NL9101531A

NL9101531A - ADSORPTIVELY IMMOBILIZED ENZYMES ON FIXED ENZYME CARRIERS, AND THEIR APPLICATION THEREOF.

Info

Publication number: NL9101531A
Application number: NL9101531A
Authority: NL
Original assignee: Roehm Gmbh
Priority date: 1990-09-15
Filing date: 1991-09-10
Publication date: 1992-04-01
Also published as: FR2666812A1; ITTO910697A1; ITTO910697A0; DE4029374A1; DK159891D0; IT1250017B; FR2666812B1; CH682401A5; DK159891A

Description

Op vaste enzymdragers adsorptief geïmmobiliseerde enzymen, alsmede de toepassing daarvan.Enzymes immobilized on solid enzyme carriers and their use.

Gebied van de uitvindingField of the invention

De uitvinding heeft betrekking op enzymen, die op deeltjes natuurlijke stof van hoofdzakelijk cellulosekarakter geïmmobiliseerd zijn en die in het bijzonder voor de toepassing in organische milieus geschikt zijn.The invention relates to enzymes which are immobilized on natural matter particles of mainly cellulosic character and which are particularly suitable for use in organic environments.

Stand der techniekState of the art

Reeds vroegtijdig werd ingezien, welke voordelen een fixering op een drager van enzymen bij de technische toepassing met zich meebrengt. Op de eerste plaats zijn hier de meest probleemloze opnieuw-toepasbaarheid bij gewoonlijk gering verlies aan activiteit, de winning van enzymvrije omzettingsprodukten en de mogelijkheid van een continue uitvoering van de werkwijze te noemen. Bijzonder actueel is de immobili-sering, wanneer enzymen in organische milieus voor de toepassing in aanmerking moeten komen (vgl. A.M. Klibanow et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 3192 (19δ5); Kazandjian et al. Biotechnology andThe benefits of fixing on an enzyme support in technical applications were recognized early on. Firstly, the most problematic re-usability with usually low loss of activity, the recovery of enzyme-free conversion products and the possibility of continuous operation of the process can be mentioned here. The immobilization is particularly topical when enzymes in organic environments are to be considered for use (cf. AM Klibanow et al. In Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 3192 (19δ5); Kazandjian et al. Biotechnology and

Bioengineering Vol. XXVIII, blz. bY]-h21 (1986).Bioengineering Vol. XXVIII, pp. BY] -h21 (1986).

Daarbij gaat het doorgaans om dure enzymen (zoals b.v. lipasen met een hoge specificiteit, esterasen, fosfolipasen enz.), waarvan de opnieuw-toepasbaarheid een economische noodzaak is. Verder speelt daarbij een rol, dat bij reacties in organisch milieu een gering watergehalte in de reactiezone noodzakelijk is. Een immobilisaat veroorlooft door zijn zeer gedefinieerde wateropname (overwegend als "zwelgedrag" op te vatten) een nauwkeurige instelling van het noodzakelijke watergehalte.These are usually expensive enzymes (such as, for example, high-specificity lipases, esterases, phospholipases, etc.), the reusability of which is an economic necessity. Another factor that plays a role is that a low water content in the reaction zone is necessary for reactions in the organic environment. An immobilisate allows, by its very defined water absorption (predominantly understood as "swelling behavior"), an accurate adjustment of the necessary water content.

De reacties in het organische milieu verlangen in het algemeen een zo groot mogelijk grensvlak tussen het organische milieu, waarin het substraat zich bevindt, en het enzym. Voor dergelijke heterogene reactie-omstandigheden biedt een uitgekozen drager met een zo hoog mogelijk geometrisch oppervlak de ideale reactieplaats. Daarentegen zijn enzymdragers voor homogene reacties waarbij op een groot inwendig oppervlak (poriënvolume) gelet wordt, voor deze reactieweg meestal niet geschikt. Zoals reeds vermeld is een reeks van enzymen, in het bijzonder van het type van de hydrolasen, in een organisch milieu werkzaam gebleken.The reactions in the organic environment generally require the largest possible interface between the organic environment in which the substrate is located and the enzyme. For such heterogeneous reaction conditions, a selected support with the highest possible geometric surface area offers the ideal reaction site. On the other hand, enzyme carriers for homogeneous reactions that pay attention to a large internal surface (pore volume) are usually not suitable for this reaction route. As already mentioned, a series of enzymes, especially of the type of the hydrolases, have been found to be active in an organic environment.

