FI93124C - Menetelmä liuenneen valkuaisaineen immobilisoimiseksi - Google Patents

Description

93124

Menetelmä liuenneen valkuaisaineen immobilisoimiseksi -Förfarande för immobilisering av löst äggviteämne

Keksinnön kohteena on menetelmä liuenneen valkuaisaineen immobilisoimiseksi vesiliuoksesta liuokseen suspendoituun kiinteään, makrohuokoiseen, veteen liukenemattomaan kantajaan elektrolyytin läsnäollessa ja valkuaisaineen kiinnittämiseksi kantajaan siihen adsorboituneen valkuaisaineen verkostusta aiheuttavan kytkentäkomponentin avulla, joka sisältää kaksi tai useampaa valkuaisaineen suhteen reaktiivista funktionaalista ryhmää.

Immobilisoituja entsyymejä on jo saatu verkostamalla liuotetut entsyymit glutaaridialdehydillä. Tällöin on havaittu, että kasvava ionivahvuus edistää verkostumista, mikä on selitetty elektrolyyttien saostavan vaikutuksen avulla; vrt. K. Ogata et ai. Biochim. Biophys. Acta, side 159 (1968), sivu 405 - 407.

Glutaarialdehydiä on käytetty myös sitomaan liuotettuja entsyymejä liukenemattomiin kantajiin; vrt. A. Habeeb, Archives of Biochemistry and Biophysics, nide 119, (1967), sivut 264 - 268. Päinvastoin kuin glutaaridialdehydillä suoritettu kantajätön saostaminen ja verkostaminen sitominen kiinteisiin kantajiin on aina suoritettu alhaisissa elektrolyyttikonsent-raatioissa.

Patenttijulkaisun DE-OS 33 36 257 mukaisessa menetelmässä valmistetaan pysyvästi immobilisoituja entsyymejä siten, että huokoinen kantaja, esimerkiksi piimää kostutetaan entsyymili-uoksella tai kantaja päällystetään kiinteän entsyymin kerroksella ja tämä kantajasta ja liuenneesta tai kiinteästä entsyymistä muodostuva valmiste laitetaan vesipitoiseen suolaliuokseen ja annetaan verkostusaineen vaikuttaa. Suolaliuos vaikuttaa siten, että entsyymivalmisteesta ei liukene pois mitään entsyymiä eikä mene hukkaan immobilisoinnissa. Tässä menetelmässä on siten periaatteessa käytettävä kaksi erillistä työvaihetta, nimittäin entsyymivalmisteen, joka sisältää kantajan ja liuennutta tai liukoista entsyymiä, valmistamisen ja ent- syymivalmisteen lisäämisen verkostushauteeseen.

2 93124

Patenttijulkaisussa EP 37667 on kuvattu sienilaktaasin sitominen makrohuokoisista kationisista ioninvaihtohartseista muodostuvaan kantaja-aineeseen ja patenttijulkaisussa EP 26672 makrohuokoisista amfoteerisistä ioninvaihtohartseista muodostuviin kantaja-aineisiin glutaaridialdehydin avulla. Molemmissa menetelmissä käytetään elektrolyyttejä puskurointiaineina korkeintaan ennen reaktiota glutaaridialdehydin kanssa tai sen jälkeen, kun taas itse reaktio suoritetaan kuitenkin vain alhaisissa konsentraatioissa, jotka missään tapauksessa eivät ole suurempia kuin 0,05 mooli/1, jotta ei estettäisi ioniad-sorptiota. Päinvastoin mainitaan korkeat ionikonsentraatiot keinona liuottaa mahdollisesti verkostumatta jääneet entsyymi-määrät kantajasta. Amfoteeriset tai kationiset kantajahartsit voivat johtaa moniin häiritseviin vuorovaikutuksiin substraat-tinesteiden liuenneiden ainesosien kanssa ja usein niitä ei sen vuoksi voi käyttää.

Esillä olevan keksinnön avulla on mahdollista immobilisoida liuenneet valkuaisaineet makrohuokoisiin kantaja-aineisiin yksinkertaisella tavalla yksivaiheisessa menetelmässä ja korkeilla aktiivisuussaannoilla.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että valkuaisaineen vesiliuoksen, jossa elektrolyytin ionivahvuus on vähintään 0,30 mooli/1, annetaan vaikuttaa tämän vesiliuoksen ympäröimään kantajaan kuormituksella, joka on ainakin 20 mg valkuaisainetta kantajan grammaa kohti, kunnes valkuaisaine on adsorboitunut kantajaan ja että valkuaisaineen vesili-•:uokseen lisätään kytkentäkomponentti adsorboitumisen aikana tai sen jälkeen ilman kantajan välikuivausta.

Yllättävää on, että korkeat ionivahvuudet tässä vaaditulla alueella edistävät valkuaisaineen immobilisointia makrohuokoi-. selle kantaja-aineelle, vaikka korkeat ionivahvuudet muutoin 3 93124 toimivat keinona, jolla kovalenttisesti sitoutumattomat valku-aisainemolekyylit irrotetaan kantajasta ja joka verkkouttamis-aineiden läsnäollessa muodostaa kantajattomia liukenemattomia sakkoj a.

Seuraava taulukko osoittaa aktiivisuussaannon kasvavan, kun penisilliiniamidaasia sidotaan glutaaridialdehydin avulla fenyylisefaroosiin nousevissa ionivahvuuksissa. Sitomis-menetelmä vastaa esimerkissä 5 annettua toimintatapaa.

Kantajaan sidotun entsyymin Kaliumfosfaattipuskuri aktiivisuus

Moolisuhde Ionivahvuus Kans.yksikköjä/ Immobil. aktiivi- (mooli/1) (mooli/1)_märkäpaino-G_suussaanto. % 0,01 0,03 64 36 0,05 0,15 103 51 0,10 0,30 128 72 0,50 1,50 170 92 Käyttämättä glutaaridialdehydiä ei muutoin samanlaisissa sito-misolosuhteissa voida todeta ylipäätään lainkaan sitoutunutta aktiivisuutta.

