JPS5978687A - 固定化酵素配合体 - Google Patents
固定化酵素配合体Info
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- JPS5978687A JPS5978687A JP58177168A JP17716883A JPS5978687A JP S5978687 A JPS5978687 A JP S5978687A JP 58177168 A JP58177168 A JP 58177168A JP 17716883 A JP17716883 A JP 17716883A JP S5978687 A JPS5978687 A JP S5978687A
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- Japan
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- polyamine
- activated carbon
- amine
- enzyme
- polyfunctional
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化酵素配合体(immobilizede
nzyme Conjugate)及びそのような固
定化酵素配合体の製造法に関する。
nzyme Conjugate)及びそのような固
定化酵素配合体の製造法に関する。
本質的に蛋白質でめり及び通常水内性である酵素が多く
の且つ様々な生活有機体内で起こる化合反応を調節する
のに役立つ生機触媒(oioca−talysts)と
して作用することは公知である。
の且つ様々な生活有機体内で起こる化合反応を調節する
のに役立つ生機触媒(oioca−talysts)と
して作用することは公知である。
酵素は分離もでき、分析、医薬及び工業の用途に使用さ
れている。例えばそれはチーズ又t」・七ンのような食
品の製造において並びにアルコール性飲料の製造におい
て工業的に使用されている。酵素グルコースインメラー
ゼは1^フルクトースのコーンシロラグの製造において
グルコースをフルクトースへ舎転換するのに良く使用さ
れているう酵素は通常水浴性てあり亜ひに一般に不安定
であり1従って不活性化を受けるから、それを利用した
浴液から魯使用のだめに取り出すことが困難であり、ま
たそれは延長された期間に亘ってその触媒活性を保持し
えない、これらの難点は、酵素をしばしば交換する必要
性があるために、16業的規模の運転で酵素を用いると
き費用の増大をもたらすう酵素の交換による高い費用を
減するために、酵素をその使用に先立って固定化する又
は不浴化する種々の方法が工夫されてきた。この酵素の
固定化Q、jその再使用をoJ能にしtさも々けれは酵
素は使用した反応媒体中で不活性化を受は或いは失なわ
れる。これらの固定化酵素系は生化学的に反応させる物
質の性質に依存して裡々の反応器系、例えば充填塔及び
撹拌式タンク反応器で使用することができる。
れている。例えばそれはチーズ又t」・七ンのような食
品の製造において並びにアルコール性飲料の製造におい
て工業的に使用されている。酵素グルコースインメラー
ゼは1^フルクトースのコーンシロラグの製造において
グルコースをフルクトースへ舎転換するのに良く使用さ
れているう酵素は通常水浴性てあり亜ひに一般に不安定
であり1従って不活性化を受けるから、それを利用した
浴液から魯使用のだめに取り出すことが困難であり、ま
たそれは延長された期間に亘ってその触媒活性を保持し
えない、これらの難点は、酵素をしばしば交換する必要
性があるために、16業的規模の運転で酵素を用いると
き費用の増大をもたらすう酵素の交換による高い費用を
減するために、酵素をその使用に先立って固定化する又
は不浴化する種々の方法が工夫されてきた。この酵素の
固定化Q、jその再使用をoJ能にしtさも々けれは酵
素は使用した反応媒体中で不活性化を受は或いは失なわ
れる。これらの固定化酵素系は生化学的に反応させる物
質の性質に依存して裡々の反応器系、例えば充填塔及び
撹拌式タンク反応器で使用することができる。
酵素の同定化を行なうためには、いくつかの一般的な方
法並びに多くのその改変法が報告されている。
法並びに多くのその改変法が報告されている。
米国!Flf¥「第3.796.654号には、ポリア
ミンをコロイド状の、寸法を統一した粒子の表面上に吸
着させ、このポリアミンを通常のアミンと反応する架橋
剤、例えばグルタルアルデヒドで架(I!5シ、得られ
る反応生成物をNaBH,で処理してアルデヒド基を還
えし且つこれによってアルデヒド基及びt整素のアミノ
基間での共有結合を防止し、及びコロイド状吸看剤が酵
素分子と反対の正の電荷を有し、そのイオン結合が他の
非共有結合力を助けるようなpHにおいて酵素を粒子の
処理した表面上に吸着させることを含む固に化法が開示
されている。この特許は暇着剤粒子を面径約50〜約2
0.000X%好ましくは約100〜200Xの範囲の
ものとして記述し、また吸治剤が活性炭−ヒドロキシア
パタイト、アルミナCガンマ、及びベントナイトである
ことを述べている。この系は、酵素を処理した粒子に結
合させることを電荷の相互作用に依存している。この紳
す、「1の結合は・イオン的相互作用がこの’4+fi
の結合に対する環境条件1例えばpH−%イオン強度及
びT昌度に敏感であるが故に共有結合の形成より望まし
くない。
ミンをコロイド状の、寸法を統一した粒子の表面上に吸
着させ、このポリアミンを通常のアミンと反応する架橋
剤、例えばグルタルアルデヒドで架(I!5シ、得られ
る反応生成物をNaBH,で処理してアルデヒド基を還
えし且つこれによってアルデヒド基及びt整素のアミノ
基間での共有結合を防止し、及びコロイド状吸看剤が酵
素分子と反対の正の電荷を有し、そのイオン結合が他の
非共有結合力を助けるようなpHにおいて酵素を粒子の
処理した表面上に吸着させることを含む固に化法が開示
されている。この特許は暇着剤粒子を面径約50〜約2
0.000X%好ましくは約100〜200Xの範囲の
ものとして記述し、また吸治剤が活性炭−ヒドロキシア
パタイト、アルミナCガンマ、及びベントナイトである
ことを述べている。この系は、酵素を処理した粒子に結
合させることを電荷の相互作用に依存している。この紳
す、「1の結合は・イオン的相互作用がこの’4+fi
の結合に対する環境条件1例えばpH−%イオン強度及
びT昌度に敏感であるが故に共有結合の形成より望まし
くない。
Liu られ[、Biotech、nol、。Bio
eng。
eng。
17.1695〜1696(1975)において、2ク
ターゼの粒状炭への固定化法を開示している、この方法
はp−アミンフェノール又は1−フエノ−ルー2−アミ
ノ−4−スルホン酸の炭素への吸着を含む。これらの吸
着された化合物はグルタルアルデヒドが反応し、順次酵
素の結合するアミン基を提供する、酊及されたアミン基
Ω有化合物はポリエチレンイミンのようなポリアミンと
異なる化学的及び物理的性質を有する単量体である、他
(IJ り/L、−プ(Ohoら、工mmob11xz
at1onof Enzymes on Acti
vated Carbon:Properties
of 工mmobilizedGlucoamyl
ase、Glucose 0x1daseand
G11100nO1aOtOnaS6+、 Biot
echno’l。
ターゼの粒状炭への固定化法を開示している、この方法
はp−アミンフェノール又は1−フエノ−ルー2−アミ
ノ−4−スルホン酸の炭素への吸着を含む。これらの吸
着された化合物はグルタルアルデヒドが反応し、順次酵
素の結合するアミン基を提供する、酊及されたアミン基
Ω有化合物はポリエチレンイミンのようなポリアミンと
異なる化学的及び物理的性質を有する単量体である、他
(IJ り/L、−プ(Ohoら、工mmob11xz
at1onof Enzymes on Acti
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of 工mmobilizedGlucoamyl
ase、Glucose 0x1daseand
G11100nO1aOtOnaS6+、 Biot
echno’l。
Bioeng、2且、1651〜1665(197B)
)も、共有結合によシ酵素を粒状炭に固定化した。
)も、共有結合によシ酵素を粒状炭に固定化した。
この方法においては、粒状炭をカルボソイミドで活性化
し1次いで酵素でカルボジイミドを直換し、酵素−炭素
複合体を形成させる、 米国特許第4.141.857号(1979年2月27
日付け)はt無機の有孔性担体材料、例えば細孔直径約
100〜約55.000 X及び表面積約100〜5o
oz/rを有するr−アルミナを、水浴性ポリアミンの
tR液で処理し、この処理した担体拐料を2官能性単量
体物負、例えばグルタルアルデヒドのl得液と接触させ
ることを含むe素の固定化法を開示している。この処理
により、酵素との反応で酵素とペンダントのアルデヒド
基トの間に共有結合を形成させるのに匈当な担体材料が
得られる。この特許の実施例IIには、有孔性のアルミ
ナ球を続いてポリエチレンイミン、グルタルアルデヒド
及びグルコアミラーゼの溶液で処理することによる固定
化RX<配合体の埴造法が記述されている。
し1次いで酵素でカルボジイミドを直換し、酵素−炭素
複合体を形成させる、 米国特許第4.141.857号(1979年2月27
日付け)はt無機の有孔性担体材料、例えば細孔直径約
100〜約55.000 X及び表面積約100〜5o
oz/rを有するr−アルミナを、水浴性ポリアミンの
tR液で処理し、この処理した担体拐料を2官能性単量
体物負、例えばグルタルアルデヒドのl得液と接触させ
ることを含むe素の固定化法を開示している。この処理
により、酵素との反応で酵素とペンダントのアルデヒド
基トの間に共有結合を形成させるのに匈当な担体材料が
