JPH0566105B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

(イ) 産業上の利用分野 この発明は固定化酵素の製造方法に関する。さ
らに詳しくは、化学結合ことに酵素間の架橋結合
により酵素を担体に固定化する固定化酵素の製造
方法に関する。 (ロ) 従来技術 最近、診断用や合成用のバイオリアクターとし
て酵素を担体に固定化してなる固定化酵素が用い
られるようになつてきた。このような固定化酵素
を製造する代表的な方法として、担体ことに多孔
性物質（例えば、多孔性シリカ）に所望の酵素水
溶液を接触させることにより酵素を担体に物理的
に吸着させる方法が知られている。 しかしながら、かような物理的な吸着のみを利
用した固定化方法では、バイオリアクターとして
使用時に酵素が試料中に溶解して短期間で酵素活
性が低下してしまうという欠点がある。 この点に関し、上記のごとく酵素を予め担体に
物理吸着させた後、適当な架橋剤を用いて吸着さ
れた酵素間に架橋させることにより、酵素を不溶
化させる方法も知られている。（「固定化酵素」、
千畑一郎著（講談社）、第37頁下から第２〜１行
及び第45頁2.1.2架橋法参照）。 しかしながら、かような従来の酵素−酵素間の
架橋法による酵素の固定化においても固定化され
た酵素の不溶化効果は充分なものとはいえず、酵
素の脱離により活性が劣化し易いという問題点が
あつた。 (ハ) 発明の目的 この発明は、上記のごとき従来の問題点を解消
すべくなされたものであり、活性の劣化が少なく
かつ高活性の架橋法による固定化酵素を提供しよ
うとするものである。 本発明者らは、架橋法による固定化について鋭
意研究を行なつた結果、従来の担体への酵素の物
理吸着処理と架橋剤の接触処理との手順を組み変
えることにより、意外にも酵素の架橋性が高く活
性の劣化が抑制され、かつ活性自体も向上された
固定化酵素が得られる事実を見出した。 (ニ) 発明の構成 かくしてこの発明によれば二又はそれ以上の官
能基を有する架橋剤を用いて酵素と酵素とを架橋
することにより酵素を担体に固定化する方法にお
いて、架橋剤を予め担体に吸着又は付着させた後
に該担体を酵素水溶液に接触保持させて酵素の架
橋させることを特徴とする固定化酵素の製造方法
が提供される。 この発明は、従来の架橋法における手順、すな
わち固定化を意図する酵素の水溶液中に担体を
入れる等の手法により先に担体に酵素を物理吸着
させ、その後に架橋剤を接触させて吸着酵素を
架橋させる手順、を逆転させ、先に架橋剤を溶
液接触等により担体に吸着や付着させた後、酵
素水溶液に接触させて酵素をその場で架橋及び固
定させる点を特徴とするものである。そしてそれ
により高活性でかつ耐久性の優れた固定化酵素を
提供するものである。 この発明に用いる担体としては、極性基の有無
にかかわらず種々の固体状物質が使用でき、例え
ば活性炭、ガラス、酸性白土、漂白土、カオリナ
イト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ア
パタイト、セピオライト、不溶性無機塩及び含酸
素有機金属化合物（金属アルコキシドやアセチル
アセトネート金属錯体等）の加水分解ゲルのよう
な天然又は合成の無機固体、無機塩、金属酸化
物、金属水酸化物などが挙げられ、これ以外にも
天然又は合成の高分子も使用可能である。かかる
担体としては実用上の酵素活性を得る点で比表面
積の大きなものが好ましく、通常、多孔性物質を
用いるのが好ましい。この際の多孔性とは少なく
とも固定を意図する酵素が内部に充分に浸透しう
る程度の多孔性を意味する。これらの点で一つの
好ましい担体としてゼピオライトが挙げられる。
これら担体の形状は用途に応じて選択すればよい
が、通常、粒状のものを用いるのが適している。 上記担体に架橋剤を吸着又は付着させる方法と
しては、担体を架橋剤の溶液（例えば、水溶液）
に浸漬して所定時間保持させる方法が好ましい。
この処理時間は、通常、常温下で数分〜数時間で
充分である。なお、多孔性の担体を用いた際には
減圧下で担体内部の気泡を充分に除去した後又は
除去しつつ吸着又は付着処理を行なうのが好まし
い。 架橋剤としては、グルタルアルデヒド、二官能
性以上のイソシアネート誘導体、ビスジアゾベン
ジジン、Ｎ，N′−ポリメチレンビスヨードアセ
トアミド、Ｎ，N′−エチレンビスマレインイミ
ド等が挙げられる。これらは酵素タンパク質中の
α−アミノ基、ε−アミノ基、フエノール基、ス
ルフヒドリル基、イミダゾール基等の官能基と反
応してシツフ塩基結合、ヘプチド結合、ジアゾ結
合等を形成して架橋結合を構成しうるものであ
り、意図する任意の酵素に応じて至適架橋剤を選
択すればよい。通常、グルタルアルデヒドやイソ