Mogelijkerwijze kunnen nog verdere enzymen resp. enzymgroepen met succes in een organisch milieu worden toegepast. Als paradigmatisch voor de technische eisen van de onderhavige uitvinding en de onderhavige problematiek wordt onderstaand de klasse van de lipasen (glycerolester-hydrolasen, E.C. 3-1-1 *3) weergegeven. (Vgl. P. Gramatica in "Chimia oggi" 1989, blz. 9; M. Schneider, E.H. Reimerdes in Forum Mikrobiologie 9/87, blz. 302).Possibly still further enzymes resp. enzyme groups are successfully used in an organic environment. As a paradigm for the technical requirements of the present invention and the present problem, the class of lipases (glycerol ester hydrolases, E.C. 3-1-1 * 3) is shown below. (Compare P. Gramatica in "Chimia oggi" 1989, p. 9; M. Schneider, E.H. Reimerdes in Forum Microbiology 9/87, p. 302).

Met behulp van geïmmobiliseerde lipasen kunnen in een organisch milieu onder geschikte omstandigheden heresteringen, veresteringen, alcoholyses, acidolyses en hydrolyses worden uitgevoerd. Dergelijke reacties spelen in de vetindustrie een grote rol. Het gaat daarbij om uitgerijpte technische werkwijzen, gebaseerd op uitvoerig onderzochte chemische processen.With the aid of immobilized lipases, transesterifications, esterifications, alcoholyses, acidolyses and hydrolyses can be carried out under suitable conditions in an organic environment. Such reactions play a major role in the fat industry. These are mature technical methods, based on extensively researched chemical processes.

Voor overeenkomstige biologische processen bestaat overwegend (noch) geen behoefte, zij het dan, dat aan het produkt van de werkwijze hogere eisen (b.v. zuiverheid, kleur, stereospecificiteit en dergelijke) gesteld worden. Twee produkten worden als plaatsvervanger voor dergelijke speciale enzymen genoemd:There is predominantly (nor) no need for corresponding biological processes, albeit that higher demands are placed on the product of the process (e.g. purity, color, stereospecificity and the like). Two products are mentioned as substitutes for such special enzymes:

Een op ionenuitwisselaar geadsorbeerde Mucor mihei-lipase (LIPOZYMeW Van de firma Novo)Mucor mihei-lipase adsorbed on ion exchanger (LIPOZYMeW From Novo)

Met behulp van acetonprecipitatie op diatomeeënaarde neergeslagen lipase (vgl. Brits octrooischrift 1.577*933)·Lipase precipitated on diatomaceous earth by acetone precipitation (cf. British Patent Specification 1,577 * 933) ·

Doelstelling en oplossingObjective and solution

Een toepassing op groottechnische schaal van waardevolle enzymen - wederom worden als voorbeeld lipasen genoemd - waardoor de gevestigde chemische werkwijzen vervangen hadden kunnen worden, is tot dusverre steeds aan de economische gegevens - lipasen zijn ook na de immobilise-ring veel te kostbaar - en aan de moelijke omzettingsomstandigheden-meestal gaat het om heterogene systemen - mislukt. Het kan derhalve ook niet verrassend zijn, dat uit de vele voorstellen voor enzymatische synthesen tot dusverre geen industrieel proces naar voren gekomen is, waarbij het probleem van het hergebruik van het enzym grotendeels onopgelost is. Derhalve bestond zoals tevoren een behoefte aan een goedkoop, op dragermateriaal geïmmobiliseerd lipase.An application on a large scale of valuable enzymes - again mentioned as example lipases - which could have replaced the established chemical processes, has hitherto always been economical - lipases are still too expensive after immobilization - and difficult conversion conditions - mostly heterogeneous systems - fail. It should therefore come as no surprise that the many proposals for enzymatic syntheses have so far not revealed an industrial process, the problem of enzyme recycling being largely unsolved. Therefore, as before, there was a need for an inexpensive lipase immobilized on support material.

Gevonden werd nu, dat volgens de uitvinding geïmmobiliseerde enzymen aan de eisen van de techniek in bijzondere mate voldoen.It has now been found that enzymes immobilized according to the invention meet the requirements of the art to a special extent.

De uitvinding heeft betrekking op adsorptief geïmmobiliseerde enzymen E, die op enzymdragers ED, bestaande uit niet-gemodificeerde deeltjes natuurlijke stof met overwegend cellulosekarakter zoals houtmeel, cellulosevezels of katoen-1inters aangebracht zijn.The invention relates to adsorptively immