DE4029374A1 - Immobilisierte enzyme - Google Patents

Immobilisierte enzyme

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DE4029374A1
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Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Enzyme, die auf Naturstoffpartikeln von vorwiegend Cellulosecharakter immobilisiert sind und die sich insbesondere für die Anwendung in organischen Medien eignen.
Stand der Technik
Schon frühzeitig wurde erkannt, welche Vorteile eine Träger-Fixierung von Enzymen beim technischen Einsatz mit sich bringt. In erster Linie sind hier die meist problemlose Wiederverwendbarkeit bei gewöhnlich geringerem Aktivitätsverlust, die Gewinnung enzymfreier Umsetzungsprodukte und die Möglichkeit einer kontinuierlichen Verfahrensführung zu nennen. Besonders aktuell ist die Immobilisierung, wenn Enzyme in organischen Medien zur Anwendung kommen sollen (vgl. A. M. Klibanow et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 3192 (1985); Kazandjian et al. Biotechnology and Bioengineering Vol. XXVIII, pp. 417-421 (1986):
Dabei handelt es sich durchweg um teure Enzyme (wie z. B. Lipasen hoher Spezifität, Esterasen, Phospholipasen usw.), deren Wiederverwendbarkeit eine ökonomische Notwendigkeit darstellt. Weiter spielt dabei eine Rolle, daß bei Reaktionen im organischen Medium ein geringer Wassergehalt in der Reaktionszone notwendig ist. Ein Immobilisat erlaubt durch seine meist definierte Wasseraufnahme (überwiegend als "Quellverhalten" zu erfassen) eine genaue Einstellung des notwendigen Wassergehalts.
Die Reaktionen im organischen Medium verlangen im allgemeinen eine möglichst große Grenzfläche zwischen dem organischen Medium, in dem sich das Substrat befindet und dem Enzym. Für solche heterogenen Reaktionsbedingungen bietet ein ausgewählter Träger mit möglichst hoher geometrischer Oberfläche den idealen Reaktionsort. Dagegen sind Enzymträger für homogene Reaktionen bei denen auf eine hohe innere Oberfläche (Porenvolumen) geachtet wird für diesen Reaktionsweg meist ungeeignet. Wie bereits erwähnt, haben sich eine Reihe von Enzymen, insbesondere vom Typ der Hydrolasen, als wirksam im organischen Medium erwiesen.
Möglicherweise lassen sich noch weitere Enzyme bzw. Enzymgruppen erfolgreich im organischen Medium einsetzen. Als paradigmatisch für die technischen Voraussetzungen der vorliegenden Erfindung und die vorliegende Problematik sei im folgenden die Klasse der Lipasen (Glycerinester-Hydrolasen, E. C. 3.1.1.3) angeführt. (Vgl. P. Gramatica in "Chimia oggi" 1989, pg. 9; M. Schneider, E. H. Reimerdes in Forum Mikrobiologie 9/87 pg. 302).
Mittels immobilisierter Lipasen lassen sich im organischen Medium unter geeigneten Bedingungen Umesterungen, Veresterungen, Alkoholysen, Acidolysen und Hydrolysen durchführen. Derartige Reaktionen spielen in der Fettindustrie eine große Rolle. Es handelt sich dabei um ausgereifte technische Verfahren basierend auf eingehend untersuchten chemischen Prozessen.