Keksinnön mukaisen, parhaana pidetyn toimintatavan edullinen vaikutus verrattuna immobilisointiin amfoteeriseen kantajaan voidaan havainnollistaa esimerkillä, joka koskee hiivalaktaa-sin immobilisointia. Patenttijulkaisun EP-A 26672 vertailu-esimerkin 1 perusteella immobilisoidaan hiivalaktaasi glutaaridialdehydin avulla pH-arvossa 6,65 ja 20 - 22°C:ssa 64 % määräsaannolla fenoli-formaldehydihartsipohjaiseen amfoteeri-seen ioninvaihtajaan. Aktiivisuus on kuitenkin tällöin niin alhainen, että käytännössä saavutetaan tuskin mitään aktii-visuussaantoa.

Jos sitä vastoin vesiliuoksesta, joka sisältää 111 g entsyymi-preparaattia litrassa, sidotaan hiivalaktaasi 23°C:ssa helmiäiseen, makrohuokoiseen, neutraaliin kantajahartsiin, jonka 4 93124 pohjana on verkostettu akryyliamidi, jossa on oksiraaniryhmiä kytkentäaktiivisina ryhminä, niin saadaan seuraavat aktiivi-suussaannot riippuen käytetystä elektrolyyttikonsentraatiosta:

Elektrolyytin kons. Ionivahvuus Aktiivisuussaanto, % käy- (Mooli ^ΗΡΟ^, ΚΗ2Ρ0^/1) (mooli/1) tetvstä aktiivisuudesta 0,5 1,21 3,5 1,0 2,42 19 1,25 3,02 51 1,5 3,33 55

Ennen kaikkea on yllättävää, että keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan helposti päästä hyvin erilaisillakin, epäspe-sifillä kantaja-aineilla suuriin absoluuttisiin aktiivisuuksiin ja erinomaisiin aktiivisuussaantoihin, jotka muutoin olivat saavutettavissa vasta kantajan kalliin aktivoinnin jälkeen. Seuraavan verkostamisen jälkeen valkuaisaine pysyy kantajaan sitoutuneena myös alhaisissa ionivahvuuksissa ja se voidaan esimerkiksi entsyymien tapauksessa käyttää uudelleen useita kertoja ilman huomattavia aktiivisuustappioita.

Menetelmä sopii kaikenlaatuisten kiinteiden makrohuokoisten hiukkasten valmistamiseen, jotka luonnostaan sisältävät liukoisia valkuaisaineita immobilisoidussa muodossa. Tärkein käyttöala on kantajaan sidottujen entsyymien valmistaminen.

Sen lisäksi merkitystä on affiniteettikromatografiaan tarkoitettujen täyteaineiden valmistaminen ja diagnostisten testiaineiden valmistaminen.

Valkuaisaineet, jotka voidaan keksinnön mukaisesti sitoa, ovat sellaisia, jotka ovat lämpötilassa välillä 0 ja 60°C niin vesiliukoisia, että ne voidaan saattaa kosketukseen kantajan kanssa liuenneessa muodossa. Keksintö ei rajoitu tämän laatuisiin määrättyihin valkuaisaineisiin vaan käsittää kaikki biogeeniset, vesiliukoiset proteiinipitoiset materiaalit.

Vaikkakin tähän mennessä keksinnön mukaisen menetelmän ei ole ^havaittu täydellisesti epäonnistuneen, ei voida sulkea pois 5 93124 mahdollisuutta, että yksittäisiä valkuaisaineita ei voida sitoa kantajaan tai voidaan sitoa vain huonommalla tuloksella kuin muilla menetelmillä. Valkuaisaine voi olla edullista stabiloida ionilisäysten avulla tai entsyymien tapauksessa substraattilisäyksen avulla.

Parhaina pidetään entsyymejä. Esimerkkeinä mainittakoon amy-laasit, proteaasit, amidaasit, pektinaasit, sellulaasit, hemi-sellulaasit, asylaasit, laktaasit, isomeraasit, invertaasit ja oksidaasit. Ei-entsyymimäisistä valkuaisaineista ovat esimerkkejä vasta-aineet, proteiinirakenteiset hormonit ja entsyymi-inhibiittorit .

Kantaja voi muodostua jokaisesta veteen tai elektrolyyttili-uokseen liukenemattomasta kiinteästä aineesta, jolla on makro-huokoinen rakenne. Sopivat kiinteät aineet, joilla on makro-huokoinen rakenne, sisältävät huokosia, joiden huokoshalkaisi-ja on vähintään 10 nm ja joiden huokostilavuus on yli 0,1 cm3/g, parhaiten yli 0,5 cm3/g. Parhaiten kantajien huo-kosleveys on 10 - 100 nm, ominaispinta-ala 10 - 500 m2/g ja huokostilavuus 1-3 cm3/g.

Kantajan ulkoinen muoto ei ole vaikutuksen kannalta kriittinen, vaikkakin usein pidetään parhaina suuripinta-alaisia systeemejä, joiden spesifinen pinta-ala on vähintään 1 m2/g, koska ne mahdollistavat immobilisoidun valkuaisaineen suuren aktiivisuusmäärän sitomisen pieneen tilaan. Sopiviin kantaja-aineisiin kuuluvat astioiden tai putkien tai astioiden tai putkijohtojen kiinteiden sisärakenteiden sisemmät pinnat tai päällysteet, foliot, membraanit, paperit, kankaat, kuitukankaat tai kuitupakkaukset tai kiinteiden aineiden muut pakkaukset tai kerrokset, jotka voidaan ympäröidä tai joiden läpi voi tapahtua virtausta. Kun näiden aineiden välissä on riittävän suuria läpivirtauskelpoisia tiloja, kantajat tai ainakin lähellä pintaa olevat kantajakerrokset voivat huomattavasti turvota vaikuttamatta läpivirtaavuuteen. Parhaiten käytetään pieniosaisia kantajia, millä tarkoitetaan kantaja-aineita, 6 93124 joiden hiukkaskoko on alle 10 mm, parhaiten välillä 0,1 ja 5 mm. Erityisen hyvinä pidetään helmiä, so. pallon muotoisia kantaja-aineita. Edullista on, että pieniosaiset kantajat eivät lainkaan turpoa tai turpoavat vain vähän vesipitoisessa mediumissa, jossa niitä käytetään, parhaiten enintään kuivan aineen keksinkertaiseen irtotilavuuteen. Pieniosaisten kantajien sopivuuden edellytyksenä on, että ne voidaan suspendoida elektrolyyttipitoiseen liuokseen sekoittamalla tai että pyl-västäytössä virtaus voi tapahtua niiden läpi.

