JPH11505120A - 多孔性基質に固定化された植物生細胞において二次代謝産物を生産する方法、および、物品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 植物生細胞の二次代謝産物の製法であって、以下の諸工程を含む、すなわち、（a）少なくとも500MPaの引っ張り強度を持つ無機材料から成る、実質的に均一な、多孔性基質を調製する工程、（b）植物生細胞の培養体を、前記基質の孔に導入する工程、（c）基質を、細胞の生存活性を妨げないゾルないしコロイド懸濁液でコートすることによって植物細胞を捕捉する工程、（d）捕捉した細胞を、揮発性SiO2ないし、有機的に修飾したSiO2前駆物質で飽和させた搬送ガスを含む反応ガスで、固定化する工程。前記基質は、SiO2ないし、無機酸化物から成る基質であってもよい。ただし、ここに、細胞負荷と、無機材料の重量比は、1x10-4から1x10-2の範囲にある。固定化された細胞は、６ヶ月間溶液中に放出されず、二次代謝産物を生成しながら、その生存活性を維持する。

Description

【発明の詳細な説明】 多孔性基質に固定化された植物生細胞において二次代謝産物を生産する方法、お よび、物品 本発明は、多孔性の無機基質において、植物生細胞の二次代謝産物を連続的に 、ないし、不連続的に生産する製法に関する。 本発明はさらに、植物細胞を、捕捉・固定するのに好適な物品に関する。すな わち、それによって、二次代謝産物生産のために、それら植物細胞の生存を維持 する条件に捕捉・固定するのに好適な物品に関する。 工業規模での二次代謝産物の生産は、本発明の応用分野の主なものではあるが 、唯一のものではない。なぜなら、本発明の方法、および、それによる固定化は 、以下に詳述するように、固定化植物細胞を用いる、他の等価的な分野のいずれ においても、用いて有益なものとなり得るからである。 もっとも一般的に使用される固定基質は、FEBS Lett．103:93-97（1979）およ び122:312-316(1980)，Plant Cell Rep．5:302-305（1986）およびAppl．Microb iol．Biotechnol．30:475-481（1989）に記載してあるように、カルシウム・イ オンと架橋反応させた、藻類のアルギン酸ポリサッカライドである。その他の方 法としては、Biotechnol．Bioeng．33:293-299(1989)，35:660-667(1990)，Appl ．Microbiol．Biotechnol．33:36-42(1990)，37:397-403（1991）および35:382- 392（1991）に記載してあるように、ポリウレタン気泡による捕捉がある。 非植物細胞の場合には、多孔性・非晶質、ゾル・ゲル由来シリカを、生細胞捕 捉のために使用することが記載されている。すなわち、J．Biotechnol．30:197( 1993)，J．Ceram．Soc．Jpn．100:426(1992)，Biochim．Biophys．Acta 276:323 (1972)，Chemistry of Materials 6:1605-1613(1994)、および、Angew．Chem．I nt．Engl．34:301-303（1995）の報告の通りである。この後者の方は、植物の高 等細胞に応用するには現実に好適な方法とは考えられない。なぜなら、細菌や、 酵母細胞の固定化に関して報告されている実験条件では、植物細胞は重篤な毒作 用を受けるからである。植物細胞の固定化に用いられ、かつ、その特許が請求さ れている方法 に関しては、いくつかの問題が必然的に伴う。先ず第一に、表面への簡単な接着 に基づく方法は、正当な意味で固定化とは考えられない。なぜなら、細胞の生殖 や、生物集団の増加は、必然的に、細胞が溶液中に放出される原因になるからで ある。 ポリウレタン・フォーム基質は、固定化細胞への、および、固定化細胞からの 輸送に重大な制限を加える恐れがある。この支持基質の一つの重大な欠点は、機 械的剛性が脆いことである。そのため、実際の工業生産用の長期の使用には適用 できそうにない。 アルギン酸ビーズへの固定化は、細胞と、ゲル基質との直接の接触を許すので 、そのため、細胞は、必然的に、高濃度の各種イオンや有機化合物にさらされる ので、否定的な生理作用の原因となる。 したがって、本発明の主な目的は、植物細胞を固定化する、ある方法によって 前記の欠点を克服することであって、その方法とは、植物細胞の生存性を維持し 、かつ、細胞が基質から放出されるのを防止しながら、固定化相と、培養液の間 の輸送を自由に保ちつつ、植物細胞を固定化する方法である。 