得られる。この特許の実施例IIには、有孔性のアルミ
ナ球を続いてポリエチレンイミン、グルタルアルデヒド
及びグルコアミラーゼの溶液で処理することによる固定
化RX<配合体の埴造法が記述されている。
粒状活性炭の使用は〜その多くの魅力的な性質及び理に
かなった価格にもかかわらず、固定化酵素に対する担体
として殆んど注目されなかつ九粒状炭はシロラグ及び他
の食品生成物% !lI!奈学的生学的生成物酸及び柚
々の他の化学品の、連続式カラム透過法による精製に対
して工業的に使用されている。
かなった価格にもかかわらず、固定化酵素に対する担体
として殆んど注目されなかつ九粒状炭はシロラグ及び他
の食品生成物% !lI!奈学的生学的生成物酸及び柚
々の他の化学品の、連続式カラム透過法による精製に対
して工業的に使用されている。
本発明は、
a)有孔性の(porous)粒状活性炭を、ペンダン
トのアミン基を有するポリアミン化合物の溶液と接触さ
せて、ポリアミンを底面への吸沼及び#IIl孔内への
捕捉の双方により活性炭にU層させ; b)活性炭との接力×による水及びそtしに分赦しだ付
オiしてないポリアミンを除去し、及びこれを多官能性
有機ハライド、多官能性無水′1シθ、多官能性アゾ化
合物、多官能性インチオシアネート又は多官能性イソシ
アネートであるアミンと反応する物質の水性分散液と接
触させてこの反応性基の1つをペンダントのアミン基と
反応させ且つ更なる反応のために存在するアミンと反応
する残基を残し;及び C)活性炭との接触による水及びそれに分肢した未反応
のアミンと反応する物質を除去いそしてこの活性級を固
定化すべき1′11“索の水τ6液と接ブ独させて、口
i素のアミン基を共有結合の形成によって未反応のアミ
ンと反15する残基と反応させ、これによってG11
素’に固定化する、工1呈をゴんでなる固定化■素配a
体の東゛L造法を菖゛む。
トのアミン基を有するポリアミン化合物の溶液と接触さ
せて、ポリアミンを底面への吸沼及び#IIl孔内への
捕捉の双方により活性炭にU層させ; b)活性炭との接力×による水及びそtしに分赦しだ付
オiしてないポリアミンを除去し、及びこれを多官能性
有機ハライド、多官能性無水′1シθ、多官能性アゾ化
合物、多官能性インチオシアネート又は多官能性イソシ
アネートであるアミンと反応する物質の水性分散液と接
触させてこの反応性基の1つをペンダントのアミン基と
反応させ且つ更なる反応のために存在するアミンと反応
する残基を残し;及び C)活性炭との接触による水及びそれに分肢した未反応
のアミンと反応する物質を除去いそしてこの活性級を固
定化すべき1′11“索の水τ6液と接ブ独させて、口
i素のアミン基を共有結合の形成によって未反応のアミ
ンと反15する残基と反応させ、これによってG11
素’に固定化する、工1呈をゴんでなる固定化■素配a
体の東゛L造法を菖゛む。
本発明で用いるのに適当なる乙状炭は、典型的には米国
ふるい系において12〜40メツシユのね径を有するで
あろう、細孔の寸法は好ましくは直径で、35ス〜10
00Xであり、′土た村状炭用体例利は200〜600
m’/fの表面積を肩する。
ふるい系において12〜40メツシユのね径を有するで
あろう、細孔の寸法は好ましくは直径で、35ス〜10
00Xであり、′土た村状炭用体例利は200〜600
m’/fの表面積を肩する。
本発明で用いるのに適当なポリアミンの例は、ポリアミ
ンがポリエチレンノアミン1.I?リエチレンイミンー
ボリへキサメチレンーヅアミン、ポリメチレンジシクロ
ヘキシルアミン〜ホリメチレンソアニリン、ポリテトラ
エチレンペンタミン、及びボリフエニレンソアミンを含
むうエビハロヒドリン及びアルキレンポリアミンの共重
合体も適当であることがわかった。ポリアミンの分子帳
は厳密なように見えないけれど、500〜ioo、oo
。
ンがポリエチレンノアミン1.I?リエチレンイミンー
ボリへキサメチレンーヅアミン、ポリメチレンジシクロ
ヘキシルアミン〜ホリメチレンソアニリン、ポリテトラ
エチレンペンタミン、及びボリフエニレンソアミンを含
むうエビハロヒドリン及びアルキレンポリアミンの共重
合体も適当であることがわかった。ポリアミンの分子帳
は厳密なように見えないけれど、500〜ioo、oo
。
の分子鴛−範囲の重合体は好適である、水浴rトのポリ
アミンはその水溶赦から活性炭に適用され、一方非水浴
性の重合体は有Wn7媒1例えばメチルアルコール1エ
チルアルコール、グロビルアルコール、イソプロピルア
ルコール、t−ブチルアルコール、アセトン、メチルエ
ーテル、エチルエーテル、アロビルエーテル1イソグロ
ビルエーテル、゛トルエン1ベンゼン、キシレン、ヘキ
サン−シクロペンタン及びシクロヘキサンから適用され
る、活性炭を1普通溶媒11に対して重合体1〜100
fのσ、14度であるポリアミン溶液と接触させること
によ、す1ポリアミンが活性炭粒子の表面に付滑するよ
うになる。重合体の1部は枯性緘粒子の表面に吸着され
るけれど、多く、の部分は巨大分子が細孔から突き出て
、更なる反応のために官能!、i2(アミノ糸)を残す
ように有孔性41体の孔の中に何者するであろう、これ
は[」IJ述した米国’t’l ie’F 1↓へ79
6. b 54号に記スホされる方法、即ち炭素イ分末
ヲポリエチレンイミンのIJ ll’j−で処セ1ルて
その表面1に荷を変化させ、これによって酵素を担体に
付着させるという方法とメ−・」比される。この方法は
本発明の方法で生成する共南結合よりも非常に望ましく
ない電荷での相互作用にイコl(存する。処置した活性
炭をポリアミン浴液との接触から例えばθ1過によって
除去し1好ましくは脱イオン〔D工)水で洗浄していず
れかの付着してない重合体を除去する。
アミンはその水溶赦から活性炭に適用され、一方非水浴
性の重合体は有Wn7媒1例えばメチルアルコール1エ
チルアルコール、グロビルアルコール、イソプロピルア
ルコール、t−ブチルアルコール、アセトン、メチルエ
ーテル、エチルエーテル、アロビルエーテル1イソグロ
ビルエーテル、゛トルエン1ベンゼン、キシレン、ヘキ
サン−シクロペンタン及びシクロヘキサンから適用され
る、活性炭を1普通溶媒11に対して重合体1〜100
fのσ、14度であるポリアミン溶液と接触させること
によ、す1ポリアミンが活性炭粒子の表面に付滑するよ
うになる。重合体の1部は枯性緘粒子の表面に吸着され
るけれど、多く、の部分は巨大分子が細孔から突き出て
、更なる反応のために官能!、i2(アミノ糸)を残す
ように有孔性41体の孔の中に何者するであろう、これ
は[」IJ述した米国’t’l ie’F 1↓へ79
6. b 54号に記スホされる方法、即ち炭素イ分末
ヲポリエチレンイミンのIJ ll’j−で処セ1ルて
その表面1に荷を変化させ、これによって酵素を担体に
付着させるという方法とメ−・」比される。この方法は
本発明の方法で生成する共南結合よりも非常に望ましく
ない電荷での相互作用にイコl(存する。処置した活性
炭をポリアミン浴液との接触から例えばθ1過によって
除去し1好ましくは脱イオン〔D工)水で洗浄していず
れかの付着してない重合体を除去する。
次いで重合体で処理した活性炭を、多官能性のアミンと
反応する物質1例えばグルタルアルデヒド、ビス−ジア
ゾペンジノン−2,21−ジスルホン酸i 4 、4’
−ノフルオルー3,6I−ソニトロソフェニルスルホン
;ジフェニル−4,4′−ソチオシアネー) −2、2
/−ジスルホン酸:3−メトキシソフェニルメタン−4
、4/−ツインシフ°ネート;トルエン−2−インシア
ネート−4−イソチオシアネート;トルエン−2,4−
ヅインチオシアネート;ジアゾペンツノン;ジアゾペン
ツジン−シアヌル酸り日ライド又は1,5−ノンルオル
ー2.4−ソニトロベンゼンであるアミンと反応スる試
剤を約1〜1oor/lで金山する水fM 7+4と接
触させることによって処理する。アルデヒドが遊離のア
ミノ基を誘導化するのに十分な時間に亘つて反応を進行
させた彼、処理した活性炭をアルデヒド浴液から除去し
、好ましくは脱イオン水で数回洗浄する、本明細jlに
用いる如き、「dδ塀体化」とは活性炭に結合したψ−
合体分子のアミン亡能基及びアミンの反応する試剤のア
ミンと反応する残基間の反応生成物を生成することを意
味するう粒状炭の孔内に捕捉され且つ髄清ぢれたホ合体
物賀に結合しているアミンと反応する51ζ青と反応し
うるアミノ基を含有する缶、素はいずれでもネ方法で固
定化することができる。これらのEff’P素は例、t
ばlJプシン、ノぐノ4イン1ヘギソキナーゼ1フィシ
ン、ブロメリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、
グルコースインメラーゼ、グルコアミラーゼ、キモトリ
ジシン1プロナーゼtアシラーゼ〜イソペルターゼ、ア
ミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペグシンルニン及
びuiプロテアーゼを含む、誘導化された活性炭を酵素
の水石液と混合する。これはバッチ型又は基型反応器中
で行なうことができる。活性炭を酵素1d液から除去し
1次いで水洗することにより、生後へ′口媒転化反応に
用いるのに適当な活性炭固定化酵素を看fる。
反応する物質1例えばグルタルアルデヒド、ビス−ジア
ゾペンジノン−2,21−ジスルホン酸i 4 、4’
−ノフルオルー3,6I−ソニトロソフェニルスルホン
;ジフェニル−4,4′−ソチオシアネー) −2、2
/−ジスルホン酸:3−メトキシソフェニルメタン−4
、4/−ツインシフ°ネート;トルエン−2−インシア
ネート−4−イソチオシアネート;トルエン−2,4−
ヅインチオシアネート;ジアゾペンツノン;ジアゾペン
ツジン−シアヌル酸り日ライド又は1,5−ノンルオル
ー2.4−ソニトロベンゼンであるアミンと反応スる試
剤を約1〜1oor/lで金山する水fM 7+4と接
触させることによって処理する。アルデヒドが遊離のア
ミノ基を誘導化するのに十分な時間に亘つて反応を進行
