ITMI20011238A1

ITMI20011238A1 - Polimeri polisaccaridici di origine naturale coniugati chimicamente asostanze farmacologicamente o biologicamente attive e loro proprieta'

Info

Publication number: ITMI20011238A1
Application number: IT2001MI001238A
Authority: IT
Inventors: Ivo Volpato; Bernard Emile Bizzini; Roberto Carlos Abreu; Marco Lippmann
Original assignee: Bartholdy Consultadoria E Serv
Priority date: 2001-06-12
Filing date: 2001-06-12
Publication date: 2002-12-12
Also published as: ITMI20011238A0; EP1399192B1; US20040219217A1; DE60223371D1; EP1399192A1; DE60223371T2; WO2002100440A1; ES2296967T3; ATE377430T1

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

“Polimeri polisaccaridici di origine naturale coniugati chimicamente a sostanze farmacologicamente o biologicamente attive, loro sintesi e loro proprietà.”

CAMPO DELL’ INVENZIONE

La presente invenzione concerne l’uso di fibre di polimeri polisaccaridici di origine naturale, preferibilmente di origine vegetale, quali per esempio cellulosa o cotone, oppure l’uso di filati, “tessuti-nontessuti” (“non-woven fabrics” o feltri), o tessuti ottenuti da suddette fibre per l’ottenimento di prodotti farmaceutici, cosmetici o igienici, oppure di prodotti per l’uso nell’industria alimentare. In particolare, i polimeri polisaccaridici secondo l’invenzione possono essere impiegati nell’ottenimento di cerotti, garze, cotone idrofilo sanitario, tamponi vaginali e chirurgici, fasce, guanti, calze, mascherine e simili. Inoltre, i polimeri polisaccaridici secondo l’invenzione possono essere impiegati per l’ottenimento di tessuti, filtri oppure involucri impiegati nel campo dell’industria alimentare.

TECNICA ANTERIORE

Fibre di polimeri polisaccaridici di origine naturale, preferìbilmente di origine vegetale, quali per esempio cellulosa o cotone, oppure filati, “tessuti-nontessuti” (“non-woven fabrics” o feltri), o tessuti ottenuti da suddette fibre vengono impiegati in medicina, nelle auto-medicazioni oppure nel campo dei prodotti igienici o cosmetici con funzioni prettamente meccaniche o di supporto. Lo stesso vale per il settore dell'industria alimentare dove p.e. tessuti di cotone vengono utilizzati per filtrare formaggi o per produrre insaccati (salumi).

In genere, nel campo delle medicina, le sostanze farmacologicamente o biologicamente attive, in forma di polveri, pomate, unguenti, vengono applicate sul corpo, in particolare sul sito tissutale da trattare, dopodiché viene applicato il supporto di cotone come semplice mezzo di copertura e protezione.

A volte, allorché la sostanza medicamentosa è solubile, come nel caso dei disinfettanti, la stessa viene spruzzata sul cotone idrofilo che viene poi sfregato sulla cute per l'applicazione.

Invece, nel campo dell’industria alimentare, le fibre o i filati e simili impiegati vengono sterilizzati prima del loro impiego mediante trattamento con disinfettanti oppure a vapore, a raggi UV ecc.

In alcuni casi però, queste modalità procedurali non rappresentano affatto un buon rimedio.

E’ il caso, ad esempio:

a. Delle piaghe, piaghe da decubito, delle ferite:

I farmaci che si applicano in questi casi (antibatterici, antiinfiammatori, antibiotici, ecc.) sono in genere costituiti da pomate, gels, unguenti, polveri o spray, ossia non dal solo principio attivo puro, ma da composizioni farmaceutiche (comprendenti eccipienti quali p.e. coadiuvanti, conservanti e simili) ottimizzate per la desiderata applicazione sul sito che si intende trattare.

Malgrado la loro indiscussa facilità di applicazione, è però ampiamente risaputo che, ad esempio, pomate, gels e unguenti, per via della spesso ridotta biodisponibilità dei principi attivi in essi contenuti ritardano la cicatrizzazione, mentre le polveri possono provocare la formazione di granulomi, mentre gli spray non sempre garantiscono un corretto apporto di medicamento nel sito leso. Quindi, l’impiego di eccipienti farmaceutici, malgrado siano selezionati sotto l’aspetto della massima compatibilità con i tessuti del paziente, può comunque comportare svantaggi non trascurabili.

b. Della disinfezione delle zone cutanee:

I disinfettanti, in genere solubili, con cui si imbevono i cotoni idrofili non rimangono a lungo e consistentemente nella zona di applicazione, si eliminano per dilavaggio, e quindi non garantiscono una buona efficacia. c. In tutti i casi, in cui le garze o bende utilizzate a protezione di zone lese, ferite, infiammazioni ed erosioni cutanee, tendono, con il tempo, ad accumulare polvere e, potenzialmente materiale infetto e rappresentano un sostanziale rischio se non frequentemente sostituite o non correttamente manipolate (sterilmente).

d. Anche nei prodotti protettivi come guanti e similari che possono avere lo stesso problema; ad esempio, possono accumulare materiale allergizzante, infetto o altro.

e. Di tamponi vaginali per mestruazioni che possono avere una efficacia parziale a causa dell’imbibimento eritrocitario e piastrinico delia superficie esterna che potrebbe impedire l’adsorbimento da parte degli strati interni.

f. Nell'uso degli assorbenti igienici, che può presentare lo stesso problema.

g. Infine, anche dei filati o tessuti utilizzati nel campo dell’industria alimentare, per esempio per la filtrazione dei formaggi, ma anche per l’insaccamento dei salumi, che possono avere lo stesso problema; ad esempio, malgrado la sterilizzazione iniziale, possono poi accumulare materiale non-sterile.

Uno scopo delle presente invenzione è quindi la messa a disposizione di prodotti farmaceutici (in particolare medicinali ed articoli medici), igienici o cosmetici che non dimostrino suddetti svantaggi e che garantiscano l’ottimale apporto di principio attivo al sito leso. Tali prodotti farmaceutici (in particolare medicinali ed articoli medici), igienici o cosmetici porterebbero quindi non solo ad un notevole risparmio di principio attivo, ma soprattutto ad un sensibile incremento dell’efficacia della cura.

In particolare, un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di cerotti, garze, cotone idrofilo, fasce e simili applicabili direttamente sul sito da curare e privi degli usuali eccipienti farmaceutici potenzialmente svantaggiosi, contenuti nelle composizioni come sopra . Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di cerotti, garze, cotone idrofilo, fasce e simili applicabili direttamente sul sito da curare senza che si verifichi un fenomeno di dilavaggio di principio attivo.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di cerotti, garze, cotone idrofilo, fasce e simili applicabili direttamente sul sito da curare che non siano suscettibili alla accumulazione di materiale infettivo o allergenico.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa disposizione di tamponi chirurigici ad elevata efficacia.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di articoli igienici quali p.e. tamponi vaginali o fasce igieniche di elevato potere assorbente.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di articoli cosmetici la cui applicazione sulla cute non è laboriosa e/o non provoca nessun sconforto.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di capi in filati anti-allergenici.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di filati, tessuti, “tessuti-nontessuti” e simili adibiti all’uso nell’ambito dell’industria alimentare che non siano suscettibili alla accumulazione di materiale non-sterile e che quindi contribuiscano alla conservazione prolungata dell’alimento ottenuto tramite il loro uso.

SOMMARIO

Questi scopi ed ulteriori scopi che meglio appariranno qui di seguito vengono raggiunti dall’invenzione in oggetto mediante la messa a disposizione di polimeri polisaccaridici di origine naturale, preferìbilmente di origine vegetale, coniugati chimicamente a sostanze farmacologicamente o biologicamente attive. In particolare, le fibre costituite da polimeri polisaccaridici secondo l’invenzione possono essere utilizzate per l’ottenimento per “tessuti-nontessuti” (“non-woven fabrics" o feltri) oppure di filati o di tessuti che possono essere utilizzati nella fabbricazione di medicinali, di articoli medicinali, cosmetici o igienici, oppure nella fabbricazione di filtri, tessuti oppure involucri impiegati nel campo dell’industria alimentare. Il coniugamento chimico tra i polimeri polisaccaridici di origine naturale, preferibilmente vegetale, e le sostanze farmacologicamente o biologicamente attive può avvenire in qualsiasi fase di lavorazione, ossia utilizzando come substrato le sole fibre naturali oppure eventuali “tessuti-nontessuti”, filati o tessuti ottenuti a valle da tali fibre.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione è la messa a disposizione di un metodo per l’ottenimento di un polimero polisaccaridico secondo l’invenzione oppure di fibre, filati, tessuti o “tessuti-nontessuti" secondo l’invenzione, comprendente le seguenti fasi:

(a) la creazione, sulle fibre di polimero polisaccaridico, oppure sui filati, tessuti o “tessuti-nontessuti” ottenute da esse, di siti adatti alla coniugazione chimica, ottenendo un polimero polisaccaridico attivato, e (b) la reazione tra il polimero polisaccaridico attivato e tra una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva o di un derivato di essa sotto la formazione di un coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico attivato e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, e, opzionalmente,

(c) la modifica, mediante reazione chimica, della natura della coniugazione chimica stabilita, nelle fasi (a) e (b), tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’ INVENZIONE

I polimeri polisaccaridi secondo l’invenzione sono costituiti da polimeri polisaccaridici di origine naturale coniugati chimicamente a sostanze farmacologicamente o biologicamente attive. Sono particolarmente preferiti i polimeri polisaccaridici di origine vegetale.

Il polimero polisaccaridico di origine naturale utilizzato dalla presente invenzione deve essere sostanzialmente non-biodegradablie al sito di applicazione terapeutica (oppure nell’ambito del suo uso in campo alimentare) ed essere preferibilmente facilmente reperibile, di costo contenuto, facilmente sterilizzabile, non-suscettibile alla depolimerizzazione quando sottoposto alle reazioni di coniugamento chimico e soprattutto deve costituire fibre macroscopiche facilmente lavorabili. Un esempio preferito per un polimero polisaccaridico di origine naturale è un polimero polisaccaridico di origine vegetale, per esempio la cellulosa, ossia il poli-D-glucosio in cui le unità di D-glucosio sono unite mediante legami β-glucosidici fra il carbonio anomerico di una molecola e il gruppo OH del C-4 di un’altra. Una forma particolarmente preferita delia cellulosa ai sensi dell'invenzione è il cotone. Una ulteriore forma preferita della cellulosa secondo l’invenzione è la cosiddetta “cellulosa ricostituita” o viscosa.

Le sostanze farmacologicamente o biologicamente attive ai sensi della presente invenzione da coniugare al polimero polisaccaridico di origine naturale possono essere di diversa natura e struttura chimica in funzione dei parametri biochimici funzionali o esogeni coinvolti nella patologia e che è necessario neutralizzare o riequilibrare per ottenere l’effetto profilattico o terapeutico. A solo titolo di esempio, e senza esclusione di ulteriori proprietà di valore terapeutico o preventivo, le sostanze farmacologicamente o biologicamente attive possono esibire proprietà antibatterica, antiinfiammatoria, antibiotica, antimicotica, fungistatica, disinfettante, antiemorragica, antisettica, immunostimolante, antitraumatica, antiallergica, cicatrizzante, riepitalizzante, anti-eritemica, anti-dermatopatica, antiscottatura, anestetica, anticoagulante, coagulante, anti-varicosa, anti-flebitica, anti-aggregante piastrinica, fibrinolitica, lipolitica, anti-rughe oppure anti-invecchiamento.

Per quanto riguarda la natura della sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, l’unica limitazione imposta dalla presente invenzione è che essa sia coniugabile chimicamente ad un polimero polisaccaridico di origine naturale.

Tra le sostanze farmacologicamente o biologicamente attive come sopra, sono particolarmente preferite quelle caratterizzate dalla presenza di almeno un gruppo amminico, carbossilico, tiolico o carbonilico.

