JPH06505148A

JPH06505148A - 親水性基質の酵素的逆加水分解−両親媒性化合物の製法

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Publication number: JPH06505148A
Application number: JP4503979A
Authority: JP
Inventors: シュナイダー，マンフレット　ペー．
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Current assignee: Individual
Priority date: 1991-02-13
Filing date: 1992-02-12
Publication date: 1994-06-16
Also published as: DE69203718T2; WO1992014830A1; EP0571421B1; EP0571421A1; DE69203718D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】親水性基質の酵素的逆加水分解−両親媒性化合物の製法発明の技術分野本発明は、固体担体上に吸着した親水性基質と、疎水性であってもよい第二の基質との生物触媒反応によって両親媒性化合物を製造する方法に関する。本発明は、異性体的に純粋な１．３−ジグリセリド及び１−モノグリセリド、糖エステル、アミノ酸エステル、ペプチド、及び糖脂質、並びにアルコール、炭水化物及びヌクレオシドのホスフェートを製造する方法に関する。本発明は、固体担体に吸着した炭水化物またはアルコールの組成物、並びに固体担体に吸着したカルボキシル基保護ペプチドまたはカルボキシル基保護アミノ酸と同じ担体に吸着したアミノ基保護ペプチドまたはアミノ基保護アミノ酸との組合せの組成物を提供する。また、本発明は、ｌ−モノグリセリド生成物を選択沈澱する方法を提供する。

発明の背景工業的に有用な多くの化学品がｖｉ親媒性化合物であり、それらは親水性化合物と、疎水性であってもよい第二の化合物とのエステル化反応または逆加水分解反応によって得ることができる。このような反応を以下に例示する。

■）ポリアルコールのエステル化：グリセロール＋遊離脂肪酸→モノグリセリド＋水２）炭水化物のエステル化ニゲルコース＋遊離脂肪酸→糖エステル＋水３）アミノ酸のエステル化：ペプチド＋遊離脂肪酸−ペプチドエステル士水このような反応の両親媒性生成物は、界面活性剤、乳化剤、食品添加物、食品成分及び食品代用品並びに薬品として用いられる。アミノ酸エステルやペプチドエステルは、天然にあるリポタンパク質と類似した生物学的活性を有し、また薬品として潜在的に有用である。

上記の反応は、低水分条件下、すなわち疎水性非極性溶剤においてのみ優先する逆加水分解の方向において示されている。親水性化合物は非極性溶剤とは相溶しないので、逆加水分解に有利な反応条件を確立することに問題がある。その上、最も親水性が高い化合物と疎水性が高い化合物とは互いに不混和性であり、多くの化合物の組合せについては、両方の基質を混合させるのに適した溶剤が無い。

結果として、グリセロール、エチレングリコール、ポリオール及びサツカリドといった多くの親水性化合物と、長＊脂肪酸残基とのエステル化は、バッチまたはカラム反応器における従来の手段では実現が困難あるいは不可能である。例えば、グリセロールと脂肪酸をエステル化する従来の工業プロセスは、毒性金属であることが多い無機触媒の存在下、２００〜２５０℃で行われている。

乳化剤として有用な両親媒性製品の１種に、長鎖のモノアシルグリセロールまたはモノグリセリドが含まれる。従来は、それらは、対応するトリグリセリドと２当量のグリセロールとの化学的アルコーリシスによって製造されている（第５図Ｂを参照のこと）。工業用エステル化と同様に、この種の反応も、高温（２１Ｏ〜２４０°Ｃ）と、通常毒性の錫化合物または鉛化合物であるエステル交換触媒の使用を必要とする。反応生成物は、モノグリセリド、グリセロール並びに脂肪酸及び脱水工程から生じる数種の汚染副産物から成る平衡混合物である。レジオ異性体として「純粋な」モノグリセリドを得るためには、出発のグリセリドに対する生成物収率が約４０〜５０％にしかならないコストのかかる精製工程が必要である。

別法として、文献に、イソプロピリデン−グリセロール（Ｂｅａｒ。

Ｅ、、　Ｆｉｓｃｈｅｒ、　Ｈ，０，Ｌ、、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　６７、２０３１　（１９４５））またはグリセロール（ドイツ国特許ＤＢ −Ｏ８２，３３８，４６２号（１９７３））に基づく化学的多段階プロセスが報告されている。

これらの方法では、天然の出発物質を使用することができない。

上記の方法は、どれも適当な出発物質の合成及び／または保護／脱保護工程を必要とする。こうして、上記の従来の合成法では、化学的にあるいは異性的に純粋なモノグリセリドを得るための便利な手段は提供されない。

酵素を利用する生触媒反応によって潜在的な別法が提供される（例えば、Ｗｏｎｇ、　Ｃ，Ｈ，、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．１１４５−１１５２　（１９８９）を参照されたい）。本明細書に記載する化学反応では、反応生変化する化合物の両方が、酵素に対する基質と考えられる（Ｗｏｎｇ、上記）。酵素的逆加水分解を工業用に実用化するためには、上記の基質／溶媒不混和性の問題を解決しなければならない。

酵素リパーゼによるエステル化反応の触媒について記載されている。グリセロールと遊離脂肪酸との反応において、菌糸リパーゼが、グリセロールの１位と３位においてエステル結合を形成してモノグリセリド及びジグリセリドを形成するのを触媒したと報告されている（Ｔａｈｏｕｎ、　Ｍ、に、ら、Ｅｎｚｙ＋ｎｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　８．　４２９−４３２（１９８６））反応は、攪はんによって分散促進された水性媒体中で行われた。また、サツカリドと脂肪酸とのエステル化にリパーゼが用いられている（Ｂｊｏｒｋｌｉｎｇ、　Ｆ、ら、Ｊ、Ｃ，Ｓ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、９３４−９３５（１９８９）　；Ａｄｅｌｈｏｒｓｔ、　Ｋ、ら、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　１１２−１１５（１９９０））　、反応は、その２種の基質が互いにいくらかは可溶性であるため、溶媒を添加せずに行われた１１反応中にη、成ば゛る水は真空により除去された。

モノグリセリドの調製について、出発化合物のイソプロビリデ゛ノグリー５　＋３−／しくＯｍａｃ、１．Ｃ，、５ａｅｋｉ、Ｈｌ、　Ｎ１５ｈｉｏ、Ｎ、、Ｎａｇａｉ、Ｎ、。

る。これらの酵素法は、」―記の化学的多段階プロセスと同様の制限を有する。

反応速度及び収率を増加させるため、水性媒体中のリパーゼ触媒エステル化は、膜バイオリアクターで実施されている。膜バイオリアクター系では、グリセロール／水／リパーゼ溶液と脂肪酸基質とを物理的に分離する微孔質疎水性膜を使用することによって、逆加（Ｉ９８５））。脂肪酸は疎水性膜の細孔を十分に透過して、膜と水溶液との１面における反応に関与する。得られる両親媒性生成物は水性区分に残留する。

別の方法は、基質の表面領域の反応性基への暴露を増加させるために、固体担体へ基質を共有結合させることを必要とする。酵素的ペプチド合成は、アミノ酸基質を活性化シリカゲルへエステルまたはアミド結合することで、水性媒体中で促進される（Ｋｏｅｎｎｅｃｋｅ、　Ａ。

また、リパーゼ触媒反応は、逆ミセル系またはミクロエマルションにおいても実施されている。これらの系は、トリグリセリドに対する脂肪酸側鎖の交換を促進するように設計された。界面活性剤を用いた乳化によって、トリグリセリドを極性溶媒中に分散させている。乳濁液系に−おいて水性緩衝液の代わりどして親水性基質のグリセロールを使用すると、エステル生成物はまったく形成しなかった報告によると、基質も酵素も可溶性ではない有機溶媒のへキサン中で、キモトリプシンによりペプチド合成が触媒された（Ｋｕｈｌ、　Ｐ。

ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　３１５２１３−５２１６（１９９０））、生成物の収率はへキサン濃度に反比例し、中濃度のへキサンでＯにまで低下した。著者は、その結果について慣例の説明は提供できなかったが、未溶解の基質が直接の粒子−粒子接触によって反応を促進したと考えた。

グリコシド転移は、酵素触媒可能な別の種類の反応である。グリコシド転移の生成物には、複雑なオリゴサツカリド、グリコプロ１イン及びゲリコリビドが含まれる。グリコジルトランスフェラーゼはまだ容易には入手できないが、対応するヒドロラーゼ、すなわちグリコシダーゼ（表１、カテゴリー３．２゜１）は市販されている。サツカリドとアルコールとの反応を触媒するために、グリコシダーゼのβ−ガラクトシダーゼが用いられている。報告されている収率は低い（２５〜３５％）が、その理由は、反応が水性媒体中で行われ、初期に生成した生成物が酵素の加水分解作用によって一部分解するためである。報告されている手順は、基質が非極性溶媒とは混和しないため、非水性媒体中で実施することができなかった。

有機溶媒中での酵素の非溶解性の問題は、ペプチダーゼやリパーゼをセライトやシリカゲルといった固体担体に吸着させることによって解決された（Ｆｅｒｊａｎｃｉｃ、　Ａ、ら、Ａｐｐｌ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ。

３６、　６５１−６５７（１９９０）；５ｃｈｕｃｈ、　Ｒ，ら、Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

３０、３３２−３３６（１９８９）；Ｅｉｇｔｖｅｄ、　Ｐ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｗｏｒｌｄ　Ｃｏｎｆ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌ、Ｆａｔｓ　ａｎｄ　０ｉｌｓ、　ＡＯＣＳ、１３４−１３７　（１９８７）　；　Ｙａｍａｎａｋａ、Ｓ、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３６．４０５−４１１（１９８７））。触媒量の酵素を吸着させるに十分量のシリカゲルまたはセライトを反応混合物に添加するか、あるいは、より普通には、予め酵素を担体に吸着させたものを購入する。攬はんによって、吸着した酵素を疎水性溶媒中で分散させた。

しかしながら、親水性基質は溶媒中で効果なく分散されたままになり、反応速度や最終生成物の収率は制限された。

今まで報告されているグリセロール、ジヒドロキシアセトン、エノールピルベート、モノサツカリド及びヌクレオシドといった生物学的に重要な分子のリン酸化は、生物学的リン酸化剤、通常はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に依存していた。報告によると、これらの反応は、グリセロールキナーゼやヘキソキナーゼといった酵素によって触媒され、また水性媒体中で行われている。このようなプロセスは、ＡＴＰが高価であり、またモル量で必要とされ、それゆえ再循環しなければならないので、コストがかかる。ＡＴＰの再循環は、いくつかの新たに別の酵素段階と補助試薬を含む。

反応の速度や収率に関する制限の他に、文献に記載されている方法では、１−モノグリセリドのような異性的且つ鏡像的に純粋な生成物を製造する問題が未解決のままである。上記の酵素法でグリセリドを製造すると、モノグリセリドとジグリセリド及びトリグリセリドとの混合物が得られる。その生成物混合物からモノグリセリドを単離すると、それらは常にレジオ異性体及び立体異性体の混合物である。モノグリセリドを絶対配置に従い類別すると、以下のようになる。

１−ｓｎ−モノグリセリド＝　（Ｓ）−１−モノグリセリド３−ｓｎ−モノグリセリド＝　（Ｒ）−１−モノグリセリド２−ｓｎ−モノグリセリド−アキラル分類記号「Ｓ叶」は、グリセリドだけに用いられる分類である。上記の従来のモノグリセリドの製造では、一般に、ラセミ体の１−モノグリセリドとアキラルの２−グリセリドとが製造される。このような混合物は、（Ｒ，５）−１−モノグリセリド＋２−モノグリセリドから成ると呼ぶことができる。レジオ異性体の混合物として化学的に純粋なモノグリセリドを得るには精製工程が必要であり、その混合物から退屈なりロフトグラフ法によって各レジオ異性体を分離しなければならない。これらのプロセスは必然的に非常に小さな規模で行われ、また工業生産には実用的ではない。

