CN1906293A - 固定化酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将例如酶的生物物种在多孔载体中固定化的方法，包括使含有生物物种的流体在高压下穿过多孔载体。本发明还提供其中固定有生物物种的多孔载体。其中固定有生物物种的多孔载体可以用于催化起始物质生成例如手性产物的产物的反应。

Description

固定化酶
技术领域
本发明涉及酶在固体多孔载体上固定化的方法，并且涉及固定在固体多孔载体上的酶。
背景技术
酶催化的不对称反应是有机合成和药物合成中最重要的领域之一。外消旋混合物的动力学拆分仍然是工业生产和学术研究中最常用的获得对映异构纯化合物的方式。通过动力学拆分，外消旋混合物当中的一种对映异构体选择性地发生反应，而另一种由于转化率的差异保持不发生反应。
酶在固体载体上的固定化使其具有更好的机械坚固性、更高的热稳定性，并且更容易从反应介质中分离出来。当酶被固定化时，由于降低了酶的聚集，催化活性也得到提高，特别是在非极性有机介质中。聚合物和无机载体典型地用于酶的固定化。共价键结合和非共价相互作用均已用于酶的固定化中。酶和载体表面之间的相互作用对酶的负载、催化活性和以及反应期间对酶溶出的稳定性均具有显著的影响。
已经进行了酶在中孔硅石上固定化方面的研究，其主要是通过物理吸附作用。多孔、疏水硅石材料是酶固定化载体的良好候选物，因为其疏水性可以有助于底物靠近其孔中捕获的酶。此外，酶和载体之间的弱疏水相互作用使得前者能够保持其活性构象，从而导致高活性。但是，酶在疏水多孔硅石上的固定化仍然存在某些问题。按照惯例，固定化涉及将多孔硅石载体与酶原料一起搅拌。通常由于酶原料水溶液与疏水硅石载体的亲和力低，酶的负载相对较低。酶自载体上的溶出是传统方法的另一个问题。Blanco等人(Blanco，R.M.；Terreros，P.；Fernandez-Perez，M.；Otero，C.；Diaz-Gonzalez，G.J.Mol.Catal.B：Enzym.2004，30，83)已经报道，在无水介质中脂肪酶不可能自疏水中孔硅石上溶出，并且固定化的脂肪酶在经过15次乙醇胺与月桂酸的酰化作用反应循环之后仍保持活性。但是，每次反应的时间仅为1小时。如果在无水有机溶剂中搅拌更长的时间，则可能发生酶的溶出。
因此需要将酶在固体载体之上和/或之中固定化以便降低酶自载体中的溶出的方法。该方法优选提供高的酶反应性，和相对于未固定化的酶来说改进的热稳定性。
发明内容
本发明的目的是克服或基本消除至少一个上述缺点。另一个目的是至少部分满足上述要求。
在本发明第一方面，提供了将生物物种在多孔载体之中和/或之上固定化的方法，包括使含有该生物物种的流体在高压下穿过多孔载体。
高压可以高于大约10MPa，并且可以在大约25至50MPa。该方法可以包括使液体在高压下穿过多孔载体循环。生物物种可以是蛋白质、蛋白片段、糖、DNA片段、肽、或者这些生物物种中的两种或多种的组合。生物物种可以是酶。含有生物物种的流体可以是液体，可以是水相液体，并且可以是水溶液。多孔载体可以是无机多孔载体，可以包括硅石(silica)，或者可以包括金属或金属氧化物或混合金属氧化物。金属可以是，例如，铁、钛、锆或铝。多孔载体可以是泡沫，例如开孔泡沫，或者可以是烧结的或其它多孔物质。其可以是中结构(mesostructured)多孔泡沫(MCF)或FDU-12。多孔载体可以是中孔的。其平均孔径可以为大约2至50nm。多孔载体可以是颗粒，其平均粒径可以为大约100nm至200微米。其粒径分布可以很窄。多孔载体可以是疏水的。该方法可以包括对多孔载体进行化学修饰的步骤，可以包括在使含有生物物种的液体穿过该多孔载体之前使其疏水化(即使其变得疏水)。化学修饰步骤(例如，疏水化)可以包括使多孔载体暴露于在例如烷基硅烷的化学修饰试剂(例如，疏水化试剂)中，可以包括使多孔载体暴露于化学修饰试剂的溶液、悬浮液、乳液或分散液中。在使液体穿过该多孔载体之前可以对其进行干燥。
该方法可以另外包括一个或多个以下步骤：
——在化学修饰步骤之后，用有机洗涤液洗涤多孔载体，
——在化学修饰步骤之后，用水相洗涤液洗涤多孔载体，
——在化学修饰步骤之后，任选地在一步或两步洗涤步骤之前，对多孔载体进行干燥，
——在使含有生物物种的流体穿过该多孔载体中的步骤之后，用有机洗涤液对其进行洗涤，
——在使含有生物物种的流体穿过该多孔载体中的步骤之后，用水相洗涤液对其进行洗涤，和
——在使含有生物物种的流体穿过该多孔载体中的步骤之后，任选地在穿过步骤之后的一步或两步洗涤步骤之前，对该多孔载体进行干燥。
在一个实施方式中，该方法包括以下步骤：
——使多孔载体疏水化，
——干燥该多孔载体，和
——使含有酶的液体在大于10MPa的压力下穿过多孔载体循环。多孔载体可以是多孔硅石载体。
在另一个实施方式中，该方法包括以下步骤：
——使多孔载体疏水化，
——用有机洗涤液洗涤多孔载体，
——用水相洗涤液洗涤多孔载体，
——干燥多孔载体，
——使含有酶的液体在大于10MPa的压力下穿过多孔载体循环，
——用有机洗涤液洗涤多孔载体，
——用水相洗涤液洗涤多孔载体，和
——干燥多孔载体。
多孔载体可以是多孔硅石载体。
在本发明的第二方面，提供了当通过根据本发明第一方面的包括将生物物种在多孔载体之中和/或之上固定化的方法制造时，在其中和/或其上固定有生物物种的多孔载体。多孔载体中可以固定有多于大约50毫克生物物种/克载体，并且可以在大约50至300毫克生物物种/克载体之间。生物物种可以是蛋白质、蛋白片段、糖、DNA片段、肽、或者这些生物物种中的两种或多种的组合。其可以是酶。其中固定有生物物种的多孔载体可以是热稳定的，并且可以在80℃下保持15小时后几乎不丧失活性。其中固定有生物物种的多孔载体可以是可回收的，可以在8次连续的重新使用之后活性的丧失低于20％。