Anche sostanze farmacologicamente o biologicamente attive note, ma prive di gruppi amminici, carbossilici, tiolici o carbonilici possono essere utilizzate nell’ambito della forma di esecuzione preferita dell'invenzione come sopra, qualora tali sostanze siano derivatizziabili mediante l’introduzione di uno questi gruppi (p.e. l’ossidazione di un gruppo idrossilico alcolico a dare un gruppo carbonilico o carbossilico) senza perdita oppure senza sostanziale diminuzione dell’attività farmacologica o biologica, ossia a dare una ulteriore sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva. Esempi preferiti ma non esclusivi di sostanze farmacologicamente o biologicamente attive coniugabili, direttamente o previa derivatizzazione, a polimeri polisaccaridici di origine naturale, preferibilmente vegetale, sono i seguenti: 4-idrossibenzaldeide, glutaraldeide, sulfadiazina, sulfadimetossina, bacitracina, gramicidina, ketanserina, procaina, nistatina, fattore di crescita epidermico (EGF), dermatan solfato (condroitin solfato B - Sigma C 4259), F Vili (fattore piasmatico anti-emofilico), proteine e glicoproteine immunostimolanti, fibrinogeno o suoi prodotti di degradazione, cosidetti “FDP”, eparina (preferibilmente a basso peso molecolare), protrombina, naproxen, dicolofenac, lipasi, immunoglobuline (IgG), acido ialuronico, collagenasi, i corticosteroidi o elastina. Tra gli corticosteroidi particolarmente preferito è il cortisolo (“idrocortisone”). Tra le proteine immunomostimolanti viene particolarmente preferita la frazione immunomodulatrice da Corynebacterium granulosum. Esempi preferiti ma non esclusivi di sostanze farmacologicamente o biologicamente attive coniugate a polimeri polisaccaridici di origine vegetale sono riportati nelle parti sperimentali della presente domanda.

La coniugazione chimica secondo l'invenzione consiste nella connessione della sostanza farmacologicamente oppure biologicamente attiva al polimero polisaccaridico mediante la generazione di uno o più legami chimici tra di essi. Tale connessione può consistere nella formazione di un solo legame chimico (unico, doppio o triplo), direttamente tra un sito del polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, oppure la connessione può consistere nell’inserzione -tra un sito del polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente attiva- di un solo atomo bivalente oppure di un frammento almeno bivalente costituito da più atomi, cosiddetto “linker”, che è legato d’una parte al sito del polimero polisaccaridico, e dall’altra parte alla sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva. In una forma preferita dell’invenzione, la connessione consiste nella formazione di una catena di più linkers di loro volta legati tra di loro, il primo termine della catena di linkers essendo legato ad un sito sul polimero polisaccaridico ed il secondo termine della catena di linkers essendo legato alla sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.

In una forma di esecuzione dell’invenzione particolarmente preferita, la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva comprende linkers trivalenti che permettono la coniugazione di un sito del polimero polisaccaridico a due molecole di sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva. Il termine linker, come utilizzato nell’ambito della presente invenzione comprende sia singoli atomi bivalenti come ad esempio -S-, sia interi gruppi almeno bivalenti come ad esempio il seguente frammento lisilico:

-NH-CH2-(CH2)3-CH(COOH)-NH-che viene introdotto nei polimeri polisaccaridici secondo l’invenzione mediante la reazione con l’amminoacido lisina. Ulteriori linkers preferiti dalla presente invenzione sono l’acido aspartico e l’acido glutamico. Un'ulteriore linker preferito nell’ambito della presente invenzione è la cisteina. Un’ulteriore linker preferito delia presente invenzione è la tiotreonina, ossia una treonina in cui il gruppo OH è stato rimpiazzato con un gruppo SH. A seconda delle necessità specifiche, in alcuni casi preferiti, la lisina e la cisteina (come anche l’acido aspartico, l’acido glutamico ed anche la tio-treonina) possono costituire anche linkers trivalenti. Per semplicità di terminologia, nell’ambito della presente invenzione, il termine “linker” designa sia la sostanza dalla quale deriva formalmente l’atomo oppure il frammento incorporato (p.e. “H2S’’ nel caso di -S-) oppure il reagente che viene utilizzato per stabilire o modificare una coniugazione chimica (p.e. la lisina), sia il frammento bio plurivalente che costituisce poi parte della coniugazione chimica cosi ottenuta (p.e. il frammento lisilico bivalente come sopra).

La natura dei legami chimici presenti nella coniugazione tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva (compresi -oltre a quelli formati durante la formazione dalla coniugazione chimica- anche quelli già presenti nei linkers) può essere diversa a seconda o meno che la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva coniugata, per estrinsecare la sua efficacia, debba essere rilasciata oppure possa rimanere legata al polimero stesso. Quando è desiderato il rilascio, si sceglie una coniugazione chimica che sia biodegradabile a contatto con il corpo del paziente, ossia una coniugazione chimica che contenga almeno un legame suscettibile a rottura sotto condizioni d'impiego. Invece, quando non è desiderato il rilascio, si sceglie una coniugazione chimica che non sia biodegradabile a contatto con il corpo del paziente, ossia una coniugazione chimica i cui legami siano stabili sotto condizioni d'impiego.

In una forma esecutiva dell’invenzione particolarmente preferita, la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e tra la sostanza biologicamente o farmacologicamente attiva comprende uno o più dei seguenti legami scelti indipendentemente dai gruppo consistente del legame imminico, del legame amminico secondario, del legame singolo tra due atomi di azoto, del legame doppio tra due atomi di azoto del legame peptidico e del legame disolfurico. La biodegradabilità relativa di questi legami dipende dall’ambiente al quale essi vengono esposti, p.e. dalla presenza di enzimi, agenti riduttivi, ecc. Per esempio, neH’ambito della presente invenzione, si è trovato che il legame amminico secondario costituisce un legame sostanzialmente non-biodegradabile al contatto con la cute.

In una forma esecutiva dell’invenzione particolarmente preferita, la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva comprende un linker cisteinilico o lisilico, ossia ottenuto da cisteina o lisina.

In una forma esecutiva dell’invenzione particolarmente preferita, la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva comprende un linker ottenuto da acido glutamico o aspartico.

In una forma esecutiva dell'invenzione particolarmente preferita, la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva comprende un linker ottenuto da tio-treonina.

In una forma esecutiva preferita della presente invenzione, la coniugazione chimica tra la sostanza farmacologicamente oppure biologicamente attiva (oppure di un derivato di essa) e tra il polimero polisaccaridico è situata su un atomo di carbonio del polimero polisaccaridico che (prima del coniugamento) è portatore di un gruppo OH alcolico primario o secondario.

In una ulteriore forma esecutiva preferita, la coniugazione chimica tra la sostanza farmacologicamente oppure biologicamente attiva (oppure di un derivato di essa) e tra il polimero polisaccaridico è localizzata su un atomo di carbonio del polimero polisaccaridico che (prima del coniugamento) è portatore di un gruppo OH alcolico secondario.

Per quanto riguarda la sintesi di coniugazione tra il polimero polisaccaridico di origine naturale, preferibilmente vegetale, e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, essa prevede (a) la creazione, sul polimero polisaccaridico, di siti adatti alla coniugazione chimica ottenendo un polimero polisaccaridico attivato, e

(b) la reazione tra il polimero polisaccaridico attivato e tra una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva o di un derivato di essa sotto la formazione di un coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico attivato e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, e, opzionalmente,

Secondo un forma di esecuzione preferita dell’invenzione, la creazione di siti adatti alla coniugazione chimica sul polimero polisaccaridico avviene mediante la modifica di almeno alcuni dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico, ottenendo un polimero polisaccaridico attivato. Esempi preferiti per polimeri polisaccaridici attivati sono polimeri polisaccaridici in cui almeno alcuni degli atomi di carbonio del polimero polisaccaridico portanti, inizialmente, gruppi OH alcolici primari o secondari, vengono modificati -direttamente sui carboni suddetti o previa inserzione di linkers intermedi- in modo da consentire la formazione di un legame chimico con una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, oppure con un ulteriore linker o con un gruppo d’uscita.

Un gruppo d’uscita è un gruppo che può essere rimpiazzato, in una reazione susseguente, con un altro gruppo.

Con riferimento alia fase (c) sopra, vengono preferite le modifiche che sono adatte a modulare (ossia ad aumentare o diminuire) la biodegradabilità della coniugazione chimica, come per esempio la riduzione di un legame amminico di una base di Schiff a dare la corrispondente ammina secondaria.

Un ulteriore metodo di sintesi preferito secondo l’invenzione prevede che la fase (a) come sopra comprende di sua volta le seguenti fasi:

(a1 ) l’ossidazione, oppure la sostituzione di almeno alcuni dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico ottenendo un primo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente,

(a2) la reazione tra il primo polimero polisaccaridico attivato e tra un primo linker oppure un primo gruppo d'uscita, ottenendo un secondo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente,

(a3) la modifica, mediante reazione chimica, della natura della coniugazione chimica stabilita, nelle fasi (al) e (a2), tra il primo polimero polisaccaridico attivato ed il linker oppure tra il primo polimero polisaccaridico attivato ed il gruppo d’uscita ottenendo un terzo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente,

(a4) la reazione tra il secondo o, rispettivamente, terzo polimero polisaccaridico attivato ottenuto secondo la fase (a2), o, rispettivamente, fase (a3), e tra un secondo linker oppure un secondo gruppo d’uscita, ottenendo un terzo oppure, rispettivamente, quarto polimero polisaccaridico attivato in cui il primo linker è stato esteso con il secondo linker oppure in cui il gruppo d'uscita è stato rimpiazzato dal secondo gruppo d’uscita oppure dal secondo linker, e, opzionalmente,

(a4+n) ulteriori ripetizioni della fase (a4) per l’ottenimento di ulteriori polimeri polisaccaridici attivati.

Con riferimento alla fase (al) sopra, l'ossidazione può consistere nella creazione di gruppi aldeidici e/o chetonici dai gruppi OH alcolici primari e/o secondari presenti sul polimero polisaccaridico. È comunque importante che le condizioni scelte siano abbastanza blande da non distruggere la catena polimerica. In una forma di esecuzione preferita, l’ossidazione viene effettuata con metaperiodato e comporta l’ossidazione stereoselettiva dei gruppi OH alcolici secondari che formano il diolo vicinale sull’anello di glucosio.

Con riferimento alla fase (a3) sopra, vengono preferite le modifiche che sono adatte a modulare (ossia ad aumentare o diminuire) la biodegradabilità della coniugazione chimica, come per esempio la riduzione di un legame amminico di una base di Schifi a dare la corrispondente ammina secondaria.

(al) l’esterificazione dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico con acido glutamico o acido aspartico, ottenendo un primo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente,

(a2) la reazione tra il primo polimero polisaccaridico attivato e tra un linker oppure un gruppo d’uscita, ottenendo un secondo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente

(a2+n) ulteriori ripetizioni della fase (a2) per l’ottenimento di ulteriori polimeri polisaccaridici attivati.

Con riferimento alla fase (al) sopra, a seconda delle condizioni/concentrazioni scelte, l’esterificazione può essere parziale oppure comportare sia il gruppo OH alcolico primario che quelli secondari, fino ad arrivare ad una esterificazione quantitativa.

Esempi specifici di metodi di sintesi preferiti secondo l’invenzione sono i seguenti:

Metodo A:

(a) l'ossidazione dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico sotto ottenimento di un polimero polisaccaridico attivato comprendente dei gruppi aldeidici, e

(b) la formazione della base di Schiff tra i gruppi aldeidici del polimero polisaccaridico attivato e tra una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva oppure un derivato di essa comprendente almeno un gruppo amminico, e, opzionalmente,

(с) la riduzione della base di Schiff come sopra, sotto ottenimento della corrispondente ammina secondaria.

Il prodotto ottenuto secondo il Metodo A(b), è un esempio di una sostanza secondo l'invenzione in cui la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva consiste in un solo legame doppio, ossia quello imminico.