シアナート誘導体（例えば、ヘキサメチレンジイ
ソシアナート）を用いるのが適している。なお、
溶液ことに水溶液により担体に接触させる際の架
橋剤の濃度は通常、10ｍmol〜5mol程度が適し
ている。 このようにして得られた架橋剤含有担体は適宜
洗浄処理に付されたのち酵素の水溶液との接触処
理に供される。この際も通常、担体を酵素水溶液
中に所定時間、浸漬保持することにより行なうの
が適している。これにより、担体中への酵素の浸
透及び吸着又は付着している架橋剤と酵素との反
応が進行する。この際の処理条件は常温下、数分
〜数時間が適しており、５分〜１時間程度が好ま
しい。なお、多孔性担体を用いた際には前記と同
様に減圧下で処理するのが好ましい。かような処
理により、酵素は担体内に充分に接触又は浸透す
ると共に架橋剤により酵素間に架橋が行なわれて
酵素が担体に強固に固定化されることとなる。な
お、この際に用いる酵素水溶液の濃度は酵素の種
類にもよるが、意図する酵素活性によつて適宜選
択すればよい。 このようにして得られた固定化酵素は適宜洗浄
処理した後、適当なカラム内に充填することによ
つて種々のバイオリアクターとして利用すること
ができる。 (ホ) 実施例 担体としてセピオライトを用い、架橋剤として
グルタルアルデヒドを用い、酵素としてグルタル
アルデヒドを用い、酵素としてラクターゼを用い
ることによりこの発明の製造方法を実施した。 まず、セピオライト塊を約100℃で120分加熱処
理して充分乾燥させ、これを破砕して平均粒径約
１mmのセピオライト粒状物を得た。このセピオラ
イト粒状物（担体）約100mgを25重量％のグルタ
ルアルデヒド水溶液（100ml）中に浸漬し、減圧
脱気条件下で常温下、30分間保持させた。次いで
メンブランフイルターによりグルタルアルデヒド
水溶液から担体を分離した後、ラクターゼ約１ｇ
を溶解したPH７のリン酸塩緩衝水溶液（10ml）中
に浸漬し、減圧脱気条件下で常温下、30分間保持
させて架橋反応を行なつた。 このようにして得られたこの発明の固定化酵素
を、15.7重量％のラクトース溶液200ml中に加え
て30℃下酵素反応に供し、反応開始後２、５、10
及び30分後にそれぞれ生成グルコース量を測定し
て活性を評価した（第１回測定）。さらに活性の
劣化を評価するために、上記反応後固定化酵素を
蒸留水で洗浄し再び30分間の活性を評価を行ない
（第２回測定）、更にこのサイクルをもう一度繰り
返した（第３回測定）。 なお、比較例として物理吸着のみによる固定化
酵素（比較例）及び従来の架橋法による固定化
酵素（比較例）について同様な評価を行なつ
た。この比較例及びの固定化酵素の製造条件
は以下の通りである。 比較例 ラクターゼ１ｇを溶解したPH７のリン酸塩緩衝
水溶液（10ml）中に架橋剤未処理のセピオライト
粒状物約100mgを浸漬し、減圧脱気下、常温で30
分間保持して吸着させた。 比較例 比較例で得られた酵素を物理吸着した担体
を、25重量％グルタルアルデヒド水溶液（100ml）
中に浸漬し、減圧脱気下、常温で30分間保持して
反応させた。 このようにして得られた結果を第１表に示し
た。

【表】 また、参考のために上記結果のうち、反応開始
30分後のグルコース量をプロツトしたグラフを第
１図に示した。 このようにこの発明の製造方法により得られた
固定化酵素の酵素活性は従来法のものに比して高
くかつ繰り返し使用による失活も低減化されてい
ることが判る。 (ヘ) 発明の効果 以上述べたごとく、この発明によれば、従来の
架橋法に比して高活性でかつ劣化が少ない固定化
酵素を得ることができる。そしてかかるこの発明
は酵素間を架橋することにより酵素を固定化して
いるため、担体の官能基の有無にかかわらず酵素
を強固に固定化することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の製造方法により得られた
固定化酵素の活性を比較例と共に例示するグラフ
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 二又はそれ以上の官能基を有する架橋剤を用
   いて酵素と酵素とを架橋することにより酵素を担
   体に固定化する方法において、 架橋剤を予め担体に吸着又は付着させた後に該
   担体を酵素水溶液に接触保持させて酵素の架橋を
   させることを特徴とする固定化酵素の製造方法。 ２ 担体が、多孔性物質からなる特許請求の範囲
   第１項記載の製造方法。 ３ 架橋剤が、グルタルアルデヒド又はヘキサメ
   チレンジイソシアナートである特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の製造方法。