本発明の要約と目的本発明は、親水性基質と第二の基質との酵素触媒反応による両親媒性生成物の製造方法に関する。本発明によると、親水性基質を特定の酵素を用いて第二の基質中に分散させ、両方の基質の反応性基を酵素の活性部位によって接触させ、そして両親媒性生成物を形成させる。該方法は、親水性基質を十分な固体担体と組み合わせてその親水性基質を実質的に吸着させる工程、並びにその吸着した基質を第二の基質中に、両方の基質に対して親和性があり且つ生成物の生成を触媒する酵素と一緒に分散させる工程を含んで成る。

基質の一方が液体である場合、反応は溶媒を添加することなく進行することができる。どちらの基質も液体でない場合には、該方法には溶媒が必要である。それゆえ、本発明の目的は、食品、ヘルスケア製品及び化粧品の処理に用いるのに適した非極性溶媒または弱極性溶媒に親水性基質を分散させる方法を提供することである。

本発明の目的は、純粋なレジオ異性体の１．３−ジグリセリドの製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、非極性溶媒における親水性炭水化物とカルボン酸誘導体との酵素触媒反応による糖エステルの製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、化学的且つ異性体的に純粋な形態の特定の１−モノグリセリドの製造及び特異的沈澱方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、アミノ酸のエステルの製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、グリコシド部分をポリアルコールへ酵素触媒転移させることによるグリコシドの製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、ペプチド結合の酵素触媒形成によるペプチドの合成方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、アルコール、炭水化物及びヌクレオシドのリン酸エステルの酵素触媒合成方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、シリカゲルのような固体担体表面に吸着したアルコールや炭水化物を含んで成る組成物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、第−及び第二の親水性基質を、どちらも固体担体に吸着して含んで成る組成物を提供することである。このような組成物では、第一の基質は、遊離の第一アミノ基を有するカルボキシル保護アミノ酸またはカルボキシル保護ペプチドであり、また第二の基質は、カルボン酸エステルを有するアミノ保護アミノ酸またはアミノ保護ペプチドである。

好ましい実施態様の詳細な説明本発明の方法では、２種の基質の間の酵素触媒逆加水分解反応が、親水性基質を固体担体に吸着させて、その吸着した親水性基質を特定の酵素と共に第二の基質中に分散させることによって促進される。

親水性基質は、非共育相互作用、おそらくは親水性基質の分極したヒドロキシル基またはアミノ基と固体担体の分極した領域との間の静電引力によって、固体担体に付着する。第二の基質は、酵素と一時的に結合してアシル／酵素中間体を形成するであろう供与性残置基（ｌｅａｖｉｎｇ　ｇｒｏｕｐＸ例、アシル基）を含有する（Ｗｏｎｇ、上記）。アシル／酵素中間体と吸着親水性基質との混合によって、親水性基質のヒドロキシル基またはアミノ基が酵素の活性部位と、また第二の基質からの供与性残置基と接触するようになり、両親媒性化合物を形成する。ペプチド合成に関する別の実施態様では、両方の基質が親水性領域を含有し、しかも両方の基質を一緒に混合してから固体担体表面に吸着する。

定義用語Ｖ親水性基質Ｊは、以下の一般式で示されるヒドロキシル基または第一アミノ基を含有する水溶性化合物をさす。

蓄２はＯＨまたはＮＨ，であってもよい。Ｘ及びＹは、Ｈ、メチル基、アシル基、アリル基、アルキル基、アリール基またはアミノ基であることができる。また、Ｘ及びＹは、ハロゲンや、スルフェート基、ホスフェート基、ニトロ基またはシアノ基でＨを置換したメチル基、アシル基、アリル基、アルキル基及びアリール基であってもよい。親水性化合物の例として、アルカノール、シクロアルカノール、ベンジルアルコール、アリル系アルコール、ジオール、トリオール、ポリオール、糖アルコール、イノシトール、ハロゲン置換アルコール、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、ペプチド、サツカリド、ヒドロキシル基を有する合成及び天然ポリマー、が挙げられる。

用語「供与性残置基を有する第二の基質」は、カルボン酸、エステル、保護または未保護側鎖を有するアミノ酸、ペプチド、タンパク質、リン酸エステル、グリコシド及び実質的に疎水性のアルコール、といった化合物をさす。供与性残置基は、使用する酵素がその酵素活性部位において親和性を示す化学部分であって、第二の基質から脱離することができ、そして第一の基質のヒドロキシル部位またはアミノ部位に共有結合しつる部分である。供与性残置基は、アシル基、アミノ酸残基、ペプチジル基、タンパク質残基、ホスホリル基、グリコシジル残基またはアルコキシド基といった化学部分であることができる。

用語「両親媒性生成物Ｊは、親水性基と疎水性基の両方を有する化合物をさす。

両親媒性化合物の例として、エステル、糖エステル、ペプチド、ペプチドエステル、グリコシド、ヌクレオシド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、ホスフェート及びスルフェートが挙げられる。

用語「エステル」は、ポリオール、炭水化物、アミノ酸またはペプチドと長鎖脂肪酸のようなアシル基供与体との反応生成物をさす。

エステルの親水性部分は、未反応ヒドロキシル基のような分極基であり、また疎水性部分は、例えば出発基質のポリアルコールや炭水化物のヒドロキシル基を置換した長い炭素鎖である。エステルの例として、グリセロールと、遊離カルボン酸、カルボン酸エステル及びカルボン酸ビニルエステルといった炭素鎖供与体との反応生成物である、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドが挙げられる。

用語「グリコシドＪは、少なくとも１個の糖残基を含有する化合物である。グリコシドの例として、オリゴ糖、糖タンパク質、ヌクレオシド及び糖脂質が挙げられる。

用語「酵素」は、逆加水分解反応を促進することができる、表１に記載したものから選ばれたタンパク質触媒をさす。本発明を実施する上で有用な酵素のさらに別の例が以下の文献に記載されている。

Ｂａｒｍａｎ、　Ｔ、Ｅ、、　Ｅｎｚｙｍｅ　）（ａｎｄｂｏｏｋ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、　Ｖｏｌ　Ｉｆｐｐ、　６０２−６４９．１９８５　；　Ｓｉｇ＋ｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）カタログ、ｐ９．８６３−８６９．１９９１゜所望の反応生成物に適した酵素を、親水性基質と第：ｌの基質の両方６４、対す、２：ｌ親和性μび比活性ζ ン二、）いｔ−選択グる１゜適当な酵素は、残ｆｔ基の１７９才特異的位置及び固有特性、例スばトリグリセリドの１位、２位または３忙、頌長、飽和度に従・えて第ニー。

の基質の１個以上の供与性残戸基を認識する１、また、適当な酵素は１、親水性の第一のＭ質の１−・ドロキシル基やアミノ基に対１．２〔、数基の周囲の化学部分の局部電荷及びづ法に基づいて、親和性及び反応性を示す。酵素は、微生物源から、また植物や動物の細胞や組織から得る。Ｔとができる。酵素は、精製してもよいし、また数種の酵素を含む比較的不純な粗混合物に含まれていてもよい。酵素の調製は、凍結乾燥粉末のようないずれの形態にあっても１、また固体担体に共有結合あるいは吸着させてもよい。

表１：逆加水分解反応を触媒する酵素番号及び分類は国際生化学連合（ＩＵＢ）の慣例に従う２．３アシルトランスフエラ・−ゼ２、３．１アシルトランスフエラーゼ２、３．２アミノアシルトランスフエラーゼ２．４グリコジルトランスフエラーゼ２、４．１へキソシルトランスフェラーゼ２、４．２ベントジルトランスフエラーゼ２．７転移性リン含有群２、７．１アルコール基を受容体として有するホスホトランスフェラーゼ２．７．２カルボキシル基を受容体として有するホスホトランスフェラーゼ２、”７．３窒素性基を受容体どして有するホスホトランスフェラーゼ＞）。７４４ホスホ基を受容体として有するホスホトランスフェラーゼ２、７．５ホスホトランスフエラーゼ、明らかに分子内２、７．６ビロホスホトランスフＪラーゼ３、ヒドロラーゼ３．１エステル結合に作用３、１．１カルボン酸エステルヒドロラーゼ３１．１．２チオールエステルヒドロラーゼ３．１．３リン酸モノエステルヒドロラーゼ３．１．４リン酸ジエステルヒドロラーゼ３．１．５）リリン酸モノエステルヒドロラーゼ３．１．６硫酸エステルヒドロラーゼ３□２グリコジル化合物に作用３゜２．１　グリコシドヒドロラーゼ３、２．２加水分解性Ｎ−グリコジル化合物３、２．３加水分解性Ｓ−グリコジル化合物３．３工−テル結合に作用３、３．１チオエーテルヒドロラーゼ３゜４ペプチド結合に作用（ペプチドヒドロラーゼ）３．４゜１α−アミノ−アシル−ペプチドヒドロラーゼ３、４．２ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ３゜４．３ジペプチドヒドロラーゼ３、４．４ベブチジルーベブチドヒドロラーゼ３．５ペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用３、５．１線状アミド内３、５．２環状アミド内３、５．３線状アミジン内３、５．４環状アミジン内３、５．５シアニド内３、５−９９その他の化合物内３．６酸無水物結合に作用３．６．１ホスホリル含有無水物４、リアーゼ４．１炭素−炭素リアーゼ４、１．１カルボキシ−リアーゼ４．１．２アルデヒド−リアーゼ４．１．３ケト酸−リアーゼ４．２炭素−酸素リアーゼ４、２．１　ヒドロ−リアーゼ４、２．９９その他の炭素−酸素リアーゼ４．３炭素−窒素リアーゼ４、３．１アンモニア−リアーゼ４、３．２アミジン−リアーゼ４．４炭素−硫黄リアーゼ４．５炭素−ハロゲン化物リアーゼ４．９９その他のリアーゼ用語「固体担体」は、体積に対して大きな表面積を有する微細材料であって、親水性化合物を吸着することができるものをさす。担体材料は、使用する基質化学物質とは反応性が無く、また溶媒を使用した場合にはその溶媒には不溶性である。親水性材料を吸着することができる固体担体の例として、シリカゲル、珪藻土、粘土、ゼオライト、活性炭、カルボキシメチルセルロース及びセルロースエステルのようなその他の置換セルロース類、中性及び塩基性イオン交換樹脂、多孔質ガラスピーズ、並びに中性または塩基性アルミニウムオキシドが挙げられる。

固体担体表面へ吸着させることで、親水性基質を疎水性基質中での混合によって分散できるようになる。

別法として、固体担体を固定カラム中に押し込み、その表面に親水性基質を吸着させ、そしてその中に疎水性基質を循環させることもできる。固体担体は、酵素／基質界面相のミクロ環境内での親水性基質と反応性基との接触を改善する原理の基本を提供する。

用語「極性溶媒」は、分子のある領域の電気陰性度が同一分子の別の領域よりも高い液体化合物をさす。一般に、親水性化合物は極性溶媒に可溶性である。極性の非常に高い溶媒、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミドまたはピリジンは、毒性があり、除去及び／または再循環しにくいため、エステル化に使用するには不適当な場合がよくある。残留する濃縮物は、合成した製品を食品、化粧品及びヘルスケア用途にとって不適当なものにしてしまう恐れがある。

