JP3256621B2 - 酵素固定化用担体の製造方法 - Google Patents
酵素固定化用担体の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素を生体触媒として生
化学反応を工業的に行わせるためのバイオリアクター、
バイオセンサー等の用途で使用される酵素固定化用担体
の製造方法に関するものである。
化学反応を工業的に行わせるためのバイオリアクター、
バイオセンサー等の用途で使用される酵素固定化用担体
の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】酵素を利用した生体反応を工業的に行わ
せる酵素固定化バイオリアクター、バイオセンサー等の
研究は近年非常に盛んに行われており、これに使用され
る酵素固定化用担体の開発も進んでいる。酵素固定化バ
イオリアクターとは、酵素を担体表面に固定した触媒を
カラム内に充填した構成を有し、担体の種類もセルロー
ス、アガロース、キチン、カラギーナン、ポリアクリル
アミド等の高分子有機材料とか、一般的な多孔質ガラ
ス、セラミックス質等の無機材料等各種のものが提案さ
れている。
せる酵素固定化バイオリアクター、バイオセンサー等の
研究は近年非常に盛んに行われており、これに使用され
る酵素固定化用担体の開発も進んでいる。酵素固定化バ
イオリアクターとは、酵素を担体表面に固定した触媒を
カラム内に充填した構成を有し、担体の種類もセルロー
ス、アガロース、キチン、カラギーナン、ポリアクリル
アミド等の高分子有機材料とか、一般的な多孔質ガラ
ス、セラミックス質等の無機材料等各種のものが提案さ
れている。
【０００３】しかしながら、有機材料は機械的強度が弱
い傾向にあり、更に酵素固定化用担体を利用した反応系
においては、雑菌汚染を防止するために高温操作が必要
とされる場合が多く、有機系の担体は高温での耐熱性お
よび化学的安定性に問題がある。特に工業的に大量に使
用する場合には、圧密、即ち圧力による担体の縮みによ
る全体の反応液の流れとか加圧圧力が変動し、一定の化
学反応が遂行できなくなる惧れがある。
い傾向にあり、更に酵素固定化用担体を利用した反応系
においては、雑菌汚染を防止するために高温操作が必要
とされる場合が多く、有機系の担体は高温での耐熱性お
よび化学的安定性に問題がある。特に工業的に大量に使
用する場合には、圧密、即ち圧力による担体の縮みによ
る全体の反応液の流れとか加圧圧力が変動し、一定の化
学反応が遂行できなくなる惧れがある。
【０００４】他方の多孔質ガラスは、熱安定性に優れ、
数百Åの細孔を持たすことが可能である反面、製造工程
が複雑であり、溶融のために高温（１５００℃）が必要
であるため、製作に要するコストが極めて高価となり、
実用規模の設備は採算に合わないという問題がある。
数百Åの細孔を持たすことが可能である反面、製造工程
が複雑であり、溶融のために高温（１５００℃）が必要
であるため、製作に要するコストが極めて高価となり、
実用規模の設備は採算に合わないという問題がある。
【０００５】一方、セラミックス質担体の中で、アルミ
ナ、ジルコニア等の一般的なセラミックス材料を用いた
担体は、熱安定性及び化学的安定性に優れているが、酵
素固定化に必要とされている数百Å〜千Åの細孔が少な
くて、肝心の酵素固定化量が少ないため装置の大型化が
要求される上、長い反応時間を必要とする等の問題があ
る。
ナ、ジルコニア等の一般的なセラミックス材料を用いた
担体は、熱安定性及び化学的安定性に優れているが、酵
素固定化に必要とされている数百Å〜千Åの細孔が少な
くて、肝心の酵素固定化量が少ないため装置の大型化が
要求される上、長い反応時間を必要とする等の問題があ
る。
【０００６】これらの一般的なセラミックス質担体の問
題点を解決したものとして、特開昭６３−９１０８３号
公報には、セピオライト原料を粉砕して一定粒度とした
上、８００〜１０００℃での温度範囲で熱処理した酵素
固定化用担体（以下セピオライト担体と呼称）が提案さ
れている。このセピオライト担体は熱安定性が良い上、
酵素の固定化に適した数百Å〜千Åの細孔分布を持ち、
一般的なセラミックス担体と較べて酵素固定化能力に優
れているという特徴を有している。
題点を解決したものとして、特開昭６３−９１０８３号
公報には、セピオライト原料を粉砕して一定粒度とした
上、８００〜１０００℃での温度範囲で熱処理した酵素
固定化用担体（以下セピオライト担体と呼称）が提案さ
れている。このセピオライト担体は熱安定性が良い上、
酵素の固定化に適した数百Å〜千Åの細孔分布を持ち、
一般的なセラミックス担体と較べて酵素固定化能力に優
れているという特徴を有している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな従来の酵素固定化用担体中、有機系の担体は前記し
たように高温での耐熱性および化学的安定性に問題があ
り、多孔質ガラスは製造工程が複雑であって製作に要す
るコストが極めて高価になるという難点がある。他方で
特開昭６３−９１０８３号公報に記載されたセピオライ
ト担体は、一般的なセラミックス担体と較べて熱安定性
及び細孔分布の面から酵素固定化能力に優れているが、
細孔分布及び細孔量を制御することが困難であり、しか
も該セピオライト原料にはドロマイト（ＣａＣＯ2・Ｍ
ｇＣＯ3）等の炭酸塩鉱物が不純物として含まれている
という問題がある。
うな従来の酵素固定化用担体中、有機系の担体は前記し
たように高温での耐熱性および化学的安定性に問題があ