本発明のもう一つの目的は、標準条件で繰り返し実行しても、定常な結果を与 える方法を提供することである。 本発明のさらにもう一つの目的は、生産中の応力に耐え、張力を分かちあうこ とができるほどの十分な剛性を持った支持基質を提供することである。 さらにもう一つの目的は、固定化物品、または、基質を提供することである。 すなわち、それらの物品または基質は、開放孔を通じて有機質や養分の自由な交 換を許しながら、細胞間接触を増大させ、したがって、それによって細胞間通信 の可能性を確保するものである。 本発明のさらにもう一つの目的は、工業規模の装置や、関係生産設備によって 実行可能な製法を提供することである。 上記の目的は、以下の諸工程から成る製法によって達成される、すなわち、 (a) 少なくとも500MPaの引っ張り強度を持つ無機材料から形成され る、実質的に均一な、多孔性基質からなる支持体を提供する工程、 (b) 前記基質の孔の中に、植物生細胞の培養体を導入する工程、 (c) 細胞の生存活性を妨げないゾルまたはコロイド懸濁液で基質をコートする ことによって、植物細胞を捕捉する工程、 (d) 揮発性SiO2、または、有機的に修飾されたSiO2前駆物質で飽和した搬送ガ スを含む反応ガスによって、捕捉された細胞を、基質内に固定化する工程。 このように、植物細胞を非活性の支持体に固定化する培養システムの使用は、 それによって、その細胞の環境を簡単に操作することができ、しかも、特定の二 次的代謝産物の収量を、液体に懸濁させた細胞が生成するものよりも増大させる 手段となることが現在では認められている。 本発明によって実現される植物細胞の固定化法は、二次代謝産物の生産におけ る広範囲な応用をカバーする。というのは、この製法は、一つの植物種には限定 されないし、また、基質の機械的剛性と、前駆物質由来のシリカを沈着させた多 孔質とがあいまって、この固定化生物系が、大規模な産業用バイオリアクターの 異質相の生産にも応用可能となっているからである。 本発明の申請者は、驚くべきことに、次の事実を発見した。そして、これが、 本発明の主眼点の一つでもある。それは、植物細胞を、その生存性を維持しなが ら、固定することが可能である、ということである。 基質は、グラス・ファイバーからなる線維体であっても、多孔性ガラス、セラ ミック、クレー、または、同様の無機材料であってもよい。 さらに好ましくは、この基質は、無機線維から成る線維体、ないし、凝集体で あって、SiO2前駆物質、または、同様の物質のゲル性溶液を染ませて、その剛性 を高めたものであってもよい。例えば、100-700mg/cm2の線維密度を持つ通常の ガラス線維体を、Si(OEt)4および、CH3SiH(OEt)2のゲル性溶液に漬けたものであ ってもよい。この濡れた材料を15日間放置し、非晶性シリカを表面に沈着させる 。このようにして得られた剛性の高い線維体を切断して、様々の大きさの小片に してもよい。 一般に、このガラス線維体は、直径30から10μmの線維で構成され ていることが好ましい。その織り目は、工程（b）に従って植物細胞を導入する のに相応しいものとする。線維基質の剛性と機械的応力を増すために用いられる Si(OEt)4および、CH3SiH(OEt)2の濃度は、公称SiO2の10から100g/cm3の範囲にあ る。溶媒は、下記のものの中から一種以上が選ばれるのが好ましい。すなわち、 エタノール、メタノール、ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチ ルフォルマミドである。溶液は、Si-OR基の加水分解を確保するのに十分なH2O濃 度を含み、かつ、公称1x10-1から1x10-5 MのH+濃度で酸性化される。工程(a)に 好適な粘度は、0.2から100Pasの範囲にあることが好ましい。操作は、類縁体Si( OR)4，SiHx(OR)4-x、および、SiXx(OR)4-xのゲル性溶液を用いて行なった。ただ し、ここに、x=1，2、R=アルキルないしアリル基、x=ハロゲン化物、または、ア ルキル基であり、これは同一結果をもたらす。前記類縁体をあらかじめ重合させ て得たシリコン誘導体は、同一結果をもたらす。 同じ大きさのガラス線維体の小片を集めて堆積物とし、工程（a）の後に自ら 自然に実行させてもよい。 