Parhaina pidetään kantaja-kiintoaineita, jotka eivät ole kuormatut kationisesti. Tällä tarkoitetaan kiintoaineita, jotka eivät sisällä matriisissaan tai luoksepäästävillä pinnoillaan lainkaan kovalenttisesti sitoutuneita kationisia ryhmiä tai emäksisiä ryhmiä, jotka protonoitumisen kautta voivat muuntua kationisiksi ryhmiksi, so. ammonium- tai aminoryhmiä, tai näiden ryhmien pitoisuus on enintään 0,1 milliekvivalent-ti/g. Erityisen hyvänä pidetään kuormittamattomia tai heikosti anionisesti kuormitettuja makrohuokoisia kiintoaineita. Kuormittamattomina pidetään kiintoaineita, jotka eivät sisällä lainkaan kovalenttisesti sitoutuneita karbonyyli-, karboksy-laatti-, sulfonaatti-, amino- tai ammoniumryhmiä tai niiden määrä on enintään 0,1 milliekvivalentti/g kuivaa kantajahart-sia. Heikosti anioniset kantajahartsit voivat sisältää anioni-sia ryhmiä, jotka sisältävät kovalenttisesti sitoutuneita karboksyyli- tai karboksylaattiryhmiä aina konsentraatioon 5 milliekvivalentti/g asti. Nämä arvot koskevat tietenkin hartsiainetta kantajahiukkasten aktiivisilla pinnoilla.

Kuitenkin on osoittautunut, että suurten suolakonsentraati-oiden vaikutuksesta proteiinin pinnalla voi tapahtua ulos-:suolautuminen myös erittäin hydrofiilisilla pinnoilla, jopa voimakkaasti anionisesti kuormitetuilla kiintoaineilla. Myös tällaiset kantajat ovat sen vuoksi käyttökelpoisia.

Hydrofobiset ryhmät, esimerkiksi tyydytetyt tai parhaiten . tyydyttämättömät alifaattiset sivuryhmät, joissa on kaksi tai • « 7 93124 useampia hiiliatomeja, tai aromaattiset ryhmät edistävät voimakkaasti valkuaisaineen sitoutumista, jolloin kyseessä on näiden ryhmien suuruuden asemesta pikemminkin niiden pinta-tiheys kantajan pinnoilla. Kantajan huokosseinämän pinnat tai kantaja kokonaisuudessaan muodostuu parhaiten polymeerimateriaalista, joka sisältää mainitunlaatuisia sivuryhmiä vähintään 1 paino-%.

Periaatteessa sopivia ovat myös makrohuokoiset epäorgaaniset kantajat, kuten lasihelmet tai lasikuidut (esim. "Controlled Pore Glass"), piihappo, alumiinioksidi tai aktiivihiili. Orgaanisilla aineilla, erityisesti muoveilla, on etuna se, että niistä voidaan helpommin valmistaa määrätyssä muodossa oleva kantaja, esimerkiksi helminä, kuituina, kalvoina tai päällysteinä. Orgaanisen kantaja-aineen kemiallinen rakenne ei ole kriittinen, vaikka yksittäistapauksessa on huolellisesti tukittava, millä kantajalla saadaan paras tulos.

Sopivat veteeniiukenemattomat, makrohuokoiset muovihartsit voivat olla luonteeltaan esimerkiksi polaarittomia ja verkos-tamattornia tai verkostettuja, kuten esimerkiksi polymetyyli-metakrylaatti ja muut akryyliesteripolymeerit, polystyreeni, selluloosaesteri, fenoli-formaldehydi-hartsit, epoksidihartsit tai polyolefiinit. Ne voivat olla myös polaarisia ja enemmän tai vähemmän hydrofiilisiä, mutta verkostamisen seurauksena < · veteeniiukenemattornia. Näihin kuuluvat verkostetut selluloosa-ja tärkkelysjohdokset, verkostettu polyakryyliamidi tai poly-metakryyliamidi, akryyli- tai metakryylihapon verkostetut polyhydroksialkyyliesterit, verkostettu polyvinyylipyrrolidoni tai ei-emäksiset aminomuovihartsit.

Adsorptio-ominaisuuksien parantamiseksi on usein edullista tehdä kantaja jonkin verran hydrofobiseksi, ainakin pinnalta. Esimerkiksi voidaan epäorgaaniset kantajat, kuten piidioksidi, pentoniitti tai huokoiset lasit varustaa pinnalta fenyyliryh-millä saattamalla reagoimaan fenyylifuktionaalisten silaanien kanssa. Vastaavalla tavalla voidaan makrohuokoiset orgaaniset 93124 8 kantajat, kuten sefaroosi, fenyloida fenyyliglysidyylieetterillä tai alkyloida alkyyliglysidyylieetterillä. Adsorptiota parantava vaikutus on fenyyliryhmien lisäksi yleensä kaikilla suoraketjuisilla tai haarautuneilla alkyyliryhmillä, joissa on 1-18 hiiliatomia.