Il prodotto ottenuto secondo il Metodo A(c), è un esempio di una sostanza secondo l’invenzione in cui la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva consiste in un solo legame singolo, ossia quello amminico secondario.

Metodo B:

(al) l’ossidazione almeno parziale dei gruppi OH alcolici i presenti sul polimero polisaccaridico sotto ottenimento di un primo polimero polisaccaridico attivato comprendente dei gruppi aldeidici, e

(a2) la reazione tra il primo polimero polisaccaridico attivato comprendente gruppi aldeidici e tra lisina , portando all’ ottenimento di un secondo polimero polisaccaridico attivato che costituisce la base di Schiff formata tra il primo polimero polisaccaridico attivato ed uno dei gruppi amminici della lisina, e,

opzionalmente,

(аз) la riduzione del secondo polimero polisaccaridico attivato, sotto ottenimento del terzo polimero polisaccaridico in cui il gruppo imminico presente nella base di Schifi è stato ridotto alla corrispondente ammina secondaria, e,

(b) la formazione della base di Schifi tra un gruppo carbonilico presente in una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva oppure in un derivato di essa, e tra il rimanente gruppo amminico del linker lisilico, e, opzionalmente,

(c) la riduzione della base di Schifi come sopra.

I prodotti ottenuti secondo i metodi B(b) e B(c) sono esempi di sostanze secondo l’invenzione in cui la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva viene stabilita tramite il linker lisina, che in questo caso è un linker bivalente. Mentre nel metodo B come sopra, la lisina si lega al polimero polisaccaridico attivato secondo due orientamenti diversi (ossia mediante il suo gruppo α-amminico o ε-amminico) generando un prodotto “misto", in fase (a2) è anche possibile introdurre un linker lisilico in cui p.e. la posizione α-amminica è opportunamente protetta di maniera da rendere possibile la reazione del polimero polisaccaridico attivato con la sola posizione ε-amminica del linker lisilico, generando, dopo la deprotezione, un prodotto omogeneo.

Il linker lisina è particolarmente preferito nel’ambito della presente invenzione, in quanto può reagire non solo con sostanze farmacologicamente o biologicamente attive comprendenti dei gruppi carbonilici (ossia aldeidici oppure chetonici), ma -sotto formazione di legami peptidici- anche con sostanze farmacologicamente o biologicamente attive aventi gruppi amminici o carbossilici.

Nel particolare caso in cui le sostanze farmacologicamente o biologicamente attive sono costituite da peptidi, la lisina, può diventare un linker trivalente mettendo a disposizione contemporaneamente il suo secondo termine amminico (a oppure ε) e quello carbossilico, entrambi rimasti ancora liberi dopo la reazione del primo termine amminico (ε oppure a, rispettivamente) con il polimero polisaccaridico attivato. Cosi, tramite l’uso della lisina come linker, diventa possibile coniugare ad un determinato sito sul polimero polisaccaridico attivato due equivalenti di sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.

Naturalmente, il linker lisilico può anche essere prolungato (per esempio mediante addizione di ulteriori aminoacidi, in analogia alla sintesi di polipeptidi su fase solida secondo Merrifield) prima di stabilire il legame (oppure i legami)) con la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.

Metodo C:

(al) la sulfonesterizzazione almeno parziale dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico mediante reazione con tosilcloruro oppure mesil-cloruro ottenendo un primo polimero polisaccaridico attivato, e

(a2) lo scambio dei gruppi tosilici o mesilici presenti sul primo polimero polisaccaridico attivato con gruppi SH, ottenendo un secondo polimero polisaccaridico attivato comprendente dei gruppi tiolici, e (a3) la reazione del secondo polimero polisaccaridico attivato comprendente gruppi tiolici con cistina, ottenendo un terzo polimero poi isacca ridico attivato comprendente dei residui cisteinilici connesi al secondo polimero polisaccaridico mediante legami disolfurici, e

(b) la formazione della base di Schifi tra un gruppo carbonilico presente in una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva oppure in un derivato di essa, tra il gruppo amminico del residuo cisteinilico.

Il prodotto ottenuto secondo il metodo C(b) è un esempio di una sostanza secondo l’invenzione in cui la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva viene stabilita tramite due linker, ossia il linker -S-ed il linker cisteina.

Il linker cisteina è particolarmente preferito nei metodi della presente invenzione in quanto, oltre alle possibilità della formazione di legami peptidici al suo termine carbossilico e amminico, rispettivamente, come descritte sopra nel’ambito della lisina, la cisteina, con sostanze esibenti un gruppo tiolico, può anche reagire come gruppo d’uscita come illustrato in prosieguo:

Metodo D:

(al) la sulfonesterizzazione almeno parziale dei gruppi OH alcolici (primari e secondari) presenti sul polimero polisaccaridico mediante reazione con tosil-cloruro oppure mesil-cloruro ottenendo un primo polimero polisaccaridico attivato, e

(a2) lo scambio dei gruppi tosilici o mesilici presenti sul primo polimero polisaccaridico attivato con gruppi SH, ottenendo un secondo polimero polisaccaridico attivato comprendente dei gruppi tiolici, e (a3) la reazione del secondo polimero polisaccaridico attivato comprendente gruppi tiolici con cistina, ottenendo un terzo polimero polisaccaridico attivato comprendente un linker o gruppo d'uscita cisteinilico connesso al secondo polimero polisaccaridico attivato mediante legami disolfurici, e

(b) il trattamento del terzo polimero polisaccaridico attivato con una proteina farmacologicamente o biologicamente attiva comprendente cisteina, in cui i ponti disolfurici in essa contenuti sono stati anteriormente ridotti sotto rigenerazione dei relativi gruppi tiolici, stabilendo, sotto espulsione di cisteina, un legame disolfurico tra la proteina farmacologicamente o biologicamente attiva e tra il polimero polisaccaridico.

Il prodotto ottenuto secondo il metodo D(b) è un esempio di una sostanza secondo l’invenzione in cui la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva viene stabilita tramite il linker -S- che forma un legame disolfurico con la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.

Secondo una ulteriore forma di esecuzione preferita della presente invenzione, la treonina tiolata può rimpiazzare la cisteina come linker in determinate situazioni.

Di conseguenza, è stata dimostrata l’estrema versatilità di alcuni dei metodi di sintesi secondo l'invenzione, in particolare di quei metodi particolarmente preferiti che coinvolgono la modifica dei gruppi OH alcolici del polimero poi isacca ridico assieme all’opzionale uso di H2S, cisteina o lisina come linker o come gruppo d’uscita, per il coniugamento di sostanze farmacologicamente o biologicamente attive esibenti gruppi amminici, tiolici, carbossilici o carbonilici. In particolare, è stato dimostrato che la precedente è una serie di sintesi di coniugazione che consentono di legare al polimero polisaccaridico, p.e. alla fibra di cotone o di viscosa, farmaci o sostanze biologicamente attive, di natura diversa e con diverse proprietà farmacologiche. È anche da sottolineare che la serie di sintesi di coniugazione permette anche di costruire -in funzione della sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva impiegatauna coniugazione chimica che per quanto riguarda la lunghezza (modulabile mediante l'inserimento di linkers, p.e. di natura amminoacidica) della connessione stabilita, la eventuale biodegradabilità dei legami compresi nella coniugazione chimica e la posizione della connessione sul polimero polisaccaridico e sulla sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, è fatta “su misura". Ulteriori esempi di metodi di sintesi preferiti neN’ambito della presente invenzione sono descritti nella parte sperimentale della presente domanda.

Importantemente, il coniugamento chimico può essere effettuato indifferentemente sulle diverse forme macroscopiche del polimero polisaccaridico, ossia sulle fibre oppure sui diversi prodotti lavorati ottenibile da questo, p.e. sulla fibra di cotone, sul filato (semilavorato) o sul prodotto finito (tessuto, tessuto non-tessuto, garza, benda) utilizzabile come tale o idoneo per preparare altri prodotti come tamponi, guanti, mascherine, calze, assorbenti igienici, ecc. È da rilevare che la possibilità di effettuare il coniugamento chimico sulla fibra o sul prodotto semilavorato apre la possibilità della messa a disposizione di prodotti finiti che supportano due o più sostanze farmacologicamente o biologicamente attive. Per esempio, mediante l’uso di due filati derivatizzati diversamente, sono ottenibili delle garze che comprendono p.e. sia una sostanza disinfettante (legata, per esempio mediante coniugazione chimica non-biodegradabile) che una sostanza terapeutica sottoposta al rilascio sotto biodegradazione della relativa coniugazione chimica. Tali garze multiattive secondo l'invenzione comportano il notevole vantaggio di costituire un notevole risparmio di materiale rispetto alla medicazione tradizionale che richiederebbe l'applicazione di disinfettante e di medicamento con cambiamento della garza a ritmo giornaliero.

Per quanto riguarda il grado di coniugazione con sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, esso può essere variato dall’esperto del ramo, a seconda delle esigenze -mediante la variazione p.e. della temperatura e del tempo di reazione o mediante l’uso di agenti bloccanti (p.e. glieina)- tra un utilizzo parziale (sotto-stechiometrico) o sostanzialmente totale (stechiometrico) dei siti adatti alla coniugazione chimica creabili sul polimero polisaccaridico. L’utilizzo di linkers trifunzionali o multifunzionali aumenta ulteriormente il grado di coniugazione chimica totale raggiungibile, a seconda delle esigenze, dall'esperto del ramo.

Per quanto riguarda l’uso dei polimeri polisaccaridici secondo l’invenzione per la preparazione di medicinali, i medicinali oppure gli articoli medicinali, cosmetici oppure igienici cosi ottenuti, si producono i seguenti esempi che costituiscono forme di esecuzione preferite ma non limitative dell'invenzione:

1. Tamponi vaginali ed assorbenti igienici:

1.a. Antiemorragici.

Polimero polisaccaridico di origine vegetale, in particolare cotone coniugato a protrombina o fibrinogeno o fibrina o Fattore Vili coagulativo. In questo caso il legame chimico può essere stabile, ossia non biodegradabile a contatto con il paziente. I principi attivi proteici coagulanti, coniugati, contribuiscono a formare un aggregato (piastrine fibrina) riducendo il processo emorragico in fase di mestruazioni. Un tale tampone costituisce un esempio per un articolo igienico secondo l’invenzione.

I .b. Anti-infezioni:

a. Antifungini.

Vengono presi, come esempio, il polimero polisaccaridico di origine vegetale, in particolare il cotone coniugato a miconazolo, nistatina ed acido benzoico.

Il miconazolo è particolarmente attivo nelle candidosi vulvovaginali, la nistatina agisce in particolare sulle candidosi, sulle infezioni da Trichophyton glabrata, da Epidermophyton, ecc.; l’acido benzoico, in genere associato ad acido salicilico viene impiegato come fungistatico topico generale.

b. Antisettici (disinfettanti).

Viene preso come esempio la fibra di cotone coniugata al fenolo, ossia alla 4-idrossibenzaldeide come derivato del fenolo.

Il fenolo ed i suoi derivati sviluppano la loro azione germicida con un meccanismo di denaturazione delle proteine ed hanno una notevole penetrabilità nei tessuti e per questo sono marcatamente tossici.

La loro coniugazione alla fibra di cotone di maniera non biodegradabile sotto condizioni d’impiego ne impedisce l'assorbibilità e quindi gli effetti tossici.

c. Antibatterici.

Vengono presi come esempio la fibra di cotone coniugata a bacitracina, gramicidina e sulfadiazina.

1.c. Antiinfiammatori:

Alla fibra di cotone vengono coniugati antiinfiammatori FANS (esempio naproxen, diclofenac) e corticosteroidi come per esempio il cortisolo. 1.d. immunostimolanti:

La stimolazione delle funzionalità delle cellule immunocompetenti del tessuto sottomucoso è in grado di incrementare la barriera delle difese nei confronti dell’impianto dei patogeni e di antagonizzare il processo flogogeno tissutale di diversa origine.