Für entsprechende biologische Prozesse besteht überwiegend (noch) kein Bedarf, es sei denn, es werden an das Verfahrensprodukt höhere Ansprüche (z. B. Reinheit, Farbe, Stereospezifität u. ä.) gestellt. Zwei Produkte seien stellvertretend für derartige spezielle Enzyme genannt:
  • - Ein auf Ionenaustauscher adsorbierter Mucor mihei-Lipase (LIPOZYME® der Fa. Novo)
  • - Mittels Acetonfällung auf Diatomeen-Erde niedergeschlagene Lipase (vgl. GB-C 15 77 933)
Aufgabe und Lösung
Ein großtechnischer Einsatz von wertvollen Enzymen - wiederum seien als Beispiel Lipasen genannt - durch den sich die etablierten chemischen Verfahren hätten ersetzen lassen, ist bislang stets an den wirtschaftlichen Gegebenheiten - Lipasen sind auch nach der Immobilisierung viel zu teuer - und an den schwierigen Umsetzungsbedingungen - meist handelt es sich um heterogene Systeme - gescheitert. Es kann daher auch nicht überraschen, daß aus den vielerlei Vorschlägen für enzymatische Synthesen bislang kein industrieller Prozeß hervorgegangen ist, zudem das Problem der Wiederverwendung des Enzyms großenteils ungelöst ist. Somit bestand nach wie vor ein Bedarf an wohlfeiler, auf Trägermaterial immobilisierter Lipase.
Es wurde nun gefunden, daß erfindungsgemäß immobilisierte Enzyme den Anforderungen der Technik in besonderem Maße nahekommen.
Die Erfindung betrifft adsorptiv immobilisierte Enzyme E, die auf Enzymträgern ET bestehend aus unmodifizierten Naturstoffpartikeln von vorwiegend Cellulosecharakter wie Holzmehl, Cellulosefasern oder Baumwoll-Linters aufgebracht sind.
Die erfindungsgemäß anzuwendenden Naturstoffpartikel haben in der Regel eine Teilchengröße im Bereich 0,01-1 mm. Im Stand der Technik hatte man zur Fixierung andere Wege eingeschlagen.
Cellulose und Lignin sind nach aufwendiger Modifizierung beispielsweise durch Perjodatoxidation und reduktive Aminierung als reaktive Enzymträger beschrieben worden (vgl. PCT Int. Appl. 81 02 860; Fengxie et al. Biotechnol. Letters Vol. 10, 221 (1988)). Kovalente Enzymbindung an Cellulose wird in sehr allgemeiner Form auch in der GB-A 14 07 488 vorgeschlagen. An Celluloseperlen kovalent gebundene β-Maltase wird z. B. von H. Maeda et al. in Biotechnol. Bioeng. 20, 383 (1978) beschrieben.
Bei den erfindungsgemäßen Enzymträgern ET handelt es sich im Unterschied zum Stand der Technik um nicht chemisch-modifizierte Naturstoffpartikel. Die die Naturstoffpartikel bildenden Fasern sind demnach nicht chemisch-reaktiv.
Die Enzyme (siehe "Die Enzyme" im folgenden) werden vorzugsweise aus wäßrigem Medium auf die Enzymträger ET aufgebracht. Vorteilhafterweise bedient man sich dabei der aus der DE-A 35 15 252 bekannten Methode, d. h. der Kupplung in Gegenwart einer relativ hohen Salzkonzentration, gegebenenfalls auch bei leicht erhöhten Temperaturen. Sulfate und Phosphate, aber auch andere aussalzende Salze sind hierfür am besten geeignet.
Die Anwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Enzyme findet jedoch zweckmäßig im organischen Milieu OM statt, vorzugsweise in Gegenwart von Spuren von Wasser. Als Anhalt seien 0,0004-1 Gew.-% Wasser bezogen auf das organische Milieu angegeben.
Die Enzyme E
Als zu immobilisierende Enzyme E eignen sich industriell anzuwendende Enzyme, insbesondere wenn deren Einsatz in organischem Medium praktikabel ist.