在一个实施方式中，提供了当通过包括以下步骤的方法制造时，其中固定有酶的疏水中孔硅石载体：
——使硅石载体疏水化，
——干燥硅石载体，和
——使含有酶的水相液体在高于10MPa的压力下穿过硅石载体循环。
本发明还提供其中和/或其上固定有生物物种的多孔载体，其中多孔载体之中和/或其上固定有大于大约50毫克生物物种/克多孔载体。该多孔载体之中和/或其上固定的生物物种负载比通过在大气压下进行的方法而在其中和/或其上固定了生物物种的多孔载体高。与如果在大气压下负载生物物种其将具有的生物物种溶出率相比，其生物物种溶出率降低。生物物种可以是蛋白质、蛋白片段、糖、DNA片段、肽、或者这些生物物种中的两种或多种的组合。其可以是酶。多孔载体可以是无机多孔载体，并且可以包括硅石，或者可以包括金属或金属氧化物或混合金属氧化物。金属可以是，例如，铁、钛、锆或铝。多孔载体可以是泡沫，例如开孔泡沫，或者可以是烧结的或其它泡沫。其可以是中结构多孔泡沫(MCF)或FDU-12。多孔载体可以是中孔的。其平均孔径可以为大约2至50nm。多孔载体可以是颗粒，其平均粒径可以为大约100nm至200微米。其粒径分布可以很窄。多孔载体可以是疏水的。
在本发明第三方面，提供了包括将起始物质暴露于其中固定有生物物种的多孔载体的化学反应的催化方法，其中生物物种包括能够催化起始物质反应生成产物的酶。其中固定有生物物种的多孔载体可以通过根据本发明第一方面的包括使生物物种在多孔载体之中和/或之上固定化的方法来制造。该多孔载体之中和/或之上可以固定有多于大约50毫克生物物种/克载体。该多孔载体上固定的生物物种负载与如果多孔载体在大气压下负载生物物种相比更高。产物可以是手性产物，其对映异构过量(ee)可以大于95％。化学反应可以是不对称或对映异构选择性化学反应。该方法可以借着起始物质在溶液中进行。该方法可以包括使溶液穿过多孔载体，并且可以包括使溶液以这样的速率穿过多孔载体：起始物质有足够长的时间反应生成产物。该方法可以包括使多孔载体悬浮、搅拌或以其它方式分布在溶液中。其可以另外包括使起始物质有足够长时间反应生成产物。足够长的时间取决于生物实体、起始物质和反应的性质。其可以是，例如，大约10分钟至24小时。溶液可以含有试剂，所述试剂能够在生物物种的影响下与起始物质反应生成产物。
该方法还可以包括一个或多个以下步骤：
——从溶液中分离出多孔载体，
——洗涤多孔载体，
——干燥多孔载体，和
——从溶液中分离出产物。
洗涤和干燥多孔载体的步骤可以使得多孔载体能够在随后的反应中重新使用。洗涤步骤可以包括一个或多个单独的洗涤步骤，每个单独的洗涤步骤可以使用不同的洗涤液。每种洗涤液可以独立地是水相或有机的。在任何两个单独的洗涤步骤之间可以对多孔载体进行干燥，或者可以不进行干燥。
在一个实施方式中，提供了化学反应的催化方法，包括：
——将含有起始物质和试剂的溶液暴露于其中固定有生物物种的多孔载体，
——使起始物质和试剂反应足够长时间，和
——从溶液中分离出产物，其中，生物物质包括能够催化试剂和起始物质反应生成产物的酶。其中固定有生物物种的多孔载体可以通过根据本发明第一方面的包括使生物物种在多孔载体之中和/或之上固定化的方法制造。本发明还提供当通过第三方面的方法催化的化学反应生成时的产物。
在本发明第四方面，提供了将起始物质转化成产物的反应器(例如填充床反应器)，其包括根据本发明第一方面的方法在其中固定有生物物种的多孔载体，所述多孔载体位于外壳中。生物物种可以能够将起始物质转化成产物。外壳可以包括，例如，HPLC柱外壳、压力外壳、压力容器或一些其它适合类型的外壳。其可以包括防止多孔载体离开外壳的限制装置。限制装置可以是多孔的，可以是玻璃料、滤器或者一些HPLC柱制造工艺中已知的其它多孔装置。
本发明还提供根据本发明第四方面当用于将起始物质转化成产物时的反应器。
本发明第五方面提供制备将起始物质转化成产物的反应器(例如根据本发明第四方面的反应器)的方法，其包括用其中固定有生物物种的多孔载体至少部分填充的外壳。生物物种可以能够将起始物质转化成产物。其中固定有生物物种的多孔载体可以是根据本发明第二方面的多孔载体，或者可以根据本发明第二方面通过使生物物种在多孔载体中固定化来制造。外壳可以具有防止多孔载体离开外壳的装置。装置可以包括，例如，滤器、玻璃料或一些其它多孔材料。装置的孔径可以小于多孔载体。装置和外壳可以能够经受反应器中所用的压力。其可以能够经受至少10MPa的压力。外壳可以是，例如，HPLC柱外壳，其构造可以是根据HPLC柱制造领域公知的方法和参数，或者其可以是一些其它类型的外壳。至少部分填充包括形成多孔载体与填充液体的混合物，例如浆料或悬浮液，并且将该混合物置于外壳中。该方法还可以包括：
——将外壳内的压力增加至填充压力；
——使第二液体在填充压力下穿过外壳；和
——任选地，将外壳内的压力降低至大气压。
第二液体可以与填充液体相同，或者填充液体可以与第二液体不同。
在本发明第六方面，提供了制备将起始物质转化成产物的反应器(例如根据本发明第四方面的反应器)的方法，其包括：
——用多孔载体至少部分填充外壳；和
——通过使含有生物物种的液体在高压下穿过多孔载体，将生物物种在多孔载体之中和/或之上固定化。
固定化步骤可以根据本发明第一方面的方法进行。生物物种可以能够将起始物质转化成产物。外壳可以如本发明第五方面所述。
