JPS6029474B2 - 固定された蛋白質及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は概して酵素系に関し、より特定的には、酵素を
不熔性支持体または担体に連結または結合させることに
よる酵素の固定方法及び手段に関する。

酵素は、当該技術で十分に実証されているように、一般
的には高分子量の蛋白質物質であり、広範囲の化学反応
、例えば、フルクトースを作るための酵素グルコースィ
ソメラーゼによるグルコースの反応、を促進することの
できる生物学的触媒として機能する。

不幸にも、ほとんどの酵素は水に可溶であり、そのこと
は酵素を繰返し使用するために溶液から取り出すこと及
び（または）酵素の触媒的有効性を長期間にわたって維
持することを困難にする。加えて、酵素は商業量で得る
かまたは作るのにいまいま相対的に高価である。従って
、典型的には酵素を不溶性支持体または担体に結合また
は連結させることによって酵素を固定して酵素を不溶性
にするために従来多くの技術が提案されている。本明細
書において、用語「不動」または「固定」は酵素につい
て用いる時には、酵素がそれらの活性を保持しており、
反応性溶液から容易に取り出すことができ、且つ繰返し
使用できるような態様で水不溶性担体に結合されるかま
たは水不溶性挺体内にとり込まれることによって本質的
に水不溶性にされている酵素をいう。固定された酵素を
用いて触媒反応を実施する従来の試みは、一部分は酵素
を不溶二性担体に連結または結合させる方法、担体物質
自体の性質または物理的及び化学的特性、及び基質が酵
素盤体と接触させられるその物質移動機構に依存して多
少は満足であった。本明細書において用語「基質」は、
酵素が物質上で触媒的に反応するその物質を意味する。
例えば、酵素は多孔質ガラスビーズの如き珪酸質担体に
吸着させられており（米国特許第３５５６９４５号）、
あるいは中間シランカツプリング剤によってそのような
多孔質ビーズに化学的に連結させられている（米国特許
第３５１９５３８号）。

ガラスの代物こ多孔質セラミックビーズが提案されてお
り、それで酵素が吸着によって連結される（米国特許第
３８５０７５１号）。しかしながら、上記の多孔質ガラ
スまたはセラミックのビーズは大きさが極めて小さいの
で、酵素反応を生じさせるためには、多数のそのような
離散粒子の充填床を通して基質を流す必要がある。充填
床酵素反応器は高価であり、目詰りやチャンネリングを
受けやすく、比較的高い流動抵抗を示し、また孔の大き
さが比較的小さいために基質が孔内に保持される傾向が
あり、それで一連の異なった基質またはサンプルを充填
床を通して供給し且つ酵素反応が比較的急速なものであ
る時には汚染の問題を示す。同様に、その上の文献報告
（米国特許第 ３８２４１５び号）としては、半透膜の如き半透過性担
体内に機械的に取り込むことによって、または炉紙の形
状のセルロース物質を含めて天然または合成の重合物質
に中間剤によって化学的に連結させることによって、酵
素が固定されている。

半透膜または機械的に取り込まれた反応器においては、
酵素反応はその支持体を通る基質溶液の拡散によっての
み起ることができ、更に、そのような支持体の使用はい
まいま酵素に対して何ら余分の安定性を付与しない。酵
素が連結されているかあるいは結合されているセルロー
ス系炉紙及び同様な有機担体の使用は、そのような支持
体物質は通常弱く、化学的及び微生物的攻撃を受け、ま
た損傷なしでは容易には殺菌できないのでそのような支
持体物質に固有の不利益に悩まされる。更にその上に、
ニトリロ、鮫アミド、またはウレィド基を持つ水不濠性
重合体塗料を単一相の巨大孔質重合体支持体に付与し、
次いで酵素をそのような支持体の被覆された表面に吸着
させることによって連結させることが知られている（米
国特許第３７０５０８４号）。

しかしながら、そのような被覆された反応器の製造は時
間を消費し且つ高価であり、また生成反応器の単位容量
に取り付けられる酵素の量は、その支持体物質が巨大孔
質であるという事実によって幾分制限される。上記の背
景にして、本発明の主目的は改善された固定された酵素
系及びその製造法る提供することにある。

本発明の他の目的は、非生分解性で且つ耐化学攻撃性で
あり、大きな表面積、高い透過度、優秀な物理強度の各
特殊を持ち、容易に殺菌でき、且つ製作が比較的安価で
ある孔質部材形態の不溶性で流体透過性の支持体または
担体に連結または結合されている酵素を含む、固定され
た酵素系を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、不溶性で流体透過性の徴孔質
支持部材に酵素を化学的に結合させ、それによって改善
された固定された酵素系を作る方法及び手段を提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、不溶‘性で流体透過性の徴孔
質部材に連結された酵素を用いて基質を酪素的に反応さ
せることによる化学プロセスの実施．方法を提供するこ
とにある。

上記の目的及び利益の達成に対して、本発明は、要する
に、重合体マトリックスまたは結合剤及びそのマトリッ
クス全体中に分散した充填物質粒子を含む不溶性徴孔質
部材の提供を意図する。

マトリックス全体中に分散した充填粒子に酵素を結合ま
たは連結させるような方法で徴孔質部材を処理する。そ
の得られた固定された酵素複合物を次いで基質と接触さ
せて酵素反応を実施することができる。追加の目的及び
利益並びに本発明のより完全な理解は以下の詳細な説明
からより明らかになるであろう。

本発明に従って、結合剤、該結合剤全体中に固定態様ま
たは次元的に安定な態様で分散した微細充填粒子を含み
、且つ該充填粒子を取り囲んで含む実質的に相互に連結
した徴孔の広がった絹状構造を含む安定で、不活性で、
三次元的流体透過性の都村形態である不溶‘性支持体ま
たは担体に酵素を連結または結合させることによって、
改善された固定された酵素系を作り得ることが見出され
た。

本発明に従って不溶性酵素担体または支持体として用い
るのに殊に通しており、それ故に特に好ましい上記タイ
プの徴孔買物質の例は米国特許第３８６２０３ぴ言明細
書に十分に記載されている。

その記載は参照文として本明細書に含まれ、本明細書の
一部となるものである。該米国特許第３８６２０３０号
明細書から明らかなように、そのような徴孔買物質は通
常は疎水性の重合体マトリックス（例えばポリ塩化ビニ
ル）、その樹脂マトリックス全体中に分散した通常は親
水性の微細充填粒子（例えばシリカ）、及びその物質全
体中に形成された相互連結した微孔の絹状構造を含む。
その相互連結した徴孔の網状構造は分散した無機充填剤
の隣接粒子間、分散した充填剤の粒子と樹脂マトリック
スとの間、及び樹脂マトリックス自体中に形成された徴
孔からなり、その微孔の大きさの分布は典型的には約０
．０１〜約１００仏の比較的広い範囲にわたり、または
その徴孔の平均孔直径は、水銀押込法によって多孔測定
的に求めた時に、典型的には約０．１〜約０．２山であ
る。更に、そのような物質の総合多孔度は典型的には約
５０〜約７０％である。そのような徴孔買物費は従来、
例えば、米国特許第３６９６０６１号明細書に発表され
ているように電池隔離板の製作に、あるいはより最近で
は前記の米国特許第３８６２０３び号明細書に発表され
ているように次微フィルター基材として用いられている
。前記米国特許第３８６２０３び号明細書に発表されて
いる以外の徴孔質物質も本発明の実施に用い得ることが
認められる。従って、例えば、該米国特許第３８６２０
３び言明細書に記載の徴孔質物質の熱可塑性結合剤成分
の代り１こ、合成または天然の熱硬化性ゴムポリマ−ま
たはそのコポリマーを用いることもできる。ゴム様ポリ
マーを用いて作る場合には、熱硬化性配合物の配合技術
で普通に用いられている劣化防止剤、架橋剤、不活性充
填剤等の如き添加物を含有するゴム様ポリマーを慣用方
法を用いてシリカヒドロゲルまたは沈降水和シリカ〔即
ち珪酸（ｎＳｊ０２・ｍＨ２０、このｎ及びｍは整数）
〕（これは、例えば、ＰＰＧ１ｎｄ雌ｔｒｉｅｓから商
標「Ｈｊ−Ｓｊｌ」として商業的に入手できる）の如き
通した充填剤と均質に混合する。