用語「非極性溶媒」は、正電荷中心と負電荷中心とが本質的に一致するか、あるいは互いに相殺し合うために双極子モーメントが生じない液体化合物をさす。本出願明細書では、用語「非極性溶媒Ｊは、正電荷中心と負電荷中心とが実質的に一致しており、その結果はんのわずかな双極子モーメントしか生じないような液体化合物、すなわち微極性溶媒、をも包含する。一般則として、疎水性化合物は非極性溶媒に可溶性であり、一方で親水性化合物はそれらには不溶性である。非極性有機溶媒の例として、簡単な脂肪族炭化水素類（叶へキサン）及び芳香族炭化水素（トルエン）が挙げられる。微極性有機溶媒の例として、エーテル類、ケトン類及びエステル類が挙げられる。その他の微極性溶媒の例として、塩素化炭化水素類（塩化メチレン）、環状エーテル類（テトラヒドロフラン）、立体障害されたアルコール類（ｔ−ブチルメチルエーテル）及びアセトニトリルが挙げられる。非極性溶媒が極性の非常に高い溶媒よりも有利な点は、非極性溶媒または微極性溶媒は従来手段によって完全に除去できるので、食品、薬品及び化粧品の調製に用いるのに適しているという点である。上記の非極性溶媒及び微極性溶媒は、ある種の極性の高い溶媒のようにリパーゼを不活化することがない。

本発明の方法によると、以下の材料を混合することによって、エステルを迅速且つ便利に調製することができる。

−親水性基質 −親水性基質を吸着させるに十分量の固体担体−供与性残置基を有する第二の基質 −酵素触媒 −特別な反応に必要または所望である場合、非極性溶媒または微極性溶媒第−の基質をグリセロールとし、また第二の基質を遊離カルボン酸（脂肪酸）として、逆加水分解時に両親媒性エステル生成物と水とを生せしめることが適当である。また、第二の基質をメチルエステルまたはアルキルエステルとして、逆加水分解時に両親媒性エステル生成物とアルコールとを生じさせてもよい。これらの種類の反応は「可逆的」と呼ばれるが、それは、その生成物が、水またはアルコールを蓄積させた場合にその逆反応（所望のエステル生成物の加水分解）に参加しつるからである。本発明は、副産物の除去を伴っても伴わなくても利用できる。水またはアルコールを生成物混合物から除去しない場合には、反応は平衡状態に達し、逆加水分解またはアルコーリシスによって、ある特定量の所望のエステル生成物を生じる。しかしながら、好ましくは、逆加水分解を継続させるため、モレキュラーシーブや無水硫酸ナトリウムといった乾燥剤を導入することによって、水またはアルコールを反応混合物から除去する。別法として、水またはアルコールが選択的に蒸留されるように溶媒混合物を実験的に決定しておく共沸蒸留法によって、水またはアルコールを除去してもよい。

また、本発明の方法は、水やアルコールがまったく生じない「不可逆的」反応にも利用される。ビニルカルボン酸エステルやイソプロペニルエステルのような第二の基質と、グリセロールのような第一の基質とを反応させて、所望のエステル生成物とアセトアルデヒドまたはアセトンとを生成させることが適当である。この種の反応は「不可逆的」と呼ばれるが、その理由は、生成物のアセトアルデヒドまたはアセトンが加水分解反応に参加できないからである。こうして、反応は、副産物を除去しなくても所望の逆加水分解の方向へ進行する。

上記の例のどちらにおいても、第二の基質の「供与性残置基」は鎖状の炭素原子である。本発明によると、供与性残置基を有する第二の基質と、固体担体に吸着させた親水性基質とを、低含水媒体中で適当な酵素と共に混合する。その混合物を、高収量の両親媒性生成物を生せしめるに十分な温度及び時間で攪はんする。

用いる固体担体の量は親水性基質の量に比例する。親水性基質がアルコールまたは炭水化物である場合には、固体担体対基質の比率は、好ましくは約０．３：１．０〜約１０．０：１．０の範囲にあり、より好ましくは５．０：１．０、最も好ましくは１．０　：　１．０　（ｇ　：　ｇ）である。ペプチド合成に関連する方法では、第−及び第二の両方の基質が親水性であり、どちらの基質も固体担体に吸着する。この場合、固体担体対混合基質の比率は、好ましくは約０．６：１．０〜約１０．０：１．０の範囲にあり、より好ましくは５．０：１．０、最も好ましくは１．０　：　１．０　（ｇ　：　ｇ）である。

固体担体対親水性基質の比率は、親水性基質の少なくとも約１０％が、より好ましくは約５０％が、最も好ましくは約１００％が固体担体に確実に吸着するよう選定される。このように、本発明の方法は、用いられる固体担体の量が、用いられる触媒量の酵素を吸着せしめるに十分なだけしかない従来の方法とは違う。例えば、５ｃｈｕｃｈら（上記）は、わずか５％（Ｗ／Ｗ）の固定化酵素調製物を添加することを報告している。こうして、酵素が固定化されている担体の全量が親水性化合物の吸着に利用できたと仮定しても、５ｃｈｕｃｈの方法では担体対親水性化合物の比率が１：２０を超えることはなかった。

本発明の一つの実施態様では、親水性基質を固体担体と機械的に混合してから、第二の基質及び生触媒と混合することができる。第二の別法では、親水性基質を最少量のメタノールのような極性溶媒に溶解し、そして固体担体と混合することができる。次いで、固体担体に吸着した親水性基質を濾過や蒸発によって極性溶媒から単離した後、第二の基質及び生触媒と混合する。第三の別法では、親水性基質を固体担体及び酵素と機械的に混合してスラリーを形成させた後、それをカラムに充填し、その中に第二の基質を循環させる。

本発明の方法は、任意の混合順序で実施することができる。こうして、上記のように親水性基質を固体担体に予め吸着させておくことができる。別法として、親水性基質と、第二の基質と、また必要であれば非極性溶媒とを予め混合して乳濁液を形成させた後、固体担体と酵素を添加してもよい。

適当な酵素は、所望の反応により、表１に記載した群から選ばれる。酵素調製は、凍結乾燥粉末の状態で自由であっても、親水性基質と同じまたは異なる種類の担体に予め吸着させておいても、また担体に共有結合させてもよい。

酵素は、微生物、例えばＭｕｃｏｒ　ｍ１ｈｅｉ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｌＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ及びＰｅｎｆｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍが合成するリパーゼ群の中から選択することが適当である。リパーゼは、水の存在において、脂肪の加水分解を触媒する酵素である。低含水環境では、ある種のリパーゼはその逆反応、逆加水分解、を触媒してエステル生成物を生ぜしめる。個々のリパーゼは、親水性基質及び疎水性基質のレジオ異性体や鏡像異性体に対して選択的な活性を育する。例えば、Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｈｅｉ由来の１，３−特異的リパーゼは、グリセロールの１位と３位においてのみ形成されるエステルの生成を促進することができる。代わりに、トリグリセリドを得るために特異性の低いリパーゼやリパーゼ混合物を使用してもよい。酵素が、供与性アシル基の位置、鎖長及び飽和度に対して必要な基質特異性または寛容性を示すならば、いずれのリパーゼを使用してもよい。酵素の選択性は種類によって異なり、またどの種類の生成物が形成されるかを決める。ある種のリパーゼは、アミノ酸またはペプチドのエステル化を触媒できる。特定のリパーゼの活性は、Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ、　Ｂ、及びＢｒｏｃｋｍａｎ。

Ｈ，Ｌ、　！ｉの文献（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４））の記載から予想することができる。グリコシダーゼとして知られている酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼは、グリコジル化化合物からグリコジル基をポリアルコールへ転移させる反応を触媒することができる。

反応の物理的条件、例えば温度、攪はん及び圧力は、所望の速度やエネルギー人力に従って調整することができる。使用温度は、約−４８°Ｃ〜約１００°Ｃの間が適当であり、また反応は、典型的には、約３時間〜約３日間行われる。下限温度は、溶媒または混合物の凝固点によって決まる。例えば、ヘキサンの凝固点は約−ｓｏ”ｃであるので、ヘキサンを用いる本発明の方法は、必然的に−５０ ”Ｃよりも高い温度で行オ）れる。最適な温度や時間は、以下の実施例で説明するように、特定の反応や選定した酵素に依存する。工業生産には、エネルギーの節約や、反応容器を長期間放置しておくことが望ましい場合があるので、最適条件未満の条件下で反応を行うことが望ましい５−ともありうる。こうして、本発明の方法は、便利で迅速な酵素逆加水分解を促進し、商業的に有用な両穀媒性製品を高収率で製造する。

反応の進行は、従来手段、例えばクロマトグラフィー（薄層、ガス、高速液体、等）によって測定する。

基質が生成物へ完全に、あるいは所望のとおりに転化した後は、簡単な濾過や遠心分離のような従来手段によって固体担体と酵素を除去する。反応生成物は、蒸発といった従来手段により有機溶媒を除去することで、高い化学純度で単離される。

本発明の別の実施態様では、１−モノ−グリセリドを選択的に製造し沈澱させる。■−モノグリセリドは、グリセロールと遊離カルボン酸またはアルキルエステルもしくはビニルエステルとを直接エステル化して製造することが適当である（第５Ａ図）。別法として、トリグリセリドのアルコーリシス由来のカルボン酸残基とグリセロールとのエステル化によって１−モノグリセリドを製造してもよい。該アルコーリシスは、特定の酵素によって触媒され、またエステル化反応に付随して起こる（第５Ｂ図）。

本発明の実施態様を行うのに適した装置を第６図に記載する。この実施態様の中心は、冷却時に、所望の１−モノグリセリド製品の選択的沈澱を促進する溶媒または溶媒混合物である。この実施態様では、親水性の第一の基質はグリセロールであって、固体担体表面に吸着されていてもよい。グリセロールを、反応容器１の中で、特定の酵素、アシル供与体及び特定の溶媒と混合する。その混合物を、反応容器１の中で、約−４８℃〜約１００°Ｃの温度で攪はんする。反応器の温度を、用いる酵素に従い、所望の１−モノグリセリドと副産物を製造せしめる酵素エステル化活性を可能にするよう選定する。該混合物を、フィルターディスク２を通して引き抜き、モしてポンプ４によってコネクター３を通して、１−モノグリセリドの選択沈澱を促進する温度に冷却しである分離Ｈ５へ移送する。採用条件下では、２−モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドを含むその他のすべての生成物及び未反応基質は可溶性であって、循環溶液＋４月こ残存する。それらを別のフィルターディスク６を通して引き抜き、そして戻りコネクター１４を通して反応器１へ移送し、再度グリセロールのエステル化のためのアシル供与体として使用することができる。選択沈澱に最適な溶媒混合物及び最適温度を選定することによって、化学的及び異性体的に純粋な１−モノグリセリドを、さらなる精製工程を何ら実施することなく、非常に高い収率で得ることができる。

アシル供与体が、遊離カルボン酸またはメチルエステルもしくはアルキルエステルである場合（第５Ａ図、Ｒ’＝Ｈ，メチル、アルキル）、水またはアルコールが反応の副産物となる。反応は可逆的であり、また生成物を除去しないならば平衡状態に達する。第７図は、本発明の実施において、水またはアルコールの副産物を除去する装置を例示するものである。適当な孔径をもつモレキュラーシーブ７をコネクター８の中に導入して水またはアルコールを除去することで、所望のエステル化方向の反応（逆加水分解）を促進する。

水は孔径３オングストロームのモレキュラーシーブで、またメタノールは孔径４オングストロームのモレキュラーシーブで除去するのが適当である。第７図中のその他の構成成分は、第６図中のものとすべて等価である。すなわち、反応器９、フィルターディスク１０、ポンプ１１、分離器１２、フィルターディスク１３、戻りコネクター１６である。

グリセロールと対応するアシル供与体とのモル比率が変わると、反応混合物においてモノグリセリドとジグリセリドの一定でない混合物が生じうる。所望のモノグリセリドの収率を最高にするには、化学量論的に適当なグリセロール対アシル供与体のモル比（例、グリセロール１モル：供与性アシル基１モル）を採用する。経済的に望ましい場合には、一方の基質をモル過剰量で使用してもよい。

