NL9101531A - Op vaste enzymdragers adsorptief geimmobiliseerde enzymen, alsmede de toepassing daarvan. - Google Patents

Op vaste enzymdragers adsorptief geimmobiliseerde enzymen, alsmede de toepassing daarvan. Download PDF

Info

Publication number
NL9101531A
NL9101531A NL9101531A NL9101531A NL9101531A NL 9101531 A NL9101531 A NL 9101531A NL 9101531 A NL9101531 A NL 9101531A NL 9101531 A NL9101531 A NL 9101531A NL 9101531 A NL9101531 A NL 9101531A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
enzymes
immobilized
enzyme carriers
enzyme
solid enzyme
Prior art date
Application number
NL9101531A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Roehm Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roehm Gmbh filed Critical Roehm Gmbh
Publication of NL9101531A publication Critical patent/NL9101531A/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen, alsmede de toepassing daarvan.
Gebied van de uitvinding
De uitvinding heeft betrekking op enzymen, die op deeltjes natuurlijke stof van hoofdzakelijk cellulosekarakter geïmmobiliseerd zijn en die in het bijzonder voor de toepassing in organische milieus geschikt zijn.
Stand der techniek
Reeds vroegtijdig werd ingezien, welke voordelen een fixering op een drager van enzymen bij de technische toepassing met zich meebrengt. Op de eerste plaats zijn hier de meest probleemloze opnieuw-toepasbaarheid bij gewoonlijk gering verlies aan activiteit, de winning van enzymvrije omzettingsprodukten en de mogelijkheid van een continue uitvoering van de werkwijze te noemen. Bijzonder actueel is de immobili-sering, wanneer enzymen in organische milieus voor de toepassing in aanmerking moeten komen (vgl. A.M. Klibanow et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 3192 (19δ5); Kazandjian et al. Biotechnology and
Bioengineering Vol. XXVIII, blz. bY]-h21 (1986).
Daarbij gaat het doorgaans om dure enzymen (zoals b.v. lipasen met een hoge specificiteit, esterasen, fosfolipasen enz.), waarvan de opnieuw-toepasbaarheid een economische noodzaak is. Verder speelt daarbij een rol, dat bij reacties in organisch milieu een gering watergehalte in de reactiezone noodzakelijk is. Een immobilisaat veroorlooft door zijn zeer gedefinieerde wateropname (overwegend als "zwelgedrag" op te vatten) een nauwkeurige instelling van het noodzakelijke watergehalte.
De reacties in het organische milieu verlangen in het algemeen een zo groot mogelijk grensvlak tussen het organische milieu, waarin het substraat zich bevindt, en het enzym. Voor dergelijke heterogene reactie-omstandigheden biedt een uitgekozen drager met een zo hoog mogelijk geometrisch oppervlak de ideale reactieplaats. Daarentegen zijn enzymdragers voor homogene reacties waarbij op een groot inwendig oppervlak (poriënvolume) gelet wordt, voor deze reactieweg meestal niet geschikt. Zoals reeds vermeld is een reeks van enzymen, in het bijzonder van het type van de hydrolasen, in een organisch milieu werkzaam gebleken.
Mogelijkerwijze kunnen nog verdere enzymen resp. enzymgroepen met succes in een organisch milieu worden toegepast. Als paradigmatisch voor de technische eisen van de onderhavige uitvinding en de onderhavige problematiek wordt onderstaand de klasse van de lipasen (glycerolester-hydrolasen, E.C. 3-1-1 *3) weergegeven. (Vgl. P. Gramatica in "Chimia oggi" 1989, blz. 9; M. Schneider, E.H. Reimerdes in Forum Mikrobiologie 9/87, blz. 302).
Met behulp van geïmmobiliseerde lipasen kunnen in een organisch milieu onder geschikte omstandigheden heresteringen, veresteringen, alcoholyses, acidolyses en hydrolyses worden uitgevoerd. Dergelijke reacties spelen in de vetindustrie een grote rol. Het gaat daarbij om uitgerijpte technische werkwijzen, gebaseerd op uitvoerig onderzochte chemische processen.
Voor overeenkomstige biologische processen bestaat overwegend (noch) geen behoefte, zij het dan, dat aan het produkt van de werkwijze hogere eisen (b.v. zuiverheid, kleur, stereospecificiteit en dergelijke) gesteld worden. Twee produkten worden als plaatsvervanger voor dergelijke speciale enzymen genoemd:
Een op ionenuitwisselaar geadsorbeerde Mucor mihei-lipase (LIPOZYMeW Van de firma Novo)
Met behulp van acetonprecipitatie op diatomeeënaarde neergeslagen lipase (vgl. Brits octrooischrift 1.577*933)·
Doelstelling en oplossing
Een toepassing op groottechnische schaal van waardevolle enzymen - wederom worden als voorbeeld lipasen genoemd - waardoor de gevestigde chemische werkwijzen vervangen hadden kunnen worden, is tot dusverre steeds aan de economische gegevens - lipasen zijn ook na de immobilise-ring veel te kostbaar - en aan de moelijke omzettingsomstandigheden-meestal gaat het om heterogene systemen - mislukt. Het kan derhalve ook niet verrassend zijn, dat uit de vele voorstellen voor enzymatische synthesen tot dusverre geen industrieel proces naar voren gekomen is, waarbij het probleem van het hergebruik van het enzym grotendeels onopgelost is. Derhalve bestond zoals tevoren een behoefte aan een goedkoop, op dragermateriaal geïmmobiliseerd lipase.
