JPS6279785A - 酵素固定用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の利用分野） 本発明は、酵素を固定するに通した酵素固定用担体に関
するものであり、更に詳細には酵素握持能力に優れ、担
持酵素の活性発現率の高い酵素固定用担体に関するもの
である。

（従来の技術） 酵素はある種の化学反応に於いて触媒的作用を発現する
ことより種々の分野で利用されており、反応終了後反応
生成物よりの分離が容易で、更には再使用が可能なよう
に担体上に担持されて使用される場合が多い。例えば米
国特許出願第３３２８０７号を引用して特公昭５８−１
９２７４号公報には酵素又はその基質のより大きいもの
と少なくとも同じ大きさでかつ、約１０００人未満の平
均孔直径を有し、約４から２００メソシユの平均粒子よ
りなる多孔質無機坦体に酵素を吸着させる方法、無機担
体にシランカップリング剤を結合させ、このシランカッ
プリング剤と酵素を共有結合させる方法（米国特許第３
５１９５３８号明細書）が教示されている。

しかし、前記方法においては酵素と担体との結合力（ｆ
＃素握持力）が弱く、後者の方法においては酵素と担体
の結合力は強いものの酵素の付着量が少ないという欠点
を有している。それ故後者の方法で、使用する担体とし
て前者の方法で特定された物性を有する担体を用い、担
体に対する酵素の付着量を改良することを試みた結果、
酵素の付着量の向上は見られたものの付着酵素量に見合
う活性の発現（以下、活性発現率という）がなく、活性
が著しく低いという欠点を有している。

（発明が解決しようとする問題点） かかる事情下に鑑み、本発明者らは酵素握持力、酵素付
着能力に優れ、付着酵素の活性発現率の高い酵素固定用
担体を見出すべく鋭意検討した結果、担体として特定の
物性を有するアルミナ成形体又はアルミナ含有成形体を
用い、これにシランカップリング剤を結合せしめる場合
には上記目的を満足する酵素固定用担体と成し得ること
を見出し、本発明を完成するに至った。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、半径１０００〜１００００Åの間の細孔の占
める容積が０，０２〜１ｃ＋ａ／ｇ、ＢＥＴ比表面積が
５〜５０ｔｒｒ／ｇのアルミナ成形体又はアルミナ含有
成形体にシランカップリング剤を結合してなる酵素固定
用担体を提供するにある。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明に通用するアルミナ又はアルミナ含有担体として
は半径１０００〜１００００人の間の細孔の占める容積
が０．０２〜１　ｃｌ　／　ｇ　、好ましくは０．０３
〜０．５ｃｄ／ｇ、ＢＥＴ比表面積が５〜５０ｍ／ｇ、
好ましくは１０〜４０ｍ２／ｇの特性を有するものであ
る。半径１０００〜１００００人の間の細孔の占める容
積が０．０２ｃｓＡ／ｇより少ない場合には活性発現率
が低く、他方１ｃＩＩｌ／ｇを越える場合には強度低下
による使用中の粉化が多くなり好ましくない。

又担体のＢＥＴ比表面積が５ｍ’／ｇより小さい場合に
は付着する酵素量が減少し、他方５０ｎ（／ｇを越える
場合には活性発現率が低下し、好ましくない。

酵素担体として使用するアルミナ成形体又はアルミナ含
有成形体の粒径は１０〜２００メツシュ、好ましくは２
０〜１５０メツシュのものが使用される。成形体の粒径
が２００メソシユより小さくなると固液分離の場合の濾
過性が悪くなり、他方１０メソシユより大きくなると活
性発現率が低下する傾向が見られる。

このような物性を有するアルミナ成形体或いはアルミナ
含有成形体の製造方法としては上記物性が得られる方法
であれば特にその手段を限定するものではないが、例え
ば遷移アルミナ又は遷移アルミナ含有物、水及び炭素数
１０〜２０の脂肪酸のソーダ、カリ又はアンモニウム塩
、炭素数１０〜１５のアルキル基を有するアルキルベン
ゼンスルフォン酸のソーダ、カリ又はアンモニウム塩、
炭素数１０〜２０の高級アルコール硫酸エステル塩及び
ポリオキシエチレン付加物の硫酸エステル塩からなるグ
ループから選ばれた少なくとも１種の起泡剤とを撹拌混
練して泡沫状物を造り、該泡沫状物、或いは泡沫状物か
ら泡沫を消失せしめた塊状物、又は顆粒状物を水中又は
水蒸気中でキュアーし、顆粒状のアルミナ、アルミナ含
有成形体を得る方法が挙げられる。