特定の溶媒中で安定であり、しかも用いるアシル供与体に対して活性であるいずれのリパーゼを使用してもよい。遊離脂肪酸またはそのエステルがアシル供与体である場合、アシル基の炭素鎖特性、すなわち鎖長や飽和度に特異性を有するリパーゼを選択する。例えば、Ａ、　ｎｉｇｅｒやＧ、　ｃａｒ＋ｄｉｄｕｍ由来のリパーゼは、ラウリン酸またはラウリン酸エステルに対しては本質的に不活性である（第３図を参照のこと）。ラウリン酸エステルをアシル供与体に選ぶ場合には、リパーゼはＭ、　ｍ１ｈｅｉ、　Ｒ，ｄｅｌｅｍａｒまたはＰ、　ｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｓから選ぶのが適当である。これらはすべてラウリン酸エステルに対して活性である。

ジグリセリドやトリグリセリドをアシル供与体として使用する場合には、リパーゼのレジオ特異性を考慮する。例えば、Ｍ、　ｍ１ｈｅｉ由来のリパーゼは、ジグリセリドまたはトリグリセリドの１位や３位のアシル基に対して特異的な活性を示し、２位のアシル基は未反応のまま残存させる。アシル供与体を効率的且つ定量的に消費させるには、グリセリドの２位にも活性を示すリパーゼを使用する方が好ましい。例として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種やＰｅｎｉｅｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ由来のリパーゼが挙げられる。

各々の所望のモノグリセリド製品について、反応及び沈澱の最適溶媒混合物や最適温度を実験的に決める。所望の製品が１−モノグリセリドである場合、溶媒はｔ−ＢｕＯＭｅとｎ−ヘキサンとの比率的１：１００〜約１＝１０、好ましくは１：１（体積二体積）、の混合物であることが適している。代わりに、適当なアシル供与体を使用する場合、溶媒を１００％ｎ−へキサンとしてもよい。溶媒組成は、所望の製品に完全に依存する。ｌ−モノグリセリドの製造では、反応容器内の温度は約−４８℃〜１００°Ｃ１より好ましくは２０°Ｃ〜６０℃、最も好ましくは２５℃〜３５°Ｃである。１−モノグリセリドの特異的沈澱では、分離器内の温度は約−４９°Ｃ〜１５°Ｃ１より好ましくは約−１０℃〜１０℃、最も好ましくは２℃である。

本発明のさらなる実施態様は、ペプチドまたはアミノ酸とビニルエステルとのリパーゼ触媒反応によるペプチドエステルの製造方法を提供する。アミノ酸のアルファーアミノ基は、共有結合させたＺ基（Ｚ＝カルボベンジルオキシ）によって保護されていることが適当である。アミノ酸またはペプチドを固体担体に吸着させ、そしてビニルカルボン酸のようなアシル基の供与源と反応させる。リパーゼの触媒作用によって、アミノ酸またはペプチドのヒドロキシル残基にカルボン酸残基が共有結合して、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルが形成される。

本発明のさらなる実施態様は、オリゴ糖、糖タンパク質及び糖脂質のようなグリコシドの酵素的製造方法を提供する。グリコジル部分を含有する親水性の第一の基質を固体担体に吸着させ、そしてポリアルコールのような第二の基質及びβ− ガラクトシダーゼのようなグリコシダーゼと混合することが適当である。酵素は、第一の基質からグリコジル部分を第二の基質のヒドロキシル基へ転移することを触媒して、所望のグリコシド製品を形成させる。

本発明のさらなる実施態様は、ペプチドの酵素的合成方法を提供する。これらの反応における親水性の第一の基質は、遊離の第一アミノ基を有するカルボキシル保護アミノ酸またはペプチドである。

用語「カルボキシル保護」は、各カルボキシル基がｔｅｒｔ−アミルエステル、ベンジルエステルまたはアルキルエステルといった基に共有結合されており、カルボキシル基が反応に参加できないようにされているアミノ酸またはペプチドをさす。用語「遊離第一アミノ基」は、Ｒ−ＮＨ＊のような未置換アミンをさし、またＲは、炭素−窒素結合によってアミンに結合している有機残基をさす。

ペプチド合成の実施態様では、少なくとも１個のカルボン酸エステルを有するアミノ保護アミノ酸またはアミノ保護ペプチドである。

用語「アミノ保護」は、各アミノ基がアセチル、アミド、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルまたはトリフルオロアセチル基といった保護基に共有結合されており、アミノ基が反応に参加できないようにされているアミノ酸またはペプチドをさす。第一の基質と第二の基質とを一緒に極性溶媒に溶解し、シリカゲルのような固体担体を混合し、そして両方の基質を固体担体に吸着させる。次いで、極性溶媒を減圧下で除去する。その後、混合されている第−及び第二の基質と固体担体とを、ｎ−へキサンのような非極性溶媒及びアルファーキモトリプシンのようなペプチダーゼと混合する。酵素がカルボン酸エステルのアミツリシスを触媒してペプチド結合を形成させ、所望のペプチド製品を生せしめる。

本発明のさらなる実施態様は、グリセロールホスフェートの合成方法を提供する。グリセロールのような親水性基質をシリカゲルのような固体担体に吸着させ、モしてｔ−ブチルメチルエーテルのような非極性溶媒を混合する。この混合物に、ホスフェート供与体、例えばアルコールやフェノールのリン酸エステル、またはカルボン酸−リン酸混合無水物を添加する。反応を、ポテト由来の酸性ホスファターゼのようなホスファターゼによって触媒する。ホスファターゼは、ホスホリル部分をグリセロールの第一アルコール官能部へ転移することを触媒して、グリセロールホスフェートを形成させる。

また、この方法は、その他のアルコール、糖及びヌクレオシドのホスフェートの酵素的触媒合成にも応用できる。使用できるホスフェート基供与体の例として、ｎ−ブチルホスフェート、メトキシカルボニルホスフェート及びビニルホスフェートが挙げられる。使用できるその他の親水性基質の例として、ジヒドロキシアセトン、グルコース及びチミジンが挙げられる。酵素触媒は、例えばＥ、　ｃｏｌｉ由来のアルカリ性ホスファターゼであってもよい。このような反応は、例えば、それぞれジヒドロキシアセトン−１−ホスフェート、Ｄ−グルコース−６− ホスフェートまたはチミジン−５−ホスフェートを生成することができる。

本発明のさらなる実施態様は、固体担体に吸着した親水性基質の組成物を提供する。吸着基質がアルコールまたは炭水化物である場合には、基質対固体担体の比率は、好ましくは約１．０：０．３〜約１，０：１０．０の範囲にあり、より好ましくはｆ、０：５．０、最も好ましくは１．０＝１、ＯＣＲ：ｇ”）である。

また、該組成物は、ペプチド合成に用いた組成物のように、固体担体に吸着した２種の基質を含んで成ることもできる。この場合、混合基質対固体担体の比率は、好ましくは約１．０二〇、６〜約１．０　：　１０．０の範囲にあり、より好ましくは１．０：５．０、最も好ましくは１０　：　１．０　（ｇａｇ）である。

組成物において、親水性基質は、シリカゲルのような微粉状固体担体の表面で分子の薄い層として分散して、基質の大きな露出表面積を提供する。固体担体に２種の基質を吸着して有する組成物では、同様に基質は担体の表面に薄い分子層として分散している。この分散によって、吸着した基質が親水性担体から急速に２次元拡散して親油性界面を通って酵素活性部位に到達できると仮定される。好ましくは、固体担体の表面は、酵素に対して最大数の反応性分子を提供することで反応を促進するために、親水性基質で完全に飽和されている。高分子レベルで見ると、固体担体に吸着した１種または２種の親水性基質を含んで成る新規組成物は、さらさらした粉末の形態をとる。

ある特定の組成物における基質対固体担体の実際の比率は、有機化学技術分野でよく知られている方法によって測定することができる。例えば、組成物を８００ ℃で数時間加熱して、その損失重量を対照（基質を含まない固体担体）と比較して測定することができる。

以下の実施例は、本発明の特別な実施態様を例示する。

実施例１本実施例は、各種の固体担体の効能を例示するものである。１グラムのグリセロールとＩｇｍのシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ社、２３０〜４００メツシユ）または別の固体担体（表２を参照のこと）とを、均質でさらさらした粉末が得られるまで機械的に混合した。次いで、固体担体に吸着したグリセロールと、０．４ｇｍのアシル供与体としてのビニルラウレートと、Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｈｅｉ由来リパーゼの固定化調製物（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ１Ｎｏｖａ社）とを、１０　ｍｌのｔ−ブチルメチルエーテル（ｔ−ＢｕＯＭｅ）中で混合した。対照として、同じ量及び同じ種類の基質と、生触媒と、溶媒とを、固体担体を加えずに混合した。その混合物を、周囲圧下、２５℃で、表示の日数（表２を参照のこと）攪はんした。酵素を濾過で除去し、そして有機溶媒を蒸発させることによって生成物を有機相から回収した。生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で定性分析した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で定量分析した。

対照混合物（すなわち、グリセロールを吸着させる固体担体を含まない）は二相のままであり、また酵素はその界面で沈澱し、回収が不可能であるゲルをもたらした。こうして、担体を加えなかった対照混合物では、７日後にも転化がまったく観測されなかった。

結果は、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドへ転化したビニルラウレートのパーセントで表示した（表２）。生成物の組成は、生触媒のレジオ選択性の結果であり、この場合、Ｍｕｃｏｒｍｉｈｅｉ由来のリパーゼは、グリセロールの１位と３位のヒドロキシル基に対して比較的選択性があったので、モノグリセリドとジグリセリド生成物が優勢となった。

表２に示したように、最も効率的な担体はシリカゲル（Ａｅｒｏｓｉｌ）、Ｆｌｏｒｉｓｉｌ及び活性炭であった。しかしながら、記載の担体はどれも潜在的に有用である。

表２１種々の担体表面でのグリセロールの酵素的エステル化表２゜（続き）種々の担体表面でのグリセロールの酵素的エステル化種々の溶媒がグリセロ・− ルの生成物−、、の転化速度に与える効果４−測定するため、固体担体どしてシリカゲルを用い、また表２に記載した溶媒を用いで、実施例１の実験手順を繰り返した。

反応は２５℃で２４時間行い、その後、舜施例１と同様にビニルーテウレ−）の生成物へのモル％転化率を測定ｌ、７た。活性は、モル％転化率を時間’Ｈ割って算出し、た。ｎ−ヘキサン（二よる反応速度を１ｏｏ９６とした相対活性どして、表３に結果を記載しｆ−，４ｇ表３に示したようｇ：＝、この反応に１！様々な溶媒か適しこ′い／、＝Ｑその高い相対活性によって、ローヘキサン、トルエンまたはｔ−ＢｕＯＭｅは寥くの種類の反応ζ、二選択できる溶媒である。アシル供与体がトヘーｒす゛〉・、ｌ・ルエンまたはｔ−ＢｕＯＭｅに不溶性である（またはほとんど溶けない）場合は、記載したぞの仙の溶媒が有ＪｆＪである場合もあろう表３、有機溶媒中のゴスチル４にこれらの実験は、本発明の方法によるニスデル化反応を触媒するのにどの種類のリパーゼ調製物が十分であるかを決めるために設計したものである。

実施例３Ａ：グリセロ−・ル（０，９２ｇ、１０　ｍｍｏｌ）と１゜ＯｇのＳｉｌｉｏａｇｅｌ（Ｍｅｒｅｋ　２３０〜４００７メツシユ）とを、グリセロール液が完全に吸着するまで機械的に混合した。そのさらさらした乾燥粉末と１０ｇのｔ−ＢｕＯＭｅ及び５．４２ｇ　（２４ｍｍｏｌ）のビニルラウレート（モル過剰ｌ）とを混合し、その混合物に１５０　ｍｇのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の粗すパーゼＣＡｍａｎｏ円＋ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ１社、１〕本１名古屋）または３２４町のＬｉｐｏｚｙｍｅのいずれかを添加した。