Gevonden werd nu, dat volgens de uitvinding geïmmobiliseerde enzymen aan de eisen van de techniek in bijzondere mate voldoen.
De uitvinding heeft betrekking op adsorptief geïmmobiliseerde enzymen E, die op enzymdragers ED, bestaande uit niet-gemodificeerde deeltjes natuurlijke stof met overwegend cellulosekarakter zoals houtmeel, cellulosevezels of katoen-1inters aangebracht zijn.
De volgens de uitvinding toe te passen deeltjes natuurlijke stof hebben als regel een deeltjesgrootte in het traject van 0,01 - 1 mm. In de stand der techniek heeft men voor het fixeren andere wegen ingeslagen.
Cellulose en lignine zijn na kostbare modificering bijvoorbeeld door perjodaatoxidatie en reductieve aminering als reactieve enzym-dragers beschreven (vgl. de internationale octrooiaanvrage PCT 81.02.860; Fengxie et al. Biotechnol. Letters Vol. 10, 221 (1988)). Covalente enzymbinding aan cellulose wordt in zeer algemene vorm ook in de Britse octrooiaanvrage 1.407.488 voorgesteld. Aan parels van cellulose covalent gebonden β-maltase wordt b.v. door H. Maeda et al. in Biotechnol. Bioeng. 20, 383 (1978) beschreven.
Bij de enzymdragers ED volgens de uitvinding gaat het in tegenstelling tot de stand der techniek om niet chemisch-gemodificeerde deeltjes natuurlijke stof. De vezels, die de deeltjes natuurlijke stof vormen, zijn derhalve niet chemisch reactief.
De enzymen (zie "de enzymen" in het onderstaande) worden bij voorkeur uit een water bevattend milieu op de enzymdrager ED aangebracht, Bijvoorbeeld bedient men zich daarbij van de uit het DE-A-3.5i5.252 bekende methode, dat wil zeggen de koppeling bij aanwezigheid van een relatief hoge zoutconcentratie, eventueel ook bij licht verhoogde temperaturen. Sulfaten en fosfaten, maar ook andere uitzoutende zouten zijn hiervoor het best geschikt.
De toepassing van de geïmmobiliseerde enzymen volgens de uitvinding vindt echter bij voorkeur in organisch milieu OM plaats, bij voorkeur bij aanwezigheid van sporen water. Als richtlijn wordt 0,0004 - 1 gew.% water, betrokken op het organische milieu, aangegeven.
De enzymen E
Als te immobiliseren enzymen E zijn op industriële schaal toe te passen enzymen geschikt, in het bijzonder wanneer de toepassing daarvan in organisch milieu praktisch is.
Genoemd worden in het bijzonder de klassen van de hydrolasen (b.v. E.C.3, in het bijzonder E.C.3.I., E.C.3.2.I.; E.C.3.4.) van de isomerasen (b.v. E.C.5, in het bijzonder E.C.5.3·!)» van de oxido-reductasen (E.C.l, in het bijzonder E.C.1.1; E.C.1.10; E.C.1.11; E.C.l.13) en van de transferasen (E.C.2, in het bijzonder E.C.2.1; E.C.2.4) (Enzyme Nomenclature, Elsevier Scientific Publishing Company 1973» Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd. Ed. Vol. 9, 148 - 240, biz. 175-178 e.v., I98O). Speciaal genoemd worden bijvoor- beeld de esterasen (E.C.3.1.1.), proteasen (E.C.3.4.12; E.C.3.4.21; E.C.3-4.22; E.C.3*4.23; E.C.3.4.24) dehydrogenasen (E.C.1.1.1, 1.1.3). peroxidasen (E.C.1.11.1) glycosyltransferasen (E.C.2.4) en in het bijzonder de lipasen (E.C.3.1.1.3), de fosfolipasen van het type A2 (E.C.3.1.1.4), B (E.C.3.1.1.5), C (E.C.3-1.4.3) en D (E.C.3.1.4.4), het glucoseoxidase (E.C.1.1.3·4), peroxidase (E.C.1.11.1.6), lipoxidase (E.C.I.13.11.12), hexosyltransferasen E.C.2.4.1) en pentoxytransferasen (E.C.2.4.2).