該方法において使用される原料遷移アルミナの粒子径は
遷移アルミナ、水及び起泡剤の使用割合、起泡剤の種類
等により変わるが、一般には約５０μ以下、好ましくは
３０μ以下の平均粒子径のものが用いられる。

遷移アルミナ含有物とは遷移アルミナと例えば水酸化ア
ルミニウム、α−アルミナ、シリカ、粘土、カオリン、
ゼオライト、コージェライト、マグネシア、チタニア、
ムライト、シリカアルミナ、無機質ファイバー等の約５
０μ以下、好ましくは３０μ以下の大きさのものとの混
合物をいい、これらは遷移アルミナ１００重量部に対し
て２０００重量部以下、より適当には１’ＯＯ重量部以
下を混合して使用することができる。

遷移アルミナ又は遷移アルミナ含有物は水１００重量部
に対して一般に１０〜５００重量部、好ましくは５０〜
３００重量部が用いられ、遷移アルミナ又は遷移アルミ
ナ含有物の添加割合が１０重量部未満になると生産性が
低く経済的でなく、又５００重量部を越すと混練が困難
となるので好ましくない。

起泡剤としては遷移アルミナ又は遷移アルミナ含有物の
存在下に泡沫を形成し、泡沫の発生により遷移アルミナ
又は遷移アルミナ含有物を顆粒状化し得るものが使用さ
れ、例えばラウリル酸、ミリスチン酸、バルミチン酸、
オレイン酸、リノール酸等炭素数１０〜２０の脂肪酸の
ソーダ、カリ又はアンモニウム塩、デシル、ドデシル、
トリデシル、テトラデシル等炭素数１０〜１５のアルキ
ル基を有するアルキルベンゼンスルフォン酸のソーダ、
カリ又はアンモニウム塩、ラウリルアルコール、セチル
アルコール、オレイルアルコール、バルミチルアルコー
ル、ステアリルアルコール等の炭素数１０〜２０の高級
アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン付加物
の硫酸エステル塩等が挙げられる。起泡剤は一般に水１
００重量部に対して０．５〜２５重量部、好ましくは１
．０〜１０重量部用いられる。

起泡剤は水と各々別々に添加してもよいし、水に起泡剤
を熔かし、た形でも、或いは少量の酸、アルカリ、有機
溶剤、アルコール等の泡沫安定化剤を含ませた形で添加
してもよい。

上述した各成分は前記した使用割合下に泡沫が発生し、
遷移アルミナ又は遷移アルミナ含有物が泡沫に十分に分
散するまで撹拌混練される。撹拌混練方法としてはマイ
クロスピードミキサー、ホバートミキサー、攪住播漬機
、ガス吹込み、手動攪拌等原料を十分に混練し、泡沫を
発生せしめる通常の攪拌手段であればいかなるものでも
用いることができる。

撹拌混練温度は通常常温〜８０’Ｃで、攪拌時間は用い
る攪拌手段により大きく依存するが、一般に数秒以上、
通常は３０秒〜６０分間程度行えばよい。

得られた泡沫状物は次いで水洗、水中に浸漬、水蒸気吹
込み等の方法により泡沫を消失せしめ、直接顆粒状アル
ミナ粒子を製造するか、或いは消泡剤を散布するか、ま
たはそのまま自然乾燥又は加熱乾燥等の方法により泡沫
状物の泡沫を消失せしめ、遷移アルミナまたは遷移アル
ミナ含有物の顆粒状物の集合した塊状物とし、次いで振
動機、手動加圧ミキサー等の公知の手段により解砕し、
顆粒状アルミナ粒子を製造する。顆粒状アルミナ粒子の
強度を向上せしめる目的で前記した顆粒状アルミナ粒子
の製造過程中の物、即ち泡沫状物、泡沫を消失せしめた
塊状物又は生成顆粒状物を水中または水蒸気中でキュア
ーすることが推奨される。

水中または水蒸気（勿論他のガスとの混合物であっても
よい。）中キュアーとは泡沫状物、泡沫を消失せしめた
塊状物又は生成顆粒状物を通常４０〜１００℃、好まし
くは８０〜１００℃の水中又は４０〜１６０℃、好まし
くは８０〜１５０℃の水蒸気中に保持し、再水和させる
ことをいう。キュアーは一般に１分以上、好ましくは１
０分〜２４時間上記雰囲気下に保持すればよい。

細孔容積を付与する方法としては原料の粒度分布を調整
する方法の他に遷移アルミナもしくは遷移アルミナ含有
物に可燃性物質を添加存在せしめ、得られ°た顆粒状物
を加熱し、可燃性物質を焼失させる方法が挙げられる。