その生成配合物を次いで、好ましくは都合のよい大きさ
のりールに巻かれた適当な支持体（即ち、紙または薄い
金属シトまたはスクリーン）上に圧延することによって
、シートに成形し、次いで熱源として加圧水蒸気を用い
て水蒸気オートグレープ中で静水条件下で適当な硬化状
態に加硫する。その加流したシートを次いで温かい乾燥
空気流中で乾燥する。それはまたシリカを脱水するもの
にも役立つ。そのような脱水はシリカの収縮によって引
起される、シート中の徴孔の生成を生じさせ、それによ
って普通には親水性の徴孔質製品が作られる。仕上がり
状態においては、典型的な熱硬化したゴム様重合体系微
孔質シートはシリカ約０．５重量部に対してゴム様ポリ
マー約１部を含有し、また容量基準で約６０％の多孔性
である。

その孔の大きさの分布は典型的にはむしろ広く、水銀押
込データに従ってほとんどの部分について約０．０５〜
１０山であり、孔の平均の大きさは典型的には約１．４
仏である。そのような熱硬化したゴム様重合体シートは
普通には親水性であり、液体水がその物質中に迅速にし
み込み、何ら加圧することなしで通過し、その徴孔が実
質的に相互連結していることを示す。そのようなシート
、及びその製造法は従来技術で公知である。本発明は、
広い態様において、酵素を連結し得るその活性部位とし
て、微孔買物質の結合剤またはマトリックス全体中に分
散した微細充填粒子の利用を意図する。

徴孔質物質の多孔質構造及びマトリックスまたは結合剤
全体中の充填粒子の分散の故に、そのような徴孔質物質
は比較的大きな、典型的には約８０〆／汐程度の表面積
を持ち、また利用できる酵素連結部位の数は比較的大き
く、それで、そのような徴孔質物質の単位容量当りに連
結し得る負荷ファクターまたは酵素の量は対応的に大き
いことが見出されている。加えて、各充填粒子は相互連
結した種々の大きさの徴孔の絹状構造によって有効に取
囲まれているので、例えば酵素が連結されている徴孔質
物質の比較的薄いシートを通して流れる流体またはガス
状流の形態の基質は、直ちに非常に多くの酵素部位に接
触するかまたは接近し、従って極めて迅速な酵素反応を
促進し、生成物転換能率が高くなる。従って、酵素の反
応能率が比較的高い場合には、そのシートを全く薄くす
ることができ、また本質的に完全な反応が基質がそのシ
ートを通過する時にほとんど瞬間的に生じる。なお、あ
まり能率的でない反応性酵素は、本質的に完全な生成物
転換を生じさせるために、わずかにより厚いシート、及
びわずかにより長い反応時間を必要とする。その徴孔質
物質は、その高度の多孔性及びその分散した充填剤成分
の親水性の故に、容易に湿り且つそれを通って流れ流体
に対して全く透過性である。従って、基質をその物質を
通過させるため比較的低い液圧が必要である。例えば、
前記の米国特許第３８６２０３０号明細書で指摘されて
いるように、約０．５肋（０．０２インチ）の厚さを持
ち且つ約１′１〜約２′１の充填剤／結合剤の比を持つ
好ましい徴孔質物質のシートをわずかに０．７ｋｇ／の
ＯＧ（１舷ｓｉｇ）の圧力勾配で用いることによって、
約１．５〜約３４と（約０．４〜約９ガロン）／分／９
２９の（ナｔ２）の流通速度が達成されている。一般的
には、結合剤に対する充填剤の比が増大すると増大した
孔の大きさ及びより大きな総合多孔度となり、それによ
ってその物質の透過度が増大することになる。従って、
本発明の固定された酵素支持体は、いわゆる流通反応器
コア−、即ち反応器コアーにおいて基質溶液が酵素を担
持した物質の一表面に侵入し、その酵素上で触媒的に反
応し、そして転換された生成物並びに未反応のいかなる
基質もその物質の同じまたは他の表面を通って出るその
反応器コアーの形態で用いるのに特に適している。該徴
孔質部材中におし、、該分散充填材粒子は少くとも約２
５重量％の量で存在する、これは、該徴孔質部村を流体
の流れに対して、該分散粒子の少くとも若干のものに結
合している蛋白質物質がそのような流体と適当に接触で
きるように浸透性とするような適度な多孔度を与えるた
めである。更に、前記したように、徴孔質支持体物質の
孔の大きさの分布は比較的広い範囲（即ち約０．０１〜
約１００〃）にわたって広がっており且つその徴孔は実
質的に相互連結しているので、その物質は多数の十分な
大きさの通路を含有しており、その通路に沿って基質及
び（または）転換生成物が容易に流れ得る。

従ってその物質からの生成物の流出は全く迅速であり、
支持体物質を通る基質の終点流と実質的に同時に終り得
る。言い換れば、本発明によって意図される酵素支持体
によって行なわれる触媒反応は極めて鋭い締切を持ち、
従って、多数の異なった基質サンプルを連続したサンプ
ル間の汚染の危険なしで急ぎの連続で同一の固定された
酵素支持体を通して供給することができ、例えば、医療
用または産業用分析機器におけるように一連の異なった
基質サンプルについて連続した触媒反応を実施するため
に、固定された酵素を用いる時に極めて望ましい利益が
ある。上記のことは本発明の有意の利益を構成する。

なぜなら、例えば多孔質ガラスビーズの充填床または半
透膜反応器の如きその他の公知の固定された酵素の反応
器においては、孔の大きさは全く均一に調節され、また
その反応器を通過する物質移動が拡散によって達成され
るような４・さし、大きさであるためである。そのよう
な拡散制限型酵素反応器においては生成物の全流出時間
は基質サンプルの終点の後に有意に遅れ、従って次の基
質サンプルを反応器中にあまりにも迅速に供給すべき場
合には汚染の問題を示す。本発明の徴孔質の酵素支持体
物質は、前記の利益の外に、典型的には約２８ｋ９／ｃ
確（４００ｐｓｉ）の引張強度及び２０％以下の伸び率
を持つ優秀な強度特性を持っており、従って、後記でよ
り詳しく説明するようにそれに酵素を結合または付着さ
せるのに必要な処理の種々の段階の間全く容易に取扱う
ことができる。

更に、本発明の徴孔質物質は、それの優秀な寸法安定性
及び強度の故に、液圧下での圧縮に耐え、それ故に例え
ば酵素反応を利用する商業産業または化学プロセスにお
ける如く大きな酵素反応領域を伴なし、且つ大きな動的
力が酵素支持部村に及ぶ大基模の大量処理反応器で用い
るのに特に適している。更に好ましい徴孔質物質は、例
えば酸及びアルコールの如き化学薬品による攻撃に耐え
、またその物理特性に影響を及ぼすことなしで高温にさ
らすことができる。その後者に関しては、例えば、その
好ましい徴孔質物質をその寸法安定性または物理特性を
劣化させることなしで１．０５ｋ９／地（１５ｐｓｉ）
、１１６ｑ○（２４びＦ）で３０分間水蒸気中に入れる
ことによって加熱殺菌し得ることが見出されている。前
記の米国特許第３８６２０３０号明細書により十分に発
表されているように、特に好ましい徴孔質物質は適当な
量の微細重合体樹脂、微細無機充填剤、溶剤（例えばシ
クロヘキサノン）及び非溶剤（例えば水）を低い灘断条
件下で混和して安定で、湿った、自由流動性の粉末を生
成させることによって製作し得る。

