JPS62171686A - 生物集団複合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物集団複合体（ｂｉｏｍａｓｓ　ｃｏｍｐｏ
ｓｉｔｅ　）の製造方法に関する。さらに詳しくは本発
明は多孔性無機支持体と、この支持体上に固定された、
バクテリア菌類の制御された集団とからなる広い表面積
と小さな体積を有する生物集団複合体の製造方法に関す
る。

支持物質と、この支持物質の表面に固定されたバクテリ
ア菌、酵母菌等の細菌とからなる複合体の製造およびそ
の使用は非常に古くからよく知られている。一般には細
菌の薄膜あるいは粘液が支持体の表面で培養される。生
じる薄膜は、含まれる細菌に依存して種々の用途に用い
ることができる生物集団を与える。例えば、初期の硫下
濾過醗酵系の１つにおいては、充填物質としてかんなく
ずあるいはその他の支持体が用いられ、この充填物質は
たるのような容器中に置かれた。充填物質を通して液体
原料が硫下され、ある場合には充填物質中を上向きに空
気が通された。液体が単一のポンプによって循環される
時、充填物質の表面に細菌の薄膜が形成され、これによ
って有効な生物集団の比較的大きな累積物が生じた。こ
の累積物は細菌薄膜のタイプに依存して（嫌気性あるい
は好気性）、砂糖をａｉ酵させてアルコールとするのに
（嫌気性）あるいはアルコールを酸に変換するのに（好
気性）用いられた。後者の方法は酢を作るのに用いられ
た。上記のようなタイプの初期の硫下濾過系は一般にシ
ュウツエンバッハ発生器（３ｃｈｕｅｔｚｅｎｂａｃｈ
　ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）と呼ばれた。

上述のような醗酵系の種々の変形はよく知られている。

例えば米国特許第４５４，５８６号には砂糖溶液を醗酵
させた種々の生成物を作るための醗酵おけが述べれてい
る。この系は多孔性充填物質を含む流貫おけからなる。

この特許においては、液体基質の醗酵菌は、その細菌が
液体中に自由に浮遊している時よりも充填物質の細孔中
でおよび表面上でより急速に繁殖することが指摘されて
いる。

広い表面積を有する細菌支持体の使用を開示するその他
の細菌支持系は、米国特許第２，４４０，５４５号（お
がくず、ムラサキウマゴヤシの切断片、きざんだわら、
ガラスビーム、砂岩等）、米国特許第３，７０９，３６
４号（汚水処理のための砂粒の使用）、米国特許第３，
４０２，１０３号（流貫反応器中に設けられた一連の水
流調節壁。この水流調節壁上にはバクテリア菌ｉ１躾が
形成されている）およびインド特許第４３５４２号（Ｈ
母菌の支持体としての軽石の使用）に述べられている。

先行技術の調査から、広い表面積を有する多孔性無機物
質が細菌薄膜の支持体として今日まで長い間有効に使用
されてきたことは明白である。

ある支持体物質の多孔率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）と、その
支持体物質がある用途に用いられる時の有効表面積との
間に関係が存在することは容易に考えられるが、全く驚
くべきことに本発明者等は、細菌用の多孔性支持体の場
合、細菌の寸法に対応して、高濃度生物集団のための非
常に広い表面積と小さな体積を与える細孔寸法範囲が存
在することを見出した。上記本発明者等の発見、この発
見に塞づく細菌が固定された複合体およびその複合体の
製造方法を以下に詳細に説明する。

本発明の細菌が固定された複合体の特徴は特許請求の範
囲に述べられている通りである。このような複合体は比
較的広い生物集団表面を有しているが、その体積は比較
的小さい。好ましい具体例においては、細菌の集団は単
一種の細菌からなり、無機支持体は例えばフリットガラ
スのような無定形ガラス物質あるいは菫青石状物質のよ
うな結晶性物質等の細孔の寸法分布を容易にまた経済的
に制御することができる物質からなり、また無機支持体
の細孔の直径の平均は、分裂によって繁殖するバクテリ
ア菌等の集団の場合には約０．８乃至２２０ミクロンで
あり、醇母菌の集団の場合には約１乃至１４０ミクロン
である。

上記複合体の製造方法は、殺菌された状態の上記支持体
物質を、この支持体物質の細孔の内面上に少なくともい
くらかの細菌が付着するのに充分な条件の下で、バクテ
リア菌の制御された集団の懸濁液にさらすことを特徴と
する。