このような可燃性物質としては活性炭、木屑、結晶セル
ロース、メチルセルロース、澱粉等を用いることができ
る。これら可燃性物質の添加量は原料遷移アルミナもし
くは遷移アルミナ含有物の粒径四分偏差値がＸの場合、
添加量をＹと置くと ｏ７　　　　　　　　　＋、’７ １００（Ｘ−１）≧Ｙ≧８　　（Ｘ−１）　−１，７（
但し右辺の値が負の時はＹ≧０とする。）となる範囲で
添加すればよい。具体的には原料としての遷移アルミナ
もしくは遷移アルミナ含有物の粒径分布は四分偏差値で
表して１．０５〜３のものが好適に用いられるので、通
常これら１００重置部に対し可燃性物質を２０００重量
部以下、好ましくは４００重量部以下、より好ましくは
１００重量部以下の範囲で使用される。

得られた顆粒状担体は適当な温度で焼成される。

焼成温度は最終の酵素固定用担体として必要な細孔径及
び比表面積を与える温度が選ばれる。通常このような温
度は９００〜１５００℃、好ましくは１０００〜１４０
０℃である。焼成温度が１１０°Ｃを越える場合には強
度保持のためＳ　ｔ　−、Ｍ　ｇの酸化物等を存在させ
ておくことが好ましい。

このようにして得たアルミナ又はアルミナ含有担体は粒
径分布がシャープで比較的大孔径の細孔を有し、比表面
積が広いにもかかわらず通常の粉砕等によって得られる
アルミナ又はアルミナ含有坦体に比較し、機械的強度に
著しく優れ、摩耗或いは粒子構成物の崩壊による反応系
内への異物の混入がないので、反応生成物を再精製する
必要がなく、酵素用担体として特に推奨し得るものであ
る。

このようにして得たアルミナ又はアルミナ含有担体は、
必要により水洗又は適当なｐＨの水溶液で洗浄後シラン
カップリング剤と結合させる。本発明に使用するシラン
カップリング剤及びその結合方法は公知の物、方法でよ
く、特に制限はないが例えばＮ−β（アミノエチル）γ
−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β　（アミ
ノエチル）γ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン
、ＴＯ−アミノプロピルトリエトキシシラン等の水又は
トルエン等の溶媒を用い、これに担体を含浸し結合せし
めればよい。

シランカップリング剤を担持したアルミナ担体若しくは
アルミナ含有担体をシランカップリング剤がアミノ基を
有する場合はグルタルアルデヒド、グリオキザール等の
二官能性試薬のアルデヒド基を介して、又例えばエポキ
シ基、メルカプト基を有する場合は直接酵素水溶液と反
応させて酵素を担体に固定化させる。

本発明に通用し得る酵素は特に限定されないが、アルカ
リンフォスフエイト、アルカリンプロテアーゼ、Ｌ−ア
ミノアシッドオキシダーゼ、アミノペプチダーゼ−Ｍ、
アミノアシラーゼ、了りルサルファターゼ、カルバミル
フォスフォキナーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、α−キ
モトリプシン、ディオキシリボヌクレアーゼ−■、フィ
シン、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グル
コースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソ
キナーゼ、インベルターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ロ
イシンアミノペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、ペル
オキシダーゼ、プロナーゼ、ステロイドエステラーゼ、
トリプシン、ウレアーゼ等が挙げられる。

本発明において何故半径１０００〜１００００人の間の
細孔の占める容積が０．０２〜ｌａｄ／ｇでかつ、ＢＥ
Ｔ比表面積が５〜ｂ アルミナ成形体又はアルミナ含有成形体が活性発現率に
優れているか、その理由は詳らかではないが、酵素反応
における反応物の粒内拡散が速くなるため、酵素が有効
に働くためと推定される。

（実施例） 以下本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、こ
こに記載する実施例は本発明の一実施態様例であり、本
発明を何等制限するものではない。

又、実施例中において活性発現率とは担体に固定化され
た酵素が示す活性を担体に固定化した酵素が可溶性酵素
として示す活性で除した値を％で示した。

〔試料の製造〕

試料−１ バイヤー法で得られたアルミナ三水和物を瞬間力焼して
得られた灼熱減量５重量％の遷移アルミナを平均粒径７
μに粉砕し、粉砕した遷移アルミナ１００重量部に結晶
性セルロース５重量部及びシリカゲル粉末３重量部を加
え混合した後、この混合物（四分偏差値１．８５）１０
０重量部を分取し、ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ
３％水溶液５５重量部とをホバートミキサー中に入れ、
５分間攪拌発泡せしめた。