In questo caso, il principio attivo da coniugare al cotone è costituito da glicoproteine ad attività immunostimolante aspecifica, di origine microrganica: esempio da Corynebacterium granulosum, parvum e catarrhalis (B. Bizzini, B. Maro e P. Lalouette, Médecine et Mal. Inf., 1978, 8, 408; T. Metianu e B. Bizzini, Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., 1981, 4, 285).

2. Calze e collants:

2. a. Anti-varici e anti-flebiti.

Le varici e le flebiti coinvolgono la funzionalità coagulativa e parientale dei capillari sanguigni.

Una delle cause della loro insorgenza sembra dovuta proprio al fatto che il contatto continuo delle zone cutanee particolarmente vascolarizzate con fibre, in particolare artificiali come il nylon, possa ridurne il contatto con l'aria e la conseguente ossigenazione.

Un buon medicamento in grado di prevenire e curare le varicoflebiti deve avere proprietà anticoagulanti, antiaggreganti piastriniche e fibrinolitiche. Queste proprietà sono possedute dall'eparina e dall’eparina a basso peso molecolare (MWcirca 6.000 D - Sigma H 2149).

La sua coniugazione alla fibra di cotone ne può ottimizzare gli effetti locali per permanenza in situ.

2.b. Anti-traumi.

Nella risoluzione dei traumi cutanei, da stimoli meccanici, da radiazioni o da altre cause possono risultare utili garze, bende fasce di fibra di cotone sia derivatizzata con eparina a basso peso molecolare sia con antiinfiammatori steroidei (esempio: cortisolo) o con (FANS).

Altrettanto con successo possono essere utilizzati gli stessi materiali coniugati a glicoproteine immunostimolanti aspecifiche.

2.c. Anti-deposito lipidico.

Per la risoluzione di depositi e cuscinetti subcutanei di grasso possono essere utilizzate calze, collant, mutandine, calzonicini, fasce, realizzate con fibra di cotone derivatizzata con l’enzima lipasi (tipo VII - Sigma L 1754) che costituiscono degli esempi per articoli cosmetici secondo l’invenzione.

L’enzima mantenuto aderentemente nel sito può penetrare sino alla sottomucosa sviluppando il suo effetto litico e mobilizzante.

Maggiori risultati si possono ottenere realizzando il tessuto con fibre miste derivatizzate con lipasi e con eparina a basso peso molecolare. 3. Guanti antiallergici.

Il principio per ottenere guanti o altri materiali (es. garze) con azione antiallergica è quello di coniugare alla fibra di cotone delle immunoglobuline specifiche contro l’allergene.

A seguito del lungo contatto si può avere una complessazione dell'allergene stesso e la sua conseguente inattivazione.

Migliori risultati si ottengono allorché il tessuto viene realizzato con fibre miste tra quelle derivatizzate con immunoglobuline e tra quelle derivatizzate con glicoproteine immunostimolanti.

4. Garze.

4. a. Disinfettanti.

Valgono gli esempi già citati in precedenza con fibra di cotone derivatizzata con germicidi, antifungini o antibatterici.

4.b. Cicatrizzanti.

Un caratteristico esempio di garze o bende cicatrizzanti è quello ottenuto realizzando la loro produzione con fibra di cottone derivatizzata con peptidi ottenuti dalla frammentazione del fibrinogeno (esempio Sigma F 3643).

Un altro esempio è rappresentato dalla fibra dove l’agente coniugato è la stessa fibronectina (Sigma 2006) oppure peptidi promuoventi la sua adesione (Sigma F 3667).

4.c. Anti-piaghe e repitelializzanti.

Le piaghe, le piaghe da decubito ed altre forme di danno tissutale cronico o cronicizzante, coinvolgono diversi biomeccanismi quali l'infiammazione, il processo immunitario, l’angiogenesi ed altro.

L’approccio terapeutico alla riparazione può essere, quindi, diverso con impiego di sostanze di diversa efficacia oppure multifattoriale.

Tra le sostanze che hanno dimostrato un’efficacia, per azione su specifici biomeccanismi coinvolti, si hanno:

a. la ketanserina (MW 395.40 - Fluka 60712) - R.P. Rooman e H. Janseen, Clin. Exp. Appr: to Derm. and Epiderm. Repair, Eds. A. Barbul e coll., Prog. In Clin. Biol. Res. Voi. 365, 1991, 115, Wiley Liss, NY.

b. L’acido ialuronico - N. Scott Adzick e M. T. Longaker, stessa rivista, pag. 177.

c. Il fattore di crescita epidermico (EGF - Epidermal Growth Factor -Sigma E 9644) o suoi frammenti peptidici (frammento 20-31 Sigma E 9384) - M. Eisinger, R.B. Flick, J. Bizick e Y. Arita, stessa rivista, pag. 375.

d. Gli immunomodulatori aspecifici, quali le glicoproteine di origine microrganica - M. Laato, stessa rivista, pag. 459.

A seconda la natura del danno tissutale (ferita, piaga da decubito, di altra natura) può essere utile l'impiego di uno o più dei suddetti principi attivi. Secondo l’invenzione, queste sostanze vengono coniugate singolarmente alla fibra di cotone.

Secondo l’invenzione, il tessuto, garza, ecc., può essere ottenuto con uno o più fibre o filati diversamente derivatizzati.

4.d. Antieritema e dermatopatie e matrice infettiva ed immunitaria.

Esempi di malattie: dermatiti atopiche, da contatto, orticaria, psoriasi, pemfigo.

Il principio è sempre quello di impiegare tessuti di cotone (garze) ottenuti con fibre derivatizzate con immunostimolanti, cortisonici, antibatterici ecc., singole o associate, a secondo la etiopatogenesi e l’evoluzione della malattia.

4.e. Antiscottature da UV o altra causa.

Il principio terapeutico è lo stesso citato al punto precedente con la possibilità d’impiego di fibre derivatizzate con acido ialuronico o peptidi ottenuti per degradazione del fibrinogeno come agenti repitelializzanti (ricostitutivi del tessuto cutaneo leso o necrotizzato).

4.f. Anti-rughe e anti-invecchiamento.

Nell’invecchiamento cutaneo e manifestazione correlate sono coinvolti numerosi fattori.

Sicuramente, tra questi, vi sono una ridotta elasticità tissutale, una ridotta funzionalità del sistema immunocompetente sottocutaneo, un variato assetto morfologico e metabolico della struttura collagenica e, secondo alcuni ricercatori una ridotta biodisponibilità di acido ialuronico (A. K. Balin e A. M. Kligman, Aging and thè Skin, 1989, Raven Press, NY).

In genere, le parti più colpite sono quelle esposte a traumi, a radiazioni di diversa natura quali viso, collo, gambe.

Le sostanze che, sulla base delle risultanze note, possono essere utilizzate nella prevenzione e correzione di tali eventi sono: i polisaccaridi del tipo dermatan solfato (condroitin solfato B - Sigma C 4259); gli immunostimolanti aspecifici di origine batterica, le collagenasi (Sigma C0130), l’elastina (Sigma E 1625).

Questi principi attivi, coniugati, per esempio, alla fibra di cotone, possono essere applicati nelle zone interessate mediante garze o altri prodotti ottenuti dal cotone, ottenendo cosi prodotti cosmetici.

5. Cotone idrofilo sanitario.

5.a. Disinfettante.

Con fibra derivatizzata con germicidi o antibatterici, come visto sopra. 5.b. Anestetico.

Con fibra derivatizzata con anestetici locali secondo l'esempio descritto sopra.

6. Articoli impiegati nell’industria alimentare.

Le garze (fascie) ed i filati coniugati a disinfettanti (per esempio acido benzoico) ad antifungini (per esempio nistatina) e/o ad antibatterici (per esempio sulfadiazina, bacitracina ecc.) possono essere impiegati per la filtrazione di formaggi oppure per la fasciatura di insaccati (salumi) e formaggi.

PARTE SPERIMENTALE CHIMICA

I. Esempi di coniugazione diretta oppure tramite il linker lisilico o idrazilico.

A. Derivatizzazione chimica della fibra di cotone.

Sintesi Quantitativa.

Una aliquota di fibra di cotone naturale viene pretrattata risospendendola in acetone, sotto leggera agitazione, per 15 minuti, al fine di ottenere la sgrassatura (a tal fine si potrebbe utilizzare anche cloroformio); quindi, si elimina l’acetone, si procede a lavaggi successivi con acqua e si asciuga la fibra.

Successivamente, 20 gr di cotone (fibra sgrassata) vengono sospesi in 1 Lt. di una soluzione fresca di sodio metaperiodato (Fluka 71859) 0.05 M (10.7 gr/Lt.) in acqua distillata.

Si lascia sotto leggera agitazione per 5 ore alla temperatura del laboratorio, al riparo dalla luce.

Si elimina la soluzione ossidante e si eseguono lavaggi con acqua (si ottiene il reattivo X, cotone-CHO, il primo polimero polisaccaridico attivato). Siccome l'ossidazione periodica controllata della cellulosa sotto le condizioni descritte nella presente domanda porta alla scissione dell'anello di D-glucosio tra due gruppi alcolici vicinali (che vengono trasformati in due gruppi aldeidici), tale ossidazione controllata (per via della sua specificità per dioli vicinali) permette di conservare sostanzialmente la catena moleculare della cellulosa stessa e quindi non porta ad una frammentazione tale da distruggere la fibra cellulosica sottoposta alla attivazione.

Si risospende la fibra attivata (reattivo X) in 500 ml di una soluzione di lisina HCI (Fluka 62960) in acqua (1.8 gr/500 ml) e si lascia reagire 2 ore a temperatura ambiente sotto agitazione. Sotto queste condizioni, si ottiene, come secondo polimero polisaccaridico attivato, la base di Schifi tra la fibra di cotone ossidata (reattivo X) e, a seconda del’orientamento, tra una delle posizioni amminiche della lisina. Quindi, il secondo polimero polisaccaridico attivato (“cotone-CH=N-lis”) è un miscuglio delle due basi di Schiff ottenibili, come illustrato sopra nelle susseguenti fasi 3a e 3b Si aggiungono, quindi, 1 gr di NaBH4 (Fluka 71320) lasciando reagire per 1 ora alla temperatura ambiente sotto agitazione.

Si filtra e si lava ripetutamente la fibra con acqua (si ottiene il reattivo Y, il terzo polimero polisaccaridico attivato, che è un miscuglio dei due orientamenti ottenuti come da fase 3a e 3b).

B. Coniugazione alla fibra di cotone di un battericida:

Come esempio di battericida vengono presi una dialdeide e un derivato fenolico.

Lo schema di sintesi è il seguente:

Esempio n° 1 :

A 10 gr di fibra di cotone derivatizzata (reattivo Y) risospesi in 250 ml di tampone carbonato-bicarbonato 0,05 M pH 9,0, si aggiungono gr 0,3 (cioè 1 ,2 mi della soluzione al 25%) di glutaraldeide (Fluka 49624) e si lascia sotto agitazione a temperatura ambiente per 1 ora.

Si lava ripetutamente per l’eliminazione dell’eccesso di reagente e si porta la fibra a secco.

Si ottiene:

In questo esempio, la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva è legata al polimero polisaccaridico mediante il linker lisilico, sotto creazione di un legame amminico secondario, tra il polimero polisaccaridico attivato ed il linker e di un legame imminico tra la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva ed il linker.

Resa in principio attivo coniugato = 82%.

Opzionalmente, a seconda delle esigenze di biodisponibilità della sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, il legame imminico tra la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva può poi essere successivamente ridotto, p.e. con NaBH4, sotto ottenimento del corrispondente legame amminico secondario.

Esempio n° 2

A 10 gr di fibra di cotone derivatizzata (reattivo Y) risospesi in 250 mi di tampone carbonato-bicarbonato 0,05 M pH 9,0, si aggiungono gr. 0,4 di 4-idrossibenzaldeide (Fluka 54589).

Si lascia reagire sotto agitazione a temperatura ambiente per 2 ore, quindi si eseguono ripetuti lavaggi per l’eliminazione dell’eccesso di reagenti.