Erityisen sopiva kantajahartsien ryhmä helminä tai onttoina helminä voidaan saada patenttijulkaisujen DE-B-22 37 316, 23 43 633 tai DE-A-27 22 751 mukaisesti. Tällöin on kysymys verkostetuista, hieman turpoavista tai turpoamattomista poly-merisaateista, joilla on hydrofiilinen matriisi, joka on muodostettu parhaiten oleelliselta osin akryyliamidista, metakryyliamidista ja verkostavasti vaikuttavasta metyleeni-bis-akryyliamidista tai -metakryyliamidista. Ne sisältävät valkuaisaineiden suhteen sitomisaktiivisia ryhmiä, erityisesti epoksidiryhmiä, koska nämä eivät hydrolysoimalla tai valkuaisaineen kanssa tapahtuvassa reaktiossa muodosta ionillisia ryhmiä. Lisäksi ne sisältävät noin 2-5 painoprosenttia vapaita metakryolyyli- tai isopropanyyliryhmiä, jotka ovat peräisin vain yksipuolisesti reagoineista verkostamisainemolekyyleistä. Näitä kantajia käytettäessä voidaan jättää myös pois mukana käytetty ylimääräinen verkostamisaine.

Elektrolyytti vaikuttaa keksinnön mukaisessa menetelmässä luultavasti siten, että muodostamalla rakenteen vesimolekyyli-' en kanssa se johtaa jonkinlaiseen ylikyllästymiseen valkuaisaineen kanssa, joka tapauksessa sen liukoisuuden pienenemiseen. Usein on edullista lisätä elektrolyytit vasta valkuaisaineen liuottamisen jälkeen, koska tämä muutoin liukenee usein vain hitaasti tai ei lainkaan.

•Kysymys jonkin elektrolyytin saostavasta vaikutuksesta jossakin konsentraatiossa riippuu valkuaisaineen laadusta, sen konsent-raatiosta ja mukana olevista aineista ja on tukittava tapaus tapaukselta. Yleensä käyttökelpoisia ovat kaikki vaikutukseltaan ulossuolavat elektrolyytit, esimerkiksi Hofmeister'in . sarjan kaikki ulossuolaavat anionit, mukaanlukien kloridi.

9 93124 H.M. Rauen on antanut esimerkkejä elektrolyyttien erilaisesta vaikutuksesta, "Biochemischen Taschenbuch", osa 2, 2. painos, sivut 56 - 57. Sopivia ovat elektrolyytit, joilla Ks-arvo on positiivinen yhtälössä

log 100 f = -K_ . J

tai jos log SQ = β

log S = β - Ks . J

jolloin S on valkuaisaineen liukoisuus elektrolyytin läsnäollessa ja SQ ilman elektrolyyttiä. Moniarvoiset metallikationit vaikuttavat usein saostavasti tai inaktivoivasti, joten parhaana pidetään yksiarvoisia kationeja, siis ennen kaikkea alkali-ioneja. Anioneilla on selvempi vaikutus elektrolyytti-lisäyksen vaikutukseen. Parhaiten sopivia ovat sulfaatti, fosfaatti ja polyfosfaatti. Myös karbonaatilla, kromaatilla, asetaatilla, sitraatilla ja tartraatilla on voimakas ulos-suolaava vaikutus, mutta näitä ei voida kuitenkaan aina käyttää herkkien valkuaisaineiden yhteydessä. Yksiarvoisia anio-neja, kuten kloridia tai asetaattia on käytettävä suurempi konsentraatio kuin moniarvoisia anioneja, jotta saavutettaisiin tarvittava ionivahvuus. Kaikkia on käytettävä suuri konsentraatio, jotta niillä olisi niiden ulossuolaava vaikutus . Useimmille valkuaisaineille sopivat parhaiten suuren tehonsa, alhaisen hintansa ja vaarattomuutensa vuoksi neutraalit rakennesuolat, kuten ammonium-, natrium- tai kaliumsul-faatti, ammonium-, natrium- tai kaiiumvetyfosfaatti. Elektro-lyyttipitoisen valkuaisaineliuoksen pH-arvo riippuu valkuaisaineen herkkyydestä ja on parhaiten välillä 4-9.

* Elektrolyyttilisäyksen tehon kannalta on ratkaiseva sen ioni-vahvuus i. Vesiliuokselle, jossa on 1-kappaletta ionilajeja, se lasketaan kaavasta i 2 r-k z± ^

•‘E

10 93124 jossa Ci on ionilajin konsentraatio ja arvo. 1 m K2HP04-liuokselle, jossa CK =2, ZK = 1, CHpo = 1, ZHpo = 2, saadaan esimerkiksi ionivahvuus J = 3. Parhaana pidettyjen elektrolyyttien konsentraatiot ovat käytännössä ionivahvuus-välillä 0,15 ja 2 mooli/1. Ionivahvuus on parhaiten vähintään 0,3 mooli/1.

Immobilisointi alkaa periaatteessa adsorptiovaiheella. Myös verkostusainetta käytettäessä lähtee verkostusreaktio adsorp-tiovaiheesta. Molemmat vaiheet voidaan suorittaa peräkkäin tässä järjestyksessä, so. ensin adsorboidaan valkuaisaine kantajaan elektrolyytin läsnäollessa ja vasta sen jälkeen lisätään verkostavat kytkentäkomponentit. Tätä järjestystä pidetään parhaana. Molemmat vaiheet voidaan kuitenkin menetelmällisesti koota yhteen ja antaa kytkentäkomponenttien vaikuttaa samanaikaisesti elektrolyytin kanssa jo adsorption aikana. Lopuksi monissa tapauksissa on myös mahdollista saattaa kantaja reagoimaan yksinään kytkentäkomponenttien kanssa ja vasta sen jälkeen lisätä valkuaisaine ja elektrolyytti.

Valkuaisaineen adsorptio tapahtuu 0,1 - 100 tunnin, parhaiten 1-10 tunnin sisällä järjestelmässä, joka muodostuu valkuaisaineen vesiliuoksen muodostamasta supernatantista ja kantajasta. Oleellista on, että elektrolyyttiliuos ympäröi täydellisesti kantajahiukkaset molemmissa reaktiofaaseissa. Immobili- * sointi nopeutuu lämpötilan noustessa. Parhaiten toimitaan korkeimmassa lämpötilassa, jonka valkuaisaine sietää ilman tehon heikkenemistä. Vaikkakin voidaan toimia vielä 0°C:ssa, erityisen edullisia ovat yli 40°C lämpötilat, monissa tapauksissa yli 50°C lämpötilat.