本发明还提供当根据本发明第五或第六方面的方法制造时将起始物质转化成产物的反应器。其进一步提供将起始物质转化成产物的方法，包括使起始物质穿过根据本发明第四方面的反应器，或者穿过根据本发明第五或第六方面的方法制造的反应器。
附图说明
现在，参考以下附图通过实施例的方式说明本发明的优选形式，其中：
图1是显示了实施例中CALB/MCF-C18(正方形)、CALB/MCF-C8(圆形)和游离CALB(三角形)的催化活性的图表；
图2显示了表示通过以下两种方法制备的CALB/MCF-C8上连续运行时转化率对时间的关系的两张图表：(a)传统的固定化方法，和(b)本发明的压力驱动法；
图3是显示了商品化的固定化CALB(Novozym 435)(正方形)、通过本发明的压力驱动法固定化的CALB/MCF-C8(圆形)和通过本发明的压力驱动法固定化的CALB/MCF-C18(菱形)在连续运行中实现的1小时转化率的图表；
图4显示了通过以下方式制备的CALB/MCF-C8的转化率的四张图表：(a)通过本发明的压力驱动法；(b)通过传统方法；(c)通过Novozym 435和(d)通过游离CALB，其中在热处理之前(实线)和热处理之后(虚线)对催化剂进行测试。
具体实施方式
本发明公开了将酶或其它生物实体在固体载体(基质)(例如用疏水硅烷修饰的中孔硅石载体)的孔内捕获或固定化的新型压力驱动法。对固定化酶的溶出和热稳定性进行检测。固体载体可以含有通过尺寸更小的窗孔连接的蜂窝状中孔。可以使用合适孔径的固体载体。合适的孔径可以取决于生物材料的大小，以使生物物种适应于固体载体的蜂窝状中孔。在MCF的情况下，孔径(窗孔孔径和泡孔孔径)可以很容易地在其合成过程中加以控制。
本发明的方法包括使生物物种穿过多孔载体，任选地使物种在高压下穿过多孔载体循环。高压可以取决于，例如，多孔载体的粒径和孔径。压力可以高于大约10MPa，可以高于大约15、20、25、30、35、40、45或50MPa，可以在大约10至50、20至50、30至50、40至50、10至40、10至30、10至20、20至40或者20至30MPa之间，可以为大约10、15、20、25、30、35、40、45或50MPa。穿过(passing)或再循环可以持续大约30分钟，或者持续至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5小时，可以在大约0.5至5小时之间，或者在0.5至2、0.5至1、1至5、2至5或者1至3小时之间，可以持续大约1、1.5、2.5、3、3.5、4、4.5或5小时。在穿过或在循环过程中可以使用低温，例如0℃。在生物物种不稳定的情况下这一点可以是有用的。低温可以为0至15℃，或者在0至10、0至5、5至10或者10至15℃之间，可以为大约0、5、10或15℃。生物物种可以是蛋白质、蛋白片段、糖、DNA片段、肽、或者这些生物物种中的两种或多种的组合。生物物种可以处于流体中，该流体可以是液体，例如水相液体，生物物种可以溶解、悬浮、乳化或者分散在流体中。生物物种在流体中的浓度将取决于生物物种的性质。浓度可以为大约1至50mg/ml，或者在大约1至25、1至10、1至5、5至50、10至50、25至50、5至25或者5至10mg/ml之间，可以为大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml。流体还可以包含其它物种，例如盐、缓冲液、营养素等。流体的pH可以取决于生物物种的性质，并且应当使生物物种稳定。其pH可以为大约2至9，或者在大约2至7、2至5、4至9、7至9或者4至7之间，pH可以为大约2、3、4、5、6、7、8或9。可以使生物物种在不变性或降解的温度下穿过或者再循环穿过多孔载体，该温度将取决于生物物种的性质。
根据本发明的其上固定有生物物种的多孔载体可以固定有大于50毫克生物物种/克载体，或者可以大于75、100、125、150、175、200、225、250、275或300毫克生物物种/克载体，并且可以在大约50至300毫克生物物种/克载体之间，或者可以在大约100至300、150至300、200至300、250至300、50至250、50至100、100至250或者150至200毫克生物物种/克载体之间，并且可以为大约50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300毫克生物物种/克载体。多孔载体上可以固定比如果多孔载体在大气压下负载生物物种的情况下更高的生物物种负载。其可以比如果多孔载体在大气压下负载生物物种的情况至少高大约10％，或者至少高大约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。例如，其可以比如果多孔载体在大气压下负载生物物种的情况高大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150％。生物物种可以在多孔载体之中和/或之上物理吸附。