発泡物を密閉容器に移し、２０時間静置後９０℃の水中
に投入し１時間攪拌処理し、次いで濾過、水洗し、１０
５℃の温度で２０時間乾燥後乾燥物を解砕、篩別し、１
４〜４２メツシュの顆粒状物を得た。

このようにして得た顆粒状物を電気炉中で温度１２００
℃、１時間焼成し、嵩密度０．８５ｇ／ｃｆｆｌ、耐摩
耗性０．６％、ＢＥＴ比表面積２５ｒｒｆ／ｇ、２５０
人の細孔の容積０．４０ｃＪ／ｇ、２５０〜１０００人
の間の細孔の容積０．１０　ｃｔｌ／　ｇ、１０００〜
１００００人の間の細孔の容積０．０３ｃｄ／ｇの物性
を有する焼成アルミナを得た。

このようにして得た焼成アルミナ１００ｇを５ｇのＮ−
β（アミノエチル）Ｔ−アミノプロピルトリメトキシシ
ランを含有する３００ｇの水溶液中に浸漬し、シェカー
中で３Ｏｒｐｍ、１５時間攪拌した後濾過、真空脱気し
、酵素固定用担体を得た。（尚濾過後の溶液中にはＮ−
β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシ
ランは検出されなかった。） 試料−２ 試料−１において結晶性セルロースを２０重量部、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ソーダ３％水溶液の量を５８重
量部に変更した以外は全く同様にし−ご酵素固定用担体
を得た。シラン化処理前の焼成アルミナの物性を第１表
に示す。

試料−３ 試料−１において結晶性セルロースを１１０重量部、ド
デシルベンゼンスルホン酸ソーダ３％水溶液の量を７１
Ｍ量部に変更した以外は全く同様にして酵素固定用担体
を得た。シラン化処理前の焼成アルミナの物性を第１表
に示す。

試料−４ 試料−１において結晶性セルロースを用いず、ドデシル
ベンゼンスルホン酸ソーダ３％水溶液の量を５３重量部
に変更した以外は全く同様にして酵素固定用担体を得た
。シラン化処理前の焼成アルミナの物性を第１表に示す
。

試料−５ 試料−１における電気炉での焼成温度を６００℃に変更
した以外は全く同様にして酵素固定用担体を得た。シラ
ン化処理前の焼成アルミナの物性を第１表に示す。

試料−６ 試料−１における電気炉での焼成温度を１６００°Ｃに
変更した以外は全く同様にして酵素固定用担体を得た。

シラン化処理前の焼成アルミナの物性を第１表に示す。

試料−７ 市販の平均粒径２４メツシュの粉砕活性アルミナ（商品
名Ｆ−１、アルコア社製）１００ｉ！１部を１０％５ｉ
Ｏ９のシリカゾル溶液中に１０分間含浸した後乾燥し、
電気炉中で１２００℃、１時間焼成した。このようにし
て得た成形体は第１表に示す物性を有していた。この成
形体を試料−１と同一の方法でシランカップリング処理
した。攪拌時担体の摩耗が激しかったため真空脱気に先
立って濾過、水洗を行った。

試料−８ 試料−１において１０５℃、２０時間乾燥後の乾燥物を
粉砕、篩別し、２００〜２５０メツシュの顆粒状物とし
た以外試料−１と全く同様にして酵素固定用担体を得た
。シラン化処理前の焼成アルミナの物性を第１表に示す
。

試料−９ バイヤー法で得られたアルミナ三水和物を瞬間力焼して
得られた灼熱減量５重量％の遷移アルミナを平均粒径７
μに粉砕し、粉砕した遷移アルミナ１００重量部に活性
炭粉末７重量部及びシリカゲル粉末３重量部を加え混合
した。これを転勤式皿型造粒機に供給し、水を散布しな
から造粒、篩別して４〜９メツシュの造粒物を得た後８
０℃で１時間密閉処理し、更に９０℃の水中に投入し、
１時間処理し、次いで濾過し、１０５℃で２０時間乾燥
した。このようにして得たアルミナ成形体は第１表に示
す物性を有していた。

父上記方法で得たアルミナ成形体を試料−１と同様の処
理を行い、酵素固定用担体を得た。

実施例１ 上記方法で得た試料１〜９の酵素固定化用担体１００重
量部を５重量部のＮ−β（アミノエチル）Ｔ−アミノプ
ロピルトリメトキシシランを３００重量部の水で希釈し
た溶液で処理した後乾燥した。