Genannt seien insbesondere die Klassen der Hydrolasen (z. B. E.C.3, insbesondere E.C.3.1., E.C.3.2.1; E.C.3.4) der Isomerasen (z. B. E.C.5, insbesondere E.C.5.3.1), der Oxidoreductasen (E.C.1, insbesondere E.C.1.1; E.C.1.10; E.C.1.11; E.C.1.13) und der Transferasen (E.C.2, insbesondere E.C.2.1; E.C.2.4) (Enzyme Nomenclature, Elsevier Scientific Publishing Company 1973; Kirk-Othmer, Encylopedia of Chemical Technology, 3rd, Ed. Vol. 9, 148 -240, pg. 175-178 ff, 1980). Speziell erwähnt seien beispielsweise die Esterasen (E.C.3.1.1), Proteasen (E.C.3.4.12; E.C.3.4.21; E.C.3.4.22; E.C.3.4.23; E.C.3.4.24) Dehydrogenasen (E.C.1.1.1, 1.1.3), Peroxidasen (E.C.1.11.1) Glycosyltransferasen (E.C.2.4) und insbesondere die Lipasen (E.C.3.1.1.3), die Phospholipasen vom Typ A₂ (E.C.3.1.1.4), B (E.C.3.1.1.5), C (E.C.3.4.3) und D (E.C.3.1.4.4), die Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4), Peroxidase (E.C.1.11.1.6), Lipoxidase (E.C.1.13.11.12) Hexosyltransferasen (E.C.2.4.1) und Pentoxytransferasen (E.C.2.4.2).
Zu den Enzymen sei im einzelnen ausgeführt:
  • A) Lipasen (E.C.3.1.1.3)
    Wie allgemein üblich seien als Lipasen Carboxylesterasen bezeichnet, die normalerweise Glycerinester in wäßriger Emulsion spalten. Sie unterscheiden sich insofern von anderen Carboxylesterasen, die das Substrat in wäßriger Lösung spalten.
    • α) Pankreas-Lipasen
      Der pankreatische Enzymkomplex enthält neben Lipasen meist Esterasen sowie Proteasen und Amylasen als technisch wichtige Begleitenzyme. Das pH-Optimum (gegenüber Olivenöl) liegt im Bereich 7-8,5 der Aktivitätsbereich liegt bei pH 6,5-9,5. Lipasen sind i. a. sehr instabil, insbesondere gegenüber proteolytischem Abbau durch Begleitproteasen.
    • β) Mikrobiologische Lipasen
      z. B. aus Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (z. B. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp. (z. B. P. chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae).
  • Diese Lipasen weisen in der Regel mindestens ein pH-Optimum bei pH<7,0 auf. Lipasen finden, soweit ihre Instabilität dies zuläßt, Verwendung u. a. in der Abfallbeseitigung, Lederindustrie und in der Ernährungsbranche.
    In herkömmlicher Weise wird die Aktivitätsbestimmung von Lipasen mit Olivenöl als Substrat durchgeführt, ferner mit Triacetin und Tributyrin. [Vgl. M. S´m´riva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971); Pharmaceutical Enzymes, edited by. R. Ruyssen and A. Lauwers 1978, (FIP)].
    Soweit die fettspaltende Aktivität in Kilo-Lipase-Units (Einheit = KLCA) ausgedrückt wird, wird unter den Standardbedingungen: 40 Grad C, pH = 5,5 mit Tributyrin als Substrat gearbeitet. (Vgl. M S´m´riva, oben zitierte Literaturstelle).
  • B) Katalasen/Hydroperoxidasen (E.C.1.11.1.6)
    • α) aus tierischem Gewebe z. B. aus Leber
    • β) aus Pflanzen z. B. aus Meerrettich
    • γ) aus Mikroorganismen z. B. aus Micrococcus lysodeicticus
  • Katalasen finden üblicherweise Anwendung zur Peroxid-Bleichung und in der Milchindustrie.
  • C) Proteasen (E.C.3.4; Kirk-Othmer, loc. cit. Vol. 9, K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industrial Aspects of Biochemistry, Vol. 30 (I), pp 23-46, North Holland 1974.)
    • a) tierischen Ursprungs, wie beispielsweise
      • α) Rennin (E.C.3.4.23.4)
      • ) Pankreas-Proteasen
        Pancreatin, insbesondere Trypsin,
        Chymotrypsin (pH-Wirkungsbereich ca. 7-10)
        Pepsin (E.C.3.4.23.1) (pH-Wirkungsbereich ca. 1,5-4,0)
        Kathepsin (E.C.3.4.23.5)
        Wirkungsbereich ca. 4,0-5,0)
    • b) pflanzlichen Ursprungs
      • α) Papain (E.C.3.4.22.1) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-8,0
      • β) Ficin (E.C.3.4.22.3) pH-Wirkungsbereich ca. 4,0-9,0.