り、多孔質ガラスは製造工程が複雑であって製作に要す
るコストが極めて高価になるという難点がある。他方で
特開昭６３−９１０８３号公報に記載されたセピオライ
ト担体は、一般的なセラミックス担体と較べて熱安定性
及び細孔分布の面から酵素固定化能力に優れているが、
細孔分布及び細孔量を制御することが困難であり、しか
も該セピオライト原料にはドロマイト（ＣａＣＯ2・Ｍ
ｇＣＯ3）等の炭酸塩鉱物が不純物として含まれている
という問題がある。
【０００８】上記不純物を除くための酸処理を行うと、
セピオライト結晶を破壊する惧れがあるため、これらア
ルカリ不純物を充分に除去することが出来ない。このた
めセピオライト担体をバイオリアクターに使用した場
合、使用条件によってはアルカリ成分の溶出が生じて精
度上満足する結果が得られないという問題がある。
セピオライト結晶を破壊する惧れがあるため、これらア
ルカリ不純物を充分に除去することが出来ない。このた
めセピオライト担体をバイオリアクターに使用した場
合、使用条件によってはアルカリ成分の溶出が生じて精
度上満足する結果が得られないという問題がある。
【０００９】そこで本発明は、従来の酵素固定化用担体
が容易に制御出来なかった高い酵素活性発現能力を持
ち、圧密がなく、熱的安定性、化学的安定性、経済性の
何れをも満足させる酵素固定化用担体の製造方法を提供
することを目的とするものである。
が容易に制御出来なかった高い酵素活性発現能力を持
ち、圧密がなく、熱的安定性、化学的安定性、経済性の
何れをも満足させる酵素固定化用担体の製造方法を提供
することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
するために、カオリン鉱物に強酸を加え、処理温度が１
００℃以上で処理時間が１時間以上の条件で水熱処理を
施した後に水洗して、粒径が数１０μｍ乃至数ｍｍのス
ラリー又は粉体の造粒体を得て、この造粒体に３５０〜
１０００℃の温度条件下で焼成処理を施す酵素固定化用
担体の製造方法を提供する。上記カオリン鉱物は、カオ
リナイト、ディッカイト、ナクライト、ハロイサイトか
ら選択された一種又は複数のものを主成分とする天然品
もしくは合成品である。
するために、カオリン鉱物に強酸を加え、処理温度が１
００℃以上で処理時間が１時間以上の条件で水熱処理を
施した後に水洗して、粒径が数１０μｍ乃至数ｍｍのス
ラリー又は粉体の造粒体を得て、この造粒体に３５０〜
１０００℃の温度条件下で焼成処理を施す酵素固定化用
担体の製造方法を提供する。上記カオリン鉱物は、カオ
リナイト、ディッカイト、ナクライト、ハロイサイトか
ら選択された一種又は複数のものを主成分とする天然品
もしくは合成品である。
【００１１】上記強酸は、カオリン鉱物を１０％スラリ
ーにした状態でｐＨが４．０以下になる無機酸もしくは
有機酸である。上記水熱処理条件は、処理温度が１００
℃以上で２５０℃以下、処理時間が１時間以上であり、
水熱処理後のスラリー又は粉体の造粒方法は、転動造粒
法，粉霧乾燥造粒法，攪拌造粒法，真空乾燥造粒法，流
動層造粒法その他の造粒法の中から選択された造粒法の
何れかを採用する。更に本発明にあっては、カオリン鉱
物に強酸を加え、処理温度が１００℃以上で処理時間が
１時間以上の条件で水熱処理を施した後に水洗して、粒
径が数１０μｍ乃至数ｍｍのスラリー又は粉体の造粒体
を得て、この造粒体に３５０〜１０００℃の温度条件下
で焼成処理してからシランカップリング処理及びグルタ
ルアルデヒト処理を施して酵素固定化用粉体とする方法
を提供する。
ーにした状態でｐＨが４．０以下になる無機酸もしくは
有機酸である。上記水熱処理条件は、処理温度が１００
℃以上で２５０℃以下、処理時間が１時間以上であり、
水熱処理後のスラリー又は粉体の造粒方法は、転動造粒
法，粉霧乾燥造粒法，攪拌造粒法，真空乾燥造粒法，流
動層造粒法その他の造粒法の中から選択された造粒法の
何れかを採用する。更に本発明にあっては、カオリン鉱
物に強酸を加え、処理温度が１００℃以上で処理時間が
１時間以上の条件で水熱処理を施した後に水洗して、粒
径が数１０μｍ乃至数ｍｍのスラリー又は粉体の造粒体
を得て、この造粒体に３５０〜１０００℃の温度条件下
で焼成処理してからシランカップリング処理及びグルタ
ルアルデヒト処理を施して酵素固定化用粉体とする方法
を提供する。
【００１２】
【作用】かかる酵素固定化用担体の製造方法によれば、
カオリン鉱物を焼成したときの焼成条件によっては細孔
ができるという知見に基づき、処理温度が１００℃以上
で処理時間が１時間以上の条件で水熱処理を施した後に
水洗して、粒径が数１０μｍ乃至数ｍｍのスラリー又は
粉体の造粒体を得て、この造粒体に３５０〜１０００℃
の温度条件下で焼成処理を実施して得られた酵素固定化
用担体は、シャープで均一な細孔分布と細孔量を有し、
高い酵素活性発現能力を持つとともに圧密がなく、しか
も熱的安定性、化学的安定性、経済性の何れをも満足す
ることができる。上記の工程は強酸を用いて水熱処理を
行うため、不純物として含まれているアルカリ成分が溶
出してカオリン鉱物本来の化学的安定性がさらに向上す
る。
カオリン鉱物を焼成したときの焼成条件によっては細孔
ができるという知見に基づき、処理温度が１００℃以上
で処理時間が１時間以上の条件で水熱処理を施した後に
水洗して、粒径が数１０μｍ乃至数ｍｍのスラリー又は
粉体の造粒体を得て、この造粒体に３５０〜１０００℃
の温度条件下で焼成処理を実施して得られた酵素固定化
用担体は、シャープで均一な細孔分布と細孔量を有し、