ＬｉＤｏｚｙｎ＋ｃによっ′″Ｃ−Ｃ−触媒反応は、３時間後にはほぼ完了した。。

１．１ｐｏｚｙＩｉ１ｅ反応から得られた生、成、物をＴＩ、Ｃで分析した。固体成５〕！そ濾過で除：Ｊ５、した後。溶媒を蒸発さ七゛１：いる除に４．９　ｇ（１００％）の粗１．３−ジラウリンが結晶析出し、た。ｎ−ペンタンから再結晶化し、４．６　ｇ（９５％）の純粋なｉ、ａ−ジジ・ウリン（白色結晶、ｍｐ、　５７°（シ）を得た。収率９６は、グリセロールの生成物へ、のモル転化率に基づいで算出した。

Ｐ、　ｆｌｕｒ＋ｒｅｓｃｅｎｓからの反応混合物は、３０時間後に濾過し、そのフィルターを２０　ｍｌｃＤｔ−ＢｕＯＭｅで２回洗浄（２、そして溶媒を減圧−下（「７トベークー）で除去した。得ら４また粗生成物混合物（４，７ｇ、　９（７％）を５ｉｎｓのＬＣで分離し、０．５　ｍｍ＋１ｌ（５％）のトリラウリンと、８．５４　ｍｍｏｌ（８５％）の１，３−ジラウリンと、１．１　ｍｍｏｌ（１１％）のモノラウリンとを得た。

収率％は、グリ（？ｌｌツールのム、６成物・＼、のモル転化率に基づいて算出し４た。

実施例３Ｂ：用いた特定の酵素に対する」−ステル化反応の時間依存性を測定す゛るため、実施例１に記載の同じ条件（モル過剰量のグリセロール）を採用し、但し次の酵素調製物を使用して以下の実験を実施Ｉ７、た：Ｒ１１１ＺＯｐＬＩＳ　ｄｅｌｅｍａｒ、　Ｃａｎｄｔｒｌａ　ｅｙｉｘｎｄｒａＣｅａＩＰｅｎｌＣｔｌｌｌｌＪＩｌｌ　ｅｙｅｌｏｐｘ盾■ （Ａｍａｒ＋ｏ　ＰｈａｒｍａｅｅｕｔｉｃａＲ社、日本、名古屋）Ｑその混合物を室温で７５Ｏｒｐｍで攪はんし、そして第１図ｒ表示した時間に試料を採取して分析（ＴＬＣ，ＥｔＪ：ｎ−ヘキサン”１：１、■！−展開、ＧＣ確認）した。

Ｒ，ｄｅｌ、ｅｍａｒ由来のリパーゼによって触媒した反応は４５時間後までに本質的に完了し、出発のビニルラウｌ、　−１−がほんの微量だけ残存した。Ｐ、　ｃｙｅｌｏｐｉｕｍ及びＣ，ｃｙｌｉｎｄｒａｅｅａ由来のリパーゼ調製物は、多少効率が低く、反応は１００時間後に約８０％〜９０％完結した。

実施例４この実験は、本発明の方法が工業用途に向けてスケールアップできるかどうかを試験するために設計したものである。

グリセロール（４６ｇ、　０．５　ｍｏｌ）を４６　ｇのシリカゲルに機械的に吸着させ、そして２２６ｇのビニルラウレートを添加しておいた１リツトルのｔ −ＢｕＯＭｅ中に懸濁させた。１．０ｇのＬｙｐｏｚｙｍｅを添加した後、その混合物を室温で４８時間攪はんした。固体成分を濾過で除去し、溶媒を蒸発させた後、２２６ｇの粗グリセリド（ｌ、３−ジラウリン８５％）が得られた。そのグリセリドをｎ−へキサンに溶解し、そしてその溶液を３００ｇのシリカゲル上で濾過した。得られた溶液を一３０℃に冷却すると、１６０　ｇ（７０％）の１．３−ジラウリンが得られ、残りの生成物を母液から回収した。ｎ−へキサンから再結晶化することによって、異性体的に純粋な形態の１，３−ジラウリンが得られた（上記の実施例１を参照のこと）。

実施例５この実施例は、各種のビニルエステルからグリセリドを調製する方法を例示するものである。

グリセロール（１０ｍｍｏｌ）を１　ｇｍのシリカゲルに吸着させた後、１０　ｍｌのｔ−ＢｕＯＭｅに懸濁させた。２０　ｍｍｏｌの量のビニルエステル（ビニルバレレート、カブリレート、ラウレートまたはパルミテート）を添加し、その後５０　ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅを添加した。その混合物を室温で２４時間攪はんした。酵素とシリカゲルを除去した後、溶媒を蒸発させると粗生成物が得られた。その粗生成物をｎ−へキサンに溶解し、シリカゲル上で濾過し、そして− ３０℃に冷却した。得られた混合物は純度〉９５％の１，３−グリセリドを８５〜９０％含有した。

実施例にの実験は、グリセロールと脂肪酸との直接エステル化の際に反応混合物から水を除去するためにモレキュラーシーブを導入する効果を試験するために設計したものである。

１　ｇｍのシリカゲルに予め吸着しておいた１０　ｍａ＋ｏｌのグリセロールとカルボン酸［カプリル酸、Ｃ８；ラウリン酸、Ｃ０，；パルミチン酸、Ｃｐｓ；各々２０　ｍｍａｌｌとを２０　ａｌｌのｔ−ＢｕＯＭｅ中に懸濁させた。５０ｍｇのＭｕｃｏｒ　ｍ１ｈｅｉ由来の固定化リパーゼと３ｇの３オングストロームのモレキュラーシーブとを添加した後、その混合物を室温で４８時間攬はんした。すべての固形分を濾過で除去した後、有機相をＮａＨＣＯ。

溶液で洗浄して微量の脂肪酸を除去した。実施例３に記載した分離工程後、１．３−ジグリセリドが６５〜８５％の収率で典型的に得られた。

実施例７この実験は、エチレングリコールのエステル化を例示するために設計したものである。

エチレングリコール（０，６２１ｇ、　１０　ｍｍｏｌ）とＩｇのシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ　２３０〜４００メツシユ）とを、液体が完全に吸着するまで機械的に混合した。そのさらさらな乾燥粉末と１２ｇのｔ−ＢｕＯＭｅ及び４．７５ｇ（２１ｍｍｏｌ）のビニルラウレートとを混合し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、由来の粗リパーゼ１５０　ｍｇを添加した。その混合物を室温で７５０　ｒｐｍで８時間攬はんした後、反応は完結した。ＴＬＣ分析は、出発物質をまったく示さず、すなわち、基質の定量的な転化が達成された。エチレングリコールジラウレートが４．０　ｇｏ＋（９１％）単離された。

実施例８この実施例は、ポリエステルの製造を例示する。

１ｇのＳｔｏｗ　（シリカゲル）の表面に吸着させたエチレングリコール（０，６２１ｇ、　１０　ｍｍｏｌ）を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の粗リパーゼ１５０　ｍｇの存在下、１０ｇのｔ−ＢｕＯＭｅ中で２．０　ｇ（１０，０９ｍｍｏｌ）のジビニルアジペートと反応させた。８日後、その混合物を分析したところ、ポリエステルの混合物を含有していることがわかった。

実施例９この実験は、親水性基質の吸着を調製する方法に対する反応速度の依存性を評価するために設計した。吸着％は、シリカゲル／グリセロール複合体のサンプルを集め、そして（ａ）水洗によってシリカゲルからグリセロールを抽出して従来のクロマトグラフ法または酵素法によってグリセロールを定量するか、あるいは別法として、室温、減圧下で乾燥して重量増加を測定することによって決定した。

調製１．１゜上記の実施例に記載したように、グリセロールと等量のシリカゲル（２３０〜４００メツシユ、Ｍｅｒｃｋ）とを、均質なさらさらの粉末が得られるまで機械的に混合した。

調製１．２゜グリセロールを最少量（１ｇ／１０　ｍｌ）のメタノール（ＭｅＯＨ）に溶解し、それに等量のシリカゲルを加えた。２時間攪はん後、シリカゲルを濾過で単離し、そしてフィルターケークを空気中で乾燥した。この調製では、最初のグリセロール量の約７０％だけがシリカゲル表面に吸着した。

調製１．３゜グリセロールを最少量（１ｇ／１００１１）のアセトニトリルと混合して、シリカゲルに吸着させた。上記の調製１．２にあるように、シリカゲルを単離した。

最初のグリセロール量の約６５％だけがシリカゲル表面に吸着したままであった。

調製１．４゜上記の調製１．２にあるように、グリセロールをＭｅＯＨと混合してシリカゲル表面に吸着させた。ＭｅＯＨは、減圧下のロタペーパーで懸濁液から除去した。

調製１．５゜この調製は、調製１．４と同様であるが、但しＭｅＯＨＯ代わりにアセトニトリルを使用した。

次いで、すべてのグリセロール調製物を、５０　ａ＋ｇのＭｕｃｏｒ　ｍ１ｈｅｉ由来リパーゼの固定化調製物（Ｌｉｐｏｚｙａ＋ｅ、　Ｎｏｖｏ）を生触媒として、また２、０ｇのビニルラウレートをアシル供与体として用い、０．５ｇのシリカゲルに吸着したグリセロールを含む８．００１１のｔ−ＢｕＯＭｅ中でエステル化した。反応を、ビニルラウレートの消費量によりモニターした（第２図）。

第２図に示されているように、上記の調製物はどれも十分な結果をもたらした。

調製１．４　（ＭｅｔＯＨから吸着）が、取扱適性が最良である最も均質なシリカゲル／グリセロール調製物を生ぜしめた。

この実施例では、アシル供与体のビニルラウレートが液体であるため、ｔ−ＢｕＯＭｅのような疎水性溶媒はエステル化にとって重要ではないことに注意すべきである。吸着したグリセロールを、生触媒と共に、液状の第二の基質中に直接分散させてもよい。しかしながら、転化速度は異なる場合がある。

実施例１０この実験は、反応を行う前に、親水性基質を予め吸着させておくことが必要であるかどうかを評価するために設計したものである。

調製２．１゜これは対照調製物であって、実施例９にあるように、グリセロールをシリカゲル表面に予め吸着させたものである。

調製２．２゜１０　ｍｌのフラスコで、０．４７　ｇ（５ｍｍｏｌ）のグリセロールと、２　ｇ（１０ｍｍｏｌ）のビニルラウレートと、８ｍｌのｔ−ＢｕＯＭｅとを十分に混合した。

形成した乳濁液に、０．５ｇのシリカゲルを加え、その混合物を約ｌ〜２分間攪はんした。次いで、５０　ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅを加え、得られた混合物を全部で２４時間攪はんした。規則的な間隔でサンプルを抜き取って分析した。

調製２．３゜調製２．２にあるように、グリセロールと、ビニルラウレートと、そしてｔ−ＢｕＯＭｅとを混合して乳濁液を形成させた。この場合、シリカゲルを加える前にＬｉｐｏｚｙｍｅを添加して１〜２分間攪はんしておいた。これらの結果（第３図）は、転化速度が３種類のどの調製物においても同等であったことを示している。調製２．１は最も速かったが、シリカゲルを後で添加した場合（２，２及び２．３）、グリセロールがシリカゲル表面に現場で吸着するため、反応速度は十分であった。

実施例１１この実験は、本発明の方法を用いて、固体の親水性アルコールをエステル化できるかどうかを調べるために設計したものである。

調製３．１゜ソルビトールと等量のシリカゲルとを、乳鉢と乳棒によって、さらさらした均質に見える混合物が得られるまで機械的に混合した。

調製３．２゜ソルビトールを最少量の９９％ＭｅＯＨに溶解し、それに等量のシリカゲルを添加した。２時間攪はん後、シリカゲルを濾過によって回収し、そして乾燥した。

最初のソルビトール量の４５％しか担体表面に残存しなかった。

調製３．３゜ソルビトールを最少量の９９％ＭｅＯＨに溶解し、それに等量のシリカゲルを添加した。次いで、溶媒をロタベーパ・−を用いて減圧下で除去した。残ったさらさらの粉末をエステル化反応に直接用いた。。