多孔载体可以是中孔的。其平均孔径可以为大约2至50nm，或者在大约10至40、10至30、10至20、20至50、30至50、40至50、20至40或者20至30nm之间，并且平均孔径可以为大约10、15、20、25、30、35、40、45或50nm。多孔载体可以是无机多孔载体，并且可以包括硅石、或金属或金属氧化物或混合金属氧化物。金属可以是，例如，铁、钛、锆或铝。多孔载体可以是泡沫，例如开孔泡沫，或者可以是烧结的或其它泡沫。其可以是中结构多孔泡沫(MCF)或FDU-12，如Schmidt-Winkel等人，Science，1999，548、Lettow等人，Langmuir，2000，16，8291和Fan等人，Angew.Chem.Int.Ed.，2003，42，3146中所述。其可以是根据题为“Mesocellular Foam Particles(中空泡沫颗粒)”的共同未决专利申请的硅石泡沫。多孔载体可以是颗粒，例如微米颗粒或纳米颗粒，其平均粒径可以为大约100nm至200微米。粒径可以为大约500nm至200微米，或者在大约1至200、20至200、50至200、100至200、1至100、1至50或者1至10微米之间，或者在大约100nm至100微米、100nm至10微米、100nm至1微米或者500nm至1微米之间，并且可以是大约100、200、300、400、500、600、700、800或900微米，或者是大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200微米。多孔载体的粒径分布可以很窄。可以有少于大约50％的粒子的粒径与平均粒径相差(大于或小于)超过10％，或者可以有少于大约45、40、35、30、25、20、15、10或5％的粒子的粒径与平均粒径相差超过10％，并且可以有大约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50％的粒子的粒径与平均粒径相差超过10％。多孔载体的粒子可以含有，例如，由尺寸更小的窗孔连接的蜂窝状中孔。中孔尺寸与窗孔尺寸的比例可以为大约10∶1至1.5∶1，或者在大约10∶1至2∶1、10∶1至5∶1、5∶1至1.5∶1、3∶1至1.5∶1、5∶1至3∶1或者8∶1至4∶1之间，并且可以为大约10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4.5∶1、4∶1、3.5∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1或者1.5∶1，或者可以是一些其它比例。多孔载体的粒子可以具有一些其它结构。应当理解为当提到这些材料的“孔径”时，其是指有效孔径，即，穿过材料的流体通道最窄部分的大小。因此，在含有由尺寸更小的窗孔连接的蜂窝状中孔的结构中，“孔径”是指窗孔的大小，而不是中孔的大小。粒子的孔隙容积可以为大约0.5至5cm3/g，孔隙容积可以为大约0.5至2、0.5至1、1至5、3至5或者1至3cm3/g，并且孔隙容积可以为大约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5cm3/g。其空隙容量可以在大约50至90％之间，可以在大约50至70、60至70、70至80、80至90或75至85％之间，并且可以是50、55、60、65、70、75、80、85或90％。其容积密度可以在大约0.2至1g/ml之间，或者在大约0.5至1、0.2至0.5、0.2至0.4、0.2至0.3、0.3至0.4或者0.25至0.35g/ml之间，并且其容积密度可以为大约0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1g/ml。
载体可以是疏水载体。该方法可以包括使多孔载体疏水化的步骤。疏水化步骤可以包括使多孔载体暴露于疏水化试剂。疏水化试剂可以位于溶液中，其可以溶解在溶剂中。疏水化试剂可以具有能够与多孔载体发生反应的基团，还可以具有至少一个疏水基团。例如，如果疏水载体包括硅石，那么疏水化试剂可以包含可水解基团，例如氯代甲硅烷基、烷氧基硅烷基、硅氮烷基或者一些其它的适当基团。疏水试剂可以是硅烷，例如卤代硅烷、硅氮烷或者烷氧基硅烷或者一些其它类型的可水解硅烷(例如乙酰氧基硅烷、肟基硅烷、酰胺基硅烷等)。疏水基团可以是烷基，例如C1至C24烷基或者大于C24的烷基，或者是芳基，例如C6至C12芳基，或者是一些其它的适当疏水基团。烷基可以是直链或支链的，可以具有1至24个碳原子，或者1至18、1至12、1至6、6至24、12至24或者6至18个碳原子，并且可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22或24个碳原子。其可以包括环烷基，例如环戊基、环己基或环庚基。芳基可以是，例如，苯基、联苯基、萘基或者一些其它的芳基。芳基或烷基可以是氟化的、多氟化的或全氟化的。疏水化试剂的每个分子上可以具有1、2、3个或多于3个疏水基团。其分子式可以是，例如，RnSiX4-n或RMe2SiCl，其中R为疏水基团，X为可水解基团，n为1、2或3。另外可选地，疏水化试剂可以包括硅氧烷或环硅氧烷。适当的疏水化试剂可以包括氯代二甲基辛基硅烷、氯代二甲基十八烷基硅烷、甲氧基三甲基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、六甲基二硅氮烷、六甲基二硅氧烷、十甲基环戊硅氧烷(DS)或其它环硅氧烷。疏水化方法可以包括使多孔载体在大约10至80℃的温度下在疏水化试剂(任选地连同催化剂)中暴露大约1至48小时，例如暴露1至24、1至12、12至48、24至48或者12至36小时(例如大约1、2、3、4、5、6、12、18、24、30、36、42或48小时)。温度可以为大约10至60、10至40、10至20、20至80、40至80、60至80、20至60或者40至60℃，并且可以为大约10、20、30、40、50、60、70或80℃。催化剂可以取决于疏水试剂和多孔载体的性质。其可以是，例如，叔胺，并且可以是例如三甲胺或三乙胺、吡啶或者一些其它的碱。疏水化试剂和催化剂(如果存在的话)可以溶解在溶剂中。溶剂可以是有机的，并且可以是非羟基的，可以是例如甲苯、二甲苯或一些其它的适当溶剂。暴露可以包括将多孔载体浸渍在溶剂中的疏水化试剂溶液中，可以包括搅拌、涡流、振荡、超声或以其它方式搅动其中有多孔载体的溶液，或者其可以包括使溶液穿过多孔载体，任选地使溶液穿过多孔载体循环。本发明还预计其它类型取决于多孔载体和生物物种的性质可能适当的化学修饰。