Si aggiungono, quindi, 1 gr di NaBH4 (Fluka 71320) lasciando reagire per 1 ora alla temperatura ambiente sotto agitazione; quindi si filtra e si lava ripetutamente la fibra con acqua.

Si porta la fibra a secco.

Si ottiene:

cotone-CH2-NH-lis-NH-CH2-Ph-OH

in cui Ph è un radicale para-fenilenico.

Resa in principio attivo coniugato 74%.

In questo esempio, la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, che è un derivato fenolico, è coniugata al polimero polisaccaridico tramite il linker lisilico, mediante la creazione di due legami amminici secondari.

C. Coniugazione alla fibra di cotone di batteriostatici di diversa struttura: C.1. Coniugazione alla fibra di cotone di un sulfamidico:

A 10 gr di fibra di cotone ossidata (reattivo X) risospesi in 250 mi di acqua, si aggiungono gr 1 di sulfadiazina sale sodico (Sigma S 6387) preventivamente sciolti in 10 ml di tampone carbonato-bicarbonato 0,05 M pH 9,0 e si lascia reagire per 1 ora alla temperatura ambiente sotto agitazione.

Si ottiene come coniugato la base di Schifi tra il primo polimero polisaccaridico attivato (reattivo X) ed il gruppo amminico della sulfadiazina. In questo coniugato, la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva è legata al polimero polisaccaridico mediante un doppio legame, quello imminico.

Si aggiungono, quindi, 1 gr di NaBH4 (Fluka 71320) e si lascia sempre sotto agitazione per 10 minuti.

Si lava ripetutamente per eliminare l’eccesso di riducente, quindi si porta a secco la fibra derivatizzata.

Si ottiene:

cotone-CH2-NH-sulfadiazina

In questo esempio, la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva è legata al polimero poi isacca ridico mediante un solo legame, quello amminico secondario.

Resa in sulfadiazina coniugata 87%.

C.2. Coniugazione alla fibra di cotone di bacitracina:

A 10 gr di fibra di cotone ossidata (reattivo X), resospesi in 250 mi di tampone carbonato-bicarbonato 0,05 M pH 9.0 si aggiungono gr 0.2 di bacitracina (Fluka 11792) in polvere.

Si lascia reagire per 2 ore a temperatura ambiente, sotto agitazione. Si aggiungono 1 mi di glieina 2 M (Fluka 50046) (150 mg/ml) e si protrae l’agitazione ancora per 1 ora.

Si lava ripetutamente, quindi si porta la fibra derivatizzata a secco.

Si ottiene: Cotone-CH=N-bacitracina

Resa in bacitracina coniugata 94%.

C.3. Coniugazione alla fibra di cotone di gramicidina.

Si procede nelle stesse condizioni sperimentali del punto C.2.) e con gli stessi rapporti ponderali.

Si ottiene: Cotone-CH=N-gramicidina

Resa in gramicidina coniugata 88%.

D. Coniugazione di anestetico locale alla fibra di cotone.

In questo caso si è scelto come esempio la procaina.

La reazione di coniugazione è la seguente:

10 gr di fibra di cotone ossidata (reattivo X) vengono risospesi in 250 mi di tampone carbonato-bicarbonato 0.05 M pH 9.0 e, sotto agitazione, si aggiungono gr. 0.2 di procaina HCI (Fluka 81666) sciolti in 5 ml di acqua distillata.

Si lascia reagire per 2 ore a temperatura ambiente e, quindi, si bloccano i siti aldeidici ancora liberi per aggiunta di 1 mi di glieina 2 M lasciando reagire per 1 ora alla temperatura ambiente.

Si eseguono successivi lavaggi per eliminare l’eccesso di reattivi non legati alla fibra, quindi si porta a secco.

Si ottiene:

cotone-CH=N-procaina

In questo esempio, la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva è legata al polimero polisaccaridico mediante un doppio legame, in particolare quello imminico della base di Schiff formata tra la funzione aldeidica del polimero polisaccaridico attivato ed il gruppo amminico della sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.

Resa in procaina coniugata: 85%

E. Schema di Coniugazione alla fibra di cotone di fattori coagulativi a struttura macromolecolare:

E.1. Coniugazione del F Vili (fattore piasmatico anti-emofilico):

(a) Derivatizzazione della proteina:

Formazione del derivato idrazidico.

10 gr di F Vili vengono disciolti in 200 mi di acqua e si aggiunge una soluzione 0.5 M di diidrazide dell’acido adipico (Fluka 02191) (87 g/Lt 20 ml) a pH 5 ed il volume portato a 250 mi con acqua.

Si aggiunge una soluzione acquosa di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma E 1769), (“EDAC”) (1 gr in 5 mi di tampone acetato a pH 5.6) e si lascia reagire per 6 ore a temperatura ambiente, sotto agitazione, mantenendo il pH sotto 5 per aggiunta di acido cloridrico.

Si dializza quindi contro tampone carbonato-bicarbonato 10 mM a pH 9. (b) Reazione di coniugazione:

Il dializzato viene aggiunto a gr 10 di fibra di cotone ossidata (reattivo X) risospesa in mi 250 carbonato-bicarbonato 0.05 M pH 9.0.

La reazione viene condotta per 2 ore a temperatura ambiente, sotto agitazione.

Si aggiungono, quindi, 1 g di NaBH4 e la reazione viene condotta per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione.

Si filtra e si eseguono numerosi lavaggi per l'eliminazione dei composti che non hanno reagito.

Si porta la fibra a secco.

Si ottiene:

cotone-CH2-NH-NH-C(0)-FVIII

Resa in F Vili coniugato 72%.

In questo esempio, la coniugazione tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, è stata stabilita mediante il linker idrazina. Il linker idrazilico è stato introdotto mediante derivatizzazione dellasostanza farmacologicamente o biologicamente attiva. La coniugazione cosi ottenuta comprende (oltre ad un legame amminico secondario ed uno peptidico) un legame singolo tra due atomi di azoto.

E.2. Coniugazione del fibrinogeno.

10 gr. di fibra di cotone attivata (reattivo Y) vengono sospesi in 250 mi di tampone carbonato-bicarbonato 0.05 M pH 9.0.

Si aggiungono 0,1 gr di fibrinogeno (Sigma F 3879) in 1 mi dello stesso tampone e subito dopo gr 0,5 di 1 -etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma E 1769), (“ED AC”) in polvere. Si lascia reagire, sotto agitazione, dodici ore sotto agitazione a 4°C riaggiustando, via via, il pH a 5,5 con HCI 0,1 N durante la prima ora.

Si blocca la reazione per aggiunta di 1 mi di glieina 2 M, protraendo la reazione per altre 2 ore a 4°C.

Si eseguono successivi lavaggi con acqua per eliminare i reattivi non reagiti.

Si porta a secco e si ottiene la miscela di:

cotone-CH2-NHCH2-(CH2)3-CH(CO-NH-fibr)-NH-CO-fibr e

cotone-CH2-NH-(CO-NH-fibr)CH-(CH2)3-CH2-NH-CO-fibr

Resa in fibrinogeno coniugato 95%. Si ottiene un esempio in cui il linker lisilico (introdotto statisticamente secondo le due orientazioni possibili), per via dei due legami peptidici con due equivalenti di sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, costituisce un linker trivalente.

F. Schema di coniugazione di una glicoproteina immunostimolante ottenuta da Corynebacterium granulosum, parvum o catarrhalis.

10 gr. di fibra di cotone ossidata (reattivo X) vengono sospesi in 250 mi di tampone carbonato-bicarbonato 0.05 M pH 9.0.

Si aggiungono gr. 0.2 di sospensione della frazione immunostimolante (ottenuta in laboratorio secondo il procedimento descritto da

come sopra) nello stesso tampone.

La reazione viene condotta per 6 ore sotto agitazione a temperatura ambiente.

Si aggiunge 1 gr di NaBH4 e si lascia reagire per 1 ora sempre sotto agitazione a temperatura ambiente, dopodiché il cotone derivatizzato viene lavato accuratamente con acqua e portato a secco.

Si ottiene una fibra di cotone derivatizzata in cui la coniugazione tra il polimero polisaccaridico e la glicoproteina immunostimolante è stabilita attraverso un legame amminico secondario tra il polimero polisaccaridico ed il gruppo amminico terminale della glicoproteina. (Naturalmente, se la glicoproteina contiene degli amminoacidi amminati quale p.e. la lisina, i gruppi amminici “laterali”, formano anch’essi, in misura statistica, legami amminici secondari.)

II. Esempi di coniugazione con coniugazione a

cotone - S - S - cisteina (ossia con due linker: -S- e cisteina, giunti fra di loro mediante legame disolfurico)

e con coniugazione a cotone-S- (ossia mediante linker solfurico). A. Derivatizzazione chimica della fibra di cotone (introduzione di gruppi SH):

Esempio 1°: Derìvatizzazione con tosil cloruro.

10 gr di fibra di cotone sgrassata, sospesi in una miscela di 200 mi di tampone fosfato 0.1 M pH 8.5 e di 100 ml di diossano, vengono trattati con 7 gr di tosil cloruro (Sigma T3, 595-5) a temperatura ambiente sotto agitazione per 4 ore.

Il cotone derivatizzato viene ripetutamente lavato con acqua prima di venire risospeso in 200 ml di tampone acetato 0.1 M pH 5.5, contenente tioacetato di potassio 0.5 M (11 gr).

Si lascia avvenire la transesterificazione per 24 ore a temperatura ambiente dopodiché il cotone viene lavato ripetutamente con acqua. La deacetilazione del tioacetoderivato del cotone è stata ottenuta per aggiustamento del pH a 12 della sospensione di cotone in 200 ml di acqua.

Il derivato tiolato viene lavato ripetutamente con acqua e portato a secco.

Si ottiene: cotone - SH (reattivo W)

Esempio 2°: Derìvatizzazione del cotone-SH con cisteina

A 10 gr di cotone-SH sospesi in 200 ml di tampone carbonatobicarbonato 0.5 pH 9.0 vengono aggiunti 1.5 gr di L-cistina -2HCI (Sigma C 2526) sciolti in 20 mi di acqua.

Si lascia avvenire la reazione sotto agitazione per 4 ore a temperatura ambiente.

Successivamente, il cotone viene lavato ripetutamente con acqua e quindi portato a secco.

Si ottiene:

cotone-S-S-CH2-CH(NH2)-COOH (reattivo C)

Resa della reazione: 86%

In questo derivato attivato del cotone, il polimero polisaccaridico è stato coniugato al linker -S- (o linker solfurico, formalmente derivato da H2S, che di sua volta è stato coniugato al linker cisteinilico tramite un legame disolfurico. Essendovi una sola possibilità della formazione di un legame disolfurico, a differenza del linker lisilico discusso sopra, il linker cisteinilico reagisce con il polimero polisaccaridico attivato secondo un solo orientamento.

B. Coniugazione di fibrinogeno alla fibra di cotone.

A 10 gr di cotone-S--S — cisteina (reattivo C) sospesi in 200 mi di tampone acetato 0.1 M pH 5.5 vengono aggiunti gr. 01 di fibrinogeno (Sigma F 3879) in 10 mi della stesso tampone e subito dopo gr 0.5 di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma E 1769), (“EDAC”) in polvere.

Si lascia reagire, sotto agitazione, a temperatura ambiente per 4 ore raggiustando, via via, il pH a 5.5 con HCI 0.1 N durante la prima ora. Dopo reazione, il cotone viene lavato ripetutamente con acqua e quindi portato a secco.

Si ottiene:

Cotone-S-S-CH2-CH(NH-CO-fibr)-CONH-fibr

Resa in fibrinogeno legato 68%.

In questo esempio, la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva è stata coniugata al polimero polisaccaridico tramite due linker, di cui il primo è costituito da -S- (ottenuto, formalmente, da H2S) e di cui il secondo è il linker cisteinilico (ottenuto formalmen da cisteina). Nel presente caso, per via dei due legami di natura peptidica tra il linker cisteinilico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, il linker cisteinilico costituisce un linker trivalente.

C. Coniugazione di fattore VIII coag. a fibra di cotone

Lo schema di coniugazione è lo stesso impiegato sopra per il fibrinogeno.