高い酵素活性発現能力を持つとともに圧密がなく、しか
も熱的安定性、化学的安定性、経済性の何れをも満足す
ることができる。上記の工程は強酸を用いて水熱処理を
行うため、不純物として含まれているアルカリ成分が溶
出してカオリン鉱物本来の化学的安定性がさらに向上す
る。
【００１３】水熱処理条件が弱いと得られた多孔質粉体
の細孔量が少なく、逆に水熱処理条件が強過ぎると、カ
オリン鉱物が分解する上、燃費等の面で不経済となるの
で、前記したように処理温度は１００℃以上で処理時間
が１時間以上、又は処理温度が１００℃以上で２５０℃
以下、処理時間が１時間以上とする。また、造粒体の焼
成温度が３５０℃以下では結晶水の放出が十分行われ
ず、メタカオリン化が不十分となって細孔量が少なくな
り、焼成温度が１０００℃以上では、焼成収縮が始まっ
て細孔量が少なくなるので、水熱処理後の粉体の焼成温
度は３５０〜１０００℃とする。
の細孔量が少なく、逆に水熱処理条件が強過ぎると、カ
オリン鉱物が分解する上、燃費等の面で不経済となるの
で、前記したように処理温度は１００℃以上で処理時間
が１時間以上、又は処理温度が１００℃以上で２５０℃
以下、処理時間が１時間以上とする。また、造粒体の焼
成温度が３５０℃以下では結晶水の放出が十分行われ
ず、メタカオリン化が不十分となって細孔量が少なくな
り、焼成温度が１０００℃以上では、焼成収縮が始まっ
て細孔量が少なくなるので、水熱処理後の粉体の焼成温
度は３５０〜１０００℃とする。
【００１４】
【実施例】以下本発明にかかる酵素固定化用担体の製造
方法の具体的な実施例を説明する。本発明者等はカオリ
ン鉱物を焼成したときの焼成条件によっては細孔ができ
るという知見に基づいて実験を行ったところ、原料の種
類とか原料組成のばらつきによって細孔分布が異なり、
かつ、大きな細孔量のものは出来ないことを確認した。
方法の具体的な実施例を説明する。本発明者等はカオリ
ン鉱物を焼成したときの焼成条件によっては細孔ができ
るという知見に基づいて実験を行ったところ、原料の種
類とか原料組成のばらつきによって細孔分布が異なり、
かつ、大きな細孔量のものは出来ないことを確認した。
【００１５】そこでこの問題を解決するために鋭意研究
した結果、カオリン鉱物に強酸を加え、水と共に水熱処
理を施した後、水洗したスラリー又は粉体を造粒し、３
５０℃〜１０００℃の温度で焼成することにより、シャ
ープで均一な細孔分布と大きな細孔量を持つ酵素固定化
用担体を安定して製造することが可能であることを見い
だした。
した結果、カオリン鉱物に強酸を加え、水と共に水熱処
理を施した後、水洗したスラリー又は粉体を造粒し、３
５０℃〜１０００℃の温度で焼成することにより、シャ
ープで均一な細孔分布と大きな細孔量を持つ酵素固定化
用担体を安定して製造することが可能であることを見い
だした。
【００１６】上記の工程は強酸を用いて水熱処理を行う
ため、不純物として含まれているアルカリ成分が溶出
し、得られたスラリー又は多孔質粉体にはほとんど可溶
性アルカリ成分は含まれておらず、カオリン鉱物本来の
化学的安定性を更に向上させることができることが判明
した。
ため、不純物として含まれているアルカリ成分が溶出
し、得られたスラリー又は多孔質粉体にはほとんど可溶
性アルカリ成分は含まれておらず、カオリン鉱物本来の
化学的安定性を更に向上させることができることが判明
した。
【００１７】上記カオリン鉱物として用いられるカオリ
ナイトは、粘土鉱物であるカオリン類の主要な鉱物であ
って、このカオリナイトを主成分とする天然粘土は従来
から陶磁器やセラミックスの原料として用いられてい
る。カオリナイトは白色，灰色又は黄色の高アルミナ鉱
物であり、良質の天然粘土，特に愛知県瀬戸地区で産出
する蛙目（がえろめ）粘土には上記のカオリナイトと粘
性を高めるための亜炭等の有機物が混合されていること
が確認されている。この蛙目粘土は世界で最も優れた陶
芸材料といわれ、珍重されている。
ナイトは、粘土鉱物であるカオリン類の主要な鉱物であ
って、このカオリナイトを主成分とする天然粘土は従来
から陶磁器やセラミックスの原料として用いられてい
る。カオリナイトは白色，灰色又は黄色の高アルミナ鉱
物であり、良質の天然粘土，特に愛知県瀬戸地区で産出
する蛙目（がえろめ）粘土には上記のカオリナイトと粘
性を高めるための亜炭等の有機物が混合されていること
が確認されている。この蛙目粘土は世界で最も優れた陶
芸材料といわれ、珍重されている。
【００１８】以下に本実施例にかかる酵素固定化用担体
の製造方法の詳細を述べる。本実施例に用いられるカオ
リン鉱物は、上記カオリナイト以外にディッカイト、ナ
クライト、ハロイサイトから選択された一種又は複数の
ものが主成分であれば良く、天然品もしくは合成品のど
ちらでも良い。強酸とはカオリン鉱物を１０％スラリー
にした状態でｐＨが４．０以下になるものを言い、使用
する酸は無機酸もしくは有機酸のどちらでも良い。
の製造方法の詳細を述べる。本実施例に用いられるカオ
リン鉱物は、上記カオリナイト以外にディッカイト、ナ
クライト、ハロイサイトから選択された一種又は複数の
ものが主成分であれば良く、天然品もしくは合成品のど
ちらでも良い。強酸とはカオリン鉱物を１０％スラリー
にした状態でｐＨが４．０以下になるものを言い、使用
する酸は無機酸もしくは有機酸のどちらでも良い。
【００１９】水熱処理条件は１００℃以上で１時間以
上、又は処理温度が１００℃以上で２５０℃以下とす
る。水熱処理条件が弱いと得られたスラリー又は多孔質
粉体の細孔量が少なく、逆に水熱処理条件が強過ぎると