      • γ) Bromelain (E.C.3.4.22.4 und 3.4.22.5) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-7,0
    • c) mikrobiellen Ursprungs (vgl. L. Keay in "Process Biochemistry", 1971, 17-21.
      • α) aus Bacillus-Arten wie B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides.
      • β) aus Streptococcus-Arten
      • γ) aus Streptomyces-Arten wie Streptomyces fradiae, S. griseus, S. rectus
      • δ) aus Aspergillus-Arten wie Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usamii
      • ε) aus Mucor- und Rhizopus-Arten wie Mucor pusillus, M. miehei
      • ζ) Endothia-Arten wie Endothia parasitica
      • η) aus Trametes-Arten wie Trametes sanguinea
  • Außer der Unterscheidung nach der Herkunft findet auch die Unterscheidung gemäß dem Angriffsort (Exo-versus Endo-Enzyme) und aufgrund der "Active Site" der Proteasen (Serin-Proteasen, die durch DFP gehemmt werden, Sulfhydryl-Enzyme) Anwendung. Weiter ist von erheblicher praktischer Bedeutung die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität. Man unterscheidet daher vor allem unter praktischen Gesichtspunkten:
    • i) Alkalische Proteasen, mit Wirkungsoptimum etwa im Bereich von pH 7,5 bis 13, insbesondere alikalische Bakterienproteasen (E.C.3.4.21.) (die zumeist dem Serin-typ angehören) und alkal. Pilzproteasen
    • ii) Neutrale Proteasen, mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 6,0-9,0 insbesondere neutrale Bakterienprotease (E.C.3.4.24.) (die zu den Metalloenzymen gehören) und Pilzproteasen, beispielsweise Bacillus-Proteasen, Pseudomonas-Proteasen, Streptomyces-Proteasen, Aspergillus-Proteasen.
    • iii) Saure Proteasen mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 2,0-5,0 (E.C.3.4.23) insbesondere saure Pilzproteasen, z. B. aus Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Mucor spp., und Impex lacteus und Endothitia parasitica
  • Proteasen finden u. a. bei der Lederherstellung, in Waschmitteln und bei der Reinigung, in der Entschlichtung, bei der Käseherstellung, beim Fleischabbau und bei der Stabilisierung von Bier industrielle Anwendung.
    Genannt seien als alkalische Proteasen insbesondere die Subtilisine, alkalische Bakterienproteinasen vom Serin-Typ, die im pH-Bereich 9-10 stabil und gegen Perborat einigermaßen unempfindlich sind. Die proteolytische Wirksamkeit von Enzymen wird gebräuchlicherweise nach der Anson-Haemoglobin-Methode (M. L. Anson J. Gen. Physiol, 22, 79 (1939) bzw. nach der Löhlein-Volhard-Methode (die Löhlein-Volhard′sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität. Gerbereichem. Taschenbuch. Dresden-Leipzig, 1955) als "LVE" (Löhlein-Volhard-Einheit) bestimmt. Unter einer Löhlein-Volhard-Einheit ist diejenige Enzymmenge zu verstehen, die unter den spezifischen Bedingungen der Methode 1, 725 mg Casein verdaut. Weiter werden im folgenden für die Aktivitätsbestimmung der im sauren Bereich wirksamen Enzyme Einheiten verwendet, die aus der Anson-Methode abgeleitet sind. Diese werden als "Proteinase-Units (Haemoglobin)" UHb bezeichnet. Eine UHb entspricht der Enzymmenge, welche die Freisetzung von trichloressigsäure-löslichen Bruchstücken aus Haemoglobin äquivalent 1 µMol Tyrosin pro Minute bei 37°C (gemessen bei 280 nm) katalysiert. (1 mUHb = 10-3 UHb).