その粉末混合物を次いで好ましくは押出し、圧延して所
望の寸法の実質的に平らな構造またはシートを形成し、
それを次いで水性格に通して溶媒を浸出させ、次いで加
熱空気炉に通して全ての徴量の水分を除去する。本発明
に従って、その徴孔質で、寸法的に安定で、半硬質で、
不溶性で、流体透過性の部材の形態の生成製品を次いで
、それに酵素を連結または結合させるような方法で処理
する。当該技術で一般に知られているように、酵素を担
体上に直接吸着させることにより、あるいは酵素を中間
カップリング剤によって担体に間接的に吸着または共有
共緒させることによって酵素を不落・性支持体または担
体に結合または付着させることも可能である。

本発明の好ましい徴孔質支持体物質は、主としてその分
散したシリカ充填剤成分の故に、吸着される蛋白質の等
露点未満のｐＨ値で蛋白質がそれに実質的に吸着される
ことによって立証されるように、正味の陰電荷を示すこ
とが見出されている。従って、物質中に分散した充填粒
子に酵素を直接吸着させることも可能ではあるが、その
吸着（直接）の相互作用は使用中の比較的迅速な脱着を
防止するのに不十分な大きさであり、それで酵素活性が
酵素複合体から失なわれることが見出されている。従っ
て、本発明の実施においては、触媒的に活性な酵素と不
溶性の徴孔質支持体物質との間に化学結合を生じさせる
ような方法で徴孔質物質を処理することが好ましい。

微孔質物質は、その未処理状態では、蛋白質物質にその
ような化学結合を生じさせるのに必要な有機官能性を持
たず、それで、その必要な官能性を微孔質物質に付与す
るための公知の任意の技術を用いることができる。なぜ
なら、本発明はその最も広い態様においては、出発徴孔
質物質への酵素の結合で優秀な固定された酵素の複合物
になるという発見に関係するからである。酵素の酵素活
性にとって必須でない酵素分子上の遊離ァミ／基を、脂
肪族第一または第二アミノ基またはヒドロキシル基を含
有する担体の表面に共有結合または架橋させることによ
ってほとんどの酵素は固定し得る。更にその他の酵素は
、カルポキシル、イソニトリル、アルデヒドまたはケト
ン、あるいは陰イオンの如きその他の官能基によって同
様な態様で担体の表面に共有結合または架橋させ得る。
それ故に、本明細書においては用語「化学結合」は棺閑
居的には、触媒的に活性な蛋白質または酵素と出発徴孔
質物質に付与された官能基との間の化学結合を言及する
ものであり、特定の官能基または特定の酵素に限定され
るものではない。本発明の好ましい一実施態様において
は、ｙ−アミノプロピルトリェトキシシランの如きオル
ガノシランの形態の橋かけ剤を、徴孔質物質中の分散し
た充填粒子に直接共有結合させることによって、脂肪族
第一アミン官能基を出発徴孔質物質に付与することがで
き、また本発明の他の好ましい実施態様においては、ポ
リエチレンィミン（ＰＥＩ）の如き高分子電解質の形態
の橋かけ剤を徴孔質物質中の分散した充填粒子に直接に
不可逆的に化学吸着させることによって、脂肪族第一ア
ミン官能基を徴孔質物質に付与することができる。

次いで酵素を化学的に変性された徴孔質物質に、より特
定的には上記の架橋剤によってその物質の表面に付与さ
れた脂肪族第一アミン基に共有結合または架橋させるこ
とができる。ッーアミノプロピルトリエトキシシランの
如き橋かけ剤を用いる場合には、それは微孔質物質の重
合体結合剤成分によって分散された親水性の無機充填粒
子に直接に主として共有結合すると思われる。

一般的に言って、珪酸質物質に酵素を結合または付着さ
せるためにシラン橋かけ剤を用いることは、例えば前記
の米国特許第３５１９５３８号明細書に発表されている
ように当該技術で公知である。その米国特許明細書の記
載は参照文として本明細書に含まれるものとする。ポリ
エチレンィミンの如き橋かけ剤を用いる場合には、それ
は徴孔質物質の分散した親水性無機充填剤成分に強力な
化学吸着力によって付着または結合すると思われる。

一般にシリカのコロイド粒子の表面または繊維セルロー
スに酵素を結合または付着させるために橋かけ剤として
高分子電解質またはポリアミンを用いることは、例えば
米国特許第３７９６６私号及び第３７４１８７１号の各
明細書に典型的に発表されているように当該技術で公知
である。それらの米国特許明細書の記載は参照文として
本明細書に含まれるものとする。その両方の場合に、徴
孔質担体または支持体全体中に分散した親水性充填粒子
の外面に橋かけ剤によって付与されている官能性アミン
基への酵素の所望の共有結合を生じさせるためにグルタ
ールアルデヒドまたはビスィミダーテェステルの如き２
官能求電子試薬によって酵素をその橋かけ剤に好ましく
架橋させる。

例えば前記のポリエチレンィミンの形態の担体表面吸着
性橋かけ剤、または例えば前記のｙ−アミノプロピルト
リェトキシシランの如き、担体表面に共有結合される橋
かけ剤を用いる時には「酵素と恒体との共有結合は一工
程法または二工程法で実施できる。

一工程法においては、化学的に変性された担体物質を２
官能求電子試薬及び酵素で同時に処理して担体表面の反
応性ポリマー及び酵素の同時の分子間架橋を生じさせる
。前記したような代表的な２官能試薬である商用銘柄の
グルタールアルデヒドは単量体ジアルデヒドの分子間ア
ルドール縮合で生成した有意量の可溶性重合体化合物を
含有しており、それで縮合の各部位は極めて反応性のＱ
−８不飽アルデヒド部分になり、その部分は酵素の表面
に見出される脂肪族アミンまたはその他の基の如き求核
基を伴うミカェル型添加反応を迅速に受ける。加えて、
坦体表面の反応性ポリマー中に存在する遊離のアルデヒ
ド基も、担体または酵素の脂肪族アミノ基との組合せに
よって架橋反応に関係してシッフ塩基を生成する。酵素
の所望の共有結合が、単なる蛋白質の変性及び担体の反
応性表面基の架橋を生じさせる望ましくない無効な反応
と競争する程度はｐＨ、蛋白質濃度及び架橋剤濃度の如
き種々の実験条件によって経験的に求め得るが、そのよ
うな望ましくない競争反応を選択的に抑制することは困
難である。なぜなら２官能架橋剤がその反応の間実質的
なモル過剰で常に存在しているからである。それ故に、
ある場合には、一工程法を用いると、酵素の広範囲の化
学変性あるいは必須の活性部位基の化学変性の故に一部
または全部の酵素が不活性となる。化学変性で広範囲の
酵素が不活性になる状態においては、化学的に変性され
た担体物質を最初に２官能試薬で架橋させ、次いで酵素
と共に温暦させる二工程法が推奨される。適当に高い濃
度の架橋剤を用いることによって、２分子反応は架橋の
如き分子内プロセスに関して表面アミノ基に対して競争
するようになり得る。これにより酵素の求電子側鎖基と
反応し得る側鎖基が高い表面密度となる。余分の禾反応
架橋剤の除去の後、酵素を変性された担体と共に塩遣し
て酵素と担体との共有結合を生じさせる。上記の二工程
法では、酸素と担体の反応性表面との間の接触領域付近
にある基のみが引き込まれるので、酵素の変性は最少に
なる。化学的に変性された担体物質に酵素を共有結合さ
せるのに前記した求電子性２官能試薬以外の種々の化学
薬品を用い得ることが認められる。