カオリン鉱物の分解が発生する上、燃費等が余計にかか
って不経済であるという問題が生じる。
上、又は処理温度が１００℃以上で２５０℃以下とす
る。水熱処理条件が弱いと得られたスラリー又は多孔質
粉体の細孔量が少なく、逆に水熱処理条件が強過ぎると
カオリン鉱物の分解が発生する上、燃費等が余計にかか
って不経済であるという問題が生じる。
【００２０】次に水熱処理後のスラリー又は粉体を目的
に応じた粒径に造粒する。造粒方法は転動造粒法，粉霧
乾燥造粒法，攪拌造粒法，真空乾燥造粒法，流動層造粒
法等多くの造粒法の何れを用いても良い。特にバイオリ
アクターカラムに充填して使用する場合には、一般に造
粒径が小さいほど液との接触面積が増えるため、酵素の
活性発現率が向上するが、圧力損失が増えて液の流れが
悪くなるという問題が生じる。このため造粒径が１０μ
ｍより小さい粒径の担体を用いると圧力損失が大きすぎ
て使用できない。
に応じた粒径に造粒する。造粒方法は転動造粒法，粉霧
乾燥造粒法，攪拌造粒法，真空乾燥造粒法，流動層造粒
法等多くの造粒法の何れを用いても良い。特にバイオリ
アクターカラムに充填して使用する場合には、一般に造
粒径が小さいほど液との接触面積が増えるため、酵素の
活性発現率が向上するが、圧力損失が増えて液の流れが
悪くなるという問題が生じる。このため造粒径が１０μ
ｍより小さい粒径の担体を用いると圧力損失が大きすぎ
て使用できない。
【００２１】従って担体の粒径は１０μｍ以上、実用的
には数十μｍ〜数ｍｍの粒径のものを反応液の粒度に応
じて使用するのが良い。造粒品の焼成温度は３５０〜１
０００℃が望ましい。
には数十μｍ〜数ｍｍの粒径のものを反応液の粒度に応
じて使用するのが良い。造粒品の焼成温度は３５０〜１
０００℃が望ましい。
【００２２】示差熱分析のデータによれば、上記カオリ
ン鉱物はＯＨの形で含まれている水が４００℃前後から
脱水し始め、６００℃前後で大きい吸熱ピークをつくっ
て脱水し、この脱水が終わった後メタカオリンになり、
更に９７０℃〜１０００℃付近でγアルミナ又はムライ
トの結晶化に起因する発熱ピークが現れ、焼成収縮が始
まる。
ン鉱物はＯＨの形で含まれている水が４００℃前後から
脱水し始め、６００℃前後で大きい吸熱ピークをつくっ
て脱水し、この脱水が終わった後メタカオリンになり、
更に９７０℃〜１０００℃付近でγアルミナ又はムライ
トの結晶化に起因する発熱ピークが現れ、焼成収縮が始
まる。
【００２３】そのため焼成温度が３５０℃以下では結晶
水の放出が十分行われず、メタカオリン化が不十分とな
って細孔量が少なくなり、焼成温度が１０００℃以上で
は、焼成収縮が始まる為、細孔がつぶされて細孔量が少
なくなることが確認された。従って焼成温度は前記の３
５０〜１０００℃とした。
水の放出が十分行われず、メタカオリン化が不十分とな
って細孔量が少なくなり、焼成温度が１０００℃以上で
は、焼成収縮が始まる為、細孔がつぶされて細孔量が少
なくなることが確認された。従って焼成温度は前記の３
５０〜１０００℃とした。
【００２４】酵素の固定化率を向上させるためには、担
体の表面を適宜のシランカップリング剤によりシラン化
したうえ、グルタルアルデヒドでアルデヒド化して酵素
の固定化を行う手段が一般的に行われている。従って酵
素の固定化法は一般的な手段に依って実施すれば良く、
酵素は共有結合によって酵素固定化用担体の表面に高密
度で、かつ、強固に固定化される。
体の表面を適宜のシランカップリング剤によりシラン化
したうえ、グルタルアルデヒドでアルデヒド化して酵素
の固定化を行う手段が一般的に行われている。従って酵
素の固定化法は一般的な手段に依って実施すれば良く、
酵素は共有結合によって酵素固定化用担体の表面に高密
度で、かつ、強固に固定化される。
【００２５】以上述べたように本実施例ではカオリン鉱
物に強酸を加え、水と共に水熱処理を施した後、濾過，
水洗したスラリー又は粉体を造粒した後、３５０〜１０
００℃で焼成してからシランカップリング処理及びグル
タルアルデヒト処理を施して得られた酵素固定化用担体
を得ており、得られた酵素固定化用担体は数百〜千Åの
シャープな細孔分布と大きな細孔量を持ち、酵素固定化
能力に優れているため高い酵素活性発現能力を示し、圧
密が無く、熱的安定性、化学的安定性、経済性を満足さ
せることが出来る。
物に強酸を加え、水と共に水熱処理を施した後、濾過，
水洗したスラリー又は粉体を造粒した後、３５０〜１０
００℃で焼成してからシランカップリング処理及びグル
タルアルデヒト処理を施して得られた酵素固定化用担体
を得ており、得られた酵素固定化用担体は数百〜千Åの
シャープな細孔分布と大きな細孔量を持ち、酵素固定化
能力に優れているため高い酵素活性発現能力を示し、圧
密が無く、熱的安定性、化学的安定性、経済性を満足さ
せることが出来る。
【００２６】以下に具体的な実施例を説明する。 〔実施例１〕先ず酵素固定化用担体を製造するため、前
記の蛙目粘土（主成分カオリナイト）に塩酸を加えてｐ
Ｈ＝０．５の１０％スラリーを作成した。このスラリー
をテフロン内装モーレ型ボンベに封入し、循環式温風乾
燥機に２２０℃で１８時間放置して水熱処理を行い、ス
ラリーを取り出して濾過，水洗した後、乾燥させてサン
プルミルで粉砕して粉体を得て、この粉体と、濾過，水
洗したスラリーをスプレードライヤーを用いて造粒した
粒径の異なる３種類の造粒乾燥体とを、電気炉にて７０
０℃、２時間焼成して、Ｈ−粉体（平均粒子径８μ
ｍ），Ｈ−５０，Ｈ−１５０，Ｈ−２５０の各サンプル
を作成した。上記サンプルナンバーのＨは酸性水熱処理