  • D) Phospholipasen
    Unter Phospholipasen sei wie üblich die Gruppe von Hydrolasen verstanden, die Phospholipide hydrolytisch spalten und zwar entweder die Carbonsäure-Esterbindung (Phospholipasen A) oder die Phosphorsäure-Esterbindung (Phospholipase C). Lecithinspaltende Phospholipasen werden als Lecithinasen bezeichnet. Die Unterscheidung wird allgemein nach dem Angriffspunkt getroffen. Die Phospholipasen A trennen aus Lecithin (bzw. Kephalin) eine Fettsäure ab, wobei Lysolecithin (bzw. Lysokephalin) zurückbleibt. Phospholipase A₁ spaltet endständige Fettsäuren ab. Phospholipase A₂ (E.C.3.1.1.4) mittelständige, meist ungesättigte, die im Falle von Arachidonsäure zu Protaglandinen metabolisiert werden können.
    Quellen für Phospholipase A₂ sind beispielsweise Pankreas, Insektengifte und Schlangengifte. Die Phospholipase B (E.C.3.1.1.5) spaltet aus Lysolecithin Fettsäure ab unter Bildung von Glycerophosphorsäurechlolinester. Sie kommt z. B. in Kohlehydraten wie Reiskleie, Malz, Getreide, Kartoffeln, Erbsen, sowie in Schimmelpilzen und Wespengift vor.
    Phospholipase C (E.C.3.1.4.3) greift Lecithin unter Bildung von Phosphorylcholin an. Sie kommt beispielsweise in Bacillus cereus, im Gehirn und in Schlangengift vor.
    Die Phospholipase D (E.C.3.1.4.4) macht aus Lecithin Cholin und als weiteres Spaltprodukt Phosphatidsäure frei. Sie kann z. B. aus Streptomyces chromofuscus gewonnen werden. Weitere Vorkommen sind Blattpflanzen wie Kohl, Spinat, Zuckerrübenblätter, Hevea brasiliensis aber auch Getreidekeimlinge, Gerstenmalz usw.
    Im allgemeinen liegt das pH-Optimum bei den Typen C und D bei ca. 8,0, bei den anderen Typen vorwiegend bei pH 5-6. (Vgl. E. A. Dennis, in P. D. Boyer (Ed.) The Enzymes, 3rd Ed. Vol. 16, pp. 307-353 Academic Press 1984; Zur Analytik: vgl. Vurioka & Matsuda, Anal. Biochem. 75, 281 (1976).
Die Enzymträger ET
Die erfindungsgemäßen Enzymträger stellen - wie vorstehend definiert - unmodifizierte Naturstoffpartikel von vorwiegend Cellulosecharakter dar. Unmodifiziert sind sie in dem Sinne, daß sie keine chemische Umwandlung, insbesondere keine irgendwie geartete Aktivierung erfahren haben. Beispielhaft genannt seien insbesondere Holzmehl, Cellulosefasern, Baumwoll-Linters u. ä. Üblicherweise sind die erfindungsgemäß einzusetzenden Enzymträger daher aus Fasern aufgebaut bzw. stellen fasrige Partikel dar. In der Regel weisen die erfindungsgemäß einzusetzenden Naturstoffpartikel eine Partikelgröße von 0,01-1 mm auf (wobei an jede Raumachse zu denken ist, die durch das Einzelpartikel gelegt werden kann).
Der Immobilisierungsvorgang
Die Enzyme werden zweckmäßig aus wäßriger Lösung auf die Enzymträger ET aufgebracht. Als Anhalt sei ein Verhältnis Enzym/Wasser von etwa 1 : (10-20) angegeben. Die wäßrige Lösung kann vorteilhaft noch an sich bekannte Zusätze zu Enzymformulierungen wie Stabilisatoren, Stellmittel wie z. B. Natriumsulfat enthalten. Als Anhalt für den Salzgehalt seien etwa 1/5-1/15 der Wassermenge angegeben. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, zunächst das Enzym in Wasser zu lösen, dann beispielsweise Natriumsulfat zuzugeben und zuletzt die Naturstoffpartikel, beispielsweise in Form von Holzmehl. Man läßt das Enzym über einen gewissen Zeitraum, gewöhnlich ca. 20 Stunden und unter Durchmischung beispielsweise durch Rühren auf den Enzymträger aufziehen, wobei es sich - in Abhängigkeit von den verwendeten Enzymen - öfter empfiehlt, oberhalb Raumtemperatur, beispielsweise bei 40°C zu arbeiten. Schließlich wird abgesaugt und der beladene Enzymträger ET getrocknet.