そのような他の方法としては、例えば、担体の反応性表
面にある脂肪族アミノ基を無水こはく酸でアシル化して
側鎖の脂肪族カルボキシル基を作り、それを次いで水瀞
怪力ルボジィミドの存在下で酵ｔの求核性側鎖基と反応
させる方法：水溶性カルボジィミドの存在下で担体の反
応性表面にあるアミ／基と酵素の側鎖カルボキシル基と
を直接反応させる方法；担体の反応性表面にあるアミノ
基を化ｐ−ニトロベンゾイルでアシル化し、亜二チオン
酸ナトリウムによってそのアリールニトロをアリールア
ミンに還元し、亜硝酸によってそのアリールアミノ基を
アリールジアゾニウム塩に酸化し、次いで蛋白質の芳香
族側鎖基と反応させて安定なアゾ結合を生成させる方法
；担体の反応性表面にあるアミノ基を塩化テレフタロィ
ルでアシル化し、その側鎖のｐ−ペンゾィル酸ハラィド
をヒドラジドと反応させてペンゾィルアジドにし、次い
で酵素の求核性側鎖基と反応させる方法がある。酵素と
化学的に変性された担体とを反応させる時には、酵素を
好ましくは緩衝液中に置き、その反応を、酵素の脱活性
または酵素の配置状態の実質的な変化を避けるために十
分に低い温度で実施する。

一般的には、約５〜約５０ｑｏの温度が許容される。当
該技術で公知のように、酵素反応溶液のｐ則ま、結合さ
せる特定の酵素に依存して、適当な緩衝液を選定するこ
とによって所望の値に調節し得る。同機に、その緩衝さ
れた反応性溶液中の酵素濃度及びそれ故に化学的に変性
された担体が酵素で負荷される程度は、酵素の転換速度
、基質の濃度、及び反応器コアーを通る基質の流速に依
存して選定し得る。本発明を以下の各実施例によって更
に記載する。

各実施例は単に説明のためのものであり、本発明の範囲
を限定するものではない。実施例 １ 禾処理の酵素用支持体部材の製造 まず、約８０メッシュの粒度を持つ「コノコ（Ｃｏ肌ｃ
ｏ）５３８５」ポリ塩化ビニル樹脂９．０７２ｋｇ（２
０．０そｂ）、及び「ＨｉＳｉｌ２３３」沈降水和シリ
カ１８．１４４ｋｇ（４０．０〆ｂ）をパターソン・ケ
リー（ＰａＭｒｓｏｎＫｅｌｌｅｙ）の「低灘断」液体
−固体配合機中で約３分間乾式配合することによって徴
孔質物質のシートを作った。

その後、連続して燈拝している間に、溶剤（シクロヘキ
サノン）２４．７６６ｋ９（５４．６〆ｂ）をポンプに
よって２び分間にわたって添加した。次いで水２６．７
６２ｋ９（５９．０〆ｂ）を蝿拝されている配合機中の
混合物に次の２０分間にわたって添加して湿った、安定
な、自由流動性の粉末を生成させた。その粉末を次いで
、約４９ｑｏ（１２００Ｆ）のバレル温度を持ったスク
リュー押出機中に導入し、その押出物をカレンダーロー
ルの間に通して０．５肋（０．０２インチ）の厚さを持
つ実質的に平らなシートを得た。そのシートを次いで７
７℃（１７００Ｆ）の水の抽出俗に通し、次いで１０７
０（２２５０Ｆ）の熱空気炉中で６分間乾燥した。その
仕上がり徴孔質シートは水銀押込み法によって求めた時
に約０．０１〜約１００仏に広がった比較的広範囲の孔
の大きさの分布、及び約０．１５〜約０．２５ムの範囲
の平均孔直径を持っていた。加えてこの物質の総合多孔
度は約６接容量％であり、また分散した充填剤（例えば
シリカ）の含有率は約５亀重量％を占める。液体水が何
ら加圧することなしでその物質中に迅速に浸入すること
は、その徴孔が表面から表面まで実質的に相互連結され
ていることを示す。その得られた実質的に平らな、半硬
質の徴孔質シートから５×５肌の大きさの多数の未処理
支持部材を切り取り、水蒸気裕中に１時間浸すことによ
って加熱殺菌し、開放空気中で冷却、乾燥させた。実施
例 ２ 共有結合による化学的変性 実施例１に従って作った未処理支持体部材を、濃塩酸を
１容量％含有するｙ−アミノプロピルトリェトキシシラ
ンの１咳容量％水溶液中に２独特間溢遣した。

その処理した支持体部材を水及びＩＭＮａＣＩでフラッ
シュして全ての未反応試薬を除去した。次いでその処理
した都村を２ｒＣで０．１Ｍテトラ棚酸ナトリウム緩衝
液中の０．５％ｗｔ／ｖｏｌのトリニトロベンゼンスル
ホン酸と反応させ、そしてその処理した支持体部材の表
面に強烈なオレンジ色のトリニトロフェニルアミソ誘導
体を観察することによって脂肪族第一アミノ基の存在を
定性的に評価した。実施例１に従って作った他の未処理
支持体部材を同様にした評価したが、この試験では反応
を示さなかった。処理した支持体部材の元素分析では窒
素は乾燥重量で、未処理支持体部村よりも０．５％多く
なっていた。その処理された支持体部材のアミノ官能基
の耐久性は、水中に１２箇月間貯蔵した後の窒素の損失
が無視し得ることによって立証された。その処理された
支持体部材は禾処理支持体部材に関して同一の流れ特性
を示し、また緩衝液またはイオン強度における差に敏感
ではなかった。実施例 ３ 化学吸着による化学的変性 実施例１に従って作った他の未処理支持体部材を、分子
量５００００の枝分れ鎖ポリエチレンィミン（ＰＥＩ）
の５％ｗｔ／ｖｏｌ水溶液中に室温で１時間温直した。

その処理した支持体を水及びＩＭＮａＣＩでフラッシュ
していかなる未吸着のＰＥＩも除去した。実施例２で用
いた試験と同じトリニトロベソゼンスルホン酸試験によ
って評価し、その処理した支持体部材の表面に実質的な
脂肪族ァミノ官能基を示す強烈なオレンジ色のトリニト
ロフェニルアミン誘導体を観察した。その処理した支持
体部村上に担持された窒素を元素分析によって定量し、
乾燥重量で未処理支持体部材が０．０２％の窒素である
のに対し１．２５％の窒素があった。その処理された支
持体部材上のＰＥＩの化学吸着は明らかに実質的に不可
逆であった。なぜならそれは３〜９のｐＨで高いイオン
強度の溶液（例えば、ＩＭＮａＣＩまたはＩＭＫ２ＨＰ
０４／ＫＨ２Ｐ０４）と共に温置することによっても除
去できなかったからである。強い酸性条件（ＩＭＨＣＩ
中に２時間温層）の場合にのみ、元素分析によって示さ
れるように、窒素含有率の５０％の量の部分的脱着があ
った。標準ＢＥＴ法によるその処理された支持体の表面
積は５５．４で／夕であり、これに対して対照品は８１
．１め／夕であった。ＰＥＩで処理した支持体部材は、
用いた緩衝液またはイオン強度にかかわらず、未処理支
持体部材に匹敵する流水特性を示した。実施例 ４酵素
のカップリング反応（グリコースオキシタ−ゼ）実施例
３に従って処理した支持体部材をｐＨ７でグルタールア
ルデヒドの１鉾容量％水溶液中に１時間塩遣した。