工程(b)による細胞の導入は、単純に、ガラス線維体の小片を、生細胞懸濁液 の中に投じて振とうすることで実行される。この懸濁液を、適当な支持体の上に 取り付けた、同じガラス線維体に濾過しても同一結果が得られるであろう。 コロイド性SiO2-ゾル懸濁液で処理すると、工程（c）に従って、ガラス線維体 の空間内に細胞の第一次の捕捉が実行されるが、この工程は、pH4.0-6.5で緩衝 させたコロイド性SiO2懸濁液を用いて実行する。この操作は、水酸化アルミニウ ム、または、その他の含水酸化物のゾル性懸濁液を用いて実行されるが、同じ結 果をもたらす。線維体の線維密度によって、工程（c）で述べたように、様々な 抽出速度が必要とされる。線維密度が最低の場合には、最高の抽出速度が用いら れる。このゾルないしコロイド懸濁液中のハイドロキッド、すなわち、含水酸化 物の量は、5から200g/dm3の範囲にあり、コロイド粒子は、10と1000nmの間に含 まれる直径を持つと考えられる。 細胞捕捉の実行は、工程（d）で行なわれる。Si(OR)4、SiHx(OR)4-x、 および／または、SiXx(OR)4-xの選択は、SiO2様沈着物の接着性、その剛性、お よび、その全体多孔性に影響を及ぼす。この工程は、気相中で行なわれ、酸化シ リコン類縁体を、細胞表面と、ガラス線維体の水酸基に定着させる。Si(OR)4、S iHx(OR)4-x、および／または、SiXx(OR)4-x溶液、または、その混合液としては 、各種の成分濃度が示される。モル比で表わせば、Si(OR)4/SiHx(OR)4-xでは0.1 /1から1/0.01まで、SiHx(OR)4-x/SiXx(OR)4-xでは0.01/2から1/0.1まで、Si(OR) 4/SiXx(OR)4-xでは1/0.01から0.01/1まで、である。化学的類縁体SiHR(OR)2であ って、ここに、Rはアルキルまたはアリルであるそのような類縁体も、溶液とし て、または、Si(OR)4との混合液として用いられる。その際、SiHR(OR)2/Si(OR)4 の比は、0.01/2と1/0.03の間にある。 前記成分の溶液ないし混合液を用いて、搬送ガス流において、適当な蒸気圧が 得られるようにする。前記溶液ないし混合液は、恒温油浴中において、20℃と12 0℃の間に得られる一定温度で保存される。本発明に用いられる搬送ガスは、空 気、窒素、アルゴン、もしくは、ヘリウムである。このガスの全体流量は、ガラ ス線維体の幾何学的表面の１平方センチメートルについて、0.2から80cm3/分の 間にあることが好ましい。蒸気相水による処理を、不活性ガスを、10と70℃の間 で恒温に保持した蒸留水中にバブルして、不活性ガス流中において実行する。全 体流量は、ガラス線維体の幾何学的表面の１平方センチメートルについて、0.01 から10cm3/分の範囲にある。 本発明の特徴および利点は、二つの実施例を記述することでさらに明らかにさ れるであろう。以下に、この実施例を、付属の図を参照しながら例示するが、こ の例示は、非限定的な意味においてのみなされる。 第１図は、本発明によるガラス線維体の顕微鏡写真であって、工程（a）によ ってコートし、安定化した後のものである。 第２図は、工程（b）による線維体中の細胞の顕微鏡写真である。 第３図は、工程（d）で用いられたガラス反応器の線描画である。 第４図は、工程（d）によって、線維体に固定化された細胞の顕微鏡写真であ る。 実施例１ 網目25x25μmの織り目を持つ、通常のガラス線維体を、約25mm直径の円盤にカ ットした。このものに、蒸気を２時間流して、加水した。公称SiO2、濃度=100g/ dm3を含む1/1 Si(OEt)4/CH3SiH(OEt)2エタノール溶液を、正規組成H20，OR/H20= 0.5モル比で加水し、粘度=100Pasになるまで放置した。 この溶液に浸した円盤を、1mm/sの速度で引き出した。この材料は、40℃で15 日間定着を実行すると、ガラス線維が、Si-Hや、Si-CH3半量体を依然として保持 している、非晶質で、かつ、多孔性のSiO2様物質にコートされていることを示す 。コートされた線維の形態を、第１図の走査電子顕微鏡写真で示す。 Coronilla vaginalis L．（1991年葉から出発した細胞系種39RAR、和名オウゴ ンハギ）を、3%(w/v)の蔗糖、1.3mg/lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、0.25mg/l のカイネチン、および、0.25mg/lのナフタレン酢酸を添加した、ガンボルグの基 礎成長B5培養液中で育成した。