использовали калибровочную кривую, построенную по пальмитиновой кислоте.
Удельную активность липазы выражали в мкмоль жирных кислот, выделившихся за 1 мин в расчете на 1 мг белка, и рассчитывали по формуле:
где - количество жирных кислот, мкмоль;
- содержание белка в препарате, мг;
- время гидролиза, мин. Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты отражены на фиг.1-3.
Высокие значение содержания белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя), а также общей активности липазы (в мкмоль жирных кислот) наблюдались при ее иммобилизации адсорбционным методом на ионообменных волокнах ВИОН АН-1 и ВИОН КН-1 (фиг.1, 2). Однако наибольшую удельную активность показали препараты липазы, иммобилизованной с помощью адсорбционного метода на матрице ВИОН КН-1 (фиг.3). Таким образом, оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в мкмоль жирных кислот) и удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) было получено при адсорбции липазы на ионообменном волокне ВИОН КН-1.
Claims (1)
- Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на ионообменных волокнах ВИОН КН-1 в Н-форме, включающий адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации липазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора, отличающийся тем, что в качестве носителя используют катионообменник ВИОН КН-1, перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г катионообменных волокон ВИОН КН-1 в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и предшествующего ей выдерживания ионообменника используют 0,05 М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2 М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818272C1 true RU2818272C1 (ru) | 2024-04-27 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5292649A (en) * | 1983-03-29 | 1994-03-08 | Agency Of Industrial Science & Technology, Ministy Of International Trade & Industry | Method for reaction of lipase upon fatty acid |
| RU2573929C2 (ru) * | 2011-08-31 | 2016-01-27 | Транс Био-Дизель Лтд. | Способы ферментативной переэтерификации/этерификации, в которых использованы липазы, иммобилизованные на гидрофобных смолах, в присутствии водных растворов |
| RU2650668C1 (ru) * | 2016-12-13 | 2018-04-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В |
| CN108148827A (zh) * | 2016-12-02 | 2018-06-12 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 固定化酶及其制备方法和用途 |
| RU2725474C1 (ru) * | 2019-04-29 | 2020-07-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Федеральный исследовательский центр "Институт катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения Российской академии наук" (ИК СО РАН, Институт катализа СО РАН) | Биокатализатор, способ его приготовления и способ получения сложных эфиров с использованием этого биокатализатора |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5292649A (en) * | 1983-03-29 | 1994-03-08 | Agency Of Industrial Science & Technology, Ministy Of International Trade & Industry | Method for reaction of lipase upon fatty acid |
| RU2573929C2 (ru) * | 2011-08-31 | 2016-01-27 | Транс Био-Дизель Лтд. | Способы ферментативной переэтерификации/этерификации, в которых использованы липазы, иммобилизованные на гидрофобных смолах, в присутствии водных растворов |
| CN108148827A (zh) * | 2016-12-02 | 2018-06-12 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 固定化酶及其制备方法和用途 |
| RU2650668C1 (ru) * | 2016-12-13 | 2018-04-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В |
| RU2725474C1 (ru) * | 2019-04-29 | 2020-07-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Федеральный исследовательский центр "Институт катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения Российской академии наук" (ИК СО РАН, Институт катализа СО РАН) | Биокатализатор, способ его приготовления и способ получения сложных эфиров с использованием этого биокатализатора |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jesionowski et al. | Enzyme immobilization by adsorption: a review | |
| Bayazidi et al. | Immobilization of lysozyme on bacterial cellulose nanofibers: Characteristics, antimicrobial activity and morphological properties | |
| Okura et al. | Improved immobilization of lipase from Thermomyces lanuginosus on a new chitosan-based heterofunctional support: Mixed ion exchange plus hydrophobic interactions | |
| Verma et al. | Synthesis and characterization of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) of thermostable xylanase from Geobacillus thermodenitrificans X1 | |
| Kharrat et al. | Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzyme | |
| Bayramoğlu et al. | Immobilization of Candida rugosa lipase onto spacer-arm attached poly (GMA-HEMA-EGDMA) microspheres | |
| Bagi et al. | Immobilization and characterization of porcine pancreas lipase | |
| Cea et al. | Enzymatic esterification of oleic acid by Candida rugosa lipase immobilized onto biochar | |
| Romdhane et al. | Esterification activity and stability of Talaromyces thermophilus lipase immobilized onto chitosan | |
| EP1042458B1 (en) | A process for immobilisation of enzymes | |
| Mohammadi et al. | Improvement of lipase biochemical properties via a two-step immobilization method: Adsorption onto silicon dioxide nanoparticles and entrapment in a polyvinyl alcohol/alginate hydrogel | |
| Yi et al. | Amino acid modified chitosan beads: improved polymer supports for immobilization of lipase from Candida rugosa | |
| US6156548A (en) | Immobilization of enzymes with a fluidized bed for use in an organic medium | |
| Arica et al. | Reversible immobilization of lipase on phenylalanine containing hydrogel membranes | |
| Gonçalves et al. | Immobilization of porcine pancreatic lipase on activated carbon by adsorption and covalent bonding and its application in the synthesis of butyl butyrate | |
| CA1223382A (en) | Immobilization of proteins on polymeric supports | |
| JP2678341B2 (ja) | 固定化リパーゼ | |
| Anand et al. | Study and deployment of methacrylate-based polymer resins for immobilized lipase catalyzed triglyceride hydrolysis | |
| Dulęba et al. | The influence of substrate systems on the enantioselective and lipolytic activity of immobilized Amano PS from Burkholderia cepacia lipase (APS-BCL) | |
| Zhu et al. | Amino modified magnetic halloysite nanotube supporting chloroperoxidase immobilization: enhanced stability, reusability, and efficient degradation of pesticide residue in wastewater | |
| Kızıldağ et al. | Milk lactose removal by β-galactosidase immobilized on eggshell membrane | |
| RU2818272C1 (ru) | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных волокнах ВИОН КН-1 в Н-форме | |
| Kilinç et al. | Chemical attachment of porcine pancreatic lipase to crosslinked poly (vinyl alcohol) by means of adipoyldichloride | |
| Milašinović et al. | Catalyzed ester synthesis using candida rugosa lipase entrapped by poly (N‐isopropylacrylamide‐co‐itaconic acid) hydrogel | |
| Soares et al. | Intensification of lipase performance for long-term operation by immobilization on controlled pore silica in presence of polyethylene glycol |