11 93124 lia, so. 2 paino-% tai yli. Sitä vastoin biomakromolekyylien eristämiseen tarkoitettujen immobilisoitujen ligandien tapauksessa pienemmät kuormitustiheydet ovat edullisempia.

Immobilisointi voidaan suorittaa siten, että kantaja lietetään valkuaisaineliuokseen ja elektrolyyttien lisäämisen jälkeen sekoitetaan kohtuullisesti menetelmän loppuun asti. Elektro-lyyttipitoisen valkuaisaineliuoksen voidaan antaa virrata pylväsreaktorissa kantajakerroksen läpi ja liuosta voidaan kierrättää pumppaamalla pidempi aika.

Immobilisointi muodostuu aluksi vain valkuaisaineen adsorptiosta kantajaan. Kun kuormitettu kantaja tämä jälkeen tuodaan vähän elektrolyyttiä sisältävään ympäristöön, useissa tapauksissa on odotettavissa valkuaisaineen desorptio. Tämä estetään sitomalla sen jälkeen valkuaisainemolekyyli kovalenttisesti keskenään tai kantajan kanssa. Tätä varten lisätään toisessa reaktiovaiheessa kytkentä- tai verkostuskomponenttia, mikä menetelmällisesti voidaan suorittaa jo adsorptiovaiheen aikana.

Kytkentäkomponentin täytyy liueta vesipitoiseen elektrolyytti-liuokseen ainakin valkuaisaineen immobilisointiin riittävä määrä. Oleellista on, että tätä komponenttia käytetään elek-Lrolyyttisliuoksen supernatantissa; so. liuos ei saa imeytyä kokonaan kantajamateriaalista. Märän kantajamateriaalin ml kohti käytetään vähintään noin 0,2 ml elektrolyyttiliuosta, parhaiten 10 ml asti. Kytkentäkomponentin on edelleen vaikutettava elektrolyytin läsnäollessa niin, että tämän saostava vaikutus säilyy jäljellä, kunnes valkuaisaine on immobilisoi-tunut irreversiibelisti.

• *

Xytkentäkomponenteiksi sopivat vähintään rajoitetusti vesiliukoiset yhdisteet, joissa on kaksi tai useampia funktionaalisia ryhmiä, joilla ne voivat reagoida valkuaisaineen ja mahdollisesti myös kantajan funktionaalisten ryhmien kanssa. Irreversiibeli immobilisoituminen voi tapahtua verkostamalla valkuaisaine itsensä kanssa tai verkostamalla se kantajan 12 93124 kanssa. Sopivia, valkuaisaineiden kanssa reaktiivisia funktionaalisia ryhmiä ovat esimerkiksi aldehydi-, epoksi-, diatso-, isosyanaatti- ja kloorimuurahaishappoesteriryhmät. Vähemmän edullisia ovat monissa tapauksissa karboksyylihappoanhydridi-tai esteriryhmät, koska ne muuttavat voimakkaasti kantajan sähkökemiallista luonnetta muodostamalla anionisia karboksy-laattiryhmiä. Erityisen käyttökelpoisia kytkentäkomponentteja ovat diatsobentsidiini, heksametyleenidi-isosyanaatti, kloori-muurahaishappoetyyliesteri ja tärkeimpänä yhdisteenä glutaari-aldehydi. Voidaan käyttää myös alempia vesiliukoisia polymeerejä, joiden molekyylipainot ovat alle 100.000, kuten polyak-roleenia, akryyli- tai metakryyliamidin sekapolymeerejä glysi-dyyliakrylaatin tai -metakrylaatin kanssa tai akroleiinin kanssa tai N-allyylimetakryyliamidia.

Mainitsematta ei voi jättää sellaisia kytkentäkomponentteja, jotka tulevat kytkentäaktiivisiksi vasta UV-säteilytyksen tai radikaalimuodostajien (redoksi-initiaattoreiden) vaikutuksesta, esimerkiksi diallyylieetteri tai akryyli- tai metakryyliamidin sekapolymerisaatti p-toluyyli-hydroksietyylimetakry-laatin kanssa.

Irreversiibeliin immobilisointiin tarvittava kytkentäkomponen-Lin määrä riippuu sen reaktiivisuudesta valkuaisaineen kanssa ja mahdollisesti kantajan kanssa ja voi olla esimerkiksi • välillä 1 - 100 paino-% laskettuna valkuaisaineen painosta. Kytkennän reaktio-olosuhteet eivät yleensä eroa adsorption olosuhteista, joten kummatkin tapahtuvat voivat kulkea samanaikaisesti samoissa olosuhteissa. Glutaaridialdehydillä suoritetussa kytkennässä reaktioaika on yleensä 0,1 - 100 tuntia, parhaiten 2 tuntia lämpötiloissa välillä 0 ja 80°C.

•

Immobilisointireaktion jälkeen elektrolyyttiliuos, joka sisältää valkuaisaineen mahdollisesti sitoutumattomia ryhmiä ja kytkentäkomponenttia, yleensä erotetaan kuormitetusta kantajasta. Tämä pestään sen jälkeen sopivalla puskuriliuoksella, #minkä jälkeen se on käytettävissä teknillisesti.

13 93124

Esimerkki 1

Immobilisointi glukoosi-isomeraasi

Kantaja: Makrohuokoiset, pitkälle verkostetut styreeni/di-vinyylibentseeni-helmet, joiden sisäinen pinta-ala noin 200 m2/g ja keskimääräinen huokoshalkaisija 40 nm.

Entsyymi: Glukoosi-isomeraasi, Streptomyces albus-viljelmän nestemäinen konsentraatti.