限られた反応体積中に生物集団の非常に大きな表面を累
積することが重要であることは、一般に固定された細菌
のいくつかの実際の用途を考えれば明らパとなる。例え
ば、細菌細胞の単なる繁殖が蛋白質類の急速な発生の基
礎となることはよく知られている。細菌細胞の連続的な
繁殖を促進する最適条件を与えることによって、累積さ
れた細胞はある条件のもとで蛋白質に処理され得る。こ
れがいわゆる単一細胞蛋白’Ｒ（Ｓ　ｉｎｇｌｅ　ｃｅ
ｌｌ　ｐｒ。

ｔｅｉｎ、　８　ＣＰ　）生産技術の基礎となるもので
ある。

ＳＣＰ生成は現在ケモスタット（ｃｈｅｍｏｓｔａｔ　
）あるいはタービドスタット（ｔｕｒｂｉｄｏｓｔａｔ
　）として知られる系を用いて連続的に行なわれている
が、壁効果を除いては、繁殖している細胞の大部分はた
だ培養基中に懸濁している。これらの系にはいくつかの
利点があるとは言うものの、流速くすなわちＳＣＰ生成
速度）は細菌種子物質の流失が生じはじめる流速以下に
制限される。すなわち、細菌種子物質の流失は、連続系
を流れる培養基の流速が速いために反応器中の細菌の損
失が細胞繁殖による細菌の増加よりも大きいことを意味
する。

ケモスタットおよびタービドスタットはいずれも流失を
受けやすく、従って細菌生成速度に上限が設けられる。

単位体積当りの生物集団表面の広い固定された細菌は、
ケモスタットタイプの系のように高流速による流失を受
けないので、培養基、廃物の除去、ＰＨＳ酵素供給等の
ような細胞の要求が満たされるならば、このような固定
された系の価値は直ちに明白となる。

単位体積当りの生物集団表面積が広いということの価値
は、第２の新陳代謝産物の生成に関係する醗酵の面積に
関しても同様に価値となるものである。例えば、第２新
陳代謝産物は一般に細菌の寿命循環過程の定常相におい
て生成されるので、また生成される第２の新陳代謝産物
の合計量は新陳代謝産物を連続的に放出するのに有効な
生物集団表面の広さに依存するので、生物集団表面の広
い定常相を与えまたそれを長びかせるための手段を有す
る系は何れも理想的な第２の新陳代謝産物生成系である
ことは明らかである。ＳＣＰ生成の場合のように、培！
！基が高速で流れることができるある体積中に広い生物
集団表面を保有することはまた、有効な生成物のほかに
新陳代謝によって生成される廃物の迅速な除去も可能に
する。また本発明の系は第１の新陳代謝産物生成にも用
いることができる。

本発明の複合体が適用されるその他の領域は分析微生物
学の分野である。この分野においては、安定した細菌集
団の均一な分配が可能な細菌が固定された複合体の使用
は明らかに有利である。従って本発明の複合体は、単位
体積当り多量の細菌を貯蔵しまた取り扱うための確実な
また便利な方法を与える細菌標準として用いられる。

本発明は細胞分裂あるいは簡単な分割によって繁殖する
特定の細菌の集団と、この細菌が最小の細菌固定体積で
最大の生物集団表面を達成することが可能であるように
付けられる多孔性支持体物質の間には独特の物理的関係
が存在するという発見に基づくものである。非常に限ら
れた範囲については、この発見は酵素固定技術の場合の
それに幾分類似している。この酵素固定技術の場合には
、ある重量（あるいは体積）の多孔性支持体物質上に装
填され得る活性酵素の量と、多孔性支持体物の間には関
係が存在することが示された。例えば、この酵素固定技
術は米国特許第３，８５０，７５１号に述べられている
、この特許においては、大部分の酵素固定系について支
持体の細孔の寸法の最適範囲は約１００乃至１０００Ａ
であることが述べられている。

以下に述べる理由から、支持体物質すなわち担体物質は
有機よりもむしろ無機でなければならないことが理解さ
れるであろう。

ｓｆ１担体物質は積々の著しい利点を有している。

その第１は、細菌の栄養素要求は主として炭素および窒
素含有物質に集中されるので、細菌は容易に無機物質を
攻撃しないということである。炭水化物、蛋白質等のよ
うな有機担体は細菌のみならずその細菌によって作り出
される細胞外に位置する酵素によってもまた容易に攻撃
される。有機担体が破壊される時、細菌の累積は減少す
る。耐久性に加えて、無機単体はほとんどの有機単体よ
りも寸法安定性の利点を有している。種々の圧力と流動
条件の下で細孔の形態を保つことによって、細菌は変形
およびその後の分離から保護される。