させた彼、処理した活性炭をアルデヒド浴液から除去し
、好ましくは脱イオン水で数回洗浄する、本明細jlに
用いる如き、「dδ塀体化」とは活性炭に結合したψ−
合体分子のアミン亡能基及びアミンの反応する試剤のア
ミンと反応する残基間の反応生成物を生成することを意
味するう粒状炭の孔内に捕捉され且つ髄清ぢれたホ合体
物賀に結合しているアミンと反応する51ζ青と反応し
うるアミノ基を含有する缶、素はいずれでもネ方法で固
定化することができる。これらのEff’P素は例、t
ばlJプシン、ノぐノ4イン1ヘギソキナーゼ1フィシ
ン、ブロメリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、
グルコースインメラーゼ、グルコアミラーゼ、キモトリ
ジシン1プロナーゼtアシラーゼ〜イソペルターゼ、ア
ミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペグシンルニン及
びuiプロテアーゼを含む、誘導化された活性炭を酵素
の水石液と混合する。これはバッチ型又は基型反応器中
で行なうことができる。活性炭を酵素1d液から除去し
1次いで水洗することにより、生後へ′口媒転化反応に
用いるのに適当な活性炭固定化酵素を看fる。
本発明の酵素固定化法の予期を越えン’j観点の1つは
、粒状炭がその処理したものが未処理のものよシ微粉炭
を生成しないという意味において強靭になったというこ
とである。この性質は次の実験で例示されるように不均
一生機触媒を考える輛に非常に重要である: 粒状炭の5つの試料を、ポリエチレンイミンCP用工)
の1農度を0〜α5多(水中W/v)で変えて処理した
。このPE工処理後に、活性炭試料を洗浄し、次いで0
02Mホウ酸塩緩衝液中p H9,0において1%グル
タルアルデヒド(GA)(w/v水)で処理した。グル
タルアルデヒド浴液中の試料を回転振とう機に取シつけ
4時間J嵐押した1次いで液体を活性炭からI’、?l
斜い懸濁液中の活性炭微粉末の程度を0〜5の相対尺度
で評価した。ゼロ値は活性体微粉末の観察されなかった
ことを表わい一方5の値は完全に不透明になる活性炭微
粉末の懸濁を表わす。次の表は撹拌中に生成する活性炭
微粉末の程度を要約する。
、粒状炭がその処理したものが未処理のものよシ微粉炭
を生成しないという意味において強靭になったというこ
とである。この性質は次の実験で例示されるように不均
一生機触媒を考える輛に非常に重要である: 粒状炭の5つの試料を、ポリエチレンイミンCP用工)
の1農度を0〜α5多(水中W/v)で変えて処理した
。このPE工処理後に、活性炭試料を洗浄し、次いで0
02Mホウ酸塩緩衝液中p H9,0において1%グル
タルアルデヒド(GA)(w/v水)で処理した。グル
タルアルデヒド浴液中の試料を回転振とう機に取シつけ
4時間J嵐押した1次いで液体を活性炭からI’、?l
斜い懸濁液中の活性炭微粉末の程度を0〜5の相対尺度
で評価した。ゼロ値は活性体微粉末の観察されなかった
ことを表わい一方5の値は完全に不透明になる活性炭微
粉末の懸濁を表わす。次の表は撹拌中に生成する活性炭
微粉末の程度を要約する。
PB工処理 +1.¥律・:、I微粉末対
照PEIなし 5 0015% pg工 6 005% PFi工 2015− P
E工 1 (L5チ pg工 0.5粒状炭粒子上
に見かけ上生成する保N’7Jコーティング又は層は、
存在するPg工の卆1.に依存するととがわかる0本方
法は酵素を活性炭粒子に固定するばかりでなく、活性炭
粒子を強化してその崩解を減少させる。
照PEIなし 5 0015% pg工 6 005% PFi工 2015− P
E工 1 (L5チ pg工 0.5粒状炭粒子上
に見かけ上生成する保N’7Jコーティング又は層は、
存在するPg工の卆1.に依存するととがわかる0本方
法は酵素を活性炭粒子に固定するばかりでなく、活性炭
粒子を強化してその崩解を減少させる。
本固定化法の他の独特な特徴は、先に使用した粒状炭が
塩基−酸洗浄を含む簡単な方法での再生後に固定化に使
用できるということである。本方法のこの性質はそれが
使用者を廃棄の問題からj管放し且つ同様に潜在的な経
済的節約を提供するということで重装である。この再生
の可能性は、pzニーGA法によって固定化されだ酵素
を有する粒状炭を乾煙し、次のように再生する実願によ
って例示される: 1.50ral!の乾燥した活性体複合体をDI水でス
ラリーとし1D工水の数倍容量で洗浄する〜1 水を
傾斜し、(L 5 N〕NaOH250−を添加し、数
分間混合し、1時間放置する。
塩基−酸洗浄を含む簡単な方法での再生後に固定化に使
用できるということである。本方法のこの性質はそれが
使用者を廃棄の問題からj管放し且つ同様に潜在的な経
済的節約を提供するということで重装である。この再生
の可能性は、pzニーGA法によって固定化されだ酵素
を有する粒状炭を乾煙し、次のように再生する実願によ
って例示される: 1.50ral!の乾燥した活性体複合体をDI水でス
ラリーとし1D工水の数倍容量で洗浄する〜1 水を
傾斜し、(L 5 N〕NaOH250−を添加し、数
分間混合し、1時間放置する。
& アルカリ溶液を傾斜し、活性炭を多量の水で洗浄す
る。
る。
4、 水の傾斜後、0.5NのHC!1250m/を添
加し、数分間混合し、次いで1時間放置する、5゜酸を
傾斜し、洗浄水のpHが66になる寸で多量の水で洗浄
するっ この方法で再生成した活性炭を、続いてpbニーGA法
によるグルコアミラーゼの固定化に便用した。この活性
炭で110単(r7. / meの活性が得られた。こ
れは固定化のためにfrLい粒状炭を用いた時にイ1ら
れる130単位/mfと非常に良く一致した。
加し、数分間混合し、次いで1時間放置する、5゜酸を
傾斜し、洗浄水のpHが66になる寸で多量の水で洗浄
するっ この方法で再生成した活性炭を、続いてpbニーGA法
によるグルコアミラーゼの固定化に便用した。この活性
炭で110単(r7. / meの活性が得られた。こ
れは固定化のためにfrLい粒状炭を用いた時にイ1ら
れる130単位/mfと非常に良く一致した。
本固定化法は酵素及び粒状炭に吸着した重合体間に、非
常に安定な結合を生成させる。ここに液化したトウモロ
コシの殿粉の阻rd液を固定化#累の床中を通過させた
時、活性炭粒子は蛋白質又は他の物質が覆ったり、それ
によって汚れたりしないということが発見された。
常に安定な結合を生成させる。ここに液化したトウモロ
コシの殿粉の阻rd液を固定化#累の床中を通過させた
時、活性炭粒子は蛋白質又は他の物質が覆ったり、それ
によって汚れたりしないということが発見された。
次の実施例は本発明を夾に例示する。実施例中、すべて
の寸法は米国標準ふるい系に基づくものである。
の寸法は米国標準ふるい系に基づくものである。
実施例 1
アミノグルコシダーゼの、PKIiJ導体化粒状炭への
固定 固定化に使用する前に粒状炭を次のようにル2洗洋した
: i、−20〜40メツシユの粒状活性炭(Darco)
i o ome’を濃塩酸と混合し、室潟で数時間放i
Nした。この時活性炭を完全に浸すのに十分な酸を使用
した。
固定 固定化に使用する前に粒状炭を次のようにル2洗洋した
: i、−20〜40メツシユの粒状活性炭(Darco)
i o ome’を濃塩酸と混合し、室潟で数時間放i
Nした。この時活性炭を完全に浸すのに十分な酸を使用
した。
2、 次いで多量の脱イオン水を活性炭スラリーに添加
しt活性炭が沈降した後に1頃か1したつ6、工程2の
水洗浄を数回繰返した。
しt活性炭が沈降した後に1頃か1したつ6、工程2の
水洗浄を数回繰返した。
4、活性炭をガラスのカラム(2,6X 70cm )
、 に移し1流出物がp H15に達す
るまで水を床中に流しだ。
、 に移し1流出物がp H15に達す
るまで水を床中に流しだ。
5、 次いで活性炭をカラムから取り出し、輩渇で水中
に貯えた。
に貯えた。
次の方法によりグルコシダ−ゼ・を室部で固定化した:
1.250m5の丸底フラスコ中において、PF!I−
600(Dow製、分子尾範囲4 o、 o o o〜
60.000のポリエチレンイミン)の4%ン各4芝1
00 meを酸わ旨4’ した粒状炭10mgに添加い
ゆっくりと数時間(祉(34’ した−2、 次いで、
I? リアミンを傾斜し、活性炭を多量の水で洗浄した
。
600(Dow製、分子尾範囲4 o、 o o o〜
60.000のポリエチレンイミン)の4%ン各4芝1
00 meを酸わ旨4’ した粒状炭10mgに添加い
ゆっくりと数時間(祉(34’ した−2、 次いで、
I? リアミンを傾斜し、活性炭を多量の水で洗浄した
。
6 活性炭上に吸着された(、−1定化アミノ基を、p
fl 9.0に調節シた1係グルタルアルテ゛ヒト°
〆台液200dKよりグルタルアルデヒド 化した,3pEiを9.0にa持しながら反応を18時
間帖fi’i口〜だ、 4、グルクルアルデヒド溶液を61斜し1活性炭を水洗
して未反応のグルクルアルデヒド紮篩去したう 5、4NaυH(2N)でp H 7. 0に調節した
グルrーfミ’j−ゼ(AG,Diazyme L−
1002、5rHe,Mzlos Laborato
rles, 工nC+)溶液をFANQ体化炭に添加
した。徳やかに数時間撹拌しなから1反応器合物のpH
をZOに保った。
fl 9.0に調節シた1係グルタルアルテ゛ヒト°
〆台液200dKよりグルタルアルデヒド 化した,3pEiを9.0にa持しながら反応を18時
間帖fi’i口〜だ、 4、グルクルアルデヒド溶液を61斜し1活性炭を水洗
して未反応のグルクルアルデヒド紮篩去したう 5、4NaυH(2N)でp H 7. 0に調節した
グルrーfミ’j−ゼ(AG,Diazyme L−
1002、5rHe,Mzlos Laborato
rles, 工nC+)溶液をFANQ体化炭に添加
した。徳やかに数時間撹拌しなから1反応器合物のpH
をZOに保った。
6、 この酵素溶油を傾斜し1固定化酵素を水洗したつ