Met betrekking tot de enzymen worden in het bijzonder genoemd: A) Lipasen (E.C.3.1.1.3)
Zoals algemeen gebruikelijk worden als lipasen carboxyl-esterasen aangeduid, die gewoonlijk glycerolesters in waterige emulsie afsplitsen.
Ze onderscheiden zich in zoverre van andere carboxyl-esterasen, die het substraat in een oplossing in water afsplitsen.
а) Pancreas-lipasen
Het pancreatische enzymcomplex bevat naast lipasen meestal esterasen, alsmede proteasen en amylasen als technische belangrijke begeleidende enzymen. De optimale pH (ten opzichte van olijfolie) ligt in het traject 7 “ 8.5. het activiteitstraject ligt bij PH 6,5 - 9,5.
Lipasen zijn in het algemeen zeer instabiel, in het bijzonder ten opzichte van proteolytische afbraak door begeleidende proteasen.
б) Microbiologische lipasen b.v. uit Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (b.v.
A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp.
(b.v. chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp.
(R. nigricans, R. oryzae).
Deze lipasen bezitten als regel ten minste een pH-optimum bij pH >7,0. Lipasen worden, voorzover hun instabiliteit dit toelaat, onder andere toegepast bij de verwijdering van afval, de lederindustrie en in de voedingsbranche.
Op gebruikelijke wijze wordt de bepaling van de activiteit van lipasen met olijfolie als substraat uitgevoerd, verder met triacetine en tributyrine. [Vgl. M. Sémériva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971);
Pharmaceutical Enzymes, uitgegeven door R. Ruyssen and A. Lauwers 1978, (FIP)].
Voorzover de vet-afsplitsende activiteit in kilo-lipase-units (eenheid = KLCA) wordt uitgedrukt, wordt onder de standaardomstandigheden: 40°C, pH = 5.5 met tributyrine als substraat gewerkt.
(Vgl. M. Sémériva, bovengenoemde literatuurplaats).
B) Katalasen/hydroperoxidasen (E.C.1.11.1.6) a) uit dierlijk weefsel b.v. uit lever β) uit planten b.v. uit mierikswortel ƒ) uit micro-organismen b.v. uit micrococcus lysodeicticus Katalasen worden gewoonlijk gebruikt voor de peroxide-bleking en in de melkindustrie.
C) Proteasen (E.C.3.Kirk-Othmer, loc.cit. Vol. % K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industrial Aspects of Biochemistry, Vol. 20 (I), biz. 23-46, North Holland (1974) a) dierlijke herkomst, zoals bijvoorbeeld a) rennine (E.C.3.4.23.4) β) Pancreas-proteasen
Pancreatine, in het bijzonder trypsine, chymotrypsine (pH-werkingstraject ongeveer 7 - 10)
Pepsine (E.C.3.4.23.1) pH-werkingstraject ongeveer 1,5 - 4,0)
Kathepsine (E.C.3-4.23.5)
Werkingstraject ongeveer 4,0 - 5.0.
b) plantaardige herkomst a) Papaine (E.C.3.4.22.1) pH-werkingstraject ongeveer 5.0 - 8,0 β) Ficine (E.C.3.4.22.3) pH-werkingstraject ongeveer 4,0-9.0 ƒ) Bromelaine (E.C.3-4.22.4 en 3.4.22.5) pH-werkingstraject ongeveer 5.0 - 7.0 c) microbiële herkomst (vgl. L. Keay in "Process Biochemistry", 1971. 17 - 21.
α) uit Bacillus-soorten zoals B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus.
B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides.
β) uit Streptococcus-soorten ƒ) uit Streptomyces-soorten zoals Streptomyces fradiae, S. griseus, S. rectus q) uit Aspergillus-soorten zoals Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usamii e) uit Mucor- en Rhizopus-soorten zoals Mucor pusillus, M. miehei Ύ ) Endothia-soorten r zoals Endothia parasitica μ) uit Trametes-soorten zoals Trametes sanguinea
Naast het onderscheid naar de herkomst vindt ook het onderscheid volgens het aangrijpingspunt (exo-versus endo-enzym) en op grond van de "active site" van de proteasen (serine-proteasen, die door DFP geremd worden, sulfhydryl-enzym) toepassing.
Verder is van aanzienlijk praktisch belang de afhankelijkheid van de pH van de enzymactiviteit. Men onderscheidt daarom op de eerste plaats onder praktische gezichtspunten i) Alkalische proteasen, met een werkingsoptimum ongeveer in het traject van pH 7*5 tot 13, in het bijzonder alkalische bacterie-proteasen (E.C.3.4.21) (die meestal tot het serine-type behoren) en alkalische s chimmelproteasen ii) Neutrale proteasen, met een werkingsoptimum in het traject van pH 6,0 - 9,0 in het bijzonder neutrale bacterie-proteasen (E.C.3.4.24) (die tot de metallo-enzymen behoren) en schimmelproteasen, bijvoorbeeld Bacillus-proteasen, Pseudomonas-proteasen,
Streptomyces-proteasen, Aspergillus-proteasen.
iii) Zure proteasen met een werkingsoptimum in het traject van pH 2,0 - 5,0 (E.C.3.4.23) in het bijzonder zure schimmelproteasen, b.v. uit Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp.,
Mucor spp., en Impex lacteus en Endothitia parasitica.