この寸法安定性はまた生物集団累積の点からも有利であ
る。

無機担体の別の利点は密度が比較的高いということであ
る。無機物質のほとんどが２．０以上の密度を有してい
るのに対して、はとんどの有機物質は１．０付近あるい
はそれ以下の密度を有している。

このような状況の下で、同一質量において有機物質と同
時の多孔度を有する無機物質はより小さな体積をしめ、
従つ・て同一体積においては無機物質はより大きな生物
集団を集めることができる。さらに高密度の無機物質は
、粒子が表面に流れ表面上に残るのではなく、むしろ粒
子は絶えず溶液中で攪拌されるので、栓流反応器におい
て圧力降下がなく、また流体層反応器においてよりよく
作用するという利点を有している。

特に本発明のように、無機物質を細菌の支持体として使
用する場合のさらに別の利点は、通常手に入れることが
できる原料を用いて制御された多孔度を有する支持体を
比較的簡単にまた経済的に得ることができるということ
である。

細菌ｓｉがいかにして支持体表面に形成されるかについ
ての知識はかなり存在するが、それによって細菌が実際
に支持体に付けられる実際のメカニズムについての知識
はほとんど存在しないように思われる。しかしながら、
はとんどの細菌はほとんどの有毒な基体を除いたすべて
の基体に付着し繁殖することはよく知られている。本明
細書においては、細菌あるいは細菌１１１１を支持体に
付ける方法に適用される「付着」という表現は、物理的
付着、化学的付着あるいはその両方によるすべての付着
方法を意味するものとする。以下に述べる実施例のいく
つかにおいては、細菌は吸着力であると思われるものに
よって簡単に支持体に付着された。他の場合には、ポリ
イソシアネートあるいはシランカップリング剤の残基が
支持体表面を被覆するのに用いられ、細胞は被覆によっ
て化学的に支持体に付着された。また細胞は支持体表面
の適当な場所に交差結合されてもよい。

本発明の複合体の制御された細菌集団は、すべて同じ一
般寸法範囲内にある特定の種の細菌を含んでいる。また
本発明の複合体の支持体は以下のような特徴を有してい
る。すなわち、支持体の細孔の少なくとも７０％は細菌
集団を構成するほとんどすべての細菌を容易に入れるの
に充分な大きさの直径を有しているが、最大有効表面積
を維持しまた細胞の流失を防止するために、上記細菌集
団が特にバクテリア菌のような細胞分裂あるいは簡単な
分割によって繁殖する細菌からなる場合には、最も大き
な細菌の最大寸法の約５倍より小さい直径を有する。

はとんどの細菌の最小および最大寸法は参考書に記載さ
れているかあるいは既知の方法を用いて測定される。無
機支持体の細孔の少なくとも７０％が上述のような寸法
を有しているか否かは水銀侵入多孔率測定法のような既
知の方法で測定される。

上記のような支持体はすべて広い表面積を有している。

本明ｍ書においては、し広い表面積」という表現は約０
．０１況／ｇより大きな表面積を有する支持体を意味す
るものとする。

特定の細菌集団の無機支持体について最適な細孔寸法の
分布が存在するという本発明者等の発見は、理論的な物
理学的考察と対応した実験結果によって最もよく説明さ
れる。

分裂によって繁殖するタイプの細菌（バクテリア菌）の
いくらかは５μ程の幅寸法（すなわち最小寸法）を有し
ており、ある種は１０μ程の長さを有しているが、はと
んどのユウバクテリア菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）は０
．３乃至１．５ミクロンの範囲の幅寸法すなわち最小寸
法を有している。もちろん、細菌の種類によっては、最
大寸法（幅ではなく長さ）は上記寸法および上記範囲の
数倍であり、生存期間、発育の状態、タイプ、培養基等
のような要因による変化を受けやすい。一般に、大半の
分裂によって繁殖するバクテリア菌の最小乃至最大寸法
は約０．５乃至約３μの範囲にある。

約１ミクロンの最大寸法を有する細菌を例にとって説明
する。この細菌が分裂を起こす時、細菌の最大寸法はほ
ぼ２ミクロン近くまで増加する。

従って、支持体の細孔内面の向い合った側面にそれぞれ
付着している２つの細菌が同時に分裂を起こし、これに
よって表面積および細孔体積の最大利用が生じる場合に
は、細孔の直径は少なくとも４μでなければならない。