固定化m素の活性及び安定性を、Fordら、Enzy
me Engineering,Wlngard,J
r+。
me Engineering,Wlngard,J
r+。
L.B,編、267頁, John Willey &
Elona, New York ( 1 9 7
2 )に記述されているように、循環式微分型反応器
において数回評価することによって決定した.評価は基
質としてMaltrin−15 [Grain Pro
cessingoo、、Muscatine,IOWa
, から入手した低DJ!!(15〜18)のトウモ
ロコシ殿杉J〕をX3 f( 4. 2の002M酉i
:111.きt清棗叱!:trンj!σ1コで月jいる
ことにより50℃下に行なつブc.H白1111を行な
うグζめに一物l綾を受器中に入れ、生成するグルコー
スの量をGlucostrate gz (−+Fal
lJな方法)で11価し1回帰分析からグルコースの分
画りに生成する初期速厩を決定した。活性の単位は’;
%k 栄↑ト下において1分間にグルコース1μモルを
生成する酵素のふ(を表わす。
Elona, New York ( 1 9 7
2 )に記述されているように、循環式微分型反応器
において数回評価することによって決定した.評価は基
質としてMaltrin−15 [Grain Pro
cessingoo、、Muscatine,IOWa
, から入手した低DJ!!(15〜18)のトウモ
ロコシ殿杉J〕をX3 f( 4. 2の002M酉i
:111.きt清棗叱!:trンj!σ1コで月jいる
ことにより50℃下に行なつブc.H白1111を行な
うグζめに一物l綾を受器中に入れ、生成するグルコー
スの量をGlucostrate gz (−+Fal
lJな方法)で11価し1回帰分析からグルコースの分
画りに生成する初期速厩を決定した。活性の単位は’;
%k 栄↑ト下において1分間にグルコース1μモルを
生成する酵素のふ(を表わす。
新しい基質を用い且つ活性の安定1111を決定する、
たメK ?& #’f 1面出J K g lIi
7 i夜(” 02” r’l’lCj’&JIJ、p
H4、2)で洗浄することによf)r庁素を連わ′C
的に3回評価し/L,次の結果は、AGMJj導体化炭
上にト1w化され且つ活性のあることを示ず− 活性炭上に固定化されたAGの活性 1回 148 544 2回 145 3!+85回
138 322実施例 ■ 炭への固定化 実施例Iにおける如(PEニーグルタルアルデヒドで誘
導体化しだネ’31状炭5 +ni 、fFEを、バク
テリヤのα−アミラーゼ(Taka−Therm■、M
ilesbaboratortee、 工nc、)を
Li:il固定化るために使用した。誘導体化炭を処理
するために用いる酵素溶液は水で50meに7:布釈し
た1〃ノeのT a k a −Thθrm■からなっ
た。固定化を実施例1に記述したように行なった。得ら
れた固定化調NV物を、緩衝液(1QmMの0aO1,
を含有する0、 02 M酢酸Ins p H6−0)
で洗浄後、10 mM 0aC1゜を含有するp H6
,0のQ、 Q 2 Mf4’f醒塩緩衝液中4%町浴
性絨粉を基質として用い、微分型反応器で評価した。殿
粉の加水分解の程り川を、Uhuysenら、Meth
Od8 in EnZym010g7 、g1Ml
1巻、685頁、Academic Press、N
ew York。
たメK ?& #’f 1面出J K g lIi
7 i夜(” 02” r’l’lCj’&JIJ、p
H4、2)で洗浄することによf)r庁素を連わ′C
的に3回評価し/L,次の結果は、AGMJj導体化炭
上にト1w化され且つ活性のあることを示ず− 活性炭上に固定化されたAGの活性 1回 148 544 2回 145 3!+85回
138 322実施例 ■ 炭への固定化 実施例Iにおける如(PEニーグルタルアルデヒドで誘
導体化しだネ’31状炭5 +ni 、fFEを、バク
テリヤのα−アミラーゼ(Taka−Therm■、M
ilesbaboratortee、 工nc、)を
Li:il固定化るために使用した。誘導体化炭を処理
するために用いる酵素溶液は水で50meに7:布釈し
た1〃ノeのT a k a −Thθrm■からなっ
た。固定化を実施例1に記述したように行なった。得ら
れた固定化調NV物を、緩衝液(1QmMの0aO1,
を含有する0、 02 M酢酸Ins p H6−0)
で洗浄後、10 mM 0aC1゜を含有するp H6
,0のQ、 Q 2 Mf4’f醒塩緩衝液中4%町浴
性絨粉を基質として用い、微分型反応器で評価した。殿
粉の加水分解の程り川を、Uhuysenら、Meth
Od8 in EnZym010g7 、g1Ml
1巻、685頁、Academic Press、N
ew York。
1966年に記述されているフェリシアニド法により生
成する還元基の量を(14す定することによって決定し
た。この鳩舎グルコースを参照物質として防用した。固
定したα−アミラーゼの活性は・連続評価において、固
定化1オ素1 mI!当りそれぞれ11.7及び95単
位であったつ 実施例 ■] 菌のα−アミラーゼの、PE工り巻導体什粒状炭への固
定化 実施例11に記述したように、W4のα−アミラーゼを
誘導体化炭上に固定化した。 p HI ZOに61.
■節L ノ7二sumiZ7me LP−8の菌−の
α−アミラーゼ(q 08MMU/η)α1fを含有す
る酵素溶液を用いてPEニーグルタルアルデヒドでh誘
導体化した活性炭5mlを処理した。同定化%、l製物
の活性を、1%Martrin−10を基質として用い
る以外実施例11に記述したように測定した。連続評価
において同定化醇木1 ml尚り5,2及び5.5単位
の活性がイIJられた。活性の単位は、フェリシアニド
法によりグルコースμモル/分として測定される如き還
元基の生成量を表わす。
成する還元基の量を(14す定することによって決定し
た。この鳩舎グルコースを参照物質として防用した。固
定したα−アミラーゼの活性は・連続評価において、固
定化1オ素1 mI!当りそれぞれ11.7及び95単
位であったつ 実施例 ■] 菌のα−アミラーゼの、PE工り巻導体什粒状炭への固
定化 実施例11に記述したように、W4のα−アミラーゼを
誘導体化炭上に固定化した。 p HI ZOに61.
■節L ノ7二sumiZ7me LP−8の菌−の
α−アミラーゼ(q 08MMU/η)α1fを含有す
る酵素溶液を用いてPEニーグルタルアルデヒドでh誘
導体化した活性炭5mlを処理した。同定化%、l製物
の活性を、1%Martrin−10を基質として用い
る以外実施例11に記述したように測定した。連続評価
において同定化醇木1 ml尚り5,2及び5.5単位
の活性がイIJられた。活性の単位は、フェリシアニド
法によりグルコースμモル/分として測定される如き還
元基の生成量を表わす。
実施例 ■
実施例■に記述した方法を用いてダイズのβ−アミラー
ゼを固定化した。p H7,0に6’・υ11シた5
0 mlの酵素溶液(凍結転作した試料cL1f。
ゼを固定化した。p H7,0に6’・υ11シた5
0 mlの酵素溶液(凍結転作した試料cL1f。
182単位/f)を用いてpg工誘導体化炭5 mlを
処理した。この固定化酵素;+’13製物を1実施例H
の評価条件を用いて微分型反応器で評価した。固定化酵
素1 ml当り2.6及び24の)i;続訂価結果が得
られた。
処理した。この固定化酵素;+’13製物を1実施例H
の評価条件を用いて微分型反応器で評価した。固定化酵
素1 ml当り2.6及び24の)i;続訂価結果が得
られた。
実施例 V
p H7,0のモルト・アミラーゼ(022、Myla
se−WauFJrf!toj−n T、+ab)の
100m1!の浴液を用いて1実施例■に記116シた
方法により1PE工誘導体化粒状炭10meを処37+
! した、この固定化酵素調製物を1実施例109(シ
述したようにN4%可溶性殿粉を基質として用いるとと
により、微分型反応器で口・1′価しブ輸固定化酵素1
グe当り1.8坪位の活性が得られた。粒状炭を用いる
tF価の多くでは、ChOら、B10technol。
se−WauFJrf!toj−n T、+ab)の
100m1!の浴液を用いて1実施例■に記116シた
方法により1PE工誘導体化粒状炭10meを処37+
! した、この固定化酵素調製物を1実施例109(シ
述したようにN4%可溶性殿粉を基質として用いるとと
により、微分型反応器で口・1′価しブ輸固定化酵素1
グe当り1.8坪位の活性が得られた。粒状炭を用いる
tF価の多くでは、ChOら、B10technol。
Bioeng、、 ヱ旦、1651(197B)に記
述されるように基質及び生成物の吸λ1が実除の速度に
影響しうろことを記述しなければならない。
述されるように基質及び生成物の吸λ1が実除の速度に
影響しうろことを記述しなければならない。
実施例 ■
D工水(1) f(7,0) 100 ml、中のコム
ギのμ−アミラーゼ(凍結乾燥した粉末140 MM
U/my)[12mg、Hlを用いt実施Nilに記述
した方法に+rrつてPEエーグルタルアルデヒ)″誘
導体化P i o meを処理した。この調製物の活性
は、微分&反応器中においてpf(aoの4チ可酊性殿
粉を基質として用いることにより、固定化酵素1 ml
当り1,6竿イVとし′て訂1曲できた。
ギのμ−アミラーゼ(凍結乾燥した粉末140 MM
U/my)[12mg、Hlを用いt実施Nilに記述
した方法に+rrつてPEエーグルタルアルデヒ)″誘
導体化P i o meを処理した。この調製物の活性
は、微分&反応器中においてpf(aoの4チ可酊性殿
粉を基質として用いることにより、固定化酵素1 ml
当り1,6竿イVとし′て訂1曲できた。
実施例 ■
プルラナーゼの、PEニーグルタルアルデヒド誘実施雄
側に記述した方法と同様に、誘導体化炭10mgを、プ
ルラナー−11’ (A 、E 、 M 、 Ch
emicalLta、、試料に1000)0.2fをD