Proteasen worden onder andere bij de lederbereiding, in wasmiddelen en bij de reinging, bij het ontslichten, bij de kaasbereiding, bij vleesopbouw en bij het stabiliseren van bier op industriële schaal toegepast.
Genoemd worden als alkalische proteasen in het bijzonder de subtilisinen, alkalische bacterie-proteinasen van het serine-type, die in het pH-traject 9 " 10 stabiel en tegen perboraat enigszins ongevoelig zijn.
De proteolytische werkzaamheid van enzymen wordt op de gebruikelijke wijze volgens de Anson-Haemoglobine-methode (M.L. Anson J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939) resp. volgens de Löhlein-Volhard-methode (de Löhlein-Volhard'sche methode voor het bepalen van de proteolytische activiteit. Gerbereichem. Taschenbuch, Dresden-Leipzig, 1955) als "LVE" (Löhlein-Volhard-eenheid) bepaald.
Onder een Löhlein-Volhard-eenheid moet die hoeveelheid enzym worden verstaan, die onder de specifieke omstandigheden volgens de methode 1,725 mg caseïne verteert. Voorts worden onderstaand voor de bepaling van de activiteit van de in het zure traject werkzame enzymen eenheden toegepast, die uit de Anson-methode zijn afgeleid. Deze worden als "Proteinase-Units (Haemoglobin)” aangeduid. Een UHb komt overeen met de hoeveelheid enzym, welke het vrijmaken van in trichloorazijnzuur oplosbare breukstukken uit haemoglobine equivalent aan 1 pmol tyrosine per minuut bij 37°C (gemeten bij 280 nm) katalyseert.
(1 mUHb = 10”3 UHb).
D) Fosfolipasen
Onder fosfolipasen wordt zoals gebruikelijk de groep van hydro-lasen verstaan, die fosfolipiden hydrolytisch splitsen en wel hetzij de carbonzuur-esterbinding (fosfolipasen A en B) hetzij de fosforzuur-esterbinding (Fosfolipasen C en D). Lecithine-afsplitsende fosfolipasen worden ook als lecithinasen aangeduid.
Het onderscheid wordt algemeen volgens het aangrijpingspunt .genomen. De fosfolipasen A scheiden uit lecithine (resp. kefaline) een vetzuur af, waarbij lysolecithine (resp. lysokefaline) achterblijft. Fosfolipase A^ splitst eindstandige vetzuren af. Fosfolipase A2 (E.0.3.1.1.4) middenstandige, meestal onverzadigde, die in het geval van arachidonzuur tot prostaglandinen gemetaboliseerd kunnen worden.
Bronnen voor fosfolipase A2 zijn bijvoorbeeld pancreas, insectengiffen en slangengiffen. Het fosfolipase B (Ε.0.3·1·1·5) splitst uit lysolecithine vetzuur af onder vorming van glycerolfosforzuurcholine-ester. Deze komt b.v.in koolhydraten, zoals rijstzemelen, mout, graan, aardappelen, erwten alsmede in schimmelfungi en wespengif voor.
Fosfolipase C (E.C.3.1.4.3·) grijpt lecithine onder vorming van fosforylcholine aan. Deze komt bijvoorbeeld in Bacillus cereus, hersenen en in slangengif voor.
Het fosfolipase D (E.C.3-1-4.4.) maakt uit lecithine choline en als verder splitsingsprodukt fosfatidezuur vrij. Het kan b.v. uit Streptomyces chromofuscus gewonnen worden. Verder komen ze voor in bladplanten, zoals kool, spinazie, suikerbietbladeren, Hevea brasiliensis maar ook in rijstkiemlingen, gerstemout enz.
In het algemeen ligt het pH-optimum bij de typen C en D bij ongeveer 8,0, bij de andere typen hoofdzakelijk bij pH 5 " 6.
(Vgl. E.A. Dennis, in P.D. Boyer (Ed.) The Enzymes, 3rd Ed.
Vol. 16, pp. 307 - 353 Academic Press 1984;
Voor de analyse: vgl. Vurioka & Matsuda, Anal. Biochem. 75, 281 (1976).)