さらに別の細菌が細孔のさらに下の位置から細孔外部の
場所まで移動するのを可能にするためには、同時に分裂
を起こしいずれも最大寸法となっている２つの固定され
た細菌の間を別の細菌が通過するのに、少なくともさら
に１ミクロンの細孔直径が必要となる。従って、支持体
細孔の・直径は細菌を容易に収容するために少なくとも
細菌の最小寸法でなければならないが、より高い細菌の
装填、すなわち細孔内部表面積のより有効な利用は、細
孔の直径が細菌を容易に収容するために必要とされる最
小の寸法よりも幾分大きい時に生じる。本発明者等は支
持体の単位体積当りの表面積の最も有効な利用を一般に
可能にする細孔の寸法の上限は、その細孔中に付着され
る分裂によって繁殖する細菌の最大寸法の約５倍である
ことを見出した。

細菌の繁殖それ自体が主なことではないある場合には（
例えば比較的一定した定常相が望まれる第２の新陳代謝
産物生成）、大部分の細孔の寸法が細菌の最小寸法に対
してより閉じている時により有効な内部表面積の利用が
生じることに注意しなければならない。従って、細菌が
固定される目的に依存して、バクテリア菌のような分裂
によって繁殖する細菌の場合、多孔性無機支持体の大半
の細孔（少なくとも７０％）がそれぞれ細菌の最小寸法
から細菌の最大寸法の約５倍である直径を有するとき、
これら細菌の集団の付着にとって最も有効な表面積の利
用が達成される。以下の実施例で示されるように、生物
集団の表面累積のピーク値は、支持体の細孔寸法が上記
範囲内にある時に得られることが見出された。特に、最
適な装填結果は、少なくとも７０％の細孔が、バクテリ
ア菌については最小細菌寸法の約５倍である直径を有す
る時に得られた。

多孔性無機支持体の細孔寸法の分布を制限することの重
要性は、その中の１つだけが厳密に制御された細孔寸法
の分布を有する別々の多孔性支持体について得られた生
物集団の装填結果を比較することによって示される。一
般に、実験結果は少なくとも約７０％の細孔が種々のタ
イプの細菌に対して上述のような範囲の細孔直径を有し
ていなければならないことを示しているように思われた
。

以下の実施例においては、既知の適当に制御された多孔
度を有する多孔性支持体は種々のフリットガラス物質お
よび菫青石状結晶性物質を含んでいる。実施例１〜４（
第１表〜第７表）においては、最もよいフリットガラス
および菫青石支持体は細孔寸法の少なくとも７０％を必
要とされる範囲内に有している（例えばフリットガラス
については７７−１００％であり、Ａ５ＬｚＯ３−菫青
石については７６−１００％である）。各支持体物質の
細孔寸法範囲（ミクロン）は以下の通りである（平均細
孔寸法を括弧内に示す）。

フリットガラス ０．８−１．８（１，１）　、　　１．５−４．０（３
，１）　、　　３．０−６、Ｏ（４，５）　、　８−２
０（１３）　、　１８−６０（３２）　、　　１７０菫
青石状物質 ２−９（４，５＞　、　　１．５−２０　　（１０）　
、　　４．５−１００（１８）細菌装填（生物集団）の
測定は種々の多孔性支持体の細孔内に付着している細菌
の数の測定を含んでいるので、従来のプレートカウンテ
ィング法は用いることができない。その代りに、細菌の
数は試料中に存在するＡＴＰの量に基づいて細菌の数を
決定するデュポンバイオメーターモデルＮＱ７６０　（
Ｄｕｐｏｎｔ　３　ｉｏｍｅｔｅｒ　ＭｏｄｅｌＮｎ　
７６０）を用いて測定した。実際に用いられた測定方法
は以下の通りである。まず約１０−２０■の複合体に９
０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルフオキシド）水溶液５ｍを
加える。懸濁液を激しり１０秒間混合する。懸濁液を２
０分間放置後、ｐＨ７，４の０．０１　ＭＭＯＰＳ　（
モルフォリノプロパンスルフォン酸）緩衝液４ｄを加え
る。激しく混合し、バイオメーターで測定されるまで水
中に保管する。この溶液１０μ応をルシフェリン−ルシ
フェラーゼ混合物を含んでいるバイオメーターのクベッ
トに加える。抽出されたＡＴＰは酸素混合物と反応し光
を生じる。この光はＡＴＰの量に比例するので、光を定
量的に測定し、その光量からＡＴＰの量を求める。

上記方法によって得た結果の信頼度は２０％である。バ
イオメーター測定法の使用方法および信頼度に関する知
識は上記バイオメーターの便覧に述べられている（Ｉｎ
ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　　Ｍａｎｕａｌ　　、７６０　Ｌ
ｕａ＋１ｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｂｉｏａ＋ｅｔｅｒ　Ｅ、
　　Ｉ　、　　Ｄｕｐｏｎｔ　ＤｅＮｅｍｏｕｒｓ　　
＆　　Ｃｏ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、［）ｅｌ
ａｗａｒｅ１９８９８　　、［）ｅｃｅｍｂｅｒ　１９
７０）。