を施したことを示し、数字は２次粒子の平均粒子径（μ
ｍ）を示す。
記の蛙目粘土（主成分カオリナイト）に塩酸を加えてｐ
Ｈ＝０．５の１０％スラリーを作成した。このスラリー
をテフロン内装モーレ型ボンベに封入し、循環式温風乾
燥機に２２０℃で１８時間放置して水熱処理を行い、ス
ラリーを取り出して濾過，水洗した後、乾燥させてサン
プルミルで粉砕して粉体を得て、この粉体と、濾過，水
洗したスラリーをスプレードライヤーを用いて造粒した
粒径の異なる３種類の造粒乾燥体とを、電気炉にて７０
０℃、２時間焼成して、Ｈ−粉体（平均粒子径８μ
ｍ），Ｈ−５０，Ｈ−１５０，Ｈ−２５０の各サンプル
を作成した。上記サンプルナンバーのＨは酸性水熱処理
を施したことを示し、数字は２次粒子の平均粒子径（μ
ｍ）を示す。
【００２７】次に比較例として市販の蛙目粘土を水熱処
理を施さないで上記実施例１と同様に造粒，焼成して３
種類のサンプル（Ｎ−５０，Ｎ−１５０，Ｎ−２５０）
を作成して実施例１との比較を行った。上記サンプルナ
ンバーのＮは酸性水熱処理を施していないことを示し、
数字は２次粒子の平均粒子径（μｍ）を示す。
理を施さないで上記実施例１と同様に造粒，焼成して３
種類のサンプル（Ｎ−５０，Ｎ−１５０，Ｎ−２５０）
を作成して実施例１との比較を行った。上記サンプルナ
ンバーのＮは酸性水熱処理を施していないことを示し、
数字は２次粒子の平均粒子径（μｍ）を示す。
【００２８】《細孔量，細孔分布の測定》上記実施例１
及び比較例の担体の細孔分布、即ち細孔径が１０2〜１
０3(Å)における細孔量（cc/g）と微分細孔量（cc/g・lo
gA）との相関を水銀圧入法で測定した結果を図１に示
す。図１によれば実線で示す本実施例の担体（Ｈ−５
０，Ｈ−１５０，Ｈ−２５０）は、微分細孔量が最大
１．７１、細孔量が最大０．５９であり、破線で示した
酸性水熱処理を施さない比較例の担体（Ｎ−５０，Ｎ−
１５０，Ｎ−２５０）の各値０．５８及び０．２０に較
べても細孔分布がシャープであり、単位重量当たりの細
孔量は約３倍多いことが判った。また、造粒径（２次粒
子）が大きくなっても、数百〜千Åの細孔分布，及び細
孔量はほとんど変わらないことも判った。
及び比較例の担体の細孔分布、即ち細孔径が１０2〜１
０3(Å)における細孔量（cc/g）と微分細孔量（cc/g・lo
gA）との相関を水銀圧入法で測定した結果を図１に示
す。図１によれば実線で示す本実施例の担体（Ｈ−５
０，Ｈ−１５０，Ｈ−２５０）は、微分細孔量が最大
１．７１、細孔量が最大０．５９であり、破線で示した
酸性水熱処理を施さない比較例の担体（Ｎ−５０，Ｎ−
１５０，Ｎ−２５０）の各値０．５８及び０．２０に較
べても細孔分布がシャープであり、単位重量当たりの細
孔量は約３倍多いことが判った。また、造粒径（２次粒
子）が大きくなっても、数百〜千Åの細孔分布，及び細
孔量はほとんど変わらないことも判った。
【００２９】《圧力損失の測定》次に上記実施例１にか
かる担体及びＨ−粉体を用いて圧力損失を測定した結果
を図２に示す。図２は各担体１５０ｃｃをカラム内径
２．８ｍｍのオープンカラムに充填し、グリセリンで粘
度調整した水溶液を通液させ、カラム通液時の圧力損失
を１ｃｐ（センチポアズ，水），１０ｃｐ（センチポア
ズ）の粘度の水溶液で測定した結果を示している。横軸
は線速度（cm/min）を示し、縦軸は圧力損失（kgf/c
m2）を示している。即ち、圧力をかけて通水した時の流
れる距離を線速度で表わして比較している。
かる担体及びＨ−粉体を用いて圧力損失を測定した結果
を図２に示す。図２は各担体１５０ｃｃをカラム内径
２．８ｍｍのオープンカラムに充填し、グリセリンで粘
度調整した水溶液を通液させ、カラム通液時の圧力損失
を１ｃｐ（センチポアズ，水），１０ｃｐ（センチポア
ズ）の粘度の水溶液で測定した結果を示している。横軸
は線速度（cm/min）を示し、縦軸は圧力損失（kgf/c
m2）を示している。即ち、圧力をかけて通水した時の流
れる距離を線速度で表わして比較している。
【００３０】図２によれば、サンプル「Ｈ−５０」は１
０ｃｐ水溶液を用いると、２（kgf/cm2）の圧力下での
線速度が約２ｃｍ／ｍｉｎであり、更に「Ｈ−１５０」
「Ｈ−２５０」と粒径が大きくなるのにつれて線速度が
順次大きくなっている。また、１ｃｐ（水）を用いる
と、１（kgf/cm2）の圧力下での線速度が約１２ｃｍ／
ｍｉｎであり、更に粒径が大きくなるのにつれて各サン
プルとも線速度は大きくなっている。
０ｃｐ水溶液を用いると、２（kgf/cm2）の圧力下での
線速度が約２ｃｍ／ｍｉｎであり、更に「Ｈ−１５０」
「Ｈ−２５０」と粒径が大きくなるのにつれて線速度が
順次大きくなっている。また、１ｃｐ（水）を用いる
と、１（kgf/cm2）の圧力下での線速度が約１２ｃｍ／
ｍｉｎであり、更に粒径が大きくなるのにつれて各サン
プルとも線速度は大きくなっている。
【００３１】一方、サンプル「Ｈ−粉体」は粒子径が余
りにも小さいため、１ｃｐの低粘度液でも圧力損失が大
きすぎて、２（kgf/cm2）の圧力をかけてもほとんど通
液せず、実用に耐えられないことも確認した。
りにも小さいため、１ｃｐの低粘度液でも圧力損失が大
きすぎて、２（kgf/cm2）の圧力をかけてもほとんど通
液せず、実用に耐えられないことも確認した。
【００３２】従って本実施例における担体の造粒径が大
きくなると圧力損失は大幅に少なくなることが判明し
た。特に反応液の粘度が高くなると造粒径を大きくしな
いと実用に耐えられないことが判明した。