pHは滅菌前に5.7に調節した。２週間おきに、細 胞を新鮮な培養液に移動し、12時間光照射時には、回転振とう器（110rpm）上で 25℃に維持した。この細胞懸濁液を、滅菌円盤を浸透するのに用いた。操作は、 滅菌状態において行なった。すなわち、円盤一つ一つを、細胞培養液で満たした ペトリ皿に投じて、90rpmの回転振とう器上で三日間放置した。この間12時間を 光照射時間とした。線維体に捕捉された細胞を、走査電子顕微鏡にて観察した。 その様子を第２図に示す。 それぞれの円盤について、その表面を洗浄し、捕捉されていない細胞負荷をす べて取り除いた。この円盤を、滅菌したSiO2ゾル懸濁液に漬けた。粒子径40nmの 、このコロイド懸濁液を、アルカリリン酸塩でpH5.7に緩衝させ、蒸留水で希釈 し、公称SiO2、濃度20g/dm3とした。 この円盤を、1mm/s-1の速度で引き出し、ラックに載せ、第３図に示すガラス 反応器に入れた。この反応器には、85℃の恒温に維持されたモル比80/20の溶液S i(OEt)4およびCH3SiH(OEt)2で飽和された空気から成るガス流が供給される。全 体ガス流量は、円盤の幾何学的表面の125cm2 当たり15ml/分であった。処理を３分間持続し、次に、同じ全体ガス流量を用い て、蒸気で飽和させた空気で２分間円盤を処理した。これは、70℃の恒温に維持 した水に空気をバブルして行なった。ガラス線維円盤中の細胞を、走査電子顕微 鏡で観察してみると、第４図に示すように、SiO2様堆積物によって固定されてい るようであった。個々の円盤を、ホルモンを含まないB5培養液中で、25℃で、12 時間の光照射時間を設けて、回転振とう器上に維持した。 細胞の生存持続性は、植物ミトコンドリアが、テトラゾリウム塩(TTC)を還元 して、赤色のフォルムアザンを与える能力のあることに基づいて定量した。この 赤色フォルムアザンは、485nmの吸収分光光度計によって簡単に検出することが できる。TTC（0.5% w/v）を、pH7のリン酸ナトリウム・バッファーに溶解した。 このTTC溶液を、それぞれの円盤に加え、振とうせずに、暗黒中で、23℃で、24 時間インキュベートした。赤色フォルムアザンを、固定化細胞から、5mlの95％ エタノールで15分間抽出した。成長ホルモンを添加した固相のB5培地上で、２本 の伸長円盤を培養して、細胞の生存性をさらにテストした。微少カルスの誘発を もって、細胞培養体の生存性を示すインディケーターとした。 固定化の維持は、10個の円盤を、25℃で、12時間の光照射時間を設けて、回転 振とう器上で飼育したとき、その培養液中に見られる浮遊細胞の出現をどの程度 コントロールできるかでテストした。テストは、14日おきに、溶液を直接顕微鏡 観察することによって行なった。または、ホルモンを添加した溶液に21日間の熟 成期間を与えて行なった。 ６ヶ月の期間にわたって、固定化細胞による溶液の汚染をチェックしたが、ま ったく認められなかった。 固定化細胞は、クマリン化合物のような二次的代謝産物を生成する。なぜなら 、固定化細胞が維持される培養液を蛍光分析してみると、蛍光化合物の存在が認 められ、その濃度は、４ヶ月の観察期間に増加していたからである。 実施例２ Coronilla viminalis Salisb．（1991年葉から出発した細胞系種７CFR、 和名オウゴンハギ）を、3%(w/v)の蔗糖、1.3mg/lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸 、0.25mg/lのカイネチン、および、0.25mg/lのナフタレン酢酸を添加した、MS培 養液中で育成した。pHは滅菌前に5.7に調節した。 細胞は、２週間おきに、新鮮な培養液に移し、12時間光照射時には、回転振と う器（110rpm）上で25℃に維持した。この細胞懸濁液を、実施例１で使用した方 法にしたがって得た滅菌円盤を浸透するのに用いた。 細胞を、実施例１で使用した方法に従って捕捉し、固定化した。個々の円盤を 、ホルモンを含まないMS培養液中で、25℃で、12時間の光照射時間を設けて、回 転振とう器上に維持した。 細胞の生存性は、TTC還元と、伸長円盤を、成長ホルモンを添加したMS固相培 地で培養した時に見られる微少カルスによってテストした。 