本発明者等の発見および本発明の複合体の製造方法が以
下の実施例で説明される。示される方法によって種々の
支持体に付着される実施例１〜４の細菌は、分裂によっ
て繁殖する細菌を有する複合体を説明するためにエシェ
リヒアコリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）
　、セラチアマルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　＊ａ
ｒｃｅｓｃｅｎｓ）　、バシリウスサブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）およびロドスピリウム
ルプラス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕ
ｍ）を含んテイル。特に断りがない限り、支持体物質は
１８乃至２５メツシユ（米国標準篩）の粒子径を有する
粒子である。

実施例１ エシェリヒアコリの付着に関する細孔寸法の効果 殺菌法を用いて、簡単な吸着とシランカップリング剤に
よる方法の２つの方法で各支持体にエシェリヒアコリ試
料（１乃至６μの寸法を有する）を付着させた。吸着に
よる付着は各支持体の１８乃至２５メツシユ粒子３ｇを
エシェリヒアコリの懸濁液２０ａｌｔと２２℃で３時間
反応させることによって達成された。シランカップリン
グ剤による付着は、１８乃至２５メツシユ粒子２ｇをγ
−アミンプロピルトリエキシシランの１０％水溶液２０
ｄと１００℃で２時間反応させて粒子表面をシラン化し
、乾燥後この粒子をエシェリヒアコリの懸濁液２ｏ−と
２２℃で一晩反応させることによって行なわれた。

複合体をｙ４製して約１８時間後、ＡＴＰ測定によって
バクテリア菌装［ｉ（支持体１ｇ当りのバクテリア菌の
数）を記録した。結果を第１表に示す。

バクテリア菌の最小寸法の１倍と最大寸法の５倍の範囲
の直径を有する細孔の百分率が各平均最高直径の後に示
されている。

１’ｔ Ｓ　　　ヘ セ 鋸 ρ Ｓ　命 上記データをプロットした第１図から明らかなように、
平均細孔直径が約４．５μである支持体について最も高
濃度の表面生物集団が得られる。第１図のピーク部分を
引き伸した第２図から明らかなように、第１図のピーク
部分はエシェリヒアコリの最小寸法の１倍から最大寸法
の５倍、すなわち約３０μ、の範囲に完全に含まれる。

実施例２ セラチアマルセスセンスの付着 ０．６乃至２．０μの寸法を有するセラチアマルセスセ
ンスバクテリア菌をポリイソシアネート（ＰＡＰ１９０
１）カップリング剤を用いて実施例１と同じフリットガ
ラス粒子支持体に付着させた。カップリングによって得
られ、バイオメーター（ＡＴＰ分析）によって測定され
た装填量を第２表に示し第３図にプロットした。カップ
リングは以下のようにして行なわれた。

担体ｏ、ｓｇを５０ａｌｔのマイクロフエルンバツハフ
ラスコに入れた。ＰＡＰＩ９０１の０．５％アセント溶
液１０ｄをカップリング剤として用い、これをフラスコ
中に入れた。担体とのカップリング後、ＰＡＰＩ９Ｑ１
溶液をフラスコから注ぎ出し、３×１０３個／ｄのセラ
チアマルセスセンスを含む細胞懸濁液１０−をフラスコ
に加えた。細菌と担体を３時間反応させた。過剰の細菌
をフラスコから注ぎ出し、担体をｐＨ７，２の０．１Ｎ
燐酸塩緩衝液で３回洗浄した。

第２表 セラチアマルセスセンスの装置ＩＸ量ど細孔直径との関
係平均細孔直径（μ）および 支持体物質　　Ｘｌ−Ｘ　５範囲内の細孔の％　１ｇ有
りの細胞数フリットガラス　　　　１．１　（１００％
）　　　　　１．６４　Ｘｌ０８３．１　（１００％）
　　　　　　２０．２Ｘ１０８４．５　（１００％）　
　　　　　　７．５ＸＩＱ”１３（１８％）　　　　　
　５．５６　ｘ１０Ｂ３２（０％＞　　　　　　２．９
３　Ｘｌ０８１９２（０％）　　　　　　０．４０　Ｘ
ｌ０８Ｉｎ！珪酸塩カラス非多？ｌＪ　（０％＞　　　
　　　１．９６　ｘｌｏ［１第３図から明らかなように
、セラチアマルセスセンスの最大寸法の５倍より大きな
１３μの平均細孔直径を有するガラスについてかろうじ
て高密度の生物集団累積が認められるのに対して、装填
量のピーク値はセラチアマルセスセンスの最小寸法の約
５倍である３、１μの平均細孔直径を有するガラスにつ
いて得られる。