その支持体部材を次いで水ですすぎ、そしてアスベルギ
リス・ニゲール（Ａｓｐｅｒｇ！ｌｉｓｎｉｇｅｒ）か
ら等質に精製されているグルコースオキシダーゼの溶液
中に１時間塩暦した。

酵素のカップリング反応の条件は次の通りであった：０
．１Ｍ Ｋ２ＨＳ０４／ＫＨ２Ｐ０４緩衝液ｐＨ６．０
中のグルコースオキシダーゼ濃度２０の９／地、周囲室
温。酵素溶液を正の液圧下で支持体部材中に直接ポンプ
送りすることは、単なる温層によって得られる場合と比
較して酵素の担特を改善しなかった。カップリング反応
の温度は臨界的ではなかったが、グルコースオキシダー
ゼについては５０ｑ○の熱不活性範囲を越えないことだ
けが必要であった。その支持体部材を次いで水及びＩＭ
ＮａＣＩで大規模に洗って禾反応酵素を除去した。固定
された酵素の複合物を、５肌ＭＮａＣＮＢＨ３を含有す
るＰＨ７の０．１Ｍエタノールアミンと共に温暦するこ
とによって支持体部材表面上の求電子性基の消失を達成
した。その固定された酵素はｐＨ６．０の０．１ＭＫ２
ＨＰ０４緩衝液中に４℃で貯蔵する時に、限界のない保
存寿命を持つことは明らかである。実施例 ５ 単一酵素反応器 実施例４に従って作った一対の直径１．５伽の円板を用
い、流通反応器中に積み重ねられた形状で据え付け、そ
の反応器内では基質の流れベクトルが各円板の平面に対
して実質的に直角であるようにして下記の反応を実施し
た。

流体流にさらされる各据え付け円板の横断面積は７９地
であった。グルコースオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．
３．４．）はグルコースの好気酸化を触媒する。３一Ｄ
−グルコース＋０２ →Ｄ−グルコノラクトレ十日２０２ その積み重ねられた円板反応器形状における酵素活性を
、その反応器からの下流の酵素消耗をＹｅｌｌｏｗＳｐ
ｒｉｎｇｓ ＩｎｓｔｍｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙから得
られるバイオロジカル オキシジヤンモニタ、モデル
Ｎｏ．５３（Ｂｊｏｌｏ蟹ｃａｌ０ｘｙ鉾ｎＭｏｎｉｔ
ｏｒＭｏｄｅｌＮｏ．５３）で測定して評価した。

ｐｒｌ５．５の空気で飽和した０．１Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液中のアノマ−性（ａｎｏｍｅｒｉｃ）平衡の０．
１５ｍＭグルコース溶液を２の【／分の流速で反応器に
ポンプ送りした。制限基質Ｂ−Ｄ−グルコースの転換を
、反応器からの下流の酵素消耗によって求めるようにし
て定量した。反応器と接触しているサンプル流の滞留時
間は約１．６秒であった。これらの実験条件下でのグル
コースオキシダーゼについての速度方程式の積算形式は
明白に知られており、固定された酵素濃度についての下
限は１０の９／泌であることが計算できる。積み重ねら
れた円板反応器の異常に高い活性は、内部の物質移動の
影響がないことに帰因する。即ち、反応器について内部
の物質移動の拘束の形跡は観察されなかった。第二セッ
トの積み重ねられた円板を実施例４に従って作り、流通
反応器中に据え付けた。

しかし、その円板は実質的に低い濃度の固定された酵素
として、即ち１０のファクターによって作ったものであ
った。ｐＨ５．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の
ｌｍＭグルコース溶液を次いで、グルコノラクトンへの
グルコースの部分的転換となる運動方式でその反応器が
動作するのに十分に速い流速で第二円板反応器にポンプ
送りした。この条件下でのその反応器による一定状態の
基質転換量は酵素濃度に極めて敏感であることが見出さ
れた。４時間の連続操作下で観察した時に、その一定状
態の転換量における変化観察されず、反応器からの酵素
活性の損失を示さなかった。

実施例 ６ 酵素カップリング反応（アルコーノレデヒドロゲナービ
）実施例３に従って処理した他の支持体部材をｐＨ７の
グルタールュアルデヒドの１批容量％水溶液中に１時間
温遣した。

その支持体部材を次いで水ですすぎ、アルコールデヒド
ロゲナーゼの溶液中に１時間温層した。酵素カップリン
グ反応の条件は次の通りであった：周囲室温で、０．１
ｍＭＥＤＴＡ及び１０仏Ｍ ＮＡＤＨ（還元されたニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド）を含有するｐＨ６
の０．１ＭＫ２ＨＰ０４／ＫＨ２Ｐ０４緩衝液中のアル
コールデヒドロゲナーゼ濃度５の９／私。その支持体部
材を次いで上記の反応緩衝液及びＩＭＮａＣＩで大規模
に洗って禾反応酵素を除去した。その固定された酵素複
合物を５皿ＭＮａＣＮＢＨ３を含有するＰＨ７．０の０
．１Ｍエタノールアミンと共に温暦することによって、
支持体部材上の未反応求電子性基を消失させた。酵素の
担特は、その消失反応の前の支持体部材について窒素の
増加分を測定することによって計算して担体１夕当り１
１雌であった。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣＩ．
１．１．１）は下記の方程式に従う第一アルコールの可
逆酸化を触媒する。アルコール＋ＮＡＤ■こ アルデヒド＋ＮＡＤＨ＋日由 ｌｎｓｔｍｍｅｎｔａｔｉｏｎＳｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ
Ｃｏ．から得られる流通吸収モニターモデルＵＡ−５を
用いてＮＡＤＨの生成を反応器の下流で３４皿ｍで分光
光度計的に測定することによって、積み重ねられた円板
反応器形状における酵素活性を評価した。

固定された酵素の単一の１．５ｃｍ円板を実施例５の方
法で流通反応器中に据え付けた。１０山Ｍ ＥＤＴＡを
含有するＰＨ７．４の０．１Ｍ Ｋ２ＨＰ０４／Ｋ比Ｐ
０４中の５仇ｎＭエタノール及び０．５ｍＭＮＡＤ由の
溶液を１の（／分の流速で反応器にポンプ送りした。

これらの条件下でのその反応について計算した平衡転換
率は出発ＮＡＤ由濃度の１６％である。完全な平衡状態
が競察され、その反応の熱力学限界を達成するのに固定
された酵素反応器との千分の２〜３秒の接触で十分であ
ることを示した。固定された酵素の安定性を示すために
、一組の条件を選び、その条件でその反応器を運動方式
で２岬時間操作した。生成分への基質の転換はこれらの
条件下で触媒の維持に極めて敏感であるので、転換率の
低下は酵素の損失または不活性化を示す。その実験の条
件は１０ＡＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．０の０．１
Ｍ Ｋ２ＨＰ０４／ＫＨ２Ｐ０４緩衝液中の５ｍＭエタ
ノール及び５０仏Ｍ、ＮＡＤ田であった。この熔綾を２
４時間１の【／分の流速で反応器にポンプ送りし、基質
の転換率を連続的に監視し、記録した。この期間の間そ
の転換率は一定のままであることが見出され、固定され
た酵素の完全な維持を示した。実施例 ７ 縦に並んだ酵素反応器 異なった３種の固定された酵素複合物を包含する円板反
応器系を、下記の反応式を触媒するために構成した。