ソルビトール（０，８ｇ、吸着後に残っている量について補正しか）と、０，４ｇのビニルラウレートと、５０　ｍｇのＭｕｃｏｒ　ｍ１ｈｅｉ由来の固定化リパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙ＋ｏｅ、、Ｎｏｖｏ）と、８ｍｌのｉ−ＢｕＯＭｅとを混合して、全体で２４時間攬はんした。定期的に混合物からサンプルを抜き取り、モしてＴＬＣによって分析した（第４図Ｌ３種類のどの吸着調製物からもエステル化が観測さむた。明らかに、調製法３．３　（ＭｅＯＨから吸着させて減圧下で溶媒を除去する方法）によって調製した材料で最も速い反応が観測された。

実施例１２この実験は、固体担体対グリセロールの比率がエステル化に与える効果を評価するために設計したものである。

グリセロール（０，９２ｇ、　１０市ｏ１）を各種量（０，０，３，０，６及びｌ　ｇ）のシリカゲル（Ｍｅｒｅｋ、　２３０〜４００メツシユ）に吸着させ、そして実施例１にあるように５．４２　ｇ（２４ｍｍｏｌ）のビニルラウレートをアシル供与体として含むｔ−ＢｕＯＭｅ中でエステル化した。エステル化触媒とし７て、１５０　ｍｇのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｓ由来のリパーゼを使用した。

３０時間のインキュベーション後、すべての反応混合物をＴＬＣで分析して、定量的な生成物単離用に仕上げた。０．６ｇ及び１ｇのシリカゲルを含有するサンプルのみが、グリセロ−・ルのエステル生成物への完全な転化を示した３５、その結果を表４に末とめる。効率的な転化のためには、シリカゲル：グリセロール比率を約０．６：１０　（ｇ：ａ＋ｍｏｌ）よりも高くすることが好ましい。

実施例１３この実験は、本発明の方法により固体の炭水化物、グルコ−＝スをエステル化できるかどうかを評価するために設計したものである。

０．５８８　ｇのシリカゲルに吸着さぜたＤ−グルコース（０，４１２ｇ、２．２９ｍｍｏｌ）を、２０　ｍｌのｔ−ＢｕＯＭｅと３０　ｍｍｏｌのアシル供与体としてのビーニルアセデート・、ビニルブチレートまたはビー、ルラウレートのいずれかとの混合物へ加えた。ＰｓｅｕｄｏＩＩｌｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｓ由来のりｉ＜−ｆを２００　ｍｇ添加しｔ；後、その混合物を１４日間攪はんした１、その後、反応混合物を濾過し２、その濾過ケークを新しいｔ−ＢｕＯＭｅで十分に洗浄した。その溶媒をロタベーパーで除去し。そしてその残留物を高真空ラインで乾燥した。

アシル供与体どしてビニルア七デ′−１・を使用した反応からは、黄色のシ１″ Ｊツブが３７０　Ｂ得られ５、それをりＤマドグラフィーで分離するとニ一つの百分が得られｌ：−二（１）−７５ｍｇのシロップ　ＲＦ＝０．９６（フロント）：ｄ−グルコース− ２，４，６−ドリアセデー・ト・（２）　１．８５　ｍｇのシＩＪｙ７ブ　ＲＦ＝０．７９　；　ｄ−グルコース −２，６−ジアセテー　１−（３）　１００　ｏ＋ｇの無色結晶　ＲＦ・０゜５４：Ｄ−グルロースＧ−了しチー１−（クロ゛ンＩ・グラノィーの溶媒；　ＥｔＯＡｅ　：　２−プロパノ−７［べＨ，０＝６００二２７０　：　１３０　、核磁気共鳴（ＮＭＲＩ分析は４００　ＭＨｚで行った）了シル供与体としてビニルブチレートを使用した反応からは、無色のシロップが５８０　ｍｇ得られた。シリカゲルによるクロマトグラフィーで分離すると、６０　ｍｇの結晶質物質、ＲＦ・０．６９　；　ｄ−ゲルコース−６〜ブチレー　トが得られた。

アシル供与体としてビニルラウレートを使用した反応では、過剰のビニルラウレートとラウリン酸から主としで成る無色の液体か残存した。ＴＬＣ分析は、ＲＦ＝０．９４を示す極性の低い主生成物が形成したことを示した。室温で２′・３１〕靜置し！ｒ後、混洒物は結晶化し、、イ゛〜の結晶を濾過によ、って単離しｔ、−、、、、ＮＭＲ５Ｊ析ｊＪ１、Ｄ−ゲルコース−６−ラウＩ／−一トの形成を示した。

対照として、固体担体を使用しない旧グル″コースのユ、ステル化を試みた。、、　１．ｆｌ　［（１０ｍｍｏｌ）の無水Ｄ−ゲル：１・−スを２０　ｍｌのｔ　ＢｕＯＭｅ中に４．６　ｍｌ（５０ｍｔｏｏｌ）のビニル’ｙ’）ｒテ＝−１ −を含む混合物・＼、添加しｔ・１．３００　ｍｇのＰｓｅｕｄｏｍｏ＋ｉａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｅｅｃｓ！ｔ（来のりパー′ゼを添加後・、混合物を室温で１４日間攬はんり、た３、その後、反応混合物を濾過して、濾過チー・−りを新し、、いｔ−ＢｕＯＭｅ′７′洗浄した。その溶媒をロタベー・バーで除去し５．その残留物を高声空ラインで乾燥１．また。６０　ｔｒｌｇの飢色のシロップが得られ、くれはトグルコースの転化を基準として５％未満の収量に相当し１．− ６要約すると、２′″の実験の結１は、Ｄ−ゲルコースが本発明の方法シ、”よりニスアル化されうろことを示した。主生成物はＤ−グルコース−Ｇ−アセテ・− １・、Ｄ−グルコ・−ス２．Ｇ＝−ジアセテ−１・及びＤ−グルコース−２，４、６−）リアセテー　１・であった。収率は３０％・・〜・５０％の範囲にあった。。

実施例１４この実施例は、グリセロ−・ルどＭ離カルボン酸との直接エステル化によって異性体的且−７）化学的に純粋な１モノグリセリドを製造することを例示する。これじ、関連して、用語「化学的に純粋」とは、２−モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドを実質的に含まない１−モノグリセリドのｍｇ物をさす。

用πＫ［異性体的に純粋１とは、２−丁・ジグリセリドを実質的に含まり戸１− モノグリセリドの調製物をさす。

用いたシリカゲル及び基質の量と種類を表５に示ず。グリセロールを実施例３にあるようにシリカゲルに予め吸着させておき、その後、反応容器（第７図７）内で、ｔ−ＢｕＯＭｅ／ｎ−ヘキサンの１＝１混合物８０　ｍｌ中に懸濁させた１００　ａ＋ｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ及び表記のカルボン酸を混合した。３オングストロームのモレキュラーシーブを充填したカラム６を通して反応器７と分離器１１とを接続して、反応中に生成する水を除去した。反応混合物を周囲圧力で反応器７中２５°Ｃの温度で攬はんした。

分離器（第７図１１）を２℃に冷却した。！　ａｌｌ／分の速度で溶液を反応器７（２５°Ｃに維持）から分離器１１（２℃に維持）へ循環させ、そして反応器７へ戻させた。２枚のフィルターディスク（１枚は反応器８からの出口にあり、もう１枚は分離器１２の出口にある）を使用して、固体物質を保持させた。冷却した分離器ｌｌ中で沈澱形成が観測された。表５に示した時間で、反応を停止させ、そして分離器ｌｌ内に沈澱した生成物を簡単な吸引濾過で集めた。その沈澱物を２倍体積量の冷ｎ−ヘキサンで洗浄し、そしてトリメチルシリルエーテル（ＴＭＳ）誘導体のガスクロマトグラフィーによって分析した。ＴＭＳ誘導体は、ヒドロキシル基とトリメチルシリルクロリドとを反応させて、揮発性ＴＭＳ誘導体を生成させることによって製造し、ガスクロマトグラフィー分析用とした。純粋なｌ−モノグリセリド生成物が、９５％よりも高い異性体的純度及び化学的純度で得られた。

表５の第１欄に示したように、グリセロールを過剰に用いると、９０％の収率が４８時間以内で得られた（収率％はラウリン酸のモル転化率に基づく）。反応体を理論量で使用すると（第２及び第３欄）、反応はよりゆっくりと進行し、１２０時間で８６％の収率が得られた（表５）。

表５この実験は、グリセロールとビニルラウレートとのエステル化によって化学的に純粋な１−モノラウリンを製造することを例示する。

基質とシリカゲルの量を表６に示す。実施例３にあるように、グリセロールをシリカゲルに予め吸着させておき、その後、反応器（第６図１）内で、ｔ−ＢｕＯＭｅ／ｎ−ヘキサンの１：ｌ混合物８０　ａ＋１中の１００ａ＋ｇのＬｉ　ｐｏｚｙｍｅ及びビニルラウレートを混合した。

反応器ｌを、第６図に示したように分離器５に接続した。この系が実施例１４で用いた系と唯−違う点は、コネクター内にモレキュラーシーブを含んでいない点である。この反応では、水またはアルコールが副産物にならないので、モレキュラーシーブが不要である。

溶液を周囲圧力で反応器ｌにおいて２５℃の温度で攪はんした。実施例１４にあるように、分離器５を２℃に冷却し、そして表示の時間溶液を系内に１０１１／分の速度で循環させた。実施例１４と同様に沈澱物を集め、洗浄し、そして分析した。表６に示したように、ＴＭＳ誘導体のガスクロマトグラフィーで測定して９７％よりも高い異性体純度を示す純粋な１−モノラウリン生成物が２７％〜９０％の収率で得られた。

表にの実験は、グリセロールとメチルラウレートとの酵素的エステル化によるｌ−モノラウリンの大規模生産において本発明の方法を試験するために設計したものである。

実施例１にあるように、グリセロール（２３ｇ、２５０闘ｏ１）を２５　ｇのシリカゲルに吸着させた。第６図に示した反応器内で、メチルラウレート（５３ｇ、　０．２５　ｍｏｌ）と５００　ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅとを吸着グリセロールと共にｔ−ＢｕＯＭｅ／ｎ−ヘキサンの１℃１混合物５００　ａｌｌ中に懸濁させた。

孔径４オングストロームのモレキュラーシーブを使用して副産物のメタノールを除去し、よって所望の方向の逆加水分解における反応を促進した。

実施例１４にあるように、分離器を２°Ｃに冷却し、そして溶液を系に循環させた。実施例１４と同様に沈澱物を分離器から集めて分析した。４８時間後、１７．８ｇ（収率２６％）の１−モノラウリンが分離器から集められた。１４４時間後、異性体的純度及び化学的純度が〉９９％であるこの物質４５．９ｇ（収率６７％）が生成した。

実施例１７この実施例は、アシル供与体としてトリグリセリドトリラウリンを用いたグリセロールのエステル化による純粋な１−モノラウリンの製造を例示するものである。この実験は、実施例１５と同様に行ったが、但し、Ｌｉｐｏｚｙｍｅの代わりに１００　ｍｇのＰ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の固定化リパーゼ（Ａ＋ａａｎｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ１社、名古屋、日本）を使用した。Ｐ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のリパーゼは、トリグリセリドの三つのすべての位置に対して活性を有し、こうしてアシル供与体からすべてのアシル基を効果的に除去する。対照的に、Ｍ、　ｍ１ｈｅｉ由来のリパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ）はトリグリセリドの１位と３位に対して特異性を示し、トリラウリンの２位からアシル基を効果的に除去することができない。基質と固体担体の量を表７に示す。