工水10〇−に浴8’Fすることによって調製したプル
ラナーゼのp H7,0の溶液100rneで処理する
ことによりプルラナーゼを固定した。この酵素調製物の
活性を、循環式微分型反応器中において、pf(5,5
の0、02 M i!i7酸塩緩衝液中(12%グルラ
ンを基質を用いて50℃下に評価した。プルランの消化
の程度を、還元基の出現によって決定した。、M元基を
、フェリシアニド法により、グルコースを参照物として
好個した。還元基の生成を時間の関数としてプロットし
、このプロットから、反応15分においてプルランの1
5チが消化されたことが評価された、 実施例 W ストレプトマイシン・オリパセウム(8treptO−
myceo olivaceus)の洗浄した細胞を
稀釈洗剤(Q、1%Lubrol WX) で処理り
及び遠心分Fr’lk して細胞かすを除去することに
よって可溶性のグルコース・インメラーゼ(G工)を得
た。を占性2単位/ me (単位=フルクトースμモ
ル/分)を有するpH7,0の可m性G工ty) 1o
Onle量ヲFI4いて、実施例11に記述したよう
に誘導体化粒状炭10meヶ処理した。活性は微分型反
応器中において、2Mグルコース、4.1 mM Mg
SO4−7H,0。
側に記述した方法と同様に、誘導体化炭10mgを、プ
ルラナー−11’ (A 、E 、 M 、 Ch
emicalLta、、試料に1000)0.2fをD
工水10〇−に浴8’Fすることによって調製したプル
ラナーゼのp H7,0の溶液100rneで処理する
ことによりプルラナーゼを固定した。この酵素調製物の
活性を、循環式微分型反応器中において、pf(5,5
の0、02 M i!i7酸塩緩衝液中(12%グルラ
ンを基質を用いて50℃下に評価した。プルランの消化
の程度を、還元基の出現によって決定した。、M元基を
、フェリシアニド法により、グルコースを参照物として
好個した。還元基の生成を時間の関数としてプロットし
、このプロットから、反応15分においてプルランの1
5チが消化されたことが評価された、 実施例 W ストレプトマイシン・オリパセウム(8treptO−
myceo olivaceus)の洗浄した細胞を
稀釈洗剤(Q、1%Lubrol WX) で処理り
及び遠心分Fr’lk して細胞かすを除去することに
よって可溶性のグルコース・インメラーゼ(G工)を得
た。を占性2単位/ me (単位=フルクトースμモ
ル/分)を有するpH7,0の可m性G工ty) 1o
Onle量ヲFI4いて、実施例11に記述したよう
に誘導体化粒状炭10meヶ処理した。活性は微分型反
応器中において、2Mグルコース、4.1 mM Mg
SO4−7H,0。
2.4 mM NaH3O,及び20mM1.リス−マ
レエート緩衝液pHaOを含む基質を用いることにょシ
150℃で固定化酵素1−当り2.2 JP位と評価さ
れた。フルクトースの生成量をシスティン−H,So。
レエート緩衝液pHaOを含む基質を用いることにょシ
150℃で固定化酵素1−当り2.2 JP位と評価さ
れた。フルクトースの生成量をシスティン−H,So。
法で決定した。
実施例 ■
1%グルタルアルデヒド浴欣をα05Mホウ酸塩でp
H9,0に緩衝させ且つn:素溶液を005M燐1・夜
ナトリウノ・でp H7,0に緩衝させる以外実施例■
に記述した方法により、閂のラクターゼをlij′F体
化粒状炭に固定化した。ラクターゼfrrWL(0,1
fの5 Qrnl、 Miles Laborator
ies。
H9,0に緩衝させ且つn:素溶液を005M燐1・夜
ナトリウノ・でp H7,0に緩衝させる以外実施例■
に記述した方法により、閂のラクターゼをlij′F体
化粒状炭に固定化した。ラクターゼfrrWL(0,1
fの5 Qrnl、 Miles Laborator
ies。
Inc、、ppの2クターゼ、1.4.280 FCO
Lυ/1)を用いてPin工誘漕1体化炭10rnIを
処理した。
Lυ/1)を用いてPin工誘漕1体化炭10rnIを
処理した。
この酵素調製物の活性を、微分型反応器において100
5M酢酸塩緩衝液p H4,5中α15Mラクトースを
基質として用いることにより55℃で測定した。ラクト
ースノ分解を、GlucoBtrate法により決定さ
れる如きグルコースの生成量によつて監視した。活性は
同定化酵素1 ml当り68単位として評価された、 実施例 X 先の実施例においてはt 1神yi1+だけのポリアミ
7(DOW PEI −600、分子lj、範囲40.
000〜6 o、 o o o )を粒状炭に誘導体化
させた。本実施例では1他の分子量のpg工を用いてc
′ニド累の結合に及はす影響を決定した。この実験のた
めに、1%P Ei I −18(M W 1.800
) s 2 % P Eニー 20.0 (MW20
,000−30.000 )%及び1%PEエーロ0”
l(MW40,000〜60,000)の溶液50m1
を用いて酸洗浄した粒状炭10Fnlを処理した。活性
炭の肪導体化法は、グルタルアルデヒド溶液を0.05
Mホウ酸塩でp H9,o K緩衝させる以外実施例
夏に記述したものと同様でありた。またAGg液(50
mlに希釈したMilesDiazyme L−100
の2 ml )も0.05 n燐a塩てpH7,0に緩
衝させた。
5M酢酸塩緩衝液p H4,5中α15Mラクトースを
基質として用いることにより55℃で測定した。ラクト
ースノ分解を、GlucoBtrate法により決定さ
れる如きグルコースの生成量によつて監視した。活性は
同定化酵素1 ml当り68単位として評価された、 実施例 X 先の実施例においてはt 1神yi1+だけのポリアミ
7(DOW PEI −600、分子lj、範囲40.
000〜6 o、 o o o )を粒状炭に誘導体化
させた。本実施例では1他の分子量のpg工を用いてc
′ニド累の結合に及はす影響を決定した。この実験のた
めに、1%P Ei I −18(M W 1.800
) s 2 % P Eニー 20.0 (MW20
,000−30.000 )%及び1%PEエーロ0”
l(MW40,000〜60,000)の溶液50m1
を用いて酸洗浄した粒状炭10Fnlを処理した。活性
炭の肪導体化法は、グルタルアルデヒド溶液を0.05
Mホウ酸塩でp H9,o K緩衝させる以外実施例
夏に記述したものと同様でありた。またAGg液(50
mlに希釈したMilesDiazyme L−100
の2 ml )も0.05 n燐a塩てpH7,0に緩
衝させた。
この調製物の酵素活性を1実施例■に記述したように循
環式微分型反応器で決定した。次の表は活性を要約する
。
環式微分型反応器で決定した。次の表は活性を要約する
。
pE■−IB 252PEニー200
252 1)Eエーロ00 179これらの結果
は、広い分子量範囲のPElが同定化酵素に便用できる
が、ポリアミン分子の大きさが固定化された酵素の足に
影響するということを示す、#素が結合するPE工分子
の大きさは、立体障害又は物質移動の現象により1液化
炒粉の消化から得られる生成物の様子にも影響する。
252 1)Eエーロ00 179これらの結果
は、広い分子量範囲のPElが同定化酵素に便用できる
が、ポリアミン分子の大きさが固定化された酵素の足に
影響するということを示す、#素が結合するPE工分子
の大きさは、立体障害又は物質移動の現象により1液化
炒粉の消化から得られる生成物の様子にも影響する。
実施例 X
本実施例では、AGを固定化するために他の釉類の承り
アミンをポリエチレンイミンの代りに用いた。この実験
に対してはBetZ1180をポリアミンとじで使用し
た。このBθtz Labora−tOrieB、
工nc、、Trevose、Penn5yl−van
la、から商品名Betz 1180として市販され
ている重合体は・エピハロヒドリンのアルキレンポリア
ミンとの組合によってfJIられる水浴性のカチオン重
合体である。これは100万以下の分子Jtをイ]シ、
溶液1v当り約α288ミリモルのアミノ基にンヒドリ
ン分析による)を含み1全石液重MK基づいてsob<
量チの固体を含イfする浴液として市販されている。こ
の重合体及びその製造に関する更に詳細な記述は米国特
許第3゜915.904号及び第へ953.530号に
見出すことができる。Iポリアミンの吸着、アミン基の
活性化及び酵素の固定化の工程は芙飾例1に記述したも
のと同様でめった。調製物の活性は実施例Iにおける如
く256単位/同定化酵素meとして評価された0本実
施例は、ペンダントのアミン基を有するポリエチレンイ
ミン以外の4′リアミンも本発明で使用するのに適当で
あることを示す。
アミンをポリエチレンイミンの代りに用いた。この実験
に対してはBetZ1180をポリアミンとじで使用し
た。このBθtz Labora−tOrieB、
工nc、、Trevose、Penn5yl−van
la、から商品名Betz 1180として市販され
ている重合体は・エピハロヒドリンのアルキレンポリア
ミンとの組合によってfJIられる水浴性のカチオン重
合体である。これは100万以下の分子Jtをイ]シ、
溶液1v当り約α288ミリモルのアミノ基にンヒドリ
ン分析による)を含み1全石液重MK基づいてsob<
量チの固体を含イfする浴液として市販されている。こ
の重合体及びその製造に関する更に詳細な記述は米国特
許第3゜915.904号及び第へ953.530号に
見出すことができる。Iポリアミンの吸着、アミン基の
活性化及び酵素の固定化の工程は芙飾例1に記述したも
のと同様でめった。調製物の活性は実施例Iにおける如
く256単位/同定化酵素meとして評価された0本実
施例は、ペンダントのアミン基を有するポリエチレンイ
ミン以外の4′リアミンも本発明で使用するのに適当で
あることを示す。
実施例 Xll
固定化#tL’;/こ酵素及び担体間の距離及びJ−(
1体に関する固定化酵素の柔軟性は、自ン素の代りにポ
リアミンをS吸着された誘導体化ポリアミンに反11w
。