Das organische Medium OM
Das organische Medium OM ist zweckmäßig den Verfahrenszwecken und -bedingungen angepaßt. Es kann aus den Reaktionspartnern allein bestehen, z. B. im Fall einer Umesterung von Fetten aus dem Fettgemisch selbst. Das Substrat kann aber auch mit organ. Lösungsmitteln verdünnt werden. Bewährt haben sich Kohlenwasserstoffe, insbesondere aliphatische oder cycloaliphatische KW mit 6-18 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Heptan, Isooctan, Hexadecan, Cyclohexan, gegebenenfalls auch Toluol.
Bei Anwendung von Lipasen kommen auch Lösungsmittel vom Ether-Typ wie z. B. Diethylether oder Isopropylether infrage, insbesondere bei Pancreas-Lipasen.
Starke polare und protische organische Lösungsmittel sind dagegen weniger nützlich, was die von anderer Seite beobachtete Tendenz zu abnehmender Enzymaktivität bei steigender Wassermischbarkeit zu bestätigen scheint.
Vorteilhafte Wirkungen
Nach den vorliegenden Erfahrungen erhält man eine sehr befriedigende Beladung der Enzymträger ET mit den Enzymen. Im Falle der Beladung mit einer Lipase fanden sich z. B. im Filtrat des Immobilisats <1% der Ausgangsaktivität wieder, d. h. unter Praxisgesichtspunkten wurde die gesamte eingesetzte Enzymmenge fixiert.
Wie unmittelbar einzusehen eignen sich die erfindungsgemäß an den Enzymträgern ET fixierten Enzyme vorwiegend zum Einsatz im organischen Medium OM, vorteilhaft in Anwesenheit geringer Wassermengen (ca. 0,004-1 Gew.-%). Dadurch kann die Desorption effektiv vermieden werden. Die erfindungsgemäßen Enzymträger sind in der Regel primär zur Anwendung in Batch-Prozessen geeignet, da das sachgerechte Packen von Säulen mit den Enzymträgern ET Schwierigkeiten bereitet.
Die erfindungsgemäß immobilisierten Enzyme sind nach vorliegenden Erfahrungen für die Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen nach Maßgabe ihrer bekannten Aktivitäten voll geeignet.
So lassen sich beispielsweise mit immobilisierten Lipasen in an sich bekannter Weise Umesterungen, Veresterungen, Alkoholysen, Acidolysen und Hydrolysen durchführen. Von besonderem Interesse ist u. a. die Möglichkeit zur selektiven Hydrolyse gegebenenfalls unter Erhalt bzw. Erzeugung optisch aktiver Zentren.
Beispiele A. Immobilisierung von Enzymen A.1. Immobilisierung von Lipasen
250 g Holzmehl (Produkt der Fa. Rettenmeier) mit einer Partikelgröße von ca. 100 µm werden mit 250 g einer Lipase aus Pseudomonas (Aktivität 20 000 LCA/g, Produkt RDEGOMMA 7101 der Fa. Röhm GmbH) in 3750 g Wasser, das 588 g Natriumsulfat enthält, gemischt und bei 40°C 20 Stunden lang gerührt. Bei der Herstellung des Ansatzes hat es sich als zweckmäßig erwiesen, zunächst die Lipasen in Wasser zu lösen, danach das Salz und zuletzt das Holzmehl zuzugeben. Anschließend wird abgesaugt und getrocknet. Aktivität des Immobilisats: 6000 LCA/g Trockengewicht. Im Filtrat des Immobilisats werden <1% der Aktivität wiedergefunden.