サツカロ−ス十日２０くＥＣ３，２，１，２６）ｏ−Ｄ
−グルコース＋フルクトース０−Ｄ−クルコース くＥ
Ｃ ５，１，３，３）クーＤ−グルコースクーＤ−クル
コース＋○２くＥ，Ｃ，１，１，３，４）ａ−Ｄ−クル
コノラクトン十日２○２グルコースオキシダーゼは均質
であり且つアスベルギリス・ニゲール（船ｐｅｒｇｌｌ
三ｓｎｉｇｅｒ）から作られたものであり、アルドース
−１−ェピメラーゼ酵素（ＥＣ５．１．３．３）は豚の
腎臓から作られたものであり且つ２０重量％の純度であ
り、Ｑ−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１
．２６）はカンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉ
ｌｉｓ）からの高純度製品であった。

上記の各酵素を実施例４の方法に従って２０の９／肘の
酵素濃度で一対の１．５ｃの円板に共有結合的に固定さ
せた。アルデヒド消失反応は用いなかった。３種の円板
２組（各組中の各円板は上記の連結した反応において且
つ上記の順序で３種の酵素の１つに対応している）を次
いで実施例１の流通反応器中に積み重ねた態様で据え付
けた。

２５ｏｏで空気で飽和させた、ｐＨ６．０の０．０８Ｍ
Ｋ２ＨＰ０４中の超純度サッカロースのｌｍＭ溶液を次
いで１．２の‘／分の流速で反応器にポンプ送りした。

その反応器の下流で酵素消耗によって測定した転換率は
、その総合反応の公知の化学量論を基準にした理論値の
１０％であった。しかしながら、達成し得る転換率は２
５％であった。なぜなら溶解した酵素は制限基質にある
からである（２５０山Ｍ）。この実施例について用いた
条件下では、アルドースー１ーェピメラーゼは速度制限
酵素である。より遅い流速、従ってより長い反応器滞留
時間においては、２５％に近ずく測定転換率が得られた
。実施例 ８ 徴孔質担体上へのグルコースィソメラーゼの固定グルコ
ースイソメラーゼ（Ｅ．Ｃ． ）は下記の反応に従
うＱ−Ｄ−グルコースへの８一Ｄーフラクトースの可逆
可能な相互転換を触媒する：夕−Ｄーフラクトース （
Ｅ，Ｃ， ）ｏ一Ｄークルコース徴孔買物質（実施
例１）から直径２６柳の円板を４個切り取り、実施例３
に従って処理し、次いで積み重ねられた態様で、ガスケ
ットシールなしで標準のミリポアー（ＭＩｌｌｉｐｏｒ
ｅ）フィルター保持器中に据え付けて流通反応器を形成
した。

ＰＥＩを担持した支持体円板を、グルタールアルデヒド
（１０％肌／ｖｏｌ、ＰＨを８．０に調節）を１００の
‘の溜めから１時間循還方式で反応器にポンプ送りする
ことによって変性させた。その支持体部材を次いで、脱
イオン水５００肌（約０．５時間）及びへべス（Ｈｅｐ
ｅｓ）緩衝液または等価物（即ち脱イオン水中２夕／そ
のＭｇＳ０４・７日２０及び０．２夕／そのＣＯＳ０４
・７日２０、ｐＨ７．０〜７．５）２００の‘をその反
応器にポンプ送りすることによって現場ですすし、だ。
−７．５のグルコースィソメラーゼの溶液（０．４３単
位／泌を含有するもの３０の‘）をミリポアーの０．６
５山フィルターに通し、上記円板反応器に室温で１時間
循遼遠遇させた。本明細書においてその用語「単位」は
活性の単位をいい、２５ｑＣで毎分１＃Ｍの８一Ｄ−フ
ルクトースをＱ−Ｄーグルコースに転換させるように触
媒する酵素の量として定義される。その反応器を、蛋白
質が流出液中に発見されなくなるまで約５００の‘のへ
べス緩衝液ですすし・だ。この実施例において固定され
たゲルコースィソメラーゼ酵素はＮｏｖｏＥｎｚｙｍｅ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｊｏｎからストレプトマイセス・アル
プス（Ｓびｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｌｂｕｓ）の凍結真空
乾燥された完全細胞同原物として得られ、可溶性蛋白質
の単機及び硫酸アンモニウム（ＡｍＳ０４）による分別
によって精製されたものであった。

その分別は蛋白質単離工程から得られた上燈液の初期蛋
白質濃度に一部分依存するが、大部分のグルコース活性
は典型的には７０〜８５％ＡｍＳ○４べレツト中に見出
される。その大部分の活性を含有する蛋白質べレツトを
約２０〜３０のとのへべス緩衝液中に溶解させ、標準の
酢酸セルロース透析管村を用いて４℃で２硯寺間４その
緩衝液に対して透析させる。この時点で製造されている
酵素は固定に用いるのに適しているが、所望により、上
記の酵素濃厚物を標準のゲル透過技術によって更に精製
することもできる。そのすすぎの豊富な溶液の蛋白質の
検定を下記の反応式を用いて実施した：ＧＩ −−−一ｏ−Ｄ−のレコース ａ・ｉ−Ｄ−フルクト‐ス遠遍鋼暇 アノレドース‐１‐エピメラーゼ ｂ．ｏ‐Ｄ−グルコース 急 速夕−Ｄ
‐グルコースクノレコースオゴミンター−ゼリ ｃ．夕‐Ｄ‐グルコース＋のＱ 急 速Ｄーグル
コノラクトン＋１ノ２８２０２ｄ．２日２０２ カタラ
ーゼ ２日２０十。

２急速 上記したように、グルコースィソメラーゼは８一Ｄ−フ
ルクトースとＱ−Ｄ−グルコースとの可逆転換を触媒す
る。

２５ｏＣにおいてこの反応の平衡定数はほぼ不変性であ
り、８−ＤーフルクトースとＱ−Ｄ−グルコースとのほ
ぼ５０−５の昆合物になる。

中間体Ｑ−Ｄーグルコースの８−Ｄーグルコースへの自
発的なェピ化はその検定条件下ではこの中間体の蓄積を
防止するのに十分には遠くなく、従ってこの中間体反応
を容易にするためにその検定溶液にアルドースー１ーヱ
ピメラーゼを添加する。この分析の報告者の反応はカタ
ラーゼの存在下でのＤーグルコノラクトンへのＢ−○ー
グルコースの好気（グルコースオキシダーゼ）酸化であ
り、酸素１モル当り２モルの８−Ｄーフルクトースの総
合化学量論となる、この最終反応はＹＳＩモデル５３の
如き生物酵素モニターによって監視される。その検定を
次のように実施した。

２５ｏｏに平衡さた反応室にｐＨ８の０．０１Ｍ燐酸塩
緩衝液３の‘を加え、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）蝿梓器
でセット５で縄拝した。

次いで、１び部こ濃縮したシグマグルコースオキシダー
ゼタイプＶ３０り〆及び戊ｐｅｄｅｓ及びＣｈａｓｅの
報文「‘‘Ａｉｄｏｓｅ−１−Ｅｐｉｍｅｒａｓｅｆｒ
ｏｍＨｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆＰｍｉｔｙ ， Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎＫｉｎｅｔｉｃｓ’’、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
＆ Ｂｉｏｐｈ＄．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，３１９６７
（１９６８）」に従って作ったアルドース−１−ェピメ
ラーゼ１００仏そを加えた。引続いて、シグマ−Ｃ−１
００カタラーゼ（５奴／私濃度）１０ム夕、及び７２％
（４．０モル濃度）Ｂ−Ｄ−フルクトース２０仏そをそ
の反応室に加えた。その生成溶液を合計で３〜５分間燈
拝した後、モデル５３ＹＳＩ生物酵素モニターの電極を
その反応室中に注意深く挿入して、電極、反応室壁、ま
たは鷹群棲の下に付着するような気泡が保持されないこ
とを確実にした。モデル５３ＹＳＩ生物酵素モニター記
録計をチャート速度毎分１．２７ｃの（０．５インチ）
で操作して、その記録を安定させた、即ち直線状の基準
線を与えた。いったん直線状の基準線を確立した後、緩
衝すすぎ液１００仏ぞを反応室に加え、その記録計の記
録を再び直線性を達成させるようにした。その検定は毎
分１０仏Ｍの酸素量まで直線状であるが、その酸素モニ
ターに拡大スケール付属品を用いることによってより遅
い速度も慣例的に用いられる。その記録計の記録の傾斜
に移動がないことは、緩衝すすぎ液中に活性酵素がない
ことを示す。固定に用いた蛋白質溶液からの活性の損失
を基準にして記録計マトリックス１の‘当り０．７単位
のグルコースィソメラーゼの担特が計算された。