1体に関する固定化酵素の柔軟性は、自ン素の代りにポ
リアミンをS吸着された誘導体化ポリアミンに反11w
。
させ、次いでこの新規なポリアミンをf’i?s<の固
定化のだめにグルタルアルデビドで誘、vi体イヒする
ことによって笈えることができる。この技術?’;1s
51にポリアミン(FEZ又Lj:Eetzlls o
)を酸洗浄した粒状炭に吸着させ;庄2にアミノ九を
グルタルアルデヒドと反応させ;第3にポリアミンをグ
ルタルアルデヒドのアルデヒド基に共有的に結合させ;
柁4にアミノ基をグルタルアルデヒドで粘性化させ、最
後に酵素を固定化するということによって試みられた。
定化のだめにグルタルアルデビドで誘、vi体イヒする
ことによって笈えることができる。この技術?’;1s
51にポリアミン(FEZ又Lj:Eetzlls o
)を酸洗浄した粒状炭に吸着させ;庄2にアミノ九を
グルタルアルデヒドと反応させ;第3にポリアミンをグ
ルタルアルデヒドのアルデヒド基に共有的に結合させ;
柁4にアミノ基をグルタルアルデヒドで粘性化させ、最
後に酵素を固定化するということによって試みられた。
実験条件tま一;JYリアミンをp H9,0ノ0.0
5 Mホウ酸塩緩衝液中で作るという第2のポリアミン
での処理を除き、ポリアミン及びグルタルアルデヒド工
程に関しては実施例XにiL述したものと同様であった
。pgエーロ00及びBetZ 1180の組合ぜに
より4つの試料を調製した。固定化に用いた酵素は実施
例■に記述したGIであった。
5 Mホウ酸塩緩衝液中で作るという第2のポリアミン
での処理を除き、ポリアミン及びグルタルアルデヒド工
程に関しては実施例XにiL述したものと同様であった
。pgエーロ00及びBetZ 1180の組合ぜに
より4つの試料を調製した。固定化に用いた酵素は実施
例■に記述したGIであった。
製造した試料の活性を1実施例■llにf5e述した評
価法を用いて下表に示す。
価法を用いて下表に示す。
活性(μモル/フルクト
1、PEニーGA−PHI 4.42、
PHI−GA−Betz 4.3S、 U
etz−GA−FBI 4.54、 B
etz−GA−Petz 4.5すべての
ル:4製物の粘性は実力iit Is!l ■liでb
L]定化したGIよりも活性があった。この16]定仕
法は、実施例■で用いたpB工誘導体化炭素に対する同
定化酵素の2.2単位/ meと比較して、炭素粒子へ
の酵素負荷量を増加させうるお 実施例 XUI の製造技術 e床固定化に関するすべての上述の実施f7!lはパッ
チ式で行なったものであっブζ。本実施例はカラム法を
用いるAGの担体300mpへのL61定化に関する結
果を示す。
PHI−GA−Betz 4.3S、 U
etz−GA−FBI 4.54、 B
etz−GA−Petz 4.5すべての
ル:4製物の粘性は実力iit Is!l ■liでb
L]定化したGIよりも活性があった。この16]定仕
法は、実施例■で用いたpB工誘導体化炭素に対する同
定化酵素の2.2単位/ meと比較して、炭素粒子へ
の酵素負荷量を増加させうるお 実施例 XUI の製造技術 e床固定化に関するすべての上述の実施f7!lはパッ
チ式で行なったものであっブζ。本実施例はカラム法を
用いるAGの担体300mpへのL61定化に関する結
果を示す。
方法(すべての工程は室fiり
1、 Darco の20/40メツシュ粒状活性炭
300ばを娘)101に数時間性した。
300ばを娘)101に数時間性した。
2、過剰のHO1′f:1LJi料し1活性炭を多ト1
;、のDI水で洗1stL 7’Cn & 活性炭を2.6X70t1nのガラス製カラムに移
し、流出物のpHが69に姪するまでノ]、を床に通じ
ることにより洗浄しh+(’、け7゛こ。
;、のDI水で洗1stL 7’Cn & 活性炭を2.6X70t1nのガラス製カラムに移
し、流出物のpHが69に姪するまでノ]、を床に通じ
ることにより洗浄しh+(’、け7゛こ。
4、 次いでポリアミンの溶液2t(Bθtzit6゜
の402をDI水で希釈)を床に通じた。すべての溶液
を床へ通しだ後)浴液を4時間に亘り上方rzicとし
て床へイI、q J、l;iした。
の402をDI水で希釈)を床に通じた。すべての溶液
を床へ通しだ後)浴液を4時間に亘り上方rzicとし
て床へイI、q J、l;iした。
5、 次いで水41(上方流)でff’c浄することに
より過剰のポリアミンを活性炭がら洗沖し7ヒ。
より過剰のポリアミンを活性炭がら洗沖し7ヒ。
6、0.02Mホウ酸塩緩衝液(1) Hq’、 o
)中1%グルタルアルデヒド1.5tを床へ通じ1次い
で約16時間上方流で循環した。
)中1%グルタルアルデヒド1.5tを床へ通じ1次い
で約16時間上方流で循環した。
1 次いで過帽jのグルタルアルデヒドを工程5と同様
の方法によシ活性炭から水で洗浄した。
の方法によシ活性炭から水で洗浄した。
8.102M燐酸塩緩衝液(p H7,0)中酵素溶%
y (Diazyme b Ome ) 1.51.
を床へ通じ1次いで約5時間に貝って上刃υ:tでqf
4H環させた、9 次いで過]・1]の川床を工程5に
記述したように洗浄した。
y (Diazyme b Ome ) 1.51.
を床へ通じ1次いで約5時間に貝って上刃υ:tでqf
4H環させた、9 次いで過]・1]の川床を工程5に
記述したように洗浄した。
1α 002Mクエン酸塩緩’+1irJilt (p
H4,2) 約7tを約18時間に亘って床へ通じた。
H4,2) 約7tを約18時間に亘って床へ通じた。
この時流出物のpHは4.2であった、
11、 固疋化酵素の調製物をカラムから取り出し、
0、02 Mクエン酸塩緩衝液中にp H4,2で貯蔵
した。
0、02 Mクエン酸塩緩衝液中にp H4,2で貯蔵
した。
実施例1)て記述したように微分型反応器で評価した固
定化AG調製物の活性は、固定化#素1ゴ当り236単
位であったつこの実ノッミで示されるように1多量への
スケ−ルアツブは固定化に対し何ら固有の問題を呈さな
かつだ。
定化AG調製物の活性は、固定化#素1ゴ当り236単
位であったつこの実ノッミで示されるように1多量への
スケ−ルアツブは固定化に対し何ら固有の問題を呈さな
かつだ。
実施例 XIV
この比較例では1アルミナとイ古性炭をi″?素の同定
化に対する担体として比較する史なる実j?ξを記述す
る61ノ」体の物理性を下表11を約する。いくつかの
異なる因子を比較しグこ。
化に対する担体として比較する史なる実j?ξを記述す
る61ノ」体の物理性を下表11を約する。いくつかの
異なる因子を比較しグこ。
1つの実五陰において、同一の条1°1下し仁PKI/
グルタルアルデヒドを用いることにより1アミログルコ
シダーゼ(AG)を2つの担体物質(アルミナ及び活性
炭)へ固定した。)渭性仄のB【要な性質の1つは塩メ
ζ−酸洗浄で7与生できるということであるから、両担
体を、rコf累の固定化に先立って穏やかなル−塩基処
理に供した、これらの実j、!7Qに対し〜担体物質を
約2時間に亘シ振とう揚でhり又は塩基と混合し、次い
で夜通し放置し7′c、次いで試剤を傾斜し1担体を固
定化工程で処理する前に1aに、要約する。
グルタルアルデヒドを用いることにより1アミログルコ
シダーゼ(AG)を2つの担体物質(アルミナ及び活性
炭)へ固定した。)渭性仄のB【要な性質の1つは塩メ
ζ−酸洗浄で7与生できるということであるから、両担
体を、rコf累の固定化に先立って穏やかなル−塩基処
理に供した、これらの実j、!7Qに対し〜担体物質を
約2時間に亘シ振とう揚でhり又は塩基と混合し、次い
で夜通し放置し7′c、次いで試剤を傾斜し1担体を固
定化工程で処理する前に1aに、要約する。
第1表: アルミナ及び粒状炭の性責
粒径(メツシュ) 24/48 30/40細
孔容Ml (me / y ) 住50
o、 95平均細孔直径■ 45 200
表面M(nz/y) 210 bo。
孔容Ml (me / y ) 住50
o、 95平均細孔直径■ 45 200
表面M(nz/y) 210 bo。
t Alcoa社、Plttsburgh、 FA
、からの活性アルミナA1級 2、 Darco社、V/l1m1ngton、、
DE、からの粒状活性炭 a、20mMクエン1:ばてp H4,2に紋1!II
Jさせた10%Maltrin−15をノdi乃として
用いることにより5DCに6D分間保υ11することに
よって評価された活性、活性の単位はクルコース1μモ
ル/分を生成するNy 素ノ夙を表わす。
、からの活性アルミナA1級 2、 Darco社、V/l1m1ngton、、
DE、からの粒状活性炭 a、20mMクエン1:ばてp H4,2に紋1!II
Jさせた10%Maltrin−15をノdi乃として
用いることにより5DCに6D分間保υ11することに
よって評価された活性、活性の単位はクルコース1μモ
ル/分を生成するNy 素ノ夙を表わす。
b、固定化酵素の活性は、r+―素を]穢とう機水浴中
へ111いたフラスコ内で培狐することにより上述と同
イg!の条件で謡l抽し/C0活性の単位tよ(a)と
同一の定壱で4〉る。
へ111いたフラスコ内で培狐することにより上述と同
イg!の条件で謡l抽し/C0活性の単位tよ(a)と
同一の定壱で4〉る。
第1a表に要約した結果は、4(1体の予備処理で1活
性炭がすべての酵素を結合するのにより効果的であるこ
とを示す、アルミナは酵素の約50%を結合していない
で残こすという結合に13リシ、見かけ上より特異的で
ある。アルミナのm゛処理、この担体の結合能力が結合
しない寸\残る多量の活性により且つ低い固定化活性C
単位/ me )により示されるように減少するという
具合にアルミナの楢造を見かけ上変えてしまう、しかし
ながらアルミナの塩基での処理は殆んど影響を示さない
。活性炭の醒又は塩基の処理は、活性炭の結合特性に本
質的に全熱影響しないように見ることができるうこれら
の結果i穏やかな酸又は塩基処理に対する相対結合性及
び担体の不活性に関し、基本的な差異を示している。