実施例３ バシリウスサブチリスの付着 細菌をフリットガラス担体に吸着によって付着させるこ
と以外は実施例２と同様にして実験を行なった。「ベル
ゲイ便覧Ｊ　　（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　１ｙｌａｎｕａ
ｌ。

８ｔｈ　　Ｅｄ、）の５３３頁にはバシリウスサブチリ
スの寸法は０．７乃至０．８ｘ　２乃至３μであると記
載されている。顕微鏡によって寸法を測った場合、培養
したものは約１×３乃至４μであり、７μの長いダブル
細胞をいくらか含んでいた。

種々のフリットガラスを担体として用いた。これらのフ
リットガラスをオートクレーブ中で乾燥し、凝集を防止
するために３１℃で保管した。

バシリウスサブチリス細胞を１あのプレインハート浸出
液（Ｂ　ｒａｉｎ　　Ｈｅａｒｔ　　Ｉ　ｎｆｕｓｉｏ
ｎ　ｂｒｏｔｈ　）中で３６時間培養させた後遠心分離
し、殺菌した燐酸塩緩衝液で２回洗浄した。洗浄した細
胞懸濁液１０ａｇを担体０，５９を含む各フラスコに加
えた。３時間の接触時間の後、担体を３回洗浄し８℃で
一晩保った。

担体上の細胞の数はデュポンバイオメーターによるＡＴ
Ｐ測定によって測定した。結果を第３表および第６図に
示す。なお第３表の値は２回の実験結果の平均値である
。

第３表 バシリウスサブチリスの装填量と細孔直径との関係平均
細孔直径（μ）および　１ｔｎＡ茶ＩＬ＃支持体物質　
　Ｘｌ−Ｘ　５範囲内の細孔の％　相１ハ平’７細胞数
フリットガラス　　　　１．１（０％＞　　　　　　　
２，４ｘｌＯ’　＊３．１（７７％）　　　　　　　９
，５ｘ１（Ｆ４．５　（１００％）　　　　　　１，５
４　ｘ１０Ｂ１３　（１００％）　　　　　　３．２７
　ｘ１０７３２（５６％＞　　　　　　１．５６　Ｘ１
０７　Ｘ１９５（０％）　　　　　　１．１２　ｘｌｏ
ｌｌ　＊硼珪酸塩ガラス　　　非多孔性（０％）　　　
　　　１，１３　Ｘ１０６　＊＊バイオメーターの測定
下限である１０５の水準から求めた値上記第３表から明
らかなように、装＊ｆｌのピークは３．１μと１３μの
間に存在する。このピークはバシリウスサプチリスの最
小寸法の１倍から最大寸法の５倍の範囲内にある。他の
実施例と同じように、７０％以上の細孔が細菌の最小寸
法の１倍から最大寸法°の５倍の範囲にない場合には細
菌装填量が著しく少なくなることが認められた。

第３表の＊印の値は測定下限である１０６水準として計
算されたが、実際の水準は１０４あるいは１０３等であ
るかもしれない。いずれにしても、これらの数はバシリ
ウスサプチリスについての狭い最適細孔寸法範囲を強調
する１０Ｔ個／９以下のより低い値を示す。

実施例４ ０ドスビリウムプラムの付着 最大寸法が約３μに過ぎない標本をいくらか含む、０．
８乃至７−１０μの寸法を有するロドスピリウムルプラ
ムバクテリア菌を、先に述べたような細孔寸法を有する
種々の支持体に簡単な吸着によって付着させた。細菌の
付着は細胞懸濁液１０Ｉｄと支持体試料０．５ｇとを２
２℃で３時間接触させ反応させることによって行なった
。その後バイオメーターでＡＴＰ濃度を測定して細胞装
填量を求めた。

結果を下記第４表および第７図に示す。

ギ 惰　　　塀 、リ ′８　田 追加実験 さらに実験を行なったところ、クロストリディウムブチ
リカム（Ｑ　ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｌｉｃｕ
ｍ）　　（３乃至７μ）およびフラボバクテリウム（１
”　ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｒｕｍ　）　　（１乃至３μ
）の両方のバクテリア菌は支持体の細孔内に多量に付着
され得ることが見出された。