Aktiivisuus: 1 g entsyymiä muodostaa 5 g D-fruktoosia 0,1-moo-lisesta D-glukoosi-liuoksesta pH-arvossa 7 ja 70°C lämpötilassa 60 minuutissa.

Kytkentä: Ensin adsorboidaan entsyymi makrohuokoiseen kantajaan. Tätä varten pyöritetään pyörimispenkissä huoneen lämpötilassa (23°C) 10 g kantajaa ja 10 g entsyymiä 50 ml:ssa suolaliuosta, joka sisältää 12 % natriumsulfaattia ja 5 % magnesiumsulfaattia sekä 0,02 % kobolttisulfaattia. Vesiliuoksen ionivahvuus on 4,18 mooli/1.

pH säädettiin arvoon 7,0. 20 tunnin kuluttua lisätään 0,5 % glutaaridialdehydiä ja pyöritetään edelleen. Adsorboitu entsyymi "ristiverkostuu" tällä tavoin ja kiinnittyy huokosiin.

2 tunnin kuluttua erotetaan imun avulla ja pestään. Aktiivisuuksien vertailumäärityksestä saadaan suodoksen jäännösaktii-visuudeksi 45 %; kantajasta saadaan takaisin 37 % (= 37 % aktiivisuussaanto).

Käyttö: Immobilisoitu glukoosi-isomeraasi täytetään pylväs- teaktoriin. 60°C lämpötilassa isomeroidaan 40-prosenttinen • glukoosiliuos, jonka pH-arvo on 7,5, 45-prosenttiseksi fruktoosiksi, kun läpivirtausnopeus on 7 kertaa kiinteän kerroksen tilavuus tunnissa.

> · 14 93124

Esimerkki 2

Immobilisoitu Aspergillus orvzae-laktaasi

Kantaja: Verkostettu polyakryylihappoesteri, keskimääräinen huokoshalkaisija 25 nm, sisäinen pinta-ala 140 m2/g; helmet, joiden halkaisija 0,3 - 1 mm.

Entsyymi: Aspergillus oryzae-laktaasi, jauhemainen konsent-raatti. Aktiivisuus = 30.000 yksikköä/g.

Kytkentä: 10 g kantajaa ja 1 g entsyymipreparaattia 40 ml:ssa suolaliuosta ravistellaan 8 tuntia 35°C:ssa. Suolaliuos sisältää 24 % kaliumkloridia, ja liuoksen pH oli säädetty arvoon 5,0. Vesiliuoksen ionivahvuus on 3,21 mooli/1. Entsyymin stabiloimiseksi lisättiin vielä 0,1 % laktoosia. Tämän jälkeen jäähdytetään ja ravistellaan huoneen lämpötilassa vielä 2 tuntia, kun on lisätty 0,5 % glutaaridialdehydiä. Tämän jälkeen erotetaan imulla ja pestään. Verrataan kantajan ja suodoksen laktaasiaktiivisuuksia. Kantajasta löydettiin 34 % käytetystä aktiivisuudesta, suodoksesta 11 %. Aktiivisuussaanto = 34 %.

Käyttö: Pylväsreaktori täytetään immobilisoidulla Aspergillus-laktaasilla. 35°C lämpötilassa hydrolysoidaan yli 90-prosent-uisesti 5-prosenttinen laktoosiliuos, jonka pH on 4,5 ja jota syötetään 40 kertaa kiinteän kerroksen tilavuus tunnissa.

* 60 päivän jälkeen ei voida vielä havaita mitään aktiivisuuden laskua.

Esimerkki 3

Immobilisoitu hiivalaktaasi • 1 1 Kantana: Makrohuokoinen, runsaasti verkostettu helmipolyme-risaatti, jonka pohjana on metakryyliamidi/metyleeni-bis-metakryyliamidi, jossa on vapaita epoksidiryhmiä (1,2 % oksi-raani-happi) ja 2,2 % oksastettuja isopropenyyliryhmiä, jotka ovat väkevöityneet huokosten sisäpinnoille. Huokostilavuus , = 3,4 ml/g, keskimääräinen huokoshalkaisija = 20 nm. Tämän 15 93124 kantajan valmistus on kuvattu patenttijulkaisun DE-A 27 22 751 esimerkissä 2.

Adsorboituneen entsyymin kytkentä tapahtuu tässä tapauksessa kovalenttisesti epoksidiryhmillä samalla, kun se adsorboidaan suuren suolakonsentraation vaikutuksen alaisena.

Entsyymi: Hiivalaktaasi Saccharomyces (Kluyveromyces) lactis-hiivasta, nestemäinen preparaatti, 5000 neutraalia laktaasi-yksikköä (NLU).

Kytkentä: 10 g kantajaa ja 10 g entsyymiä ravistellaan huoneen lämpötilassa (23°C) 80 g:ssa suolaliuosta. Suolaliuos sisältää 16 % dikaliumvetyfosfaattia, 7,9 % kaliumdivetyfosfaattia ja entsyymin stabiloimiseksi 20 ppm Μη(II)-kloridi.4 H20. Sen ionivahvuus on 3,34 mooli/1. 72 tunnin kuluttua erotetaan imulla, pestään ja verrataan suodoksen laktaasiaktiivisuutta kantajan vastaavaan aktiivisuuteen. Käytetystä aktiivisuudesta löydetään 55 % kantajasta ja 14 % suodoksesta.

Tällä herkällä entsyymillä on siten erittäin korkea aktiivi-suussaanto, so. 55 %.

Käyttö: Pylväsreaktori täytetään kytketyllä hiivalaktaasilla.

7°C lämpötilassa johdetaan pylvään läpi 20 päivää kevytmaitoa (0,3 % rasvaa) läpivirtausnopeudella 55 kertaa kiinteän kerroksen tilavuus tunnissa. Maidon sisältämä laktoosi hydrolysoituu aluksi 65-prosenttisesti glukoosiksi ja galaktoosiksi ja 20 päivän kuluttua vielä 50-prosenttisesti.