性炭がすべての酵素を結合するのにより効果的であるこ
とを示す、アルミナは酵素の約50%を結合していない
で残こすという結合に13リシ、見かけ上より特異的で
ある。アルミナのm゛処理、この担体の結合能力が結合
しない寸\残る多量の活性により且つ低い固定化活性C
単位/ me )により示されるように減少するという
具合にアルミナの楢造を見かけ上変えてしまう、しかし
ながらアルミナの塩基での処理は殆んど影響を示さない
。活性炭の醒又は塩基の処理は、活性炭の結合特性に本
質的に全熱影響しないように見ることができるうこれら
の結果i穏やかな酸又は塩基処理に対する相対結合性及
び担体の不活性に関し、基本的な差異を示している。
固定化AG作用特性及びその両組体上での安定性を液化
したトウモロコシ殿粉の消化について評価するために、
他の一連の実5〜を行なった。AGは畝又は塩基の予備
処理を行なわずに両組体上へ固定化した。
したトウモロコシ殿粉の消化について評価するために、
他の一連の実5〜を行なった。AGは畝又は塩基の予備
処理を行なわずに両組体上へ固定化した。
第2表は固定化工程におけるf’l?素の分布を友釣す
る。カラム反応器(100X1.5mのガラス製のソヤ
ケットつきカラム)を用いて、各固定化酵素を同量でa
イJするカラムを準備し/ζ−0この実験に対して、カ
ラムは活性炭に結合したAG床1〇−及びアルミナに結
合したAG床50m1からなった0両カラムに・23%
DBにS’4 卸され且つ5mMクエン酸塩でp H4
,2に調盲jされた25DECデキストロ一ス同等〕の
未1#製のα−アミラーゼで液化したトウモロコシ粉を
供給した。、基f1を約10me/時の一定流速で床に
通じ/こうカラムのノヤケットに50℃の水を循];E
J してカラムを一定温度に維持した。消化の程度を決
定するために・カラム流出物をHPLO分離へ周期的に
供して炭水化物特性を決定した。アルミナ及び活性炭に
結合するAGによる消化物の戻水化りl特性をそれぞれ
第3及び4表に要約する。またこれらの表には、公称の
反応時間及びDFi値も示す、この公称の反応時間はそ
の大きい比容量が故にアルミナに結合しプこAGに対し
て長かった。屍化水紫%性は例え両醇累が同一の活性単
位(初井J1占住に基づいて)を有したとしても著しく
異なった。
る。カラム反応器(100X1.5mのガラス製のソヤ
ケットつきカラム)を用いて、各固定化酵素を同量でa
イJするカラムを準備し/ζ−0この実験に対して、カ
ラムは活性炭に結合したAG床1〇−及びアルミナに結
合したAG床50m1からなった0両カラムに・23%
DBにS’4 卸され且つ5mMクエン酸塩でp H4
,2に調盲jされた25DECデキストロ一ス同等〕の
未1#製のα−アミラーゼで液化したトウモロコシ粉を
供給した。、基f1を約10me/時の一定流速で床に
通じ/こうカラムのノヤケットに50℃の水を循];E
J してカラムを一定温度に維持した。消化の程度を決
定するために・カラム流出物をHPLO分離へ周期的に
供して炭水化物特性を決定した。アルミナ及び活性炭に
結合するAGによる消化物の戻水化りl特性をそれぞれ
第3及び4表に要約する。またこれらの表には、公称の
反応時間及びDFi値も示す、この公称の反応時間はそ
の大きい比容量が故にアルミナに結合しプこAGに対し
て長かった。屍化水紫%性は例え両醇累が同一の活性単
位(初井J1占住に基づいて)を有したとしても著しく
異なった。
/″
7/
/
/
公を11の
1 .81
17.75 90.ノド2
・9う 41,75
つ0.8′2)1.00 65
.5 9]、1句 −9
8,89,590,65,46,115,25つ0.1 6 .97 137゜25 9
0.37 ] 、05
162.25 つ0.88
]。、o7 186.0 ’)
1.691・07 209.75 88.
010 .96 233.75
85.311 ・96255−75 ’
Blh、212 .93 2
88.25 85.113 1.02
うo6.o 85.314
.88 329..5 83.O15]、
02 335.25 83.816
.89 356.25 82.01
71、lO678,5B7.4 18 .97 402.0 8
6゜4基質 2
5.1a、第3表に示した条件の11−’OLから得た
話り、7%3表に示した方法で計算したDFi87.2
2A1.1 (J OO9,387゜
9 2.0 1.0 0 0
0 9.188.5 1,5 1.Go
OOO9,087,7:1..9 .9
0 0 0 9.58G、9
2.2 1.0 0 0 0
10,087.2 、’、1 .9
0 0 0 9.788.1
1.6 1.0 0 0 0
9.389、’3 1−.1 .9
0 0 0 8,7an、2.
2.7 、.8 0 0 0
12.580.6 3.7 .8
0 0 0 14.979、う 3.
7 .8 Q O○ 16
.580.6 3.1 .7 0
0015゜680.9 )7.1 .8
0 0 0 15,277.4
4゜6 .9
0 0 0 1
7.178、ノI ノ1.6
.7 0 0
0 16,476.3 11.、lh
、8. 0 0 0
18゜581−.2 1.6
.7 0 0
0 13.683.2 1.1
.7 0 0 (’l
14.93.7 9.3 15.8
5.4 24.1 14.λ 27.61水化
物特(eE 。
17.75 90.ノド2
・9う 41,75
つ0.8′2)1.00 65
.5 9]、1句 −9
8,89,590,65,46,115,25つ0.1 6 .97 137゜25 9
0.37 ] 、05
162.25 つ0.88
]。、o7 186.0 ’)
1.691・07 209.75 88.
010 .96 233.75
85.311 ・96255−75 ’
Blh、212 .93 2
88.25 85.113 1.02
うo6.o 85.314
.88 329..5 83.O15]、
02 335.25 83.816
.89 356.25 82.01
71、lO678,5B7.4 18 .97 402.0 8
6゜4基質 2
5.1a、第3表に示した条件の11−’OLから得た
話り、7%3表に示した方法で計算したDFi87.2
2A1.1 (J OO9,387゜
9 2.0 1.0 0 0
0 9.188.5 1,5 1.Go
OOO9,087,7:1..9 .9
0 0 0 9.58G、9
2.2 1.0 0 0 0
10,087.2 、’、1 .9
0 0 0 9.788.1
1.6 1.0 0 0 0
9.389、’3 1−.1 .9
0 0 0 8,7an、2.
2.7 、.8 0 0 0
12.580.6 3.7 .8
0 0 0 14.979、う 3.
7 .8 Q O○ 16
.580.6 3.1 .7 0
0015゜680.9 )7.1 .8
0 0 0 15,277.4
4゜6 .9
0 0 0 1
7.178、ノI ノ1.6
.7 0 0
0 16,476.3 11.、lh
、8. 0 0 0
18゜581−.2 1.6
.7 0 0
0 13.683.2 1.1
.7 0 0 (’l
14.93.7 9.3 15.8
5.4 24.1 14.λ 27.61水化
物特(eE 。
第3及び4表からは1活性炭に固定化したAGがDPい
低DP、及びDPsオリゴサツカライドの高割合及びD
P、、DP、及びDP、オリゴサツカライドの完全な消
化によって示されるように液化殿粉をより完全に消化し
たことが決定できるーまた〉DP6画分はアルミナに固
定化したAGに比べて活性炭に同定化したAGに対して
笑質的に低かった。3AG−アルミナカラムからの流出
lレフ中の、ソザツカライド(DP、)及び中間オリゴ
ザツカライド(DP、〜DP6)の高量及びグルコース
の低量はt活性の見かけの損失或いは酵素活性の見かけ
の損失を引き起こすある種の物質移動す♂、数の存在を
示す。
低DP、及びDPsオリゴサツカライドの高割合及びD
P、、DP、及びDP、オリゴサツカライドの完全な消
化によって示されるように液化殿粉をより完全に消化し
たことが決定できるーまた〉DP6画分はアルミナに固
定化したAGに比べて活性炭に同定化したAGに対して
笑質的に低かった。3AG−アルミナカラムからの流出
lレフ中の、ソザツカライド(DP、)及び中間オリゴ
ザツカライド(DP、〜DP6)の高量及びグルコース
の低量はt活性の見かけの損失或いは酵素活性の見かけ
の損失を引き起こすある種の物質移動す♂、数の存在を
示す。
アルミナに結合したAGの1活性の見かけの伯失或いは
活性炭に結合したAGと同程度に効果的に紋粉を消化し
えないことを定量化するために、活性は第3及び4表に
示す結果から計算した1生成グルコースのμモル/分/
m素mlとして表わすことができる。この時、カラム消
化物から観察される活性を、Maltrin 15を
基質として用いる珈とう浴中で固定化cA¥累をtl’
1曲することによって得られる初期速度活性で割るこ
とにより、活性の結果を無名数に規格化もし7iγ占性
炭に結合したAGの無名数での活性は〜アルミナ結合し
たAGの無名数での活性の殆んど2倍である。
活性炭に結合したAGと同程度に効果的に紋粉を消化し
えないことを定量化するために、活性は第3及び4表に
示す結果から計算した1生成グルコースのμモル/分/
m素mlとして表わすことができる。この時、カラム消
化物から観察される活性を、Maltrin 15を
基質として用いる珈とう浴中で固定化cA¥累をtl’
1曲することによって得られる初期速度活性で割るこ
とにより、活性の結果を無名数に規格化もし7iγ占性
炭に結合したAGの無名数での活性は〜アルミナ結合し
たAGの無名数での活性の殆んど2倍である。
/′
両方のAGの固定化形の結果から1縁られる無名数での
活性の比較は1両カラムの転化率が同様でないから、比
較耐荒い1′価となる。しかしながら、91.11名1
jJ1.−C(’) ?’i’i性の広イyz化は1五
4 a ’L t r l n 15(15DE)を?