制御された多孔率と制御されていない多孔率制御された
細孔寸法の分布を有することが重要であることを、既知
の制御された多孔率を有する無機支持体（２０％Ａ応２
０３８０％菫青石、２乃至９μの平均細孔寸法を有して
いる）と制御されてない多孔率を有する多孔性無機物質
（軽石）を比較することによって確かめた。ポリイソシ
アネートを使用して、先に述べたような方法によって、
両方の多孔性支持体のエシェリヒアコリに一１２バクテ
リア菌を付着させた。両方の複合体を多量培養溶液が絶
えず流れているカラム内に置いた。

この実験に用いた軽石は、直径が約２乃至４インチの大
きな塊りとして市販されているものである。この大きな
塊りを乳鉢と乳棒を用いて粉砕し、篩で篩って１８乃至
２５メツシユの粒子を得た。

支持体（担体）および固定された細菌を調製するのに用
いられるすべての容器を使用の前に殺菌した。固定の後
、担体をｐＨ７，２の殺菌された燐酸塩緩衝液で３乃至
４回洗浄した。個々の担体上の固定された細胞のスラリ
ーを細胞発生器として使用されるカラム中に置いた。

流媒体中の細菌の測定は媒体として寒天培養基を用いて
プレートカウンティング法で行なった。

第４図および第５図はそれぞれＡｆＬｚ０３　ｍ！青石
支持体および軽石の細孔寸法分布曲線を示すものである
。軽石は非常に広範囲の細孔寸法を有していることがわ
かる。Ａ９Ｊ２０３−菫青石担体は平均が約５であるど
ちらかといえば厳密に規定された細孔を有している。表
−面積は軽石が０．２１００１９であるのに対してＡ免
２０３−菫青石は０．３８００　ｙｒｔ／９であった。

２ｇの軽石によって占められる体積は等ｆｆ１ｆｆｉの
Ａ９．ｚｏ３−菫青石のそれの約２倍であった。実験の
間に、軽石担体の場合にはカラム体積のわずかの損失が
生じた。ＡＬｚＯ３−菫青石担体のカラム体積の損失は
軽石担体の場合に比較してはるかに少なかった。第５表
はこのデータを示す。

各担体２ｇを最初の固定に用いた。エシェリヒアコリに
−１２を固定したＡＬｚＯ３−菫青石全部を２つのカラ
ムのうらの１つの中に置き、エシェリヒアコリに−１２
を固定した軽石をもう１つのカラム中に置いた。いずれ
の場合も同じガラスびんから媒体を供給して２つのカラ
ムを同時にスタートさせた。プレートカウンティング法
によって得たデータを第６表および第７表に示す。いず
れの場合もＡｆＬｚＯ３−菫青石担体の方が軽石担体よ
りもより多くの細胞を生成することがこれらの表かられ
かる。２回目の実験の結果は１回目の実験の結果のよう
に明白ではないが、それでも多孔率が制御された支持体
からの細胞の生成は軽石が゛らのそれよりも多いことを
示している。

これらの実験の間になされたより興味ある発見の１つは
、いずれの担体についても流速が増加した後に計数が急
激にまた著しく低下するということである。このデータ
から作成したグラフを調べたところ、軽石支持体よりも
Ａ９Ｊ２ｏ３−菫青石支持体の方がより著しく応答する
ように思われる。

このような応答はＡＬ２０３−菫青石支持体のより小さ
な床体槽によって起されるものと思われる。

第　　５　　表 担体使用中のカラム体積の損失 カラムの高さくａｎ） 実験　時間（日）　軽　石　Ａ９Ｊ２０３−菫青石１　
　　０　　　　６．６　　　　　　３．４１　　　１　
　　　６．５５　　　　　　３．３１　　　２　　　　
６．３　　　　　　３．３２　　　０　　　　５．８５
　　　　　　３．０２　　　１　　　　５．６　　　　
　　２．９２　　　２　　　　５．５　　　　　　２．
９甚「−１４判′Ｍ′ＭＬＭ ０００　（’５００　Ｃ）　ｅ）　ＣＩ　Ｃ）　ＯＣｌ
Ｏ４＋−ｉ　　　Ｇ　　　ｃｉ　　　ｉ　　　ｔｃｉ　
　　、−ｉ　　　ｍ　　　％　　ｃｔ３　　ｏ６　　　
ｃｅｉ　　　ｃｓ６０　　　　　包　　　　　＋Ｐ　　
ｏ　　旧　　（’Ｑ　　　Ｏト　　　ω　　−−ＯｅＪ
　　　　ｅＪ　　　　ｅＪ　　　　ｅＪ　　　　ｅＪ　
　　ＯＯ（）　　　Ｏ（）　　　　Ｏ（）４　　０　　
　０　　　０　　　　ＣＩ　　　　Ｏ，ａｏ　　　Ｑコ
　　　αコ　　００　　００　　　ｃｏ　　　　ａりａ
ｏ　　　　　　膿　　　　　■　　−の　　り　　−　
　Φ　　０　　へ　　〜へ寸寸トへ哨　−− ｃＱｏロロ０口ｔｏ　ｔｏ　ｔｏ　ｔｏ　ｔｏ　ｔｏ　
ｗ膿φ■■Φ■■■ωＱ’ＩＯ’ｌφΦ Ｖｌ　　（）　　　Ｌｌ’）　　　の１１’）　　　０
　　　旧１１’）　　＋ｎ　　ＶＩ　　Ｖ３　　　ｋｎ
　　　。