Menetelmä 4

Immobilisoitu aminohappo-asvlaasi

Kantaja: Makrohuokoinen, runsaasti verkostettu helmipolyme-risaatti, jonka pohjana on metakryyliamidi/metyleeni-bis-metakryyliamidi, jossa on vapaita epoksiryhmiä (1,2 % oksi-raani-happi) ja 2,2 % oksastettuja isopropenyyliryhmiä, jot- 16 93124 ka ovat väkevöityneet huokosten sisäpinnoille. Huokostilavuus = 3,4 ml/g, keskimääräinen huokoshalkaisija = 20 nm. Tämän kantajan valmistus on kuvattu patenttijulkaisun DE-A 27 22 751 esimerkissä 2.

Entsyymi: Jauhemainen aminohappo-asylaasi-konsentraatti Aspergillus-kannasta.

Aktiivisuus: 23.000 yksikköä/g, substraatti = asetyyli-D,L-metioniini.

Kytkentä: 10 g kantajaa ja 20 g entsyymipreparaattia ravistellaan 35°C:ssa 80 ml:ssa suolaliuosta. Suolaliuos sisältää 14,2 % natriumsulfaattia sekä 24 ppm koboltti(II)-kloridi.6 H20, ja liuoksen pH on säädetty arvoon 7,0. Sen ionivahvuus on 3 mooli/1 ottamatta huomioon entsyymipreparaatin suolapitoisuutta .

8 tunnin kuluttua kantaja erotetaan imulla ja pestään. Käytetystä aktiivisuudesta löydetään 61 % kantajasta ja suodoksesta 1 %. Aktiivisuussaannoksi saavutetaan siten 61 %.

Esimerkki 5

Penisilliiniamidaasin sitominen erilaisiin kantajiin

Taulukon I mukaista kosteaa kantajamateriaalia pestään kulloinkin 3,5 g 5 kertaa kulloinkin viisinkertaisella tilavuudella demineralisoitua vettä ja suodatetaan lasisintterillä. Tämän jälkeen kantajamateriaalia ja 6,8 ml entsyymiliuosta, joka sisältää 676 kansainvälistä yksikköä penisilliini-amidaa-sia E.coli-bakteerista 0,5 M K-fosfaattipuskurissa (pH 7,5, mukana 0,1 % NaN3), ravistellaan 2 tuntia noin 21°C:ssa. Puskuriliuoksen ionivahvuus on 1,5 mooli/1. Lisätään 0,136 ml 25-prosenttista vesipitoista glutaaridialdehydi-liuosta, joka on stabiloitu ioninvaihtohartsin avulla (Amberlite A 21), minkä jälkeen ravistellaan vielä kaksi tuntia. Tämän jälkeen kuormitettu kantajamateriaali viedään veden avulla lasisint-,terille ja pestään vielä kolme kertaa 1 M natriumkloridilla 17 93124 ja kaksi kertaa 0,05 M Na-fosfaattipuskurilla (pH 7,5, jossa 0,1% NaN3).

Entsymaattinen aktiivisuus määritettiin titraamalla alkalimet-risesti pH-arvossa 7,5, kun substraattina oli penisilliini-G K (puhdistamaton). Tätä varten lisättiin kulloinkin 20 ml 2-prosenttista substraattiliuosta 0,05 M Na-fosfaattiliuokseen, pH 7,5, ja titrattiin automaattisesti 37°C:ssa 0,5 M natrium-hydroksidilla. Tulokset on annettu taulukossa I.

Taulukko I

Kantajamateriaali Immobilisoidun PC-amidaasin aktiivisuus

Kem. koostumus (Kauppanimi) Yks./mär- Aktiivi- paino suus- _g_saanto a) Verkostettu agaroosi (Sepharose-CL-4B*) 96 58 b) oktyloitu, verkos- (Octyl-Sepharose- tettu agaroosi CL-4B*) 98 53 c) fenyloitu verkos- (Phenyl-Sepharose- tettu agaroosi CL-4B*) 168 91 d) verkostettu agaroosi, (DEAE-Sepharose- joka substituoitu di- CL-6B*) 84 61 etyyliaminoetyyliryh- mällä (kationinen) s) karboksimetyloitu (CM-Sepharose- verkostettu agaroosi CL-6B*) 94 48 (anioninen) f) fenoksiasetyylisellu- loosa 77 59 g) oksiraani-polyakryyliami-dihartsi (DE 27 22 751, esimerkki 1), joka saa- 172 85 tettu reagoimaan bentsyyli-merkaptaanin kanssa h) polymetakryyli-imidi- (Rohacell WF, vaahto, jauhettu Rohm GmbH) 70 45 18 93124

Taulukko I jatkuu

Kantajamateriaali Immobilisoidun PC-amidaasin aktiivisuus

Kem. koostumus (Kauppanimi) Yks./mär- Aktiivi- paino suus- _g_saanto i) verkostettu polymetyy-limetakrylaattiglyko- lidimetakrylaatti- 35 25 sekapolymerisaatti1), painosuhde 90:10 j) verkostettu polymetyy- limetakrylaattiglykoli- 55 37 dimetakrylaatti-sekapolymerisaatti1) k) verkostettu polymetyy- limetakryalattiglykoli- 43 33 dimetakrylaatti-sekapolymerisaatti1) l) verkostettu, polysty- reeni, jossa 10 % divi- 57 42 nyylibentseeniä1) m) Huokoinen lasi huokos- (Controlled Pore tilavuus 0,75 cm3/g Glass-10) 105 60 keskim. huokoshalkai-sija 17 nm sisäinen pinta-ala 107 m2/g *) Pharmacia AB, Uppsala, Ruotsi, yhtiön tavaramerkit

Valmistusmenetelmä: Sekoitusastiassa lämmitetään 50°C:een liuos, jossa on 1 paino-osa (T) polyvinyylialkoholia ja 320 paino-osaa vettä, ja tähän jaetaan pisaramaisesti sekoittamalla seos, jossa on 100 T monomeerejä (metyylimetakrylaatti + glykolidimetakrylaatti tai styreeni + divinyylibentseeni), 60 T n-heptaania ja 1,4 T dibentsoyyliperoksidia. 4-tuntisen polymerointiajan aikana lämpötila pidetään jäähdyttämällä enintään 75°C:ssa. Tämän jälkeen liuotin tislataan pois tunnin 19 93124 aikana 36°C:ssa. Muodostuneet polymerisaattihelraet erotetaan suodattamalla jäähdyttämisen jälkeen.