De enzymdrager ED
De enzymdragers volgens de uitvinding zijn, zoals bovenstaand gedefinieerd - niet gemodificeerde deeltjes natuurlijke stof met hoofdzakelijk een cellulosekarakter. Niet gemodificeerd zijn ze in die zin, dat ze geen chemische omzetting, in het bijzonder geen enkel- soortige activering hebben ondergaan. Bijvoorbeeld worden in het bijzonder genoemd houtmeel, cellulosevezels, katoen-linters en dergelijke. Gewoonlijk zijn de volgens de uitvinding te gebruiken enzymdragers derhalve uit vezels opgebouwd resp. zijn ze vezelvormige deeltjes. Als regel bezitten de volgens de uitvinding te gebuiken deeltjes van natuurlijke stof een deeltjesgrootte van 0,01 - 1 mm (waarbij aan elke ruimte-as te denken is, die door het afzonderlijke deeltje kan worden gelegd).
Het immobiliseringsproces
De enzymen worden bij voorkeur uit een oplossing in water op de enzymdrager ED aangebracht. Als richtsnoer wordt een verhouding enzym/water van ongeveer 1:(10-20) aangegeven. De oplossing in water kan met voordeel nog op zich bekende toevoegsels aan de enzymformuleringen, zoals stabiliseermiddelen, stelmiddelen, zoals b.v. natriumsulfaat, bevatten. Als richtsnoer voor het zoutgehalte wordt ongeveer 1/5 - 1/15 van de hoeveelheid water aangegeven. Het is doelmatig gebleken, eerst het enzym in water op te lossen, dan bijvoorbeeld natriumsulfaat toe te voegen en ten laatste de deeltjes natuurlijke stof, bijvoorbeeld in de vorm van houtmeel. Men laat het enzym gedurende een bepaalde tijdsperiode, gewoonlijk ongeveer 20 uur en onder dooreenmengen bijvoorbeeld door roeren op de enzymdrager optrekken, waarbij het - afhankelijk van de gebruikte enzymen - vaker wordt aanbevolen, boven kamertemperatuur, bijvoorbeeld bij 40°C te werken. Tenslotte wordt afgezogen en wordt de beladen enzymdrager ED gedroogd.
Het organische milieu OM
Het organische milieu OM is bij voorkeur aan de werkwijzedoel-einden en -omstandigheden aangepast. Het kan uit alleen de reactie-componenten bestaan, b.v. in het geval van een verestering van vetten uit het vetmengsel zelf. Het substraat kan echter ook met organische oplosmiddelen verdund worden. Goed gebleken zijn koolwaterstoffen, in het bijzonder alifatische of cycloalifatische koolwaterstoffen met 6 - 18 koolstofatomen, zoals b.v. heptaan, isoöctaan, hexadecaan, cyclohexaan, eventueel ook tolueen. Bij toepassing van lipasen komen ook oplosmiddelen van het ether-type, zoals b.v. diethylether of isopropyl-ether, in aanmerking, in het bijzonder bij pancreas-lipasen.
Sterk polaire en protonische organische oplosmiddelen zijn daarentegen minder nuttig, hetgeen de van de andere kant waargenomen tendens tot een afnemende enzymactiviteit bij stijgende mengbaarheid met water schijnt te bevestigen.
Voordelige werkingen
Volgens de onderhavige ervaringen verkrijgt men een zeer bevredigende belading van de enzymdrager ED met de enzymen. In het geval van de belading met een lipase werden b.v. in het filtraat van het geïmmobiliseerde produkt <1% van de aanvangsactiviteit weer gevonden, d.w.z. vanuit het oogpunt van de praktijk werd de totale toegepaste hoeveelheid enzym gefixeerd.
Zoals onmiddellijk is in te zien, zijn de volgens de uitvinding aan de enzymdragers ED gefixeerde enzymen hoofdzakelijk geschikt voor toepassing in het organische milieu OM, met voordeel bij aanwezigheid van geringe hoeveelheden water (ongeveer 0,004 - 1 gew.%). Daardoor kan de desorptie effectief worden vermeden. De enzymdragers volgens de uitvinding zijn als regel primair voor de toepassing in batch-processen geschikt, aangezien het doelmatig pakken van kolommen met de enzymdragers ED moeilijkheden geeft.
De volgens de uitvinding geïmmobiliseerde enzymen zijn volgens de onderhavige ervaringen voor het uitvoeren van enzymatisch gekatalyseerde reacties naar de mate van hun bekende activiteiten volledig geschikt.
Zo kunnen bijvoorbeeld met geïmmobiliseerde lipasen op op zich bekende wijze heresteringen, veresteringen, alcoholyses, acidolyses en hydrolyses worden uitgevoerd. Van bijzonder belang is onder andere de mogelijkheid voor de selectieve hydrolyse eventueel onder verkrijging resp. produktie van optisch actieve centra.