La resa in Fatt. VIII coniugato è stata del 64%.

D. Coniugazione alla fibra di cotone di eparina a basso peso molecolare (MW)

1. Ossidazione periodica dell'eparina:

0.25 gr. di eparina sodica (Sigma H 1636) sono stati sciolti in 10 mi di tampone acetato 0.01 M contenente 0.01 M di Nal04.

La soluzione è stata messa in agitazione al riparo dalla luce per 20 minuti a temperatura ambiente.

La reazione è stata bloccata per aggiunta di 100 μl di glicerolo mantenuto a contatto, sempre sotto agitazione, per 15 minuti.

L'eparina ossidata è stata dializzata contro tampone carbonatobicarbonato 0.1 M pH 9.0.

In analogia al caso dell'attivazione del polimero polisaccaridico descritto sotto punto I sopra, anche qui l’ossidazione controllata con metaperiodato (che è specifica per dioli vicinali) crea due gruppi aldeidici sul substrato farmacologicamente o biologicamente attivo, sotto scissione dell’anello dell’acido d-glucuronico contenuto nell'eparina nelle posizioni detenute da gruppi alcolici secondari vicinali.

2. Coniugazione dell’eparina ossidata al cotone-S-S-cisteina:

5 gr. di cotone-S-S-cisteina (reattivo c) sospesi in 100 mi di tampone carbonato-bicarbonato 0.1 M pH 9.0 sono stati messi a reagire con gr.

0.25 di eparina ossidata, sotto agitazione, per 3 ore a temperatura ambiente.

A reazione compiuta, il cotone è stato lavato ripetutamente con acqua prima di essere portato a secco.

Si ottiene:

Cotone-S-S-CH2-CH(COOH)-N=CH-eparina

In questo esempio, il polimero polisaccaridico, che è stato attivato mediante la coniugazione con il linker -S- ed il linker cisteinilico a dare il reattivo C, è stato coniugato alla sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva tramite la formazione della base di Schiff tra un gruppo aldeidico creato per derivatizzazione della sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva ed il gruppo amminico del linker cisteinilico.

In alternativa, la coniugazione tra il polimero polisaccaridico attivato (reattivo C) può anche avvenire senza la modifica dell’eparina quale sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, attraverso il residuo di acido glucuronico dell’eparina che può formare un legame peptidico con il gruppo amminico del reattivo C.

Resa in eparina a basso MW coniugata tramite la formazione della base di Schiff a cotone-S-S-cisteina: 74%.

E. Coniugazione alla fibra di cotone-S-S-cisteina di naproxen (antiinfiammatorio).

A 10 gr. di cotone-S-S-cisteina (reativo C) sospesi in 200 ml di tampone acetato 0.1 M pH 5.5 vengono aggiunti 10 ml di una soluzione acquosa contenente gr. 0.25 di naproxen (Sigma N 5160) e subito dopo gr. 0.5 di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma E 1769), (“EDAC”).

La miscela viene agitata per 4 ore a temperatura ambiente, raggiustando il pH a 5.5 con HCI 0.1 N durante la prima ora di reazione.

Si eseguono, quindi, successivi lavaggi per l’eliminazione dei reattivi in eccesso e si porta successivamente a secco la fibra.

Si otiene:

Cotone-S-S-CH2-CH(COOH)-NH-CO-naproxen

Quindi, in questo esempio, la coniugazione tra il polimero polisaccaridico attivato e la sostanza farmacologicamente o biologicamente ativa portante un gruppo carbossilico avviene per la formazione di un legame peptidico tra il reattivo C e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.

Resa in antiinfiammatorio coniugato 67%.

F. Coniugazione al cotone-S-S-cisteina di lipasi.

A 10 gr. di cotone-S-S-cisteina (reattivo C) in 200 mi di tampone acetato 0.1 M pH 5.5 si aggiungono gr. 0.1 di lipasi (Sigma L 1754) in 10 ml dello stesso tampone e subito dopo gr. 0.5 di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma E 1769), (“EDAC") soto forma solida.

Si lascia reagire per 4 ore a 4°C sotto agitazione riaggiustando i( pH a 5.5 durante la prima ora di reazione, se necessario.

Dopo la reazione, il cotone derivatizzato viene sottoposto a successivi lavaggi, portato a secco e conservato a 4°C.

Si ottiene:

Cotone-S-S-CH2-CH(NH-CO-lipasi)-CO-NH-lipasi

Anche in questo esempio, il linker cisteinilico è un linker trivalente.

Resa di lipasi coniugata sulla base dell’attività lipasica: 65%

G. Coniugazione di IgG (Immunoglobuline) alla fibra cotone-S-S-cisteina.

1. Riduzione delle IgG:

100 mg di IgG in 1 mi di PBS (tampone fosfato/salino) pH 7.4 contenente 1 mM di EDTA sono stati ridotti per trattamento con DTT (Sigma D 9680) a concentrazione finale 5 mM, per 20 minuti a temperatura ambiente, rompendo i ponti disolfurici presenti sull'lgG sotto ricostituzione dei rispettivi gruppi tiolici delle cisteine contenute nella catena peptidica dell’lgG, sotto ottenimento di “IgG-SH”

Successivamente la soluzione è stata filtrata su colonna di Sephadex G 25 e la frazione di IgG ridotte (“IgG-SH"), raccolta.

2. Reazione delle IgG ridotte con cotone-S-S-cisteina

10 gr. di cotone-S-S-cisteina (reattivo C) sospesi in 200 ml di PBS-EDTA sono stati trattati con 100 mg di IgG ridotte (IgG-SH) durante 12 ore agitando in atmosfera di azoto.

Quindi il cotone è stato lavato più volte e portato a secco.

Si ottiene: cotone-S-S-lgG

Resa in IgG coniugate 67%.

Quindi nell’ambito di questo esempio, il linker cisteinilico del reattivo C ha reagito da gruppo d'uscita ed è stato espulso e rimpiazzato dai gruppi tiolici presenti sulla proteina farmacologicamente o biologicamente attiva, sotto formazione di un legame disolfurico tra il reattivo W (quale polimero polisaccaridico attivato) e la proteina farmacologicamente o biologicamente attiva. Si ottiene quindi un coniugato in cui il polimero polisaccaridico è coniugato alla sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva tramite il linker -S-.

H. Coniugazione di acido ialuronico con cotone-S-S-cisteina.

Metodo 1°: a 5 gr. di cotone-S-S-cisteina (reattivo C) sospesi in 100 mi di tampone acetato 0.1 M pH 5.5 vengono aggiunti 10 mi di una soluzione contenente gr. 0.1 di acido ialuronico sodico (Sigma H 1876) in acqua e subito dopo gr. 0.5 di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma E 1769), (“EDAC").

Si lascia reagire sotto agitazione per 4 ore a 4°C, raggiustando il pH a 5.5 durante la prima ora di reazione per aggiunta di HCI 0.1 N.

Dopo la reazione si eseguono successivi lavaggi del cotone, quindi si porta a secco.

Si ottiene:

cotone-S-S-CH2-CH(COOH)-NH-CO-ialuronico

Quindi, in questo esempio, si è stabilito un legame peptidico tra il gruppo amminico del reattivo C ed il gruppo carbossilico presente sull’acido ialuronico.

Resa in acido ialuronico coniugato 57%.

Metodo 2°: Ossidazione dell'acido ialuronico:

100 mg di acido ialuronico sodico (Sigma H 1876) vengono sciolti a 4°C ed al riparo dalla luce in 10 mi di tampone acetato 0.1 M pH 5.5 contenente 1 mM di Nal04.

Si prosegue all’agitazione per 15 minuti.

Si blocca la reazione per aggiunta di 100 μΙ di glicerolo fatto reagire sempre sotto agitazione per ulteriori 15 minuti.

Coniugazione:

A gr. 5 di cotone-S-S-cisteina (reattivo C) sospesi in 100 mi di tampone carbonato-bicarbonato 0.1 M pH 9.0 si aggiungono la soluzione di acido ialuronico ossidato e si lascia reagire sotto agitazione a 4°C per 4 ore. Quindi, il cotone derivatizzato viene lavato più volte con acqua e portato a secco.

Si ottiene:

Cotone-S-S-CH2-CH(COOH)-N=CH-ialuronico

Come nel caso dell’eparina descrìtto sopra, anche l'acido ialuronico può essere ossidato con sodio metaperiodato sotto creazione di due gruppi aldeidici coniugabili al reattivo C mediante formazione della rispettiva base di Schifi.

Resa in polisaccaride coniugato: 45%.

I. Coniugazione di collagenasi al cotone-S-S-cisteina.

A 5 gr. di cotone-S-S-cisteina sospesi in 100 mi di tampone acetato 0.1 M pH 5.5 vengono aggiunti 1 mi di un soluzione in PBS 0.01 M contenente gr. 0.1 di collagenasi cruda tipo 1A (Sigma C 9891) e subito dopo gr. 0.5 di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma E 1769), (“EDAC") in polvere.

Si lascia reagire sotto agitazione per 4 ore a 4°C riaggiustando il pH a 5.5 durante i primi 20 minuti con HCI 0.1 N.

Dopo la reazione si eseguono successivi lavaggi del cotone con acqua molto fredda.

Si porta a secco.

Si ottiene:

cotone-S-S-CH2-CH(NH-CO-coll)-CO-NH-coll

Resa sulla base dell’attività idrolitica su substrato FALGPA (Sigma F 5136): 53%.

J. Coniugazione di elastina a cotone-S-S-cisteina.

A 10 gr. di fibra di cotone-S-S-cisteina (reattivo C) sospesi in 200 ml di tampone acetato 0.1 M pH 5.5 vengono aggiunti gr. 0.1 di elastina (Sigma E 1625) in 10 ml dello stesso tampone e successivamente gr. 0.5 di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma E 1769), (“EDAC”) in polvere.

Si lascia reagire a 4°C per 4 ore sotto agitazione, riaggiustando il pH a 5.5 per i primi 20 minuti con HCI 0.1 N.

Dopo la reazione il cotone derivatizzato viene lavato ripetutamente per eliminazione dei reattivi che non hanno reagito.

Si porta a secco.

Si ottiene:

cotone-S-S-CH2-CH(NH-CO-elast)-CO-NH-elast

Resa: non determinata.

III. Esempi di coniugazione tra polimero polisaccaridico e sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva tramite il linker ottenuto da acido 4-diazobenzoico.

A. Coniugazione di cortisolo (“idrocortisone”, 11β,17a,21-triidrossipregn-4-ene-3,20-dione, Sigma H4001) alla fibra di cotone.

1. Derivatizzazione dell’idrocortisone col diazoderivato dell’acido pamminobenzoico.

a) Preparazione del diazoderivato dell’acido p-amminobenzoico (PABA).

548 mg di PABA vengono sciolti in 40 mi di HCI 1N e la soluzione viene raffreddata in ghiaccio.

248 mg di NaN02 sciolti in 20 ml di acqua ghiacciata vengono aggiunti goccia a goccia sotto agitazione alla soluzione di PABA, dopodiché si protrae l’agitazione ancora per un’ora in un bagno di ghiaccio.

b) Derivatizzazione dell'idrocortisone.

1300 mg di idrocortisone vengono sciolti in una miscela di 20 ml di acido acetico e 90 mi di dimetilformammide. A questa soluzione viene aggiunta, goccia a goccia, la soluzione del diazoderivato di PABA, sotto agitazione, lavorando in un bagno di ghiaccio, al riparo della luce. L'agitazione è protratta per 12 ore 4° C, dopodiché si precipita il diazoderivato dell’idrocortisone per aggiunta di un grande volume di acqua. Il precipitato viene raccolto per centrifugazione, risciolto in acetato di etile, lavato due volte con acqua. La fase organica viene raccolta su Na2S04, filtrata ed evaporata a secco.