へ０凶へ〜リリ寸寸呻寸クク へ　　ｅＪｃ＋３　　　へ　　〜　　０　　寸　　寸　
　寸　　寸　　寸　　り　　の　　リ各支持体によって
生成される細胞の量の違いは、実験の最初の２０乃至２
４時間においては目視によってさえ明らかであった。Ａ
Ｌｚ○３−菫青石を含むカラムから低速度（５００ｍ／
時以下）で出てくる流体は濁っていたが、軽石を含むカ
ラムから出てくる流体は透明であった。１回目の実験に
おいては、流速が１応／時となった後にＡ９Ｊ２０３−
菫青石を含むカラムから出てくる流体の濁度と軽石を含
むカラムから出てくる流体の濁度がほぼ同じになった。

２回目の実験においては、５００ｄ　／時で両方の濁度
は同じになった。

表および図面に示されたデータから、制御された細孔寸
法の分布を有するＡＱ、ｚｏ３−菫青石支持体は軽石よ
りも細菌繁殖のためのより有効な支持体であることが容
易にわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は無機支持体の平均細孔直径と、この支持体に付
着したエシェリヒアコリの数との関係を示すグラフであ
る。 第２図は第１図のピーク部分を引き伸したグラフである
。 第３図は無機支持体の平均細孔直径と、この支持体に付
着したセラチアマルセスセンスの数との関係を示すグラ
フである。 第４図は制御された多孔率を有する支持体についての細
孔寸法分布曲線を示すグラフである。 第５図は制御されてない多孔率を有する支持体について
の細孔寸法分布曲線を示すグラフである。 第６図は無機支持体の平均細孔直径と、この支持体に付
着したバリシラスサブチリスの数との関係を示すグラフ
である。 第７図は無機支持体の平均細孔直径と、この支持体に付
着したロドスピリラムプラムの数との関係を示すグラフ
である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）分裂によって繁殖す細菌の制御された集団の懸濁
   液を、細孔数の少なくとも７０％が上記細菌の最小寸法
   （幅寸法）と同等以上かつ、上記細菌の最大寸法の約５
   倍未満の直径を有するような制御された多孔率および約
   ０．０１ｍ＾２／ｇより大きな表面積を有する殺菌され
   た多孔性無機支持体物質に、上記支持体物質の上記細孔
   の内面上に少なくともいくらかの上記細菌が付着するの
   に充分な条件の下でさらすことを特徴とする表面積が広
   く体積が小さい生物集団複合体の製造方法。
2. （２）上記細菌集団が単一種のバクテリア菌からなるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
3. （３）上記細孔の直径の平均が約０．８乃至２２０ミク
   ロンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の製造方法。
4. （４）上記支持体物質が無定形物質からなることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
5. （５）上記無定形物質がフリットガラスであることを特
   徴とする特許請求の範囲第４項記載の製造方法。
6. （６）上記支持体物質が結晶性物質からなることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
7. （７）上記結晶性物質が菫青石状物質であることを特徴
   とする特許請求の範囲第６項記載の製造方法。
8. （８）分裂によって繁殖する細菌の制御された集団の懸
   濁液を、細孔数の少なくとも７０％が上記細菌の最小寸
   法（幅寸法）と同等以上かつ上記細菌の最大寸法の約５
   倍未満の直径を有するような制御された多孔性率および
   約０．０１ｍ＾２／ｇより大きな表面積を有する殺菌さ
   れた多孔性無機支持体物質にポリイソシアネートおよび
   シランカップリング剤から選ばれる被覆物質を破壊した
   後、上記支持体物質の上記細孔の内面上に少なくともい
   くらかの上記細菌が付着するのに充分な条件の下でさら
   すことを特徴とする表面積が広く体積が小さい生物集団
   複合体の製造方法。