在进行化学修饰和/或疏水化之前可以将多孔载体脱气和/或干燥。可以将其加热至大约100至200℃的温度，例如100至150、100至120、150至200、170至200或者125至175℃(例如大约100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200℃)。可以有经加热并任选干燥过的气体在上文列举的温度下穿过其中。可以有经加热并任选干燥过的气体在大气压下穿过其中。其可以在上文列举的温度下暴露于真空下。真空的绝对压力可以为低于大约10-2torr，或者低于大约5×10-3、10-3、5×10-4、10-4、5×10-5、10-5、5×10-6或10-6torr，或者绝对压力可以为大约10-2至10-6torr，或者大约10-3至10-6torr、大约10-4至10-6torr、大约10-5至10-6torr、大约10-3至10-5torr或者大约10-4至10-5torr，压力可以为大约5×10-3、10-3、5×10-4、10-4、5×10-5、10-5、5×10-6或10-6torr。
进行化学修饰(如疏水化)之后，可以将多孔载体洗涤一次或多次。每次洗涤可以用不同的洗涤溶剂，或者数次洗涤可以使用相同溶剂。溶剂可以是水相或有机的。有机溶剂可以是极性或非极性的。适当的溶剂包括水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和二甲苯，还可以是适当溶剂的任意混溶组合。任意或全部洗涤之后，可以干燥多孔载体。干燥可以包括，例如，加热(例如上文所述)、使气体穿过多孔基质或者将多孔基质暴露于真空(例如上文所述)。气体可以是空气、氮气、二氧化碳或一些其它气体，并且可以加热，也可以不加热。
在使生物物种穿过多孔载体的步骤之后，可以将多孔载体洗涤一次或多次，如上文所述。任意或全部洗涤之后，可以干燥多孔载体。干燥可以包括，例如，加热、使气体穿过多孔基质或者将多孔基质暴露于真空。气体可以是空气、氮气、二氧化碳或一些其它气体，并且可以加热，也可以不加热。加热(和/或经加热的气体)可以采用不会使生物物种降解或变性的温度。这将取决于生物物种的性质。其上负载有生物实体的多孔载体可以是热稳定的。其可以在高达大约50℃的温度下，或者在直至大约60、70、80、90或100℃的温度下保持热稳定。加热至该温度大约15小时，或者大约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5小时之后，催化活性的丧失可以低于大约10％，或者低于大约9、8、7、6、5、4、3、2或1％。加热可以在空气或一些惰性气体中进行，如氮气或二氧化碳，或者其可以在真空下进行。
根据本发明的其中固定有生物物种的多孔载体可以用于催化起始物质生成产物的化学反应。化学反应可以是可由生物物种催化的化学反应。其可以是不对称反应，可以是生成手性产物的反应。手性产物的对应异构过量可以为大于大约95％，或者大于大约96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9％，并且可以为大约95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％。对应异构过量可以大致如同用未固定在固体载体上的生物物种进行一样，或者可以有所不同。
反应催化方法可以包括使溶剂中的起始物质溶液穿过多孔载体，或者其可以包括将多孔载体悬浮、搅拌或以其它方式分布在溶液中。溶液还可以包含试剂，所述试剂能够在生物物种的影响下与起始物质反应生成产物。溶剂可以是任何能够溶解起始物质和试剂(如果存在的话)的适当溶剂。其可以是水相溶剂或有机溶剂，或者是水相溶剂和有机溶剂的混合物。适当的溶剂包括水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和二甲苯，以及溶剂的组合。因此，通过使溶液中的起始物质液流任选地连同试剂一起穿过多孔载体，反应可以连续进行。另外可选地，其可以分批进行，其中，例如，单个批次包括使一批溶液中的起始物质任选地连同试剂一起与多孔载体接触，留出足够长的反应时间。在两种情况下，起始物质与多孔载体接触足够长时间以使反应发生是非常重要的。足够长的时间取决于起始物质的性质、反应的性质和多孔载体的性质(例如生物物种在多孔载体上的负载)。足够长的时间可以为大约10分钟至24小时。足够长的时间可以为10分钟至12小时、10分钟至6小时、10分钟至3小时、10分钟至1小时、10至30分钟、1至24小时、6至24小时、12至24小时、18至24小时、1至12小时或者1至6小时，并且可以为大约10、20、30、40或50分钟，或者大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者可以多于24小时。如果反应如上文所述连续进行，溶液穿过其中固定有生物物种的多孔载体的流速可以为足以留出足够长的时间以使反应发生。因此流速可以为低于或一个柱长/段足够长的时间(如上文详述)。因此，实际流速(例如以ml/min为单位)将取决于其中固定有生物实体的多孔载体所在的容器(如柱子)的大小(特别是横截面积)。例如，可以通过调节施加于含有起始物质的溶液上的压力来调节流速。