B. Anwendung der immobilisierten Enzyme B.1. Umesterung
1 g immobilisierter Lipase (Beispiel A.1.) werden 2 Stunden bei 50°C in einer Mischung aus 0,8 g Tristearin in 40 g Myristinisopropylester gerührt. Der Wassergehalt ist gering: 8,3% im Immobilisat; das Substrat wurde vorher getrocknet.
Nach 2 Stunden ist der Gehalt des Tristearins auf 5% des Ausgangswertes abgesunken. Das entspricht einem Umsatz von 95%. Laut GC-Analyse sind ca. 40% Umesterungsprodukte, wie z. B. Trimyristin, 55% Hydrolyseprodukte wie verschiedene Mono- und Diglyceride.
B.2. Enantioselektive Umesterung
Zu einer schwach gerührten Lösung von 1.11 g 2-0-Benzylglycerin (6,1 mmol) in 20 ml tert.-Butylmethylether (= 0,3 mol/l) gibt man bei Raumtemperatur 2 ml Vinylacetat (1,82 g; 18,2 mmol) und 100 mg immobilisierter Lipase (Beispiel 1) hinzu. Der Verlauf der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie (Cyclohexan/Essigester = 1/1 auf Kieselgel-Platten rf (Diol) = 0,10; rf (Acetat) = 0,32) verfolgt. Bei erstmaliger Anwendung des Enzyms erreicht man nach 6 Stunden vollständigen Umsatz (bei achtmaliger Anwendung steigt die benötigte Reaktionszeit kontinuierlich auf ca. 12 Stunden). Nach beendigter Reaktion filtriert man das Enzym ab, wäscht dieses mit tert.-Butylmethylester und engt die vereinigten Filtrate mit Hilfe eines Rotationsverdampfers ein. Man erhält sehr sauberes (S)-1-Acetyloxy-2-benzyloxy-propan-3-ol als Öl.
(S)-1-Acetyloxy-2-benzyloxy-propan-3-ol:
C₁₂H₁₆O₄ MG: 224,26 g/mol
Drehwerte (c = 2 T = 20°C)
Aus dem Vergleich mit Literaturdrehwerten (Y. Terao, M. Murata, K. Achiwa, T. Nishio, M. Akamtsu, M. Kamimura, Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5173) liegt das Material mit einem Enantiomerenüberschuß (ee) von 86% vor.
Immobilisierung auf Holzmehl A.2. Immobilisierung von Phospholipase A₂
5 g einer Phospholipase A₂ (Lecitase 10 L der Fa. Novo-Nordisk, 10.000 internat. Units/ml 1 internat Unit für Phospholipase A₂ ist definiert als die Enzymmenge, die 1 µmol freie Fettsäure pro Minute aus Lecithin abspaltet) werden in 4000 ml Wasser gelöst, dem nachträglich 400 g Ammoniumsulfat zugesetzt wurden. In diese Lösung werden 250 g Holzmehl "Lignocel C 120" der Fa. Rettermeier mit einer Partikelgröße von ca. 100 µm eingetragen. Die Suspension wird 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt.
Anschließend wird abgesaugt (aber nicht nachgewaschen) und schonend getrocknet (bei 40°C im Vakuumtrockenschrank über Nacht).
Im Filtrat des Immobilisats wird praktisch keine Enzymaktivität wiedergefunden. Der Träger selbst wird auf Aktivität nach der "Eigelbmethode" geprüft (Eigelb als Substrat, 40°C, pH = 8). Er hat 212 internat. Units/g, was einer Aktivitätsausbeute von 30,3% entspricht.
Dieses Enzym ist z. B. zur Lecithinspaltung nach Zusatz von geringen Wassermengen in Öl (z. B. Soja-Rohöl) geeignet.
A.3. Immobilisierung von Glucoseoxidase (GOD)/Katalase
Es wird wie in Beispiel A₂ vorgegangen, nur werden als Enzym 10 ml Glucoseoxidase/Katalase aus Aspergillus einer GOD-Aktivität von 850 Units/ml (1 GOD-Unit/ml ist definiert als Enzymmenge, die pro Minute 1 µmol Gluconsäure freisetzt (37°C, pH = 5.5)) eingesetzt.