円盤から、培養液中への細胞の放出は、６ヶ月の期間に渡って認められなかっ た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物生細胞の二次代謝産物の製法であって、下記の諸工程から成る、すなわ ち、 (a) 少なくとも500MPaの引っ張り強度を持つ無機質の材料から成る、実質的に均 一な、多孔性基質からなる支持体を提供する工程、 (b) 植物生細胞の培養体を、前記基質の孔に導入する工程、 (c) 細胞の生存活性を妨げないゾル、または、コロイド懸濁液で、基質をコート することによって植物細胞を捕捉する工程、 (d) 基質内に捕捉された細胞を、揮発性SiO2、または、有機的に修飾したSiO2前 駆物質で飽和させた搬送ガスを含む反応ガスで、固定化する工程。 ２．請求項１に請求される製法であって、ここに、固定化工程（d）で使用され る搬送ガスが、Si(OR)4，SiHx(OR)4-x，および／または、SiXx(OR)4-xで飽和さ れる。ただし、ここに、x=1，2、Rはアルキルまたはアリル、Ｘはハロゲン化物 、または、アルキルである。 ３．請求項１に請求される製法であって、ここに、固定化工程（d）が、多孔性 支持体の孔中に捕捉された植物細胞の表面において実行され、かつ、その後、細 胞が蒸気相の水によって処理される。 ４．請求項１から３に請求される製法であって、ここに、植物細胞の培養体が、 生物集塊を育成するのに好適な化学的、生理的条件の下に維持された植物組織か ら発生したものである。 ５．請求項１に請求される製法であって、ここに、導入工程（b）が、次の諸手 順を含む物理的方法から成る、すなわち、多孔性無機質支持体を、振とうしなが ら細胞懸濁液中に投じ、細胞懸濁液を、前記支持体を貫通、濾過せしめ、磁場な いし電場のような外部駆動装置によって細胞を浮動せ しめ、かつ、生殖可能な侵入によって、多孔性支持体中に自発的に導入される。 ６．前記のいずれかの請求項に請求される製法であって、ここに、固定化基質が 、処理工場において二次的代謝産物の実質的に連続的な生産を実行するのに相応 しい期間、細胞が遊離されるのを防止する。 ７．前記のいずれかの請求項に請求される製法であって、ここに、固定化された 細胞の培養体に、刺激性の協働因子を添加し、それによって、二次代謝産物の生 産を増大させる。 ８．前記のいずれかの請求項に請求される製法であって、ここに、固定化された 細胞の培養体に、酵素、および、その他の化学物質を添加し、それによって、そ の植物細胞の生理的機能を保存、強化する。 ９．請求項１に請求される製法であって、ここに、前記支持体を形成する基質が 、多孔性ガラス、セラミック、クレー、ないし、同様の無機質である。 10．請求項１に請求される製法であって、ここに、前記支持体を形成する基質が 、無機線維の線維体、または、凝集体である。 11．請求項10に請求される製法であって、ここに、無機線維の線維体ないし凝集 体に、SiO2前駆物質、または、同様の物質のゲル性溶液を染み込ませ、それによ って、前記線維体ないし凝集体の剛性を増大させる。 12．請求項11に請求される製法であって、ここに、ゾル、または、コロイド懸濁 液が、SiO2を含む水酸化物、または、含水酸化物の水性懸濁液であって、4.0か ら6.5の範囲のpH、0.2から100Pasに渡る粘度を持つ。 13．請求項11に請求される製法であって、ここに、ゾル、または、コロイド懸濁 液に分散される水酸化物、または、含水酸化物の量が５から200g/dm3の範囲にあ り、コロイド粒子が、10から1000nmに渡る直径を持つ。 14．前記請求項のいずれかによって二次代謝産物を生産するに当たって、生体内 応用するのに用いられる、静止相にある植物細胞培養体を維持する物品であって 、次の特徴を持つ、すなわち、その物品は、細胞を捕捉し、かつ、その細胞を生 存的条件に維持する孔が、実質的に均一に分布する無機質材料から成る多孔性基 質から形成される支持体から成り、ここに、前記多孔性基質が、少なくとも500M Paの最終引っ張り強度を持つ。 15．請求項14に請求される物品であって、ここに、前記支持体が、ガラス、セラ ミック、線維体、ないし、ガラス線維、または、同様の無機材料から成る、少な くとも１個の円盤状要素であって、前記少なくとも１個の円盤状要素は、反応ガ ス流の供給される閉鎖された反応器の中に封鎖可能なものであって、それによっ て、植物生細胞を固定化し、かつ、二次代謝産物の生産を実行することができる 。 16．請求項14に請求される物品であって、ここに、前記多孔性基質が、植物細胞 の生理的機能を保存ないし強化するのに好適な協働因子、酵素、および／または 、化学物質を含む。