実施例 ９徴孔質担体と対照気孔ガラス（ＣＰＧ）との
比較４０〜８０メッシュの対照気孔ガラス粒子をＥｌｅ
ｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
から入手し、標準法（‘ｌｍｍｏｂｍｚｅｄＥｎｚｙｍ
ｅｓ：Ａ ＰｒｏのｔｙｐｅＤｅｖｉｃｅ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｃｏｓｅ
ｍＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ Ｅｍｐｌ
ｏｙｊｎｇ ｌｍｍｏｂｊｌｉｚｅｄＧＩＭｏｓｅ
０幻ｄａｓｅ” Ｍ．Ｋ．ＷｅｉＧＩ ｅｔ ａｌ．，
ＡＭ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２５０２（１９７３）〕に
よって化学的に変性してその外面及び内面に共有結合し
た脂肪族ァミノ官能基を導入した。

そのアミノ変性ＣＰＧ２夕を脱ガスし、へべス緩衝液１
００必中に０．虫時間懸濁させた。その上燈液をその床
から吸い出し、その粒子を１０％グルタールアルデヒド
水溶液中に１時間再度懸濁させた。そのＣＰＧ粒子を、
グルタールアルデヒドの臭いがなくなるまで懸濁及びデ
カンテーションによって大規模に洗った。−７．５の０
．４３単位／奴を含有する酵素溶液１０の‘をその粒子
に加え、１時間反応させた。その粒子１．２泌を小さな
カラム（直径０．６弧）中に入れて充填床反応器を作り
、そして実施例８の検定技術によって求める時に蛋白質
が上燈液中に見出されなくなるまでへべス緩衝液ですす
し、だ。反応溶液からの活性の損失を基準にして、その
担特は０．６６単位／の‘であった（ＣＰＯは０．３６
夕／叫の嵩密度を持つ）。それは実施例８の固定された
酵素の担体の場合と実質的に等しい。円板反応器（実施
例８）及び充填床反応器の容積はそれぞれ１．０の‘及
び１．２机であった。ｐＨ７．０のへべス緩衝液中の７
・２％ｗｔ／ｖｏｌフルクトース溶液（０．４モル濃度
）の転換率を幾つかの流速で測定することによって各反
応器を経験的に評価した。反応器流出液をｐＨ５．５の
０．１モル濃度の酢酸ナトリウム中に１０針音‘こ希釈
し、報告者の酵素の存在下での終点酵素消費を測定する
ことによってグルコースを測定した。実施例８で記載し
た溶液について用いたのと同じ技術を用いて固定された
酵素の活性の分析を行なった。しかし、この場合には第
一の反応が達成されておりそれで反応器の流出液流中の
Ｑ−Ｄーグルコースの量を分析することだけが必要であ
る。従って、反応：ＧＩク‐Ｄ−フルクトース−−→
ｏ‐Ｄ−グルコースは反応器中で完了されており、また
へべス緩衝液中の７．２％フルクトース溶液を用いて実
施される。その反応器流出液の分析順序は実施例８で記
載した検定技術の反応順の式ｂ，ｃ，及びｄと同じであ
る。Ｑ−Ｄ−グルコースへの８−Ｄーフレクトースの転
換効率についての反応器流出液の検定は次の通りである
：２５００で平衡化された反応室中にＰＨ５．５の酢酸
ナトリウム緩衝液３地をピペットで入れ、トーマス損枠
器でセット５で渡洋した。

次いで、グルコースオキシダーゼ６０仏そ、アルドース
ー１ーェピメラーゼ２００ｒそ、及びカタラーゼ１０仏
夕をその反応室に加えた。その生成溶液を合計で３〜５
分間燈拝した後、ＹＳＩ酵素モニターの電極を、気泡が
電極の表面、反応室、または溶液自体中に保持されない
ことを確実にするように注意深く反応室中に挿入した。
ＹＳＩ生物酵素モニターの記録計を毎分１．２７伽（０
．５インチ）のチャート速度で操作して、その記録を一
定の基準線に安定させた。いったん基準線を確立した後
に、反応器流出液３０山そをその反応室中に注入し、そ
の曲線を再び安定な傾斜を達成するようにした。その経
験評価の結果を下表に示す。

固定及び反応器の両研究を、直接の比較が確実に行ない
得るように同じ日に平行して実施した。６時間にわたる
各反応器の性能は、その２つの反応器を運動方式で操作
した時にグルコースへのフルクトースの一定状態の転換
率によって求められるように不変であった。

上記のデータから分るように、充填床反応器の効能は、
滞留時間を標準に一致させる時には、積み重ねられた円
板組立の場合のわずかに６０〜７０％である。

このことは、酵素の「高濃度」が実際の目的に対して両
反応器について同じであることを示す計算の観点から、
全く意外である。円板反応器は室温で基質溶液の存在下
で５日間そのままであり得た。反応器の輸送特性は変化
せず、また０．３７の‘／分での転換率は１．５０％で
わずかにより高かつた。実施例 １０ 熱硬化したマトリックスを持つ徴孔質担体本発明の徴孔
質酵素担体のマトリックスまたは結合剤成分が熱可塑性
重合体樹脂に限定されないことを示すために、徴孔質物
質のシートを次のようにして作った。

天然ゴム１０の重量部、シリカヒドロゲル１６５．５部
、不活性充填剤（ゴム徴粉）３．１部、硫黄３９．０部
、ステアリン酸０．８部、及びジフェニルグアニジン０
．８部をバンバリーミキサー中で十分に混合して均質混
合物を作った。次いでこの混合物をシート形に押出し、
名目上１．２肋（０．０４７インチ）厚に圧延した。そ
の圧延したシートをリールに巻き取り、オートクレープ
中で３５分間、１７２０、１０．９ｋ９／鮒・Ｇ（１５
５ｐｓｉｇ）で加硫した。その加硫したシートを次いで
炉内で空気乾燥して全ての水分を除去した。その生成し
た徴孔質物質は極めて多孔質であり、水銀押込み法によ
って求めた時に約０．５〜約５仏の大きさの徴孔を持っ
ており、且つ約１．５仏の平均孔直径を持っている。加
えて、この物質の総合多孔度は約５筋容量％であり、ま
たその分散した充填剤（例えばシリカ）含有率は約２亀
重量％である。直径１．３伽のサンプル片をその仕上が
り微孔質シートからプレスで切り出し、そして次のよう
に単一円板反応器を作るのに利用した：１ 反応器Ｎｏ
．１一酵素のみ中に温遣した。

２ 反応器船．２−ポリエチレンィミン、グルタールア
ルデヒド及び酵素中に温遣した。

比較のために、実施例１の物質から１．３伽の直径を持
つ円板を作り、ポリエチレンイミン、グルタールアルデ
ヒド、及び酵素中に縞層することによって第３の単一の
円板反応器（反応器Ｎｏ．３）を作った。