VOORBEELDEN
A. Immobilisering van enzymen A. l Immobilisering van lipasen 25Ο g houtmeel (produkt van de firma Rettenmeier) met een deeltjesgrootte van ongeveer 100 pm wordt met 250 g van een lipase uit Pseudomonas (activiteit 20.000 LCA/g, produkt ^DEGOMMA 7101 van de firma Rohm GmbH) in 3·750 g water, dat 588 g natriumsulfaat bevat, gemengd en bij 40°C 20 uur lang geroerd. Bij de bereiding van het mengsel is het doelmatig gebleken, eerst de lipasen in water op te lossen, vervolgens het zout en ten laatste het houtmeel toe te voegen. Aansluitend wordt afgezogen en gedroogd. Activiteit van het geïmmobiliseerde produkt: 6.000 LCA/g droog gewicht. In het filtraat van het geïmmobiliseerde produkt wordt <1# van de activiteit teruggevonden.
B. Toepassing van de geïmmobiliseerde enzymen B.1 Heres tering 1 g geïmmobiliseerd lipase (voorbeeld A.l) wordt 2 uur bij 50°C in een mengsel van 0,8 g tristearine in 40 g myristineisopropylester geroerd. Het watergehalte is gering: 8,3# in het geïmmobiliseerde produkt; het substraat werd tevoren gedroogd.
Na 2 uur is het gehalte van het tristearine tot 5# van de uitgangswaarde gedaald. Dit komt overeen met een omzetting van 95#· Volgens GC-analyse zijn ongeveer 40# heresteringsprodukten, zoals b.v. trimyristine, 55# hydrolyseprodukten, zoals verschillende mono- en diglyceriden.
B.2 Enantionselectieve herestering
Bij een licht geroerde oplossing van 1,11 g 2-0-benzylglycerol (6,1 mmol) in 20 ml tert-butylmethylether (= 0,3 mol/1) voegt men bij kamertemperatuur 2 ml vinyl acetaat (1,82 g; 18,2 mmol) en 100 mg geïmmobiliseerd lipase (voorbeeld I) toe. Het verloop van de reactie wordt door dunne-1aag-chromatografie (cyclohexaan/ethylacetaat = 1/1 op kiezelgel-platen, r^ (diol) = 0,10; r^ (acetaat) = 0,32) gevolgd. Bij de eerste toepassing van het enzym bereikt men na 6 uur volledige omzetting (bij een achtmalige toepassing stijgt de benodigde reactietijd continu tot ongeveer 12 uur). Na beëindiging van de reactie filtreert men het enzym af, wast dit met tert-butylmethylester en concentreert de verenigde filtraten met behulp van een rotatieverdamper. Men verkrijgt zeer zuiver (S)-l-acetyloxy-2-benzyloxy-propaan-3-ol als olie.
(S)-l-Acetyloxy-2-benzyloxy-propaan-3-ol ^12^16^4 molecuulgewicht: 224,26 g/mol Rotatiewaarden (c = 2 T = 20°C) CHCI3 Ethanol [a] Ca] 589 nm -17.3° +12,2° 578 nm -18,1° +12,7° 546 nm -20,3° +14,6° 436 nm -34,6° +25,1° 365 nm -54,1“ +39,6°
Uit de vergelijking met de rotatiewaarden uit de literatuur (Y. Terao, M. Murata, K. Achiwa, T. Nishio, M. Akamtsu, M. Kamimura, Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5173) is het materiaal met een overmaat enantiomeer (ee) van 86# aanwezig.
Immomobilisering op houtmeel A.2. Immobilisering van fosfolipase A2 5 g van een fosfolipase A2 (lecitase 10 L van de firma Novo-Nordisk, 10.000 internat, units/ml [1 internat, unit voor fosfolipase A2 is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym, die 1 pmol vrij vétzuur per minuut uit lecithine afsplitst]) wordt in 4.000 ml water opgelost, waaraan naderhand 400 g ammoniumsulfaat werd toegevoegd. In deze oplossing wordt 250 g houtmeel "Lignocel C 120" van de firma Rettermeier met een deeltjesgrootte van ongeveer 100 pm gebracht.
De suspensie wordt 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
Aansluitend wordt afgezogen (maar niet nagewassen) en mild gedroogd (bij 40°C in een vacuüm-droogkast gedurende een nacht).
In het filtraat van het geïmmobiliseerde produkt wordt praktisch geen enzymactiviteit teruggevonden. De drager zelf wordt op activiteit volgens de "eigeelmethode" beproefd (eigeel als substraat, 40°C, pH = 8). Deze bezit 212 internat, units/g. hetgeen met een acitiviteits-opbrengst van 30.3 % overeenkomt.
Dit enzym is b.v. voor de lecithinesplitsing na toevoeging van geringe hoeveelheden water in olie (b.v. ruwe soja-olie) geschikt.