[1化する原の及び液化トウモロコシ殿粉(25,DI
Jを転化する時のAGの固定化1しの基本的な差異を示
している。これらの結果から引き出すことのできる結6
而は〜活性炭に結合したAGがアルミナに結合したAG
よりも短釦のオリゴザツカライドをグルコースへ迅速に
消化することができるということである。これは炭んに
結合したAGがアルミナに結合したAGよりも比較的拘
束されていないことを示す。
活性の比較は1両カラムの転化率が同様でないから、比
較耐荒い1′価となる。しかしながら、91.11名1
jJ1.−C(’) ?’i’i性の広イyz化は1五
4 a ’L t r l n 15(15DE)を?
[1化する原の及び液化トウモロコシ殿粉(25,DI
Jを転化する時のAGの固定化1しの基本的な差異を示
している。これらの結果から引き出すことのできる結6
而は〜活性炭に結合したAGがアルミナに結合したAG
よりも短釦のオリゴザツカライドをグルコースへ迅速に
消化することができるということである。これは炭んに
結合したAGがアルミナに結合したAGよりも比較的拘
束されていないことを示す。
固定化AGの画形は第1表に示すように全く安定である
かに見える。最初、炭素に結合したAGは運転の約50
時間まていくらか見かりの活性を失い、次いで運転40
0時間を経て定常状態に達するということは興味深;記
述できる。アルミナに結合したAGは運転の初期の50
時間に亘って見かけの活性の増大をもたらう物へある神
の物y(移jJの抵抗を示1度している6 t1’r
17’、のデータは1見かけの定常状態後に、アルミナ
ti−結自したAGtユ炭素に結合しだAGでνく現し
たものの約20%でちることを示す。
かに見える。最初、炭素に結合したAGは運転の約50
時間まていくらか見かりの活性を失い、次いで運転40
0時間を経て定常状態に達するということは興味深;記
述できる。アルミナに結合したAGは運転の初期の50
時間に亘って見かけの活性の増大をもたらう物へある神
の物y(移jJの抵抗を示1度している6 t1’r
17’、のデータは1見かけの定常状態後に、アルミナ
ti−結自したAGtユ炭素に結合しだAGでνく現し
たものの約20%でちることを示す。
これらの実験から、同一の糸外において活性炭はアルミ
ナ(25,7単位/ me )よりもAGを結合する(
713単位/ me )ことが示される。活性炭に結合
したAGは、アルミナに結合したAGよりも1夜化トウ
モロコシ殿粉を完全に消化するから、アルミナに結合し
たAGよりも物質移動抵抗の影響を受けにくいようであ
る。活性炭が酸及び塩基の処理に対して安定でおり、一
方アルミナは塩基の処理に安定であるが、酸の処理に不
安定であるということも示される。担体の酸及び塩基の
双方に対する安定性は、tη、素固定化にN使用するた
めに担体をrJ生する際に必要である。総合してこれら
の結果は、PE工・−グルタルアルデヒド法による酵素
の固定化における担体として用いたとき1活性炭及びア
ルミナが全く異なることを明白に示している。
ナ(25,7単位/ me )よりもAGを結合する(
713単位/ me )ことが示される。活性炭に結合
したAGは、アルミナに結合したAGよりも1夜化トウ
モロコシ殿粉を完全に消化するから、アルミナに結合し
たAGよりも物質移動抵抗の影響を受けにくいようであ
る。活性炭が酸及び塩基の処理に対して安定でおり、一
方アルミナは塩基の処理に安定であるが、酸の処理に不
安定であるということも示される。担体の酸及び塩基の
双方に対する安定性は、tη、素固定化にN使用するた
めに担体をrJ生する際に必要である。総合してこれら
の結果は、PE工・−グルタルアルデヒド法による酵素
の固定化における担体として用いたとき1活性炭及びア
ルミナが全く異なることを明白に示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、a)有孔性の粒状活性炭を〜ペンダントのアミン基
を有するポリアミン化合物の溶液と接触させて、ポリア
ミンを表面への吸看及びH1+札内への捕捉の双方によ
り活性炭にイマ4ノ凸さゼ;b)活性炭との接触による
水及びそれに分Bした付Nしてないポリアミンを除去し
翫及びこれを多官能性有機ハライド、多官能性無水物、
多官能性アゾ化合物、多官能11イソチオシアネート又
は多官能性インシアネートであるアミンと専反応する物
質の水性分1f’1. VW−と接触させてこの反応性
基の1つをペンダントのアミン基と反応させ且つ更なる
反応のだめに存在するアミンと反応する残基を残し;及
びC)活性炭との接触による水及びそれに分散した未反
応のアミンと反応する物質を除去し1そしてこの活性炭
を固定化すべき酵素の水溶液と接触させて〜1“1.累
のアミン基を共有結合の形成によって未反応のアミンと
反応する残基と反応させ、これによって111゛水をl
う1定化する〜 工程を含んでなる同定化酵素配合体の製造法う2、活1
41: Wが米国ふるい系で12〜40メツシユの粒径
、直径で65〜100OXの細孔寸法及び200〜bo
ai/yの表面積を有する特許請求の範囲第1項記載の
方法。 五 ポリアミンがポリエチレンジアミン、ポリエチレン
イミン、ポリへキザメチレンージアミン・ポリメチレン
ジシクロヘキシルアミン、ポリメチレンツアニリン、ポ
リテトラエチレンペンタミン1及びポリエチレンイミン
の徂:から選択される特許請求のjjiα囲第1項第1
項記載4. ポリエチレンイミンがボリソエチレントリ
アミン、ボリトリエチレンテト2ミン、ポリペンタエチ
レ/へキサミ/又はポリへキサメチレンツアミンである
特許請求の範囲第3項記載の方法う5、 ポリアミンが
エビハロヒドリン及びアルキレンポリアミンの共重合体
である’%ii’f請求の範囲第1項記載の方法。 6、 ポリアミンが500〜100. OOOの分子量
馳囲を有する特許請求の範囲第1坦記載の方法。 Z アミン反応性物質がビスーソアゾベンヅノン−2,
21−ジスルホンhセi 4 、4’−ジフルオル−=
−3,3’−ジニトロジフェニルスルホン;ジフ
ェニル−4,4′−ソチオシアネートー2.2′−ソス
ルホン師;6−メドキシソフエニルメタンー4,4′−
ジイソシアネート;トルエン−2−インシアネート−4
−インチオシアネート;トルエン−2,4−ジイソチオ
シアネート;ソアゾペンソジン;ソアゾペンジノン−3
,31−ソアニシシン;N、N/−へキサメチレンビス
ヨードアセトアミド;ヘキザメチレンジイソシアネート
;シアヌル自グクロライド又は1.5−ノフルオルー2
.4−ジニトロベンゼンである特許請求の範囲第181
記載の方法。 8 アミン反応性物質がグルクルアルデbドである特許
請求の範囲第1又は3項記載の方法〜9、 酵素がグル
コアミラーゼである特許請求の範囲第1項記載の方法。 10、 有孔性の粒状活性炭を4I体として有し、こ
れにペンダントのアミンbli ’k ’1j’するポ
リアミン化合物の、多官能性アルデヒド、多′自能性有
槻ハライド、多官能性アゾ化合物、多官能・詑イソチオ
シアネート又は多官能性・インシアネートとの反応生成
物を付着して有し、この反応性生成物の未反応のアミン
反応性基がそれに結合させるべき酵素の遊離のアミン基
と反応している固定化酵素配合体。 11、 活性炭が米国ふるい系で12〜4oメツシユ
の粒径、直径で35〜1oooXの細孔寸法及び200
〜600m’/fの表面積を有する特許請求の範囲第1
0JAHt載の配合体、12、 ポリアミンがポリエ
チレンイミン、ポリエチレンイミン、ポリへキサメチレ
ン−ジアミン、ポリメチレンジクロヘキシルアミン、ポ
リメチレンツ゛アニリン、ポリテトラエチレンペンタミ
ン箋及びポリエチレンイミンの群から選択される特r目
iN求の範囲第10項記載の配合体つ13、 ポリエ
チレンイミンがボリソエチレントリブミン1ポリトリエ
チレンテトラミンへポリペンタエチレンへキサミン又は
ポリへキサメチレンジアミンである特許請求の範囲第1
2項記載の配合体。 14、 ポリアミンがエビハロヒドリン及びアルキレ
ンポリアミンの共重合体である%Ff請求の範囲第10
項Gじ載の配合体、 15、 ポリアミンが500〜100.0000分・
子對範囲を有する特許請求の範囲第10項記載の配合体
、 16、 アミン反応性物l!Jがビスーソアゾペンジ
ノン−2,2′−ノスルホン酪; 4 、4/−ノフル
オルー6.6′−ジニトロソフェニルスルポン;ジフェ
ニル−4,4I−フチオシアネート−2,2′−ソスル
yJz 7 N i 6−メドキシジフエニルメタンー
4.4′−ジイソシアネート;トルエン−2−インシア
ネート−4−インチオシアネ−1・;トルエン−2,4
−ヅインチオシアネート;ヅアゾペンソジン;ソアゾペ
ンソジンー6,3′−ジアニシソン;N 、 NZ−へ
キサメチレンビスヨードアセlアミド;ヘキサメチレン
ツイソシアネート;シアヌル戯クロライド又は1.5−
ノフルオルー2.4−ソ二トロベンゼンである特許請求
の範囲泥10項記載の配合体つ 1Z アミン反応性物質がグルタルアルデヒドである特
許請求の範囲第10又は12項記載の配合体。 1a 酵素がグルコアミラーゼである特許Ml(求の範
囲第10項記載の配合体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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US425942 | 1982-09-28 | ||
US06/425,942 US4438196A (en) | 1982-09-28 | 1982-09-28 | Immobilization of biocatalysts on granular carbon |
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---|---|
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---|---|---|---|
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EP (1) | EP0104571B1 (ja) |
JP (1) | JPS5978687A (ja) |
AT (1) | ATE41676T1 (ja) |
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-
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-
1983
- 1983-09-19 AT AT83109247T patent/ATE41676T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-09-19 EP EP83109247A patent/EP0104571B1/en not_active Expired
- 1983-09-19 DE DE8383109247T patent/DE3379468D1/de not_active Expired
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- 1983-09-27 DK DK441983A patent/DK164819C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-09-28 MX MX27049A patent/MX163390B/es unknown
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