適当な大きさに切断されている各徴孔質反応器円板（反
応器Ｎｏ．２及び３のみ）を５％ポリエチレンィミン２
０ｃｃ中に３０分間浸め、いまいま櫨拝して気泡を除去
した。その各片を次いで塩化ナトリウムの１モル濃度溶
液中で３び分間洗ってポリエチレンィミンを固定させ、
次いで蒸留水中で十分に洗ってその反応器円板から全て
の塩化ナトリウムを除去した。これはそれぞれ５０の‘
、５分間の洗浄を４回必要とした。次いでその反応器円
板をＰＨ９のグルタールアルデヒドの１０％水溶液５０
ｃｃ中に浸し、そしてグルタールアルデヒドが円板に均
質に浸入するのを確実にするためにいまいま縄拝した。
グルタールアルデヒド中での温層の後、その円板を蒸留
水中で４回、各５の‘、１０分間で十分に洗浄た。グル
コールオキシダーゼ（１２７山単位／汎【）を燐酸塩緩
衝液（０．１モル濃度、ｐＨ６）で５０／５０に希釈し
た。その生成溶液（５０ｃｃ）を希薄水酸化ナトリウム
でｐＨ６に調節し、反応器恥．１，２及び３の円板をこ
の溶液中で３０分間温遣した。その３０分間の温暦の後
、その反応器円板を取り出し、蒸留水で十分に洗って、
多孔質物質から遊離の酵素を除去し、固定された酵素の
みを残した。上記の３種の各々の反応器を、８−Ｄーグ
ルコースをＤ−グルコノラクトンに転換させ且つ流出液
中の過酸化水素の濃度を監視することによってそれらの
活性について検定した。基質溶液（ｐＨ６の０．１モル
濃度の燐酸カリウム緩衝液中の０．１５モル濃度の８−
Ｄ−グルコース）を種々の流速で反応器にポンプ送りし
、その流出液を集め、下記の式に従って発生する過酸化
水素を検定した：グノレコースオキシダーゼ｝し２０２
十日２０十夕‐Ｄ−のレコース↑日２０２十Ｄ−クルコ
ノラクトン ベルオキシダーゼ溶液（ｐＨ６の燐酸カリウム緩衝液中
１０ｍｇ／５の‘）２５ｒ〆及び還元した○−ダイアニ
シジン溶液（メタノール中）２％５０メタを分析機のっ
ぽ中に加えた。

そのつばを反応器流出液で満たし、蝿拝し、そして光学
密度対ブランク標準についＢａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏ
ｍｂのスベクトロニツク（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）２０
で４６仇ｈ仏で分析した。その観察結果は次の通りであ
る。反応器Ｎｏ．１ 最少の酵素活性がこの反応器で示された。

存在したその活性は、グルコース溶液を反応器にポンプ
送りするにつれて容易に洗い出された。即ち、酵素がそ
の媒体に結合されておらず、むしろその孔内にとどめら
れていたことを示した。反応器Ｎｏ．２ この反応器は第一日目‘こ良好な活性を示し、その物質
のシリカ含有量について標準化した時に対照（反応器舷
．３）とほとんど同じ活性であった。

０．５ｃｃ／分の流速で１の直径の面積を通過する時に
、その円板は物質１夕当り０．６５単位の活性を示した
。

その活性は第二日割こわずかに低下するように思われた
が、これは定量されなかった。反応器Ｍ．３この反応器
は良好な活性を示し、また両日とも一定の反応速度を示
した。

１伽直径の面積を通る０．５ｃｃ／分の流速において、
その円板は物質は１夕当り１．８単位の活性を示した。

反応器蛇．２の活性は反応器船．３の活性のほぼ半分で
あること、また、反応器Ｍ．２の物質は反応器Ｍ．３の
ほぼ半分のシリカ充填剤を含有することが留意される。
このことは、例えば硬質ゴムまたはポリ塩化ビニルのよ
うな取り囲んでいるマトリックスよりも徴孔質物質中の
充填剤（シリカ）成分が固定された酵素用の主要な結合
種を構成することを示している。前記の各実施例のある
ものは、いわゆる積み重ね円板または流通反応器の形態
の本発明の固定された酵素系を説明しているが、その他
の多くの形態の反応器も十分に用い得ることが認められ
る。

例えば、出発徴孔質物質を中空管の形状に作り、そして
前記した方法で処理して、それに触媒的に活性な酵素を
結合または付着させる。次いで基質を一端でその管中に
流入させ、基質が管に沿って流れてその内壁と接触した
時に酵素的に反応させ、そしてその生成物を他端におい
て管から流出させる。同様に、基質が比較的高い粘度を
持つか、あるいは、例えば充填床、流動床、健梓タンク
型の反応器を利用することが望ましい場合には、前記の
ように出発徴孔買物質に酵素を結合させて固定し、その
生成シートを次いで特定の任意の所望の大きさの小片（
例えば、片体、粒体、ビーズ、粉体等）に切断または破
砕する。

その固定され破砕された生成粒子はそのような形状の固
定された酵素担体を必要とする用途に利用できる。最後
に、更に理解されるように、本発明の固定の原理は酵素
以外の蛋白質物質、例えば抗体、抗原に適用できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 固定化された蛋白質物質、例えば、酵素を含んでな
   り、該蛋白質物質を、例えば酵素転換方法において流体
   と接触させるために使用する不溶性複合物であつて、少
   くとも一対の対立した表面と所定の厚さを有する微孔質
   部材を包含する不溶性複合物であつて、前記微孔質部材
   が全体にわたつて微細充填粒子が分散した重合樹脂状結
   合剤と、ほぼ相互に連絡した孔の網状構造とを包含し、
   これらの孔が前記充填粒子と前記重合樹脂状結合剤の間
   および隣合つた充填粒子の間で前記重合樹脂状結合剤内
   に形成されており、前記分散した充填粒子が少くとも約
   ２５％の重量割合で前記微孔質部材内に存在し、前記孔
   の寸法分布が前記各表面を横切りかつ前記所定の厚さを
   横切つて不均一に、水銀押込法でポロシメーター的に測
   定して約０．０１ミクロン乃至約１００ミクロンの範囲
   にわたつて変化し、また、蛋白質物質が前記結合剤全体
   に分散した前記充填粒子の少くとも若干のものに結合し
   ており、前記微孔質部材が前記表面のうち少くとも一方
   の表面を通して流れる流体に対して透過性を持ち、前記
   蛋白質が結合した前記充填粒子の少くとも若干のものが
   この流体と接触するようになつていることを特徴とする
   不溶性複合物。 ２ 固定化された蛋白質物質、例えば、酵素を含んでな
   る不溶性複合物の製造方法であつて、少くとも一対の対
   立表面および所定の厚さを有する不溶性微孔質部材を用
   意する段階を包含し、前記微孔質部材が全体にわたつて
   微細充填粒子が分散した重合樹脂状結合剤と、ほぼ相互
   に連絡した孔の網状構造とを包含し、これらの孔が前記
   充填粒子と前記重合樹脂状結合剤の間および隣合つた充
   填粒子の間で前記重合樹脂状結合剤内に形成されており
   、前記分散した充填粒子が少くとも約２５％の重量割合
   で前記微孔質部材内に存在し、前記孔の寸法分布が前記
   各表面を横切りかつ前記所定の厚さを横切つて不均一に
   、水銀押込法でポロシメーター的に測定して約０．０１
   ミクロン乃至約１００ミクロンの範囲にわたつて変化し
   、また、該蛋白質物質を前記結合剤全体に分散した前記
   重点粒子の少くとも若干のものに化学的に結合する段階
   を包含し、前記得られた微孔質部材が前記表面のうち少
   くとも一方の表面を通して流れる流体に対して透過性を
   持ち、前記蛋白質が結合した前記充填粒子の少くとも若
   干のものがこの流体と接触するようになつていることを
   特徴とする方法。