该方法还可以包括一个或多个如下步骤：
——从溶液中分离出多孔载体，
——洗涤多孔载体，
——干燥多孔载体，和
——从溶液中分离出产物。
分离出多孔载体的步骤可以包括过滤、离心、超速离心、沉降、倾析或者这些方式的组合，或者其可以包括一些其它的适当方法。洗涤步骤可以包括将多孔载体悬浮在洗涤液中，搅拌、涡流、振荡、超声或以其它方式搅动洗涤液中的多孔载体，使洗涤液穿过多孔载体，或者这些方式的任意组合。洗涤液可以是任何适当的溶剂，例如水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和二甲苯，或者其可以是多种溶剂的组合。洗涤步骤可以进行数次，并可以使用不同的洗涤液进行。每一次洗涤步骤之后，可以对多孔载体进行干燥，或者也可以不进行干燥。干燥可以包括，例如，加热、使气体穿过多孔基质或者将多孔基质暴露于真空。气体可以是空气、氮气、二氧化碳或一些其它气体，可以加热，也可以不加热。加热(和/或经加热的气体)可以采用不会使生物物种降解或变性的温度。这将取决于生物物种的性质。在穿过或循环过程中可以使用低温，例如0℃。在生物物种不稳定的情况下这一点可以是有用的。低温可以为大约0至25℃，或者大约0至20、0至15、0至10、0至5、5至10、10至15、15至20、20至25、5至20、5至15或者10至20℃，并且可以为大约0、5、10、15、20或25℃。从溶液中分离出产物的步骤可以使用任何本领域已知的方法进行。这些方法可以包括，例如，以下方式中的一种或多种：制备HPLC、制备GC、柱层析、蒸发、蒸馏、重结晶、溶剂沉淀或升华。
其上固定有生物实体的载体可以在多次重复使用，即，在任意批次(第一批除外)中其上固定有生物实体的载体可以在之前的反应中已经使用过。其可以重复使用超过1批次，或者超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20批次。任意一次重复使用时的催化活性比原始催化活性降低少于大约20％，或者少于大约20、15、10或5％，可以降低少于大约0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、10、15或20％。
实验
材料
载体材料为中结构多孔泡沫(MCF)和FDU-12，其根据文献方法合成(Schmidt-Winke等人，Science，1999，548、Lettow等人，Langmuir，2000，16，8291和Fan等人，Angew.Chem.Int.Ed.，2003，42，3146)。游离酶南极假丝酵母(Candida Antarctica)2脂肪酶B(CALB)购自Roche。Novozyme 435(商品化的固定化酶)由Novo Nordisk提供。氯代二甲基辛基硅烷和氯代二甲基十八基硅烷均购自Aldrich。
方法
中孔材料的化学修饰
采用两种长链烷基辛基和十八烷基制备疏水中孔材料。在150℃下真空脱气过夜后，将MCF(3.0g)悬浮在甲苯(40ml)中，然后在搅拌条件下依次加入三乙胺(12.0mmol，1.67ml)和氯代二甲基辛基硅烷(6.0mmol，1.42ml)。将悬浮液在60℃下搅拌24小时，过滤。固体用甲苯、甲醇、丙酮和二氯甲烷洗涤数次，真空干燥。经修饰的MCF称为MCF-C8。MCF-C18用相同方法制备，除了用氯代二甲基十八基硅烷(6.0mmol，2.08g)代替氯代二甲基辛基硅烷。另外用FDU-12代替MCF采用同样的方法制备FDU-12-C8。
酶的固定化
传统的负载方法
将官能化的MCF(0.6g)在50ml CALB原溶液(8mg/ml)中剧烈搅拌24小时，将悬浮液过滤，并用蒸馏水和己烷洗涤。真空干燥后，根据游离酶当中氮的比例对样品进行酶负载的C、H、N分析。通过Bradford检验测量固定化后上清液中的蛋白量，对结果进行证实。
压力驱动的负载方法
将官能化的MCF(0.6g)悬浮在环己烷中，然后使用浆料填充器在高压下将其装入高压液相色谱(HPLC)柱(100mm×4.6mm)中。将填充好的柱子在真空下充分干燥。使酶的原溶液(50ml，8mg/ml)在5000psi(大约35MPa)的高压下穿过硅石柱循环2小时。然后从柱当中收集负载有酶的硅石，用蒸馏水和己烷洗涤，在真空下干燥。通过C、H、N分析和Bradford检验测定酶的负载，如上一部分所述。催化反应
用乙酸异丙烯酯对1-苯基乙醇进行动力学拆分，以评价催化活性(方案1)。
方案1：通过CALB用乙酸异丙烯酯对1-苯基乙醇进行动力学拆分
在典型的步骤中，将一定量的催化剂(含固定的CALB总负载10mg)悬浮在干燥的甲苯(15ml)中。然后在室温下依次加入1-苯基乙醇(10.8mmol，1.34ml)和乙酸异丙烯酯(17.4mmol，1.58ml)。反应用气相色谱(GC)来监控，直至达到完全转化。然后通过HPLC测量对映异构过量(％ee)。
催化剂回收
反应结束后，将催化剂过滤，并用甲醇洗涤数次，在真空下干燥。对干燥的催化剂进行重新称重，以确定新的反应循环中所用底物的精确量。
填充床反应器
通过压力驱动的方法使用250mm×4.6mm HPLC柱将CALB固定化到MCF-C18上。将柱子在高压下(2000psi)用蒸馏水洗涤数次。然后将其在真空下干燥，并直接用作填充床反应器。使甲苯中0.65M的1-苯基乙醇和0.97M的乙酸异丙烯酯穿过填充床反应器流动。为了确定实现全部充分转化用的流速，通过GC对产物进行连续分析。