Im Filtrat nach Kupplung des Enzyms werden nur Spuren des Enzyms wiedergefunden. Die Aktivität des Trägers betrug 20 Units, was einer Aktivitätsausbeute von 59% entspricht.
Durch seinen Gehalt an Katalase kann der Träger zur Entfernung von H₂O₂ in einer verdünnten Desinfektionslösung verwendet werden. Dazu wird er in einem Fließbett in einer Säule (Fließrichtung von unten nach oben) eingesetzt. Die Zerstörung von H₂O₂ ist an der Bildung von Gasbläschen (Sauerstoff) gut erkennbar.
A.4. Immobilisierung von alkalischer Proteinase auf Cellulosepulver
4 g einer alkalischen Proteinase aus B. licheniformis (Alcalase 2.0 T von Novo Nordisk) werden in 4 l 1 m Phosphatpuffer von pH=8,0 gelöst. Dann werden 400 g Cellulosepulver fein mit einem Schüttvolumen von 3 l/hg (Fa. Rettenmeier) zugesetzt und 1 Std. bei 40°C gerührt. Dann wird die Cellulosepulver-Suspension, ohne zu waschen, abgesaugt und schonend getrocknet (40°C, Vakuumtrockenschrank).
Im Filtrat werden <7% der ursprünglichen Enzymaktivität wiedergefunden. Die Hauptmenge ist am Cellulosepulver adsorbiert (81% des eingesetzten Enzyms).
Gemessen wurde hier in Löhlein-Vollhard-Einheiten (LVE)*.
Alcalase 2.0 T
140 000 LVE/g
0,1%ige Lösung 140 LVE/g
Filtrat nach Kupplung <10 LVE/g (=<7% der Ausgangsaktivität)
Aktivität am Träger 113 LVE/g (=81% Aktivitätsausbeute)
Dieses Enzym ist z. B. für stereospezifische Estersynthesen im organischen Medium geeignet.
A.5. Immobilisierung des Pankreasenzymkomplexes
Es wird wie in Beispiel A₂ vorgegangen, nur werden als Enzym 10 g Pankreasenzyme (Corolase PP Röhm Enzymtechnologie, Leitaktivität 220 000 LVE) eingesetzt.
Im Filtrat nach Kupplung des Enzyms werden nur Spuren des Enzyms wiedergefunden. Die Aktivität des Trägers wurde mit 4000 LVE gemessen, was einer Aktivitätsausbeute von 45% entspricht.
Durch seinen Chymotrypsingehalt (∼10% der Proteinasen) ist dieses immobilisierte Enzym für Estersynthesen im organischen Medium gut geeignet.

Claims (12)

1. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzym auf Enzymträgern ET bestehend aus unmodifizierten Naturstoffpartikeln von vorwiegend Cellulosecharakter adsorptiv immobilisiert sind.
2. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymträger ET ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Holzmehl, Cellulosefasern und Baumwoll-Linters.
3. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Naturstoffpartikel eine Teilchengröße im Bereich 0,01-1 mm besitzen.
4. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäß den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme ausgewählt sind aus der Klasse der Hydrolasen, der Isomerasen, der Oxidoreduktasen und der Transferasen.
5. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Lipasen (E.C.3.1.1.3) darstellen.
6. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Proteasen (E.C.3.4) darstellen.
7. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Katalasen (E.C.1.11.1.6) darstellen.
8. Verfahren zur Herstellung von adsorptiv an festen Enzymträgern ET immobilisierten Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzyme aus wäßrigem Milieu auf unmodifizierte Naturstoffpartikel mit vorwiegend Cellulosecharakter aufziehen läßt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Milieu zu 1/5 bis 1/15 seines Gewichts an Stellsalz enthält.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Stellsalz Natriumsulfat verwendet wird.
11. Verwendung der auf festen Enzymträgern ET adsorptiv immobilisierten Enzyme gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Reaktionsmedium ein organisches Medium OM verwendet wird.
12. Verwendung der auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierten Enzyme, gemäß den Ansprüchen 1, 5 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine enantioselektive Umesterung durchführt.
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