きくなると圧力損失は大幅に少なくなることが判明し
た。特に反応液の粘度が高くなると造粒径を大きくしな
いと実用に耐えられないことが判明した。
【００３３】《担体の表面処理》上記実施例１及び比較
例の各サンプルを２％の３−アミノプロピルトリエトキ
シシランのトルエン溶液に浸漬してシラン化し、しかる
後にトルエンで洗浄し、乾燥した後、２．５％のグルタ
ルアルデヒドを含む１０ｍＭリン酸緩衝溶液中で４℃、
２４時間反応させて表面をアルデヒド化した。
例の各サンプルを２％の３−アミノプロピルトリエトキ
シシランのトルエン溶液に浸漬してシラン化し、しかる
後にトルエンで洗浄し、乾燥した後、２．５％のグルタ
ルアルデヒドを含む１０ｍＭリン酸緩衝溶液中で４℃、
２４時間反応させて表面をアルデヒド化した。
【００３４】《酵素の固定化》次に表面をアルデヒト化
した各サンプル１ｃｃを５０ｃｃ三角フラスコに入れ、
０．１Ｍ酢酸緩衝液５ｃｃを加えて１２１℃で１０分間
オートクレーブ殺菌をした。冷却後、グルコアミラーゼ
７０ｍｇをそれぞれ添加した後、氷冷しながら１時間攪
拌して酵素を担体に吸着固定化して酵素固定担体を作成
した。吸着終了後、担体を殺菌済みの濾紙上に移し、同
緩衝液で１５回洗浄し（１回の洗浄で緩衝液５ｃｃ使
用）、未吸着の酵素を除去した。使用したグルコアミラ
ーゼはAspergillus niger起源、ベーリンガーマンハイ
ム山之内製薬のものである。
した各サンプル１ｃｃを５０ｃｃ三角フラスコに入れ、
０．１Ｍ酢酸緩衝液５ｃｃを加えて１２１℃で１０分間
オートクレーブ殺菌をした。冷却後、グルコアミラーゼ
７０ｍｇをそれぞれ添加した後、氷冷しながら１時間攪
拌して酵素を担体に吸着固定化して酵素固定担体を作成
した。吸着終了後、担体を殺菌済みの濾紙上に移し、同
緩衝液で１５回洗浄し（１回の洗浄で緩衝液５ｃｃ使
用）、未吸着の酵素を除去した。使用したグルコアミラ
ーゼはAspergillus niger起源、ベーリンガーマンハイ
ム山之内製薬のものである。
【００３５】《酵素活性の測定》得られた酵素固定担体
の定量分析を実施するため、０．１Ｍ酢酸緩衝液に可溶
性デンプン１０％を溶かし、オートクレーブで殺菌し、
冷却後、デンプン溶液１００ｃｃに得られた酵素固定担
体を投入し、攪拌しながら３５℃でデンプンの糖化を行
い、経時的にサンプリングし、グルコースを定量して糖
化曲線を描き、初速度法により、酵素活性を求めた。反
応終了後デンプン溶液のみを入れ替えることにより、繰
り返し回分反応を行い、酵素活性の変化を調べた。その
結果を図３に示す。グルコースの定量はグルコースＣII
−テストワコー（和光純薬）により行った。
の定量分析を実施するため、０．１Ｍ酢酸緩衝液に可溶
性デンプン１０％を溶かし、オートクレーブで殺菌し、
冷却後、デンプン溶液１００ｃｃに得られた酵素固定担
体を投入し、攪拌しながら３５℃でデンプンの糖化を行
い、経時的にサンプリングし、グルコースを定量して糖
化曲線を描き、初速度法により、酵素活性を求めた。反
応終了後デンプン溶液のみを入れ替えることにより、繰
り返し回分反応を行い、酵素活性の変化を調べた。その
結果を図３に示す。グルコースの定量はグルコースＣII
−テストワコー（和光純薬）により行った。
【００３６】図３に示すように、繰り返しテストの１回
目，２回目は充分固定化されていない酵素が残留するた
め、酵素活性が高くなるので、真の固定化酵素の活性と
して３回目以降の値を比較した。実施例１（Ｈ−５０，
Ｈ−１５０，Ｈ−２５０）に固定化したグルコアミラー
ゼの活性は担体１ｃｃ当たり５００〜８００Ｕｎｉｔに
達し、酸性水熱処理を施さない比較例（Ｎ−５０，Ｎ−
１５０，Ｎ−２５０）の１５０〜２５０Ｕｎｉｔに較
べ、３〜４倍の高い発現を示し、本発明の効果が極めて
顕著であることが明らかとなった。また、造粒径が大き
くなると酵素固定担体と反応液の接触面積が小さくなる
ため、酵素活性発現能力が接触面積に応じて徐々に低下
することを確認した。なお、図３における活性１Ｕｎｉ
ｔは、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素
単位である。
目，２回目は充分固定化されていない酵素が残留するた
め、酵素活性が高くなるので、真の固定化酵素の活性と
して３回目以降の値を比較した。実施例１（Ｈ−５０，
Ｈ−１５０，Ｈ−２５０）に固定化したグルコアミラー
ゼの活性は担体１ｃｃ当たり５００〜８００Ｕｎｉｔに
達し、酸性水熱処理を施さない比較例（Ｎ−５０，Ｎ−
１５０，Ｎ−２５０）の１５０〜２５０Ｕｎｉｔに較
べ、３〜４倍の高い発現を示し、本発明の効果が極めて
顕著であることが明らかとなった。また、造粒径が大き
くなると酵素固定担体と反応液の接触面積が小さくなる
ため、酵素活性発現能力が接触面積に応じて徐々に低下
することを確認した。なお、図３における活性１Ｕｎｉ
ｔは、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素
単位である。
【００３７】〔実施例２〕次に造粒径の影響をみるた
め、実施例１と同様に酸性水熱処理を施したスラリーを
水洗，乾燥後、サンプルミルにて粉体を作成し、攪拌造
粒機にて造粒後、電気炉にて７００℃，２時間焼成し
「Ｈ−１５００」（２次粒子の平均粒子径１５００μ
ｍ）の担体を作成し、圧力損失の測定を行った。その結
果水溶液の粘度を５０ｃｐと高くしても、線速度１０
（ｃｍ／ｍｉｎ）のカラム通液時の圧力損失は０．２
（ｋｇｆ／ｃｍ2）となり、図２に示した実施例１のＨ
−２５０の１ｃｐにおける圧力損失とほぼ同等になっ