结果和讨论
固定化MCF的表征
焙烧的MCF具有明确的超大中孔，其平均孔径为24nm。其孔隙容量和表面积分别为2.2cm3/g和680m2/g。可以容易地通过改变合成条件对孔径加以控制。用C8基团修饰MCF使孔径降低2nm(表1)。当用C18基团修饰时，MCF的孔径降低了4nm。MCF-C8和MCF-C18的表面积和孔隙容量也低于未经修饰的MCF(表1)。
                 表1.负载CALB的中孔硅石的特性
  孔径(nm)/窗口尺度(nm)   孔隙容积(cm3/g)      酶负载(mg/g)
  通过搅拌   通过压力
  MCF-C8   21.3/12.1   1.60   92   275
  MCF-C18   20.0/10.6   1.27   65   250
  FDU-12-C8   9.1/3.5   0.454   30   98
酶的负载
与传统方法相比，压力驱动法在更短的时间内在MCF-C8、MCF-C18和FDU-12-C8上的酶负载量更高(高3至4倍)(表1)。例如，搅拌24小时产生的酶负载为92mg/g MCF-C8，而压力驱动法仅用2小时便达到275mg/g MCF-C8的酶负载，FDU-12-C8的孔径和孔隙容量小于MCF-C8，其显示的酶负载低于MCF-C8。另外，压力驱动法比传统方法显示出更高的酶负载。
1-苯基乙醇的动力学拆分中的活性和选择性
在室温下在甲苯中通过CALB对1-苯基乙醇进行酰基化。压力驱动法制备的CALB/MCF-C8和CALB/MCF-C18显示出相似的催化活性(见图1)。在典型的反应条件下(见上文“催化反应”)，两种情况下，5小时后(R)-1-苯基乙醇均完全转化为(R)-1-苯基乙基乙酸酯(即50％的转化率)。与此相反，游离CALB显示出较低的反应速率，5小时内转化率达45.5％。通常，游离酶在有机溶剂中形成聚集体。通过将CALB均匀地负载在MCF硅石的中孔内，可以避免或减少聚集，从而给出更高的酶催化活性。图1中的全部3种催化剂均表现出高的对映异构选择性(ees＞99.7，和eep＞99.7)，这说明压力驱动法未改变CALB的选择性。(ees是指底物亦即剩余反应物的对映异构选择性，eep表示产物的对应异构选择性。)
多次运行反应的酶溶出
反应过程中的任何酶溶出均导致后续运行中的转化率降低。其可以通过C、H、N分析来进行定量测定。通过传统方法制备的CALB/MCF-C8运行5次后转化率显著降低(从50％至37％)(图2a)。与此相反，通过压力驱动法制备的CALB/MCF-C8在运行8次后或反应48小时后转化率仅有少量降低(从50％至46.5％)(图2b)。C、H、N分析的结果显示，当通过传统方法固定时，运行5次后超过65％的CALB自MCF-C8溶出(见表2)。
             表2.不同反应循环中的MCF-C8酶负载
                 酶含量(mg/g)
 第1次循环之前  第5次循环之后  第8次循环之后
  传统方法  92  30  -
  压力驱动法  275  -  250
通过压力驱动法引入时，CALB大多数保留在中孔载体内，运行8次后仅检测到10％的溶出。我们注意到压力驱动法不仅提高了酶的负载，而且降低了酶的溶出。
通过压力驱动法，酶分子可能被推入至位于MCF-C8中孔的内部。与此相反，在传统的搅拌方法中，相当大量的酶分子可能弱吸附在载体的外表面上。这样便解释了两种固定化方法在酶溶出量之间的差异。
通过压力驱动法对酶进行负载之后，固定化的酶催化剂用蒸馏水洗涤数次。通过Bradford检验知，洗涤后的滤液中不含任何的酶。这也说明了酶被稳固地捕获在MCF-C8的中孔内。
可重复使用性评价
对通过压力驱动法制备的CALB/MCF-C8和CALB/MCF-C18的可重复利用性与市售的Novozyme 435进行比较。与Novozyme 435相比，CALB/MCF-C8和CALB/MCF-C18在多次运行后显示出更好的1小时转化率(图3)。这项研究表明通过压力驱动法固定化在中孔硅石载体上的酶具有比固定化在市售聚合物基质上的酶(Novozyme 43)更稳定的活性。
热稳定性
为了考查其热稳定性，将游离酶和固定化酶在80℃下处理15小时，然后用动力学拆分反应进行测试。压力驱动法制备的CALB/MCF-C8没有显示出任何热处理导致的活性丧失(图4a)。与此相反，传统方法制备的CALB/MCF-C8和Novozyme 435在热处理之后则显示出相当大的活性降低(图4b和4c)。游离CALB经热处理后严重失活，丧失了绝大多数活性(图4d)。这项研究表明该方法可以特别有效地固定化酶催化剂以达到更高的热稳定性。
CALB/MCF-C18填充床反应器
通过压力驱动法用250mm×4.6mm的HPLC柱制备CALB/MCF-C18填充床反应器。在甲苯中用0.65M 1-苯基乙醇和0.97M乙酸异丙烯酯，在1.5ml/mm的流速下实现了将(R)-1-苯基乙醇完全转化为(R)-1-苯基乙基乙酸酯。低于0.5ml/mm的流速给出来自乙酸异丙烯酯通过CALB聚合的白色产品。这一聚合产物增加了反压力。聚合在最优化的反应条件下(1.5ml/mm)并未发生。填充床反应器的活性和对映异构选择性在连续反应6小时的过程中没有改变。
结论
新的压力驱动酶固定化法大大提高了酶在疏水中孔硅石载体上的负载。实现了达到280mg/g载体的非常高的负载。固定化的酶在多次运行中比市售的Novozyme 435表现出更低的溶出。新的固定化方法也使得酶的热稳定性大为提高。通过压力驱动法制备的CALB/MCF-C18成功地用作填充床反应器。