次いでこの乾燥物１００重量部を水洗して微粉を除いた
後グルタルアルデヒド１％ｉ’８？＆（５０ミリモル、
ｐＨ６，０のリン酸緩衝液）２００重量部に室温で１時
間浸漬した後精製水で十分水洗した。

その後グルコースオキシラーゼ１％溶液（５０ミリモル
、ｐＨ７，０のリン酸緩衝液）１００重量部に前記担体
を浸漬し、４０℃にて１２時間静置した後精製水で十分
水洗し、酵素固定化触媒を得た。

担体への酵素固定化量を第２表に示す。

次いで担体５ｇと水５０ｍ１を容器に入れ、振蕩巾６ｃ
ｍ、１４０ストローク／分で１５分間振蒸させた後Ｎｏ
２濾紙（東洋濾紙層）で濾過し、濾過時間及び２００メ
ソシユの篩で濾別し、濾液と濾過物を別々に８００℃の
温度で焼成し、焼成後の濾液残査（ａグラム）と濾過物
（ｂグラム）から次式によりダスト発生量を求めた。

ａ／　（ａ＋ｂ）ｘｌｏｏ　　（％） これらの結果をも第２表に示す。なお、活性はグルコー
スを基質とし、１分間に１μモルのグルコースを酸化さ
せる量を１単位とした。

第　　　　２　　　　表 実施例２ 実施例１と同様にしてグルタルアルデヒドで活性化した
担体３０ｇ（湿重量）をカラムに充愼した。その後市販
のグルコアミラーゼであるグルクザイム（大野製薬製）
を１％となるように５０ミリモル、ｐＨ７のリン酸緩衝
液に溶解した酵素液３　Ｑ　ｍ　ｌを、そのカラムに通
液した。４℃にて１７時間循環通液し、酵素蛋白を反応
させた後、３００ミリモルの塩化ナトリウムを含む５０
ミリモル、ｐＨ７のリン酸緩衝液３００ｍｌにて洗浄を
行い、固定化酵素を取得した。

担体湿重量１ｇ当たり５．２　ｍ　ｇの蛋白質が固定化
でき、グルコアミラーゼ活性は５．４単位であった。な
お、活性発現率は９％であった。

活性は０．５％可溶性澱粉１０ｍｌを基質とし、３０分
間に１０ｍｇのグルコースを生成させる量を１単位とし
た。

実施例３ 実施例１のグルタルアルデヒドに代えてグリオキザール
を用い、同様の方法にて活性化担体を得た。酵素液とし
てアミノアシラーゼ（大野製薬製）を２％となるように
５０ミリモル、ｐＨ７のリン酸緩衝液に溶解し７たもの
を用い、実施例２と同様にして酵素を固定化した。

担体湿重量１ｇ当たり６．２　ｍ　ｇの蛋白質が固定化
でき、又アミノアシラーゼ活性は８１単位であった。活
性発現率は２７％であった。なお、１単位とは、アセチ
ル−ＤＬ−メチオニンを基質とし、３０分間に１μモル
のし一メチオニンを生成させる活性である。

（発明の効果） 以上詳述した本発明の酵素固定用担体は酵素把持能力、
酵素付着量に優れるのみならず、担持酵素の活性発現率
が著しく優れるものであり、工業的に頗る価値のある発
明である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）半径１０００〜１００００Åの間の細孔の占める容
   積が０．０２〜１ｃｍ＾３／ｇ、ＢＥＴ比表面積が５〜
   ５０ｍ＾２／ｇのアルミナ成形体又はアルミナ含有成形
   体にシランカップリング剤を結合してなる酵素固定用担
   体。 ２）アルミナ成形体又はアルミナ含有成形体が遷移アル
   ミナ又は遷移アルミナ含有物、水及び炭素数１０〜２０
   の脂肪酸のソーダ、カリ又はアンモニウム塩、炭素数１
   ０〜１５のアルキル基を有するアルキルベンゼンスルフ
   ォン酸のソーダ、カリ又はアンモニウム塩、炭素数１０
   〜２０の高級アルコール硫酸エステル塩及びポリオキシ
   エチレン付加物の硫酸エステル塩からなるグループから
   選ばれた少なくとも１種の起泡剤とを撹拌混練して泡沫
   状物を造り、該泡沫状物から泡沫を消失せしめることに
   より得た物である特許請求の範囲第１項記載の酵素固定
   用担体。 ３）アルミナ成形体又はアルミナ含有成形体の平均粒径
   が１０〜２００メッシュである特許請求の範囲第１項記
   載の酵素固定用担体。