表７に示したように、異性体純度が９５％よりも高い１−モノラウリンが収率２１％〜８０％で得られた。グリセロールをモル過剰量で用いた場合（表７、第１欄）には、反応は急速に進行し、４８時間以内に収率は８０％に達した。反応体を理論量で用いた場合（表７、第２１１）には、反応はよりゆっくりと進行し、９６時間後の収率は７５％であった。

表７この実施例は、グリセロールとメチルパルミテートとのエステル化による純粋なｌ−モノパルミチンの製造を例示するものである。実施例１５に用いた溶媒混合物１００　ｍｌ中で、５．４　ｇ（２０ｍｍｏｌ）のメチルパルミテート、１．９ｇのシリカゲルに吸着させた１、８５　ｇ（２０ｍｍｏｌ）のグリセロール、及び１００　ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅを使用して、実施例１５と同様に実験を行った。

４８時間後、２．３１　ｇ　（収率３５％）の１−モノバルミチンが、異性体純度〉９７％で得られた。

実施例１９この実施例は、実施例９で採用した吸着基質の調製方法の別法として、カラム内で固体担体を使用する方法を例示するものである。

グリセロール（３，７ｇ、　２０　ｍｍｏｌ）を、４ｇのシリカゲル及び１００　ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅと機械的に混合した。ガラスカラム（８ｍｏ＋Ｘ　１５　ｃｍ）にその混合物を充填した。２０　ｍｌのｔ−ＢｕＯＭｅに９．０ｇのビニルラウレートを含む溶液を、メンブランポンプによってカラム内に５　ｍｌ／分の速度で全体で２４時間循環させた。次いで、カラムを２０　ａｌｌの新しいｔ−ＢｕＯＭｅでフラッジして、すべての有機相を除去した。残った粘性物質をｎ−へキサンに溶解して、短いシリカゲルカラムによるフラッシュクロマトグラフにかけた。溶液を一２０℃に冷却すると、粗１．３〜ジラウレート（純度的９５％）が結晶析出した。ｎ−ヘキサンから再結晶化した後、８．２ｇ（収率９０％）の１゜３−ジラウリンが白色結晶として得られ、その化学純度は、ガスクロマトグラフィーで定量して９９％よりも高いものであった。

実施例２０この実施例は、ペプチドエステルの製造を例示するものである。

用いた親水性基質はＺ−Ｌ−セリン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とした。「Ｚ」部分は、両性イオンの形成を防止するため１．またアシル基を受容する核性基を１個だけ提供するために、セリンのアルファルアミノ基に共有結合されるカルボキシベンジルオキシ保護基である。

実施例９の調製１．４に記載したように、アセトンを溶媒と１７で用いて２ｇのシリカゲルにＺ−Ｌ−セリン（０，４７８５ｇ、２　ｍｍｏｌ）を吸着させた。

得られたさらさらな粉末を、２０　ｍｏｌのｔ−ＢｕＯＭｅ及び１０　ｍｍｏｌのビニルバレレート（１，２８ｇ）または１０　ｏ＋ｍｏｌのビニルラウレート（２，２６ｇ）と混合した。この混合物に１ｇのＬｉｐｏｚｙｍｅを添加した。

その混合物を、３０℃で２４時間３５０　ｒｐｍで振とうした後、すべての固形分を濾過によって除去した。得られた有機相から、蒸発（ロタベーパー）によって溶媒を除去し、そして得られた残留物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフにかけて、過剰のビニルバレレートまたはビニルラウレートを除去した（ｎ− ヘキサン：　ｔ−ＢｕＯＭｅ＝　ｌ　：　１に続いてアセトン：メタノール＝４：１）。すべての溶媒を除去した後で、固体残留物をｎ−へキサンから再結晶化した。ビニルバレレートを用いた反応からは、０．５７６　ｇ（収率９４％）のＺ−Ｌ−セリンバレレートが無色結晶として得られた。そのｍ、　ｐ、は１８８〜１８９℃であり、また：ビニルラウレートを用いた反応からは、０．７７６　ｇ（収率９２％）のＺ−Ｌ−セリンラウレートが無色結晶として得られた。そのｍ、　ｐ、は１６０〜１６２℃であり、また：実施例は、グリコシドのト叶β−叶ガラクトピラノシル−ｎ−ドデカノールの製造を例示するものである。

親水性基質の０−ニトロフェニルガラクトピラノシド（１０，２ｇ、　３２ｍｏｒａｌ）を、５０〜６０°Ｃに温めた１５０　ｍｌのメタノールに超音波下で溶解した。その溶解した基質を、実施例９の調製１．４に記載し７たように、３０　ｇのシリカゲル表面に吸着させた。溶媒を除去した後、その材料を減圧下で乾燥してさらさらな粉末を形成させた。次いで、その材料に３２０　ｍｌのｎ・− ヘキナンと１７．６　ｇ（９６叩０υのｎ−ドデカン・−ルとを混合した。酵素 β−がラクトシダ・−ぜＣ２７５０Ｕ、　５１ｇ１ｌｌａ　Ｃｂｅｍｊｃ、！ｌＪ社、Ｓｔ、、　Ｌｏ旧ｓ、　ＭＯ）を添加して５、その混合物を室温で２４時間攬はんし。

た１、固体物質を濾過によって除去した。有機泪かｆ）、１１．Ｏｇｃ６０　ｍ庫＋１）の１１−ドア１カツ　ルど４．４　ｇ（３１［１１１１１０１）のｏ− 、ニー斗［１ソｊ−、ノールとを回収した６固体物質を３Ｘ２００ｍｌのメタノールで十分ｉ″′′抽出、５４してずべ′Ｃの固体物質を濾過６．゛よ、−Ｈ除去した。溶媒除去後、千固体油状物質どして９．４６　ｇ（２６ｍｍｏｌ）のト１）−β−Ｄ−ガラクトビラ２ノシルー１１−ドデカノールが得られた。

実施例２２この実施例は、Ｎ−アセチル−１、−ｆ″ロジン１、−フ」−ニール了うて、゛／了ミ１れ・）合成を例示するものである。、Ｎγ−；！ｆ−ルーＬ〜ヂ【ｊシンエ、チルエステル１水和物１１順ｎｌ；２６９　ｍ（ＨｌどＬ−）ｌｌ、二ノトアラニ゛／了ミド塩酸塩［１ｍｍｎ１；２０１　ｍｇｌとを２０　ｍｌのＭｅＯＨ６、−溶解した。この溶液に、５ｇのシリカゲル尤・添加し、そしてｌｅＯ［（を減圧下Ｃ除去した。こうして得られた材料に、２０　ｍｌのｎ−へセリンと、！ｌｌａ＊ｃＯｓ　−１０ＨＪ［２ｍｍｏＬ；５７２　ｏ＋ｇｌと、２０　ｍｇの了ルフーｒ−キモ１へリブシンとを混合した。その混合物を室温で２４時間攬はんＩ７、そし７゛Ｃ溶媒を減圧トＣ除去した。次いで、残留物を高温の７ −１−１−＝、、）リルで抽出した。得られた溶液をＩ（ＰＬＣ分析したところ、この時点で９０％を超える転化率を示した。残る溶媒を減圧下で除去すること（７よ、って溶液を濃縮し、そして残留物をアセ）、：：）リルから再結晶化した。得られた生成物は、２５９　ｍｇ（７０％）のＮ−アセチル−１４−チロシン−［、−フェニルアラニンアミドであった。

実施例２３この実施例は、Ｎ−アセデル−し−チロシン−し−ロイシンアミドの酵素触媒合成を例示するものである。

Ｎ−アセチル−し−チロシン−エチルエステル１水和物（１＋ｎｍｏｌ；２６９　ｍｇ）ど１４−ｒノ、イシンアミド塩酸塩（１ｍｏｌ；１６’７　ｍｇ）とを２０　ｍｌのＬ−ＲｕＯＭｅに懸濁さぜた１、この懸濁液に、Ｎａ、、Ｃ（１＊　・１０　ＨＪＩ（２＋ｕｉｏｌ；５７２　ｍｇ）と、シリカゲル（５ｇ）ど、Ｙルア丁ギ玉トリブシ゛メ（２０ｍｇ）、ｕを添加した。

得：　ｌ；　ｉ’ｌた混合物を室温で２４時Ｉ７！ｌｉ攬はんしｉ、溶媒除去後、残留物を高温の−）’−１″ｌ−４−６ｌ・リルで抽出１’；’Ｌ−：ｉ　！ｌｌ’１．ｃ分析は、９５％イー超え、５転化率ン、示した。単炉し、たジペブ千！”（８０％）は、既知試料との比較（ニーよこの実施例は、グリセ１１−ルー１−ボス、ノコ、−・１・の＃素触媒ｒ；７成を例示するものである。１グ’）　”’！　’　＝　ル（１０ｍ１ｌｌｎｉ、０．９２　ｇ）ｔホｉｌ？１１ノシ１，１−ｈケ）Ｉ、Ｃ１，０［）に吸着さ旧−を−後、　２０　ｍｌのｔ　−Ｂ＋１０Ｍｅ　ｉ：”、懸Ｒｂ−！ｉた１１、の混合物（−１，１，）−、）　ｃｌ”、ノエニ゛ルポスフ−？、−ｌ□　（Ｎｏ　ｕ＋ｍｒｉ１）を添加し、次いでポテト由来の酸性ポスフγり・ゼ（１０００［に２（１０１ｉ１ｇ）を添加しｉ、その混合物を室温で２・４時面亨はんした１、溶媒を・減圧下で除去１７、残留物を水で十分に抽出ｌ、　（３ｘ　１５０　ｍｌ）　、そしてすべての固形分を濾過によ、っ゛Ｃ除去した。得られた水溶液を域圧ドで７５　ｍｌまで濃縮］２、そして２ｉ　ｍｍｏＩＩ７３ＢａｃＩＩｌ・２Ｈ，０の溶液゛ｒ処理し７て沈澱を形成させた。、−の懸濁液に、５００　ｍｌの９５％エタ八・へｌ、を加え、そして沈澱物を一晩沈降させた。懸濁液を濾過１３、て固体物質をＣａ５Ｏａで乾燥Ｉ７た。バリウｊ・塩どして表記化合物を９４％含有Ｖるグリセロール−１−ホスフア−１・（８，５ｍｍｏｌ）が得られた。

図面の簡単な説明第１図は、グリセロールとビニルラウレートとのエステル化の速度に対する種々の酵素調製物の効果を示している。

第２図は、グリセロールを固体担体へ吸着する種々の方法がエステル化速度に与える効果を示している。

第３図は、基質と、固体担体と、酵素との混合順序がグリセロールのエステル化速度に与える効果を示している。

第４図は、ソルビトールを固体担体へ吸着する種々の方法がソルビトールのエステル化速度に与える効果を示している。

第５図は、１−モノグリセリドを生成する反応を概略的に示している。

第６図は、水やアルコールを副産物として生成しないので生成物を除去せずに完了する反応から純粋な１−モノグリセリドを製造するのに使用できる反応器／分離器系を概略的に説明する図である。

第７図は、水やアルコールを副産物として生成する反応から純粋な１−モノグリセリドを製造するのに使用できる反応器／分離器系を概略的に説明する図である。水またはアルコールを除去するために導入したモレキュラーシーブが、所望の方向のエステル化における反応を促進する。

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ドイツ連邦共和国、デー−５６００ブツペルタル　１．トリーペルシャイダー　ベーク