2. Coniugazione del diazoderivato dell'idrocortisone alla fibra di cotone.

A 20 gr. di cotone-S-S-cisteina (reattivo C) sospesi in diossano, si aggiungono 150 mg di 1-cicloesil-3,2-morfolino-etilcarbodiimmide metilp-toluenesulfonato (Sigma C1011), quindi 100 mg dell'azoderivato e si lascia reagire per 12 ore, sotto agitazione, a 4 " C. Il cotone viene successivamente lavato, prima con diossano, poi ripetutamente con acqua, prima di essere portato a secco.

Si ottiene:

Il coniugato cosi ottenuto è un esempio dell’uso dell’acido 4-azobenzoico come linker nell’ambito della presente invenzione. Tale linker viene introdotto mediante derivatizzazione della sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva. Si ottiene cosi una coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva comprendente un legame doppio tra due atomi di azoto.

Resa: 64%.

PARTE SPERIMENTALE FARMACOLOGICA

1. Test per la validazione dell’efficacia di tamponi in fibra di cotone coniugata a F Vili , fibrinogeno e fibrina sulla velocità e consistenza della formazione del coagulo “in vitro".

L’influenza della presenza di un tampone di cotone derivatizzato con proteine specifiche sulla velocità e consistenza del coagulo è stata determinata in accordo al metodo di Lee/White (Amer J. Med., 1913, 145, 495) modificato.

In provette da sierologia da 15 mi, si inseriscono quantità esattamente pesate (circa 1 gr) di fibra di cotone idrofilo normale o di fibra di cotone derivatizzata, secondo le procedure esposte nella parte sperimentale chimica, con le varie proteine coinvolte nella coagulazione e si aggiungono, a ciascuno provetta, 5 mi di soluzione fisiologica.

Si mantengono in bagno maria termostatico a 37°C.

In ciascuna provetta si versano, quindi, 5 ml di sangue in toto ottenuto per puntura venosa dalla vena marginale dell'orecchio di conigli, si agitano leggermente le provette e si lasciano in termoregolazione a 37°C per 5 minuti, una serie, e per 10 minuti una seconda serie.

Dopo tali tempi, i batuffoli di cotone vengono prelevati dalle singole provette, asciugati per leggero contatto su carta da filtro e pesanti.

Nella tabella successiva sono riportati gli aumenti percentuali del peso dei batuffoli di cotone coniugati con le diverse proteine rispetto a quelle di controllo (non coniugati).

I risultati evidenziano che la presenza di fibra di cotone, opportunamente derivatizzata è in grado di accelerare il processo coagulativo. Inoltre, nell’ambito di esperimenti condotti con la stessa sostanza attiva, coniugata però in maniera sempre diversa alla fibra di cotone (come da esempi sopra), si ha trovato che la natura della coniugazione tra le citate proteine coagulanti ed il cotone non incide sul potere coagulativo del cotone cosi ottenuto.

Ciò indica che il cotone derivatizzato secondo la presente invenzione è in grado di contrastare gli episodi emorragici funzionali o conseguenti a ferite.

2. Valutazione dell’influenza di cotone derivatizzato con germicidi, con antibatterici o con antifungini nello sviluppo ed entità della flora microrganica.

L’influenza della fibra di cotone opportunamente derivatizzata sulla sviluppo della flora microrganica è stata determinata “in vitro” su colture in crescita, su piastra, di vari microrganismi: Candida albicane, Escherichia coli, Stafilococcus aureus isolati e caratterizzati da materiale organico contaminato.

Allo scopo, vengono preparati terreni selettivi di crescita (sabouraud agar per i miceti e nutrient agar per i batteri) e con essi vengono preparate delle piastre di Petri.

Sulla superficie del terreno si applica la coltura del microrganismo per deposizione di un mi di una sospensione dello stesso contenente 10 alla nona microrganismi, agitando leggermente in modo che tutta la superfìcie della piastra venga interessata.

Si applica, quindi, sulla superficie una garza di cotone ottenuta con fibra derivatizzata con le diverse sostanze in esame; si pone in termostato a 37°C.

A distanza di 24 ore si rimuove la garza e si controllano le colonie sviluppate in confronto a piastre sottoposte a crescita normale.

Viene valutata la riduzione percentuale della crescita nelle piastre con presenza di garza coniugata rispetto alla crescita normale.

Dai risultati si evince che l'applicazione di cotone derivatizzati con farmaci o germicidi idonei, a livello di una superficie, è in grado di antagonizzare la crescita sulla stessa (esempio cute o mucosa) di forme microrganiche patogene o comunque indesiderate.

3. Influenza della fibra derivatizzata con antiinfiammatori o con immunostimolantì sul processo flogogeno.

Gli esperimenti sono stati condotti sul ratto mediante il test dell’induzione del granuloma da “cotton pellets”.

Secondo questo test, vengono inseriti nella regione sottocutanea della zona subascellare dell’animale dei “batuffoli” di cotone di peso (1 gr) e forma predeterminati, per mezzo di una cannula in grado di forare la cute e il sottocute per l'inserimento (la cicatrice viene richiusa con un punto di sutura).

Attorno alla pallina di cotone si forma un deposito collagenico “granuloma” di entità proporzionale al processo flogogeno.

Dopo quindici giorni dall'intervento, si preleva, dall'animale sotto anestesia, il granuloma formatosi e si pesa per determinarne l’entità. In questo caso, il cotone utilizzato come base per l'impianto del granuloma era costituito da:

- fibra di cotone normale (controllo),

- fibra di cotone derivatizzata con naproxen (esempio II. E. sopra), - fibra di cotone derivatizzata con glicoproteina immunostimolante da C. granulosum (esempio I.F. sopra).

Di seguito è riportata la differenza percentuale del peso dei granulomi formatisi interno alla palline di cotone derivatizzate con antiinfiammatori o immunostimulanti (da Corynebacterium granulosum) rispetto a quelli interno alle palline di solo cotone (controlli).

Dai risultati si evince che la derivatizzazione della fibra di cotone con sostanze ad attività antiinfiammatoria o immunostimolante è in grado di antagonizzare la progessione dell'evento flogogeno cronico sperimentale.

Ciò si traduce, nell’applicazione cutanea, in un'azione antiinfiammatoria ed antitraumatica.

4. Influenza dell’applicazione di fibre di cotone derivatizzate sull’entità della sclerosi sperimentale nella vena femorale del coniglio.

Una vena femorale del coniglio, dopo idonea depilazione, viene chiusa per un tratto di circa cinque cm mediante punti di sutura a valle e a monte.

All’interno della zona separata si iniettano 0.05 ml di carbonio tetracloruro in soluzione al 10% (Fluka 87031), come agente sclerotizzante.

Si fascia opportunamente la zona con garze di cotone normale (controllo) o derivatizzate in modo che le stesse aderiscano perfettamente alla parte trattata.

A distanza di dieci giorni, i frammenti di vena sottoposti a stasi vengono prelevati e controllati microscopicamente per lo stato parientale e la consistenza dei depositi sclerotizzanti formatisi.

E’ stato così possibile osservare come l'applicazione nella zona sottoposta a stese di garze di cotone derivatizzate con:

eparina a basso peso molecolare (esempio H.D.2.),

sono in grado di ridurre notevolmente lo stato sclerotico tissutale. In particolare, non sono state rilevate differenze tra l’attività dell’eparina ossidata e coniugata mediante la formazione di una base di Schiff e tra l’eparina coniugata attraverso legami peptidici formati mediante partecipazione dei gruppi di acido glucuronico presenti sull'eparina.

Da ciò si deduce che l'applicazione di tali garze ha un'azione farmacologica nella regolazione della funzionalità vascolare e nella formazione e consistenza del trombo venoso.

Ne consegue l'importanza dell'applicazione nella prevenzione e terapia delle varici e della patogenesi flebitica.

5. Influenza dell’applicazione di fibre di cotone derivatizzate sul tempo di emorragia sperimentale nell'orecchio di coniglio.

L’orecchio del coniglio viene opportunamente depilato e lavato con soluzione fisiologica.

Quindi, con una normale lametta "da barba" si provocano dei tagli della superficie in senso orizzontale, avendo l’accortezza di operare con uniformità per i diversi animali.

Subito dopo si applicano sulle ferite delle garze di cotone, normale (controlli) o ottenute con fibra derivatizzata con fattori o peptidi procoagulanti (F Vili oppure prodotti di degradazione del fibrinogeno, Sigma F9036, “FDP").

Si controlla l'alone di sangue rilevabile nella garza.

Una riduzione è indice di proprietà cicatrizzante.

Nella tabella successiva sono riportate le riduzioni percentuali degli aloni rilevabili nelle garze derivatizzate rispetto ai controlli. Anche qui non sono state rilevate differenze riconducibili alla natura diversa delle coniugazioni chimiche nei diversi preparati di cotone derivatizzato con

fattore Vili o fibrinogeno

6. Influenza dell'applicazione delle fibre di cotone derivatizzate sull’edema indotto da UV nella cute di ratto.

Ratti adulti vengono depilati nella zona dorsale e quindi sottoposti a radiazioni ultraviolette fino a consistente formazione di edema cutaneo. L’esposizione veniva effettuata solo su zone circolari ben determinate con l'ausilio di opportune mascherine forate.

Successivamente si applicano, ben aderenti, sulle zone infiammate delle garze di cotone normali (controlli) o ottenute con fibra derivatizzata con medicamento.

In parallelo veniva saggiata, su un altro gruppo di animali, l'efficacia dell’applicazione degli stessi medicamenti in forma di gel al 5%.

Giornalmente, rispetto ad animali di controllo senza alcuna applicazione, veniva controllata la regressione dell’eritema definita come riduzione dell’entità e superficie dell’arrossamento e, subito dopo si procedeva alla riapplicazione del medicamento nelle varie forma.

Al 5° giorno veniva misurata l’estensione media della superficie degli eritemi e veniva calcolata la sua riduzione percentuale rispetto agli animali senza alcuna applicazione.

I relativi risultati sono riportati in tabella:

I risultati evidenziano una significativa accelerazione della regressione del processo eritematoso con l'applicazione di garze sanitarizzate (ossia derivatizzate), superiore anche all’impiego di farmaco in forma di gel. Su alcuni animali l’esposizione ai raggi UV veniva protratta fino a provocare delle vere e proprie piaghe tissutali.

Successivamente sulle zone lese venivano applicati una garza di cotone ottenuta con una miscela di fibre derivatizzate con immunostimolatore (glicoproteina da Corynebacterium granulosum) e con acido ialuronico (come da esempio II. H. sopra).

Su un secondo gruppo di animali veniva applicata la miscela degli stessi farmaci in forma di gel al 3% di ciascun composto.

Veniva controllato il tempo necessario, nelle due condizioni, per la completa riepitelializzazione delle piaghe in confronto ad animali di controllo senza alcuna applicazione.

Nella tabella sono riportate le riduzioni percentuali dei tempi riscontrati rispetto ai controlli.

I risultati dimostrano un significativo effetto nel caso di applicazione di garza di cotone realizzata con fibre miste derivatizzate con immunomodulatori e acido ialuronico (irrispettivamente se ossidato e coniugato tramite la formazione della base di Schifi oppure se coniugato mediante formazione di legame peptidico), mentre non evidenziano un significativo risultato nel caso di applicazione del gel corrispondente; ciò a conferma di quanto noto sull’influenza della forma farmaceutica gel applicata a piaghe di diversa natura.

7. Influenza dell’applicazione di fibre di cotone derivatizzate sul deposito sottocutaneo sperimentale di lipidi nel ratto.

Gli esperimenti venivano condotti sul ratto adulto cui veniva iniettato nella zona addominale sottocutanea una frazione lipidica ricca in colesterolo (Sigma L 4646), ripetendo giornalmente le somministrazioni fino aH'ottenimento di un deposito lipidico sottocutaneo stabilizzato; la miscela grassa veniva iniettata in sei siti ravvicinati nel volume di 0.2 ml/sito, per sette giorni consecutivi.

Successivamente, dall’ottavo giorno, si applicavano sulla stessa zone ed in maniera perfettamente aderenti delle garze di cotone ottenute con fibra derivatizzata con lipasi (esempio II.F. sopra).