た。よって、２次粒子径を大きくすれば、かなり高粘度
の反応液でも圧力損失は問題にならないことが判った。
め、実施例１と同様に酸性水熱処理を施したスラリーを
水洗，乾燥後、サンプルミルにて粉体を作成し、攪拌造
粒機にて造粒後、電気炉にて７００℃，２時間焼成し
「Ｈ−１５００」（２次粒子の平均粒子径１５００μ
ｍ）の担体を作成し、圧力損失の測定を行った。その結
果水溶液の粘度を５０ｃｐと高くしても、線速度１０
（ｃｍ／ｍｉｎ）のカラム通液時の圧力損失は０．２
（ｋｇｆ／ｃｍ2）となり、図２に示した実施例１のＨ
−２５０の１ｃｐにおける圧力損失とほぼ同等になっ
た。よって、２次粒子径を大きくすれば、かなり高粘度
の反応液でも圧力損失は問題にならないことが判った。
【００３８】また、実施例１と同様にシラン化及びグル
タルアルデヒド処理を行った後、酵素の固定化を行い、
酵素活性を測定するとともに、比較のため、優れた酵素
活性発現能力を持つと言われている市販の酵素固定化用
担体キトパール（キトサンビーズ，平均粒子径１０００
μｍ）に、実施例１と同様の方法で酵素の固定化を行
い、酵素活性を測定した。その結果を図４に示す。図４
に示すように単位容積当たりの酵素活性は図３に示した
実施例１のＨ−２５０に較べやや低くなったが、優れた
酵素活性発現能力を持つと言われているキトパールの約
２倍の活性を示し、本発明の効果が極めて顕著であるこ
とが判った。従って２次粒子径を大きくすれば、かなり
高粘度の反応液でも圧力損失は問題にならず、上記例の
ように平均粒子径が１５００μｍの大きさであっても実
用可能な酵素活性発現性を有し、しかも圧力損失は小さ
いという特徴があることが判明した。よって、粒径数ｍ
ｍ程度のものまで実用可能であることが判明した。
タルアルデヒド処理を行った後、酵素の固定化を行い、
酵素活性を測定するとともに、比較のため、優れた酵素
活性発現能力を持つと言われている市販の酵素固定化用
担体キトパール（キトサンビーズ，平均粒子径１０００
μｍ）に、実施例１と同様の方法で酵素の固定化を行
い、酵素活性を測定した。その結果を図４に示す。図４
に示すように単位容積当たりの酵素活性は図３に示した
実施例１のＨ−２５０に較べやや低くなったが、優れた
酵素活性発現能力を持つと言われているキトパールの約
２倍の活性を示し、本発明の効果が極めて顕著であるこ
とが判った。従って２次粒子径を大きくすれば、かなり
高粘度の反応液でも圧力損失は問題にならず、上記例の
ように平均粒子径が１５００μｍの大きさであっても実
用可能な酵素活性発現性を有し、しかも圧力損失は小さ
いという特徴があることが判明した。よって、粒径数ｍ
ｍ程度のものまで実用可能であることが判明した。
【００３９】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明にか
かる酵素固定化用担体の製造方法によれば、カオリン鉱
物に強酸を加え、処理温度が１００℃以上で処理時間が
１時間以上の条件で水熱処理を施した後に水洗して、粒
径が数１０μｍ乃至数ｍｍのスラリー又は粉体の造粒体
を得て、この造粒体に３５０〜１０００℃の温度条件下
で焼成処理を実施することにより、シャープで均一な細
孔分布と大きな細孔量を有し、酵素活性が高い上、造粒
径に応じて圧力損失が調整可能であり、熱的安定性、化
学的安定性、経済性の何れをも満足する酵素固定化用担
体を得ることができる。特に得られた酵素固定化用担体
は、従来の有機系担体の持つ耐熱性及び化学的安定性上
での問題をなくし、かつ、製造工程の複雑性を解消し
て、製作に要するコストが低廉化されるという効果が得
られる。
かる酵素固定化用担体の製造方法によれば、カオリン鉱
物に強酸を加え、処理温度が１００℃以上で処理時間が
１時間以上の条件で水熱処理を施した後に水洗して、粒
径が数１０μｍ乃至数ｍｍのスラリー又は粉体の造粒体
を得て、この造粒体に３５０〜１０００℃の温度条件下
で焼成処理を実施することにより、シャープで均一な細
孔分布と大きな細孔量を有し、酵素活性が高い上、造粒
径に応じて圧力損失が調整可能であり、熱的安定性、化
学的安定性、経済性の何れをも満足する酵素固定化用担
体を得ることができる。特に得られた酵素固定化用担体
は、従来の有機系担体の持つ耐熱性及び化学的安定性上
での問題をなくし、かつ、製造工程の複雑性を解消し
て、製作に要するコストが低廉化されるという効果が得
られる。
【００４０】更にセピオライト担体の持つ酸処理による
結晶破壊の惧れがなく、特に強酸を用いて水熱処理と造
粒処理を行うことによって不純物として含まれているア
ルカリ成分を充分に除去することが可能となり、カオリ
ン鉱物本来の化学的安定性を発揮してバイオリアクター
に使用した場合であってもアルカリ成分の溶出が生じる
ことがなく、精度上満足する酵素固定化用担体を提供す
ることが出来る。よって、バイオリアクターの性能と経
済性を高めるのに寄与するところは極めて大である。
結晶破壊の惧れがなく、特に強酸を用いて水熱処理と造
粒処理を行うことによって不純物として含まれているア
ルカリ成分を充分に除去することが可能となり、カオリ
ン鉱物本来の化学的安定性を発揮してバイオリアクター
に使用した場合であってもアルカリ成分の溶出が生じる
ことがなく、精度上満足する酵素固定化用担体を提供す
ることが出来る。よって、バイオリアクターの性能と経
済性を高めるのに寄与するところは極めて大である。
【図１】本発明にかかる実施例１と比較例の担体の細孔
径に対する細孔量と微分細孔量との相関を測定した結果