这一方法可以广泛地应用于将其它的酶固定化在中孔硅石上。本研究还表明MCF是酶的固定化用的优良载体。可以容易地对MCF的孔径加以控制，以优化不同尺寸的酶的负载。

Claims (36)

1.使生物物种在多孔载体中固定化的方法，包括使含有生物物种的流体在高压下穿过所述多孔载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述压力高于大约10MPa。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述压力为大约25至50MPa。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的生物物种是酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的流体是水相液体。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔载体包括多孔硅石。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔载体的平均孔径为大约2至50nm。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔载体包括中孔硅石泡沫。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔载体是疏水的。
10.根据权利要求1所述的方法，包括在使所述液体穿过所述多孔载体之前使所述多孔载体疏水化的步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，包括使所述流体在高压下穿过所述多孔载体循环的步骤。
12.根据权利要求1所述的方法，包括在使所述流体穿过所述多孔载体之前干燥所述多孔载体。
13.其中固定有生物物种的多孔载体，其中所述多孔载体中固定的生物物种负载比通过大气压下进行的方法在其中固定生物物种的多孔载体高。
14.其中固定有生物物种的多孔载体，通过包括使含有该生物物种的流体在高压下穿过所述多孔载体的方法制造。
15.根据权利要求14所述的多孔载体，其中，在所述方法中，所述压力高于大约10MPa。
16.根据权利要求14所述的多孔载体，其中，在所述方法中，所述压力为大约25至50MPa。
17.根据权利要求14所述的多孔载体，其中所述的生物物种是酶。
18.根据权利要求14所述的多孔载体，其中，在所述方法中，所述流体是水相液体。
19.根据权利要求14所述的多孔载体，所述多孔载体包括多孔硅石。
20.根据权利要求14所述的多孔载体，所述多孔载体的平均孔径为大约2至50nm。
21.根据权利要求14所述的多孔载体，所述多孔载体包括中孔硅石泡沫。
22.根据权利要求14所述的多孔载体，所述多孔载体是疏水的。
23.根据权利要求14所述的多孔载体，其中所述方法包括在使液体穿过所述多孔载体之前使所述多孔载体疏水化的步骤。
24.根据权利要求14所述的多孔载体，其中所述方法包括使所述流体在高压下穿过所述多孔载体循环的步骤。
25.根据权利要求14所述的多孔载体，其中所述方法包括在使所述流体穿过所述多孔载体之前干燥所述多孔载体。
26.其中固定有酶的疏水中孔硅石载体，其通过包括下列步骤的方法制备：
使所述硅石载体疏水化，
干燥所述硅石载体，和
使含有所述酶的水相液体在高压下穿过所述硅石载体循环。
27.化学反应催化方法，包括将起始物质暴露于其中固定有生物物种的多孔载体，其中所述生物物种包括能够催化所述起始物质反应生成产物的酶，并且其中所述固定有生物物种的多孔载体是通过包括使含有所述生物物种的流体在高压下穿过所述多孔载体的方法制造的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述产物是手性产物。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述起始物质在溶液中。
30.根据权利要求29所述的方法，包括使所述溶液穿过所述其中固定有生物物种的多孔载体。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述溶液还包含试剂。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述其中固定有生物物种的多孔载体是在较早的反应中使用过的。
33.通过由权利要求27至32中任意一项所述的方法催化的化学反应制备的产物。
34.将起始物质转化成产物的反应器，包括通过包括使含有生物物种的流体在高压下穿过多孔载体的方法制造的其中固定有生物物种的多孔载体，所述多孔载体位于外壳中，并且所述生物物种能够将所述起始物质转化成产物。
35.制备将起始物质转化成产物的反应器的方法，包括用其中固定有生物物种的多孔载体至少部分填充外壳，所述其中固定有生物物种的多孔载体是通过包括使含有生物物种的流体在高压下穿过多孔载体的方法制备的，其中所述的生物物种能够将所述起始物质转化成产物。
36.制备将起始物质转化成产物的反应器的方法，包括：
——用多孔载体至少部分填充外壳；和
——通过包括使含有生物物种的液体在高压下穿过多孔载体的方法，将生物物种在多孔载体中固定化；
其中，所述生物物种能够将所述起始物质转化成产物。
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