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１個のヒドロキシル基を含有する親水性の第一の基質と、前記第一の基質を吸着することができる固体担体と、少なくとも１個の供与性残置基を有する第二の基質と、酵素とを混合する工程を含んで成る両親媒性化合物の製造方法において、前記固体担体対前記第一の基質の比率が約０．３：１．０〜約１０．０：１．０（ｇ：ｇ）であり、前記第一の基質が前記固体担体に付着し、前記酵素が前記ヒドロキシル基と前記残置基との間の反応を触媒して両親媒性化合物を形成する、両親媒性化合物の製造方法。２．ｎ−ヘキサン、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、エチレンオキシド、メチルイソブチルケトン、酢酸ビニル、酢酸エチル、ｔ−ブタノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン及びアセトニトリルから成る群より選択した有機溶媒を添加する工程をさらに含んで成る、請求の範囲１記載の方法。３．前記両親媒性化合物がエステルであり、また前記第一の基質がアルコール類及び炭水化物類から成る化合物群から選択される、請求の範囲１記載の方法。４．前記第二の基質が、カルボン酸類、エステル類、無水物類及びトリグリセリド類から成る化合物群から選択される、請求の範囲１記載の方法。５．前記酵素が逆加水分解酵素である、請求の範囲１記載の方法。６．前記逆加水分解酵素がカルボン酸エステルヒドロラーゼである、請求の範囲５記載の方法。７．前記第一の基質が、グリセロール、エチレングリコール、ソルビトール及びグルコースから成る群より選択される、請求の範囲３記載の方法。８．前記第二の基質が、ビニルラウレート、ビニルアジベート及びビニルアセテートから成る群より選択される、請求の範囲４記載の方法。９．前記第二の基質が、カプリル酸、ラウリン酸及びパルミチン酸から成る群より選択される、請求の範囲４記載の方法。１０．前記第一の基質と前記固体担体とを機械的に混合してから前記第二の基質と前記酵素とを添加する工程をさらに含んで成る、請求の範囲１記載の方法。１１．前記第一の基質を極性溶媒に溶解して溶液を形成させ、前記溶液と前記固体担体とを混合し、そして前記第一の基質を表面に吸着して有する前記固体担体を単離してから、前記第二の基質と前記酵素とを添加する工程をさらに含んで成る、請求の範囲１記載の方法。１２．前記極性溶媒が、水、メタノール、アセトニトリル及びアセトンから成る群より選択される、請求の範囲１１記載の方法。１３．少なくとも１個のヒドロキシル基を含有する親水性の第一の基質と、前記第一の基質を吸着することができる固体担体と、酵素とを混合して混合物を形成する工程、前記混合物をカラムに充填する工程、並びに少なくとも１個の供与性残置基を有する第二の基質を前記カラム内に循環させる工種を含んで成る両親媒性化合物の製造方法において、前記固体担体対前記第一の基質の比率が約０．３：１．０〜約１０．０：１．０（ｇ：ｇ）であり、前記第一の基質が前記固体担体に付着し、前記酵素が前記ヒドロキシル基と前記残置基との間の反応を触媒して、前記固体担体を実質的に含まない両親媒性化合物を形成する、両親媒性化合物の製造方法。１４．前記両親媒性化合物がホスフェートであり、前記第一の基質がアルコール類、炭水化物類及びヌクレオシド類から成る群より選択され、そして前記酵素がホスファターゼである、請求の範囲１記載の方法。１５．前記第一の基質がグリセロールである、請求の範囲１４記載の方法。１６．前記第二の基質が、アルコール類のリン酸エステル、フェノール類のリン酸エステル及びカルボン酸−リン酸混合無水物から成る群より選択される、請求の範囲１４記載の方法。１７．前記両親媒性化合物がグリセロール−１−ホスフェートであり、そして前記第二の基質がｐ−ニトロフェニルホスフェート、ｎ−ブチルホスフェート、ビニルホスフェート及びメチルカルボニルホスフェートから成る群より選択される、請求の範囲１６記載の方法。１８．前記反応混合物を、前記残置基を前記両親媒性化合物へ少なくとも約１０％転化させるに十分な物理条件下で且つ十分な時間インキュベーションする工程をさらに含んで成る、請求の範囲１記載の方法。１９．前記固体担体が、シリカゲル、珪藻土、粘土、活性炭、カルボキシメチルセルロース、セルロースエステル、イオン交換樹脂及び不溶性ポリサッカリドから成る群より選択される、請求の範囲１記載の方法。２０．遊離第一アミノ基を有する親水性の第一の基質と、カルボン酸エステルを含んで成る少なくとも１個の供与性残置基を有する第二の基質と、前記第一の基質及び前記第二の基質を吸着することができる固体担体と、ペプチダーゼとを混合する工程を含んで成るペプチドの製造方法において、前記固体担体対前記第一及び第二の基質の比率が約０．６：１．０〜約１０．０：１．０（ｇ：ｇ）であり、前記第一及び第二の基質が前記固体担体に付着し、前記ペプチダーゼが前記遊離第一アミノ基と前記カルボン酸エステルとの間の反応を触媒してペプチドを形成させる、ペプチドの製造方法。２１．前記第一の基質が、カルボキシル保護アミノ酸及びカルボキシル保護ペプチドから成る化合物群から選択される、請求の範囲２０記載の方法。２２．前諾第二の基質が、アミノ保護アミノ酸及びアミノ保護ペプチドから成る化合物群から選択される、請求の範囲１８記載の方法。２３．前記ペプチダーゼがアルファーキモトリプシンである、請求の範囲２０記載の方法。２４．前記第一の基質がＬ−フェエルアラニンアミドまたはＬ−ロイシンアミドであり、また前記第二の基質がＮ−アセチル−Ｌ−チロシンエチルエステルである、請求の範囲２０記載の方法。２５．異性体的且つ化学的に純粋な１−モノグリセリドを製造及び選択沈澱する方法において、ａ）グリセロール基質と、第二の基質と、第一の有機溶媒とを混合して第一の混合物を形成する工程であって、前記第二の基質が少なくとも１個の供与性残置基を有し、また前記第一の有機溶媒が特定の１−モノグリセリドの選択沈澱を促進することができる工程；ｂ）前記第一の混合物と酵素とを混合して第二の混合物を形成する工程であって、前記酵素が、前記グリセロールのヒドロキシル基と前記残置基との間の反応を触媒して１−モノグリセリドを形成させる工程；ｃ）溶解した１−モノグリセリド生成物を生ぜしめるに十分な温度で前記第二の混合物をインキュベーションする工程；並びにｄ）工程（ｃ）の混合物を、前記１−モノグリセリドが選択的に沈澱する温度に冷却する工程、を含んで成る方法。２６．工程（ｄ）の後に少なくとも一部の副産物が溶液中に残存し、前記副産物が前記反応において１個以上のアシル基を供与することによって第三の基質として役立つことができる、請求の範囲２５記載の方法において、ｅ）前記溶液を反応容器へ再循環させる工程であって、前記反応容器が、前記反応を継続させて１−モノグリセリド及び副産物を含んで成る第三の反応混合物を生ぜしめるに十分な量のグリセロール、前記酵素を含有し且つ温度を示す工程；ｆ）前記反応を継続する工程；ｇ）アシル基の１−モノグリセリドヘの少なくとも約８０％の転化率と１−モノグリセリドの沈澱が得られるまで、工程（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を繰り返す工程、を含んで成る方法。２７．前記反応の副産物の一つが水またはアルコールであって、前記水またはアルコールを乾燥剤によって前記第二の混合物から除去する、請求の範囲２６記載の方法。２８．前記第一の混合物に前記グリセロールを吸着することができる固体担体を加える工程をさらに含んで成る請求の範囲２６記載の方法において、前記固体担体対前記グリセロールの比率が約０．３：１．０〜約１０．０：１．０（ｇ：ｇ）であり、前記グリセロールが前記固体担体に付着する、請求の範囲２６記載の方法。２９．前記第二の基質が遊離カルボン酸である、請求の範囲２７記載の方法。３０．前記遊離カルボン酸がラウリン酸またはステアリン酸である、請求の範囲２９記載の方法。３１．前記第二の基質がメチルエステルである、請求の範囲２５記載の方法。３２．前記メチルエステルがメチルラウレートまたはメチルパルミテートである、請求の範囲３１記載の方法。３３．前記第二の基質がトリグリセリドである、請求の範囲２５記載の方法。３４．前記トリグリセリドがトリラウリンである、請求の範囲３３記載の方法。３５．前記第一の混合物を約４８℃〜約１００℃の温度で維持する、請求の範囲２５記載の方法。３６．前記工程（ｄ）の温度を約−４９℃〜約１０℃とする、請求の範囲２５記載の方法。３７．前記温度が２℃である、請求の範囲３６記載の方法。３８．前記溶媒が、ｔ−ブチルメチルエーテル：ｎ−ヘキサンの比率約１：１００〜約１００：１（体積：体積）の混合物である、請求の範囲２５記載の方法。３９．前記比率が１：１（体積：体積）である、請求の範囲３８記載の方法。４０．前記第一の基質が、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質から成る化合物群より選択される、請求の範囲１記載の方法。４１．前記両親媒性化合物がアミノ酸エステルであり、また前記第一の基層がアミノ酸である、請求の範囲４０記載の方法。４２．前記アミノ酸がＺ−Ｌ−セリンである、請求の範囲４１記載の方法。４３．前記第二の基層がビニルバレレートまたはビニルラウレートである、請求の範囲４２記載の方法。４４．前記両親媒性化合物が、オリゴ糖、糖タンパク質及び糖脂質から成る群に含まれる、請求の範囲１記載の方法。４５．前記第一の基質がサッカリドであり、また前記酵素がグリコシダーゼである、請求の範囲４４記載の方法。４６．前記サッカリドがラクトースである、請求の範囲４５記載の方法。４７．前記グリコシダーゼがβ−ガラクトシダーゼである、請求の範囲４５記載の方法。４８．前記第二の基質がポリアルコールである、請求の範囲４４記載の方法。４９．前記ポリアルコールがイソプロピリデングリセロールである、請求の範囲４８記載の方法。５０．固体担体に吸着したアルコールまたは炭水化物を約１．０：０．３〜約１．０：１０．０（ｇ：ｇ）の比率で含んで成る組成物。５１．前記アルコールがポリオールである、請求の範囲５０記載の組成物。５２．前記ポリオールが、グリセロール、グリコール、エリトロトール及びソルビトールから成る群より選択された、請求の範囲５１記載の組成物。５３．前記炭水化物がグルコースまたはガラクトースである、請求の範囲５０記載の組成物。５４．前記固体担体が、シリカゲル、珪藻土、粘土、活性炭、カルボキシメチルセルロース、セルロースエステル、イオン交換樹脂及び不溶性ポリサッカリドから成る群より選択された、請求の範囲５０記載の組成物。５５．前記比率が１：１（ｇ：ｇ）である、請求の範囲５０記載の組成物。５６．約１．０：０．３〜約１．０：１０．０（ｇ：ｇ）の比率でシリカゲルに吸着したグリセロールを含んで成る組成物。５７．前記比率が１：１（ｇ：ｇ）である、請求の範囲５６記載の組成物。５８．固体担体に吸着した親水性の第一の基質と、前記担体に吸着した第二の基質とを含んで成る組成物において、前記第一の基質は遊離第一アミノ基を含有し且つカルボキシル保護アミノ酸及びカルボキシル保護ペプチドから成る化合物群から選択され、また前記第二の基質は少なくとも１個のカルボン酸エステルを含有し且つアミノ保護アミノ酸及びアミノ保護ペプチドから成る化合物群より選択され、前記固体担体対前記第一及び第二の基質の比率は約０．６：１．０〜約１０．０：１．０（ｇ：ｇ）である、前記組成物。５９．前記固体担体が、シリカゲル、珪藻土、粘土、活性炭、カルボキシメチルセルロース、セルロースエステル、イオン交換樹脂及び不溶性ポリサッカリドから成る群より選択された、請求の範囲５８記載の組成物。