Esimerkki 6

Trvpsiinin sitominen fenvvli-sefaroosiin 3,5 g fenyyli-sefaroosia (märkäpaino) esikäsitellään esimerkin 1 mukaisesti. Tämän jälkeen lisätään 150 mg trypsiiniä, joka on liuotettu 6,8 ml:aan 0,5 M kaliumfosfaattipuskuriliuosta (pH 7,5, jossa 0,1 % NaN3), ja ravistellaan 2 tuntia 23°C:ssa. Ionivahvuus on 1,5 mooli/1. Adsorboitu entsyymi kiinnitetään ja jälki käsitellään esimerkin 1 mukaisesti.

Entsymaattinen aktiivisuus määritettiin käyttämällä substraattina kaseiinia ja N-bentsoyyli-l-arginiini-etyyliesteri-hydro-kloridia (BAEE).

Tulokset: kaseiinia vastaa 8,3 yks./märkäpaino-g BAEE:ta vastaan 311 yks./märkäpaino-g

Esimerkki 7

Kantanaan sidottujen laktaasi-preparaattien valmistaminen

Kulloinkin 1 g Aspergillus oryzae-laktaasia (kauppanimi "Lactase-Präparat 2214 C Konz.", Rohm GmbH), jonka aktiivisuus on 30.000 yks./g, liuotetaan 40 ml:aan 0,7 M Na2S04-liuosta, jonka ionivahvuus on 2,1 mooli/1, pH 5,5, ja liuokseen lisätään kulloinkin 10 g taulukossa annettuja kantajahartseja ja ravistellaan 20 tuntia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen lisätään 0,8 ml 25-prosenttista vesipitoista glutaaridialde-hydiliuosta ja ravistellaan 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Preparaatit erotetaan suodattamalla, pestään ja määritetään immobilisoituneen ja suodokseen jääneen entsyymin aktiivisuus ja ilmaistaan prosentteina käytetystä aktiivisuudesta. Tulokset on annettu taulukossa II: 20 93124

Taulukko II

Aktiivisuus immob.lak- jäännös-Kantajamateriaali taasin ak- aktiivi- tiivisuus- suus

Kem. koostumus (kauppanimi) saanto suodok- _%_sessa % a) heikosti emäksinen sty- (Amberlite reeni/divinyylibentseeni- IRA 921) 17,5 0 pohjainen ioninvaihto- hartsi b) makrohuokoinen polyak- (Amberlite ryylihappoesteri-pohjai- XAD 71) 29,5 18 nen adsorptiohartsi c) markohuokoinen fenoli- (Duolite formaldehydi-adsorptio- S 5612) 24,0 5 hartsi, heikosti emäksinen d) makrohuokoinen fenoli- (Duolite formaldehydi-adsorptio- S 5872) 26,0 4 hartsi, heikosti emäksinen e) markohuokoinen fenoli- (Duolite formaldehydi-adsorptio- S 7612) 22,0 6 hartsi, ei-ionillinen f) makrohuokoinen lasi huo- (Controlled kostilavuus 0,75 cm3/g Pore Glass 42,4 8 keskim. huokoshalkaisija CPG 10) 17 nm sisäinen pinta-ala 107 m2/g g) polymetakryyli-imidi- (Rohacell3) 31,0 0 vaahto, jauhettu h) Hydroksyyliapatiitti (emäks. kalsiumfos- - 16,5 5 faatti), jauhettu

Rohm & Haas Co., Philadelphia, USA, yhtiö tavaramerkki 2

Duolite International Co. yhtiön tavaramerkki 3

Rohm GmbH, Darmstadt, yhtiön tavaramerkki

Claims (6)

1. 93124
2. 1. Menetelmä liuenneen valkuaisaineen immobilisoimiseksi vesi-liuoksesta liuokseen suspendoituun kiinteään, makrohuokoiseen, veteen liukenemattomaan kantajaan elektrolyytin läsnäollessa ja valkuaisaineen kiinnittämiseksi kantajaan siihen adsorboituneen valkuaisaineen verkostusta aiheuttavan kytkentäkompo-nentin avulla, joka sisältää kahta tai useampaa valkuaisaineen suhteen reaktiivista funktionaalista ryhmää, tunnettu siitä, että valkuaisaineen vesiliuoksen, jossa elektrolyytin ionivahvuus on vähintään 0,30 mooli/1, annetaan vaikuttaa tämän vesiliuoksen ympäröimään kantajaan kuormituksella, joka on ainakin 20 mg valkuaisainetta kantajan grammaa kohti, kunnes valkuaisaine on adsorboitunut kantajaan ja että valkuaisaineen vesiliuokseen lisätään kytkentäkomponentti adsorboi-tumisen aikana tai sen jälkeen ilman kantajan välikuivausta.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kantajaa, joka ei sisällä kovalenttises-ti sitoutuneita kationisia ryhmiä tai joka sisältää näitä enintään 0,1 milliekvivalentti/g.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kantajaa, jossa on enintään 5 milliekvi-valenttia kovalenttisesti sitoutuneita anionisia ryhmiä grammaa kohti kuiva-ainetta.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kantajaa, joka sisältää enintään 0,1 milliekvivalenttia kovalenttisesti sitoutuneita ionillisia ryhmiä grammaa kohti kuiva-ainetta. 1 Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kantajaa, joka turpoaa vesipitoisissa mediumeissa enintään kaksinkertaiseen tilavuuteen. 93124
6. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantajaa käytetään hienojakoisina hiukkasina, erityisesti helminä. « · 93124