を示すグラフ。
径に対する細孔量と微分細孔量との相関を測定した結果
を示すグラフ。
【図２】本発明にかかる実施例１の各担体のカラム通過
時の圧力損失を測定した結果を示すグラフ。
時の圧力損失を測定した結果を示すグラフ。
【図３】本発明にかかる実施例１と比較例についての繰
り返しテスト回数と酵素活性の関係を示すグラフ。
り返しテスト回数と酵素活性の関係を示すグラフ。
【図４】本発明にかかる実施例２と実施例１及び比較例
についての繰り返しテスト回数と酵素活性の関係を示す
グラフ。
についての繰り返しテスト回数と酵素活性の関係を示す
グラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−275480（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−87700（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／18623（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 11/14
Claims (6)
- 【請求項１】 カオリン鉱物に強酸を加え、処理温度が
１００℃以上で処理時間が１時間以上の条件で水熱処理
を施した後に水洗して、粒径が数１０μｍ乃至数ｍｍの
スラリー又は粉体の造粒体を得て、この造粒体に３５０
〜１０００℃の温度条件下で焼成処理を施すことを特徴
とする酵素固定化用担体の製造方法。 - 【請求項２】 上記カオリン鉱物は、カオリナイト、デ
ィッカイト、ナクライト、ハロイサイトから選択された
一種又は複数のものを主成分とする天然品もしくは合成
品である請求項１に記載の酵素固定化用担体の製造方
法。 - 【請求項３】 上記強酸は、カオリン鉱物を１０％スラ
リーにした状態でｐＨが４．０以下になる無機酸もしく
は有機酸である請求項１又は２に記載の酵素固定化用担
体の製造方法。 - 【請求項４】 上記水熱処理条件は、処理温度が１００
℃以上で２５０℃以下、処理時間が１時間以上である請
求項１，２又は３に記載の酵素固定化用担体の製造方
法。 - 【請求項５】 上記水熱処理後のスラリー又は粉体の造
粒方法は、転動造粒法，粉霧乾燥造粒法，攪拌造粒法，
真空乾燥造粒法，流動層造粒法その他の造粒法の中から
選択された造粒法の何れかを採用した請求項１，２，３
又は４に記載の酵素固定化用担体の製造方法。 - 【請求項６】 カオリン鉱物に強酸を加え、処理温度が
１００℃以上で処理時間が１時間以上の条件で水熱処理
を施した後に水洗して、粒径が数１０μｍ乃至数ｍｍの
スラリー又は粉体の造粒体を得て、この造粒体に３５０
〜１０００℃の温度条件下で焼成処理してからシランカ
ップリング処理及びグルタルアルデヒト処理を施して酵
素固定化用粉体とすることを特徴とする酵素固定化用担
体の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35076993A JP3256621B2 (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 酵素固定化用担体の製造方法 |
| US08/466,898 US5756415A (en) | 1993-06-23 | 1995-06-06 | Method of making a enzyme immobilizing carrier |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35076993A JP3256621B2 (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 酵素固定化用担体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07184651A JPH07184651A (ja) | 1995-07-25 |
| JP3256621B2 true JP3256621B2 (ja) | 2002-02-12 |
Family
ID=18412746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35076993A Expired - Lifetime JP3256621B2 (ja) | 1993-06-23 | 1993-12-27 | 酵素固定化用担体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3256621B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1235068B1 (en) * | 1999-11-15 | 2006-01-25 | ARKRAY, Inc. | Biosensor |
| CN103146675B (zh) * | 2013-03-06 | 2014-07-30 | 昆明理工大学 | 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法 |
-
1993
- 1993-12-27 JP JP35076993A patent/JP3256621B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07184651A (ja) | 1995-07-25 |
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