A.3 Immobilisering van glucoseoxidase (GOD) / katalase
Er wordt zoals in voorbeeld A£ te werk gegaan, slechts wordt als enzym 10 ml glucoseoxidase/katalase uit Aspergillus met een G0D-activiteit van 850 units/ml toegepast (1 GOD-unit/ml is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym, die per minuut 1 pmol gluconzuur vrijmaakt. (37°C, PH = 5.5))·
In het filtraat worden na koppeling van het enzym slechts sporen van het enzym teruggevonden. De activiteit van de drager bedroeg 20 units, hetgeen met een activiteitsopbrengst van 59% overeenkomt.
Door het gehalte ervan aan katalase kan de drager voor het verwijderen van H2O2 in een verdunde desinfectie-oplossing worden toegepast. Daarvoor wordt deze in een gefluïdiseerd bed in een kolom (stromingsrichting van onderen naar boven) toegepast. De vernietiging van H2O2 is aan de vorming van gasbellen (zuurstof) goed te herkennen.
A.4 Immobilisering van alkalische proteinase op cellulosepoeder.
4 g van een alkalisch proteinase van B. licheniformis (Alcalase 2,0 T van Novo Nordisk) wordt in 4 1 1 m fosfaatbuffer met een pH = 8,0 opgelost. Vervolgens wordt 400 g cellulosepoeder fijn met een stortvolume van 3 1/hg (firma Rettenmeier) toegevoegd en 1 uur bij 40°C geroerd. Vervolgens wordt de cellulosepoeder-suspensie zonder te wassen afgezogen en mild gedroogd (40°C, vacuüm-droogkast).
In het filtraat wordt <7% van de oorspronkelijke enzymactiviteit teruggevonden. De voornaamste hoeveelheid is aan het cellulosepoeder geadsorbeerd (8l% van het toegepaste enzym).
Gemeten werd hier in Löhlein-Vollhard-eenheden (LVE)*.
Alcalase 2,0 T ... 140.000 LVE/g 0,1 procents oplossing ... 140 LVE/g
Filtraat na koppeling ... <10 LVE/g ( = <7% van de uitgangs- activiteit)
Activiteit aan de drager ... 113 LVE/g ( = Sl% opbrengst van activiteit)
Dit enzym is bijvoorbeeld voor stereo-specifieke estersyntheses in organisch milieu geschikt.
A.5 Immobilisering van het pancreas-enzymcomplex
Er wordt zoals in voorbeeld A£ te werk gegaan, maar als enzym wordt 10 g pancreas-enzym (Corolase PP Röhm enzymtechnologie, Leid-aktiviteit 220.000 LVE) toegepast.
In het filtraat na koppeling van het enzym worden slechts sporen van het enzym teruggevonden. De activiteit van de drager werd met 4.000 LVE gemeten, hetgeen met een acitiviteitsopbrengst van 45# overeenkomt.
Door het chymotrypsinegehalte ervan (~10# van de proteïnasen) is dit geïmmobiliseerde enzym voor estersyntheses in het organische milieu goed geschikt.

Claims (12)

1. Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen, gekenmerkt. doordat de enzymen op enzymdragers ED, bestaande uit niet-gemodificeerde deeltjes natuurlijke stof met hoofdzakelijk cellulose-karakter adsorptief geïmmobiliseerd zijn.
2. Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat de enzymdragers ED gekozen zijn uit de groep, bestaande uit houtmeel, cellulosevezels en katoen-linters.
3. Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de deeltjes natuurlijke stof een deeltjesgrootte in het traject van 0,01 - 1 mm bezitten.
4. Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen volgens de conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de enzymen gekozen zijn uit de klasse van de hydrolasen, de isomerasen, de oxidoreduktasen en de transferasen.
5. Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de enzymen lipasen (E.C.3.1.1.3) zijn.
6. Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de enzymen proteasen (E.C.3-4.) zijn.
7. Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de enzymen katalasen (E.C.1.11.1.6) zijn.
8. Werkwijze voor de bereiding van adsorptief aan vaste enzymdragers ED geïmmobiliseerde enzymen, met het kenmerk, dat men de enzymen uit een water bevattend milieu op niet gemodificeerde deeltjes natuurlijke stof met overwegend cellulosekarakter laat optrekken.
9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het water bevattende milieu voor 1/5 tot 1/15 van het gewicht ervan aan stelzout bevat.
10. Werkwijze volgens conclusie 9» met het kenmerk, dat als stelzout natriumsulfaat wordt toegepast.
11. Toepassing van de op vaste enzymdragers ED adsorptief geïmmobiliseerde enzymen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als reactiemilieu een organisch milieu OM wordt toegepast.
12. Toepassing van de op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen volgens de conclusies 1, 5 en H* met het kenmerk, dat men een enantio-selectieve herestering uitvoert.