A distanza di trenta giorni gli animali venivano sacrificati e veniva prelevata la zona di addome trattata.

Aliquote della stessa nell’ordine di due gr., esattamente pesate, venivano omogeneizzate su Waring blender e si procedeva all'estrazione del contenuto lipidico per aggiunta sotto energica agitazione di aliquote di etere etilico: tre estrazioni con 20 mi cad. di solvente.

Le frazioni eteree venivano mescolate e concentrate su evaporatore rotante fino a secco.

La concentrazione /gr. di tessuto di lipidi estratti veniva determinata per pesata degli estratti.

I tessuti degli animali mantenuti a contatto con garze derivatizzate con enzima risultavano avere, rispetto ai controlli non mantenuti a contatto, un contenuto lipidico inferiore del 45 per cento.

Ciò indica che l’enzima lipasi coniugato a tessuto di cotone in modo da essere mantenuto aderente al tessuto cutaneo è in grado di mobilizzare e catabolizzare i depositi grassi sottocutanei.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Polimero polisaccaridico di origine naturale, preferibilmente di origine vegetale, coniugato chimicamente ad una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.
2. Polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere costituito da unità di poli-D-glucosio.
3. Polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che le unità di D-glucosio sono legate tra di loro da costituire cellulosa.
4. Polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che la cellulosa forma fibre macroscopiche, in particolare fibre di cotone o viscosa.
5. Polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva non è biodegradabile a contatto con il corpo del paziente.
6. Polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni 1-4, caratterizzato dal fatto che la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva è biodegradabile a contatto con il corpo del paziente portando al rilascio della sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva oppure di un derivato di essa.
7. Polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva comprende uno o più dei seguenti legami scelti indipendentemente dal gruppo consistente del legame imminico, del legame amminico secondario, del legame singolo tra due atomi di azoto, del legame doppio tra due atomi di azoto, del legame peptidico e del legame disolfurico.
8. Polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 7 in cui la coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva comprende uno o più linker ottenuto/i da una sostanza scelta dal gruppo consistente di H2S, idrazina, acido 4-diazobenzoico, acido glutamico, acido aspartico, tio-treonina, cisteina o lisina.
9. Polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 8, in cui almeno un linker è legato di sua volta a due equivalenti di sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.
10. Polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni precedenti, coniugato ad una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva con proprietà antibatterica, antiinfiammatoria, antibiotica, fungistatica, antimicotica, disinfettante, antiemorragica, antisettica, immunostimolante, antitraumatica, antiallergica, cicatrizzante, riepitalizzante, antieritemica, anti-dermatopatica, antiscottatura, anestetica, anticoagulante, coagulante, anti-varicosa, anti-flebitica, antiaggregante piastrinica, fìbrinolitica, lipolitica, anti-rughe oppure anti-invecchiamento.
11. Filato oppure “tessuto-nontessuto” costituito da fibre di almeno un polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni precedenti.
12. Tessuto oppure “tessuto-nontessuto” costituito da almeno un filato secondo la rivendicazione 11.
13. Metodo per l'ottenimento di un polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni 1-10 oppure di filati, tessuti o “tessutinontessuti" secondo la rivendicazione 11 o 12, comprendente le seguenti fasi: (a) la creazione, sulle fibre di polimero polisaccaridico, oppure sui filati, tessuti o “tessuti-nontessuti” ottenuti da esse, di siti adatti alla coniugazione chimica, mediante la modifica di almeno alcuni dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico, ottenendo un polimero polisaccaridico attivato, e (b) la reazione tra il polimero polisaccaridico attivato e tra una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva o di un derivato di essa sotto la formazione di una coniugazione chimica tra il polimero polisaccaridico attivato e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva, e, opzionalmente, (c) la modifica, mediante reazione chimica, della natura della coniugazione chimica stabilita, nelle fasi (a) e (b), tra il polimero polisaccaridico e la sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva.
14. Metodo secondo la rivendicazione 13, fase (a), consistente nell’ossidazione almeno parziale dei gruppi alcolici presenti sul polimero polisaccaridico sotto ottenimento di un polimero polisaccaridico attivato comprendente dei gruppi aldeidici.
15. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che la modifica di almeno alcuni dei gruppi OH alcolici secondo la fase (a) comprende di sua volta le seguenti fasi: (al) l'esterificazione dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico con acido glutamico o acido aspartico, ottenendo un primo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente, (a2) la reazione tra il primo polimero polisaccaridico attivato e tra un linker oppure un gruppo d’uscita, ottenendo un secondo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente (a2+n) ulteriori ripetizioni della fase (a2) per l’ottenimento di ulteriori polimeri polisaccaridici attivati.
16. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che la modifica di almeno alcuni dei gruppi OH alcolici secondo la fase (a) comprende di sua volta le seguenti fasi: (al) l’ossidazione, oppure la sostituzione di almeno alcuni dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico ottenendo un primo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente, (a2) la reazione tra il primo polimero polisaccaridico attivato e tra un primo linker oppure un primo gruppo d'uscita, ottenendo un secondo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente, (a3) la modifica, mediante reazione chimica, della natura della coniugazione chimica stabilita, nelle fasi (a1) e (a2), tra il primo polimero polisaccaridico attivato ed il linker oppure tra il primo polimero polisaccaridico attivato ed il gruppo d’uscita ottenendo un terzo polimero polisaccaridico attivato, e, opzionalmente, (a4) la reazione tra il secondo o, rispettivamente, terzo polimero polisaccaridico attivato ottenuto secondo la fase (a2), o, rispettivamente, fase (a3), e tra un secondo linker oppure un secondo gruppo d’uscita, ottenendo un terzo oppure, rispettivamente, quarto polimero polisaccaridico attivato in cui il primo linker è stato esteso con il secondo linker oppure in cui il gruppo d’uscita è stato rimpiazzato dal secondo gruppo d’uscita oppure dal secondo linker, e, opzionalmente, (a4+n) ulteriori ripetizioni della fase (a4) per l’ottenimento di ulteriori polimeri polisaccaridici attivati.
17. Metodo secondo la rivendicazione 16, consistente nelle seguenti fasi: (al ) la sulfonesterizzazione almeno parziale dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico mediante reazione con tosilcloruro oppure mesil-cloruro ottenendo un primo polimero polisaccaridico attivato, e (a2) lo scambio dei gruppi tosilici o mesilici presenti sul primo polimero polisaccaridico attivato con gruppi SH, ottenendo un secondo polimero polisaccaridico attivato comprendente dei gruppi tiolici, e (a3) la reazione del secondo polimero polisaccaridico attivato comprendente gruppi tiolici con cistina, ottenendo un terzo polimero polisaccaridico attivato comprendente un linker cisteinilico connesso al secondo polimero polisaccaridico mediante un legame disolfurico.
18. Metodo secondo la rivendicazione 16, consistente (al) nell’ossidazione almeno parziale dei gruppi OH alcolici presenti sul polimero polisaccaridico sotto ottenimento di un primo polimero polisaccaridico attivato comprendente dei gruppi aldeidici, e, (a2) nella reazione tra il primo polimero polisaccaridico attivato comprendente gruppi aldeidici e tra lisina, portando all' ottenimento di un secondo polimero polisaccaridico attivato che costituisce la base di Schiff formata tra il primo polimero polisaccaridico attivato ed uno dei gruppi amminici della lisina, e, opzionalmente, (a3), la riduzione del secondo polimero polisaccaridico attivato, sotto ottenimento del terzo polimero polisaccaridico in cui il gruppo imminico presente nella base di Schiff è stato ridotto alla corrispondente ammina secondaria.
19. Metodo secondo la rivendicazione 13, fase (b), consistente nella formazione di legami peptidici tra un polimero polisaccaridico attivato ottenuto secondo la rivendicazione 15, oppure tra il terzo polimero polisaccaridico attivato, ottenuto mediante la rivendicazione 17 o 18, al termine carbossilico e/o amminico del linker glutamilico, aspartilico, lisilico o cisteinilico , e tra una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva comprendente almeno un gruppo amminico e/o carbossilico.
20. Metodo secondo la rivendicazione 13, fase (b), consistente nella formazione della base di Schifi tra i gruppi aldeidici del polimero polisaccaridico ottenuto secondo la rivendicazione 14, e tra una sostanza farmacologicamente o biologicamente attiva oppure un derivato di essa comprendente almeno un gruppo amminico.
21. Metodo secondo la rivendicazione 13, fase (b), consistente nella formazione della base di Schifi tra un gruppo carbonilico presente in una sostanza farmacologicamente o biologociamente attiva oppure in un derivato di essa e tra - il gruppo amminico del linker lisilico o cisteinilico presente nel terzo polimero polisaccaridico attivato, ottenuto mediante la rivendicazione 17 o 18, oppure - il gruppo amminico del linker glutamilico o aspartilico presente nel polimero polisaccaridico attivato ottenuto secondo la rivendicazione 15.
22. Metodo secondo la rivendicazione 13, fase (b), in cui il linker cisteinilico del terzo polimero polisaccaridico attivato, ottenuto mediante la rivendicazione 17, viene, mediante trattamento con una proteina farmacologicamente o biologicamente attiva comprendente cisteina, in cui i ponti disolfurici in essa contenuti sono stati anteriormente ridotti sotto rigenerazione dei relativi gruppi tiolici, scambiato con la proteina farmacologicamente o biologicamente attiva, stabilendo, sotto espulsione della cisteina, un legame disolfurico tra la proteina farmacologicamente o biologicamente attiva e tra il secondo polimero polisaccaridico attivato secondo la rivendicazione 17.
23. Metodo secondo la rivendicazione 13, fase (c), consistente nella riduzione della base di Schifi ottenuta secondo la rivendicazione 13, fase (b), sotto ottenimento della corrispondente ammina secondaria.
24. Uso di almeno un polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni 1-10 oppure uso di un filato, di un tessuto oppure di un “tessuto-nontessuto” secondo la rivendicazione 11 o 12 come medicinale.
25. Articolo medicinale per l’applicazione topica comprendente almeno un polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni 1-10, oppure un filato, un tessuto oppure un “tessuto-nontessuto” secondo la rivendicazione 11 o 12.
26. Uso di almeno un polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni 1-10 oppure uso di un filato, di un tessuto oppure di un “tessuto-nontessuto" secondo la rivendicazione 11 o 12 per la preparazione di un medicinale per la terapia topica di emorragie, infezioni, micosi, infiammazioni, traumi, scottature, allergie, eritemi, dermatopatie, necrosi, orticarie, psoriasi, pemfigo.
27. Uso di almeno un polimero polisaccaridico secondo una delle rivendicazioni 1-10 oppure uso di un filato, di un tessuto oppure di un “tessuto-nontessuto” secondo la rivendicazione 11 o 12 per la preparazione di un medicinale ad applicazione topica per l’induzione della cicatrizzazione, l' immunostimulazione oppure per la prevenzione di allergie.
Uso di almeno un polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 1- 10 oppure uso di un filato, di un tessuto oppure di un “tessuto-nontessuto” secondo la rivendicazione 11 o 12 per la riduzione del grasso corporeo, per la prevenzione della formazione di rughe sulla pelle, per la prevenzione dell'invecchiamento della pelle, oppure per l'ottenimento di articoli igienici.
29. Articolo igienico o cosmetico comprendente un polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 1- 10 oppure un filato, di un tessuto oppure un “tessuto-nontessuto” secondo la rivendicazione 11 o 12.
30. Uso di almeno un polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 1-10 oppure uso di un filato, di un tessuto oppure di un "tessuto-nontessuto" secondo la rivendicazione 11 o 12 nel campo dell'industria alimentare, in particolare neH’ambito della produzione di insaccati {salumi) o formaggi. Filtro o involucro per alimenti costituito da un polimero polisaccaridico secondo la rivendicazione 1- 10 oppure da un filato, da un tessuto oppure da un “tessuto-nontessuto” secondo la rivendicazione 11 o 12.