NL9101531A 1990-09-15 1991-09-10 Op vaste enzymdragers adsorptief geimmobiliseerde enzymen, alsmede de toepassing daarvan. NL9101531A (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4029374A DE4029374A1 (de) 1990-09-15 1990-09-15 Immobilisierte enzyme
DE4029374 1990-09-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL9101531A true NL9101531A (nl) 1992-04-01

Family

ID=6414368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL9101531A NL9101531A (nl) 1990-09-15 1991-09-10 Op vaste enzymdragers adsorptief geimmobiliseerde enzymen, alsmede de toepassing daarvan.

Country Status (6)

Country Link
CH (1) CH682401A5 (nl)
DE (1) DE4029374A1 (nl)
DK (1) DK159891A (nl)
FR (1) FR2666812B1 (nl)
IT (1) IT1250017B (nl)
NL (1) NL9101531A (nl)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2739109B1 (fr) * 1995-09-26 1997-12-12 Thor Sarl Produit et procede pour le traitement modificateur de l'etat de surface et/ou de la teinte d'articles textiles
ITMI20011238A1 (it) * 2001-06-12 2002-12-12 Bartholdy Consultadoria E Serv Polimeri polisaccaridici di origine naturale coniugati chimicamente asostanze farmacologicamente o biologicamente attive e loro proprieta'
US9481879B2 (en) 2012-06-26 2016-11-01 Avent, Inc. Preparation of stabilized catalase enzymes with a surfactant
US9487759B2 (en) * 2013-02-26 2016-11-08 Avent, Inc. Preparation of stabilized catalase enzymes using polyvinyl alcohol

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3515252C2 (de) * 1985-04-27 1994-02-24 Roehm Gmbh Verfahren zur Immobilisierung gelöster Eiweißstoffe

Also Published As

Publication number Publication date
FR2666812A1 (fr) 1992-03-20
ITTO910697A1 (it) 1993-03-13
ITTO910697A0 (it) 1991-09-13
DE4029374A1 (de) 1992-03-19
DK159891D0 (da) 1991-09-13
IT1250017B (it) 1995-03-30
FR2666812B1 (fr) 1994-09-02
CH682401A5 (de) 1993-09-15
DK159891A (da) 1992-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hiol et al. Purification and characterization of an extracellular lipase from a thermophilic Rhizopus oryzae strain isolated from palm fruit
Diaz et al. Lipase from the thermotolerant fungus Rhizopus homothallicus is more thermostable when produced using solid state fermentation than liquid fermentation procedures
Saxena et al. Purification and characterization of an alkaline thermostable lipase from Aspergillus carneus
Chen et al. General aspects and optimization of enantioselective biocatalysis in organic solvents: The use of lipases [new synthetic methods (76)]
Pimentel et al. Lipase from a Brazilian strain of Penicillium citrinum
WO1990009446A1 (en) Cutinase
de Almeida et al. Biochemical properties of free and immobilized Candida viswanathii lipase on octyl-agarose support: hydrolysis of triacylglycerol and soy lecithin
Brahimi-Horn et al. The esterase profile of a lipase from Candida cylindracea
AU3075697A (en) Enzymatic process for the manufacture of ascorbic acid, 2-keto-l-gulonic acid and esters of 2-keto-l-gulonic acid
Meghji et al. Production, purification, and properties of extracellular carboxyl esterases from Bacillus subtilis NRRL 365
Mase et al. Purification and characterization of Penicillium roqueforti IAM 7268 lipase
Rashid et al. Chitosan-alginate immobilized lipase based catalytic constructs: Development, characterization and potential applications
Dimitrijevic et al. Production of lipase from Pseudozyma aphidis and determination of the activity and stability of the crude lipase preparation in polar organic solvents
Sakai et al. Purification and characterization of an esterase involved in poly (vinyl alcohol) degradation by Pseudomonas vesicularis PD
Long et al. Mycelium‐bound lipase from a locally isolated strain of Aspergillus flavus link: Pattern and factors involved in its production
Aruna et al. Proteases: An overview on its recent industrial developments and current scenario in the revolution of biocatalysis
Sugihara et al. Purification and characterization of a lipase from Pichia burtonii
Fadıloğlu et al. Lipase production by Rhizopus oryzae growing on different carbon and nitrogen sources
Dosanjh et al. Biochemical analysis of a native and proteolytic fragment of a high-molecular-weight thermostable lipase from a mesophilic Bacillus sp.
NL9101531A (nl) Op vaste enzymdragers adsorptief geimmobiliseerde enzymen, alsmede de toepassing daarvan.
Politino et al. Purification and characterization of a cephalosporin esterase from Rhodosporidium toruloides
Garske et al. Industrial enzymes and biocatalysis
Habu et al. Enhanced production of cellobiose dehydrogenase in cultures of Phanerochaete chrysosporium supplemented with bovine calf serum
Lin et al. Purification and characterization of a lipase from Neurospora sp. TT-241
Neidleman Applications of biocatalysis to biotechnology

Legal Events

Date Code Title Description
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
BC A request for examination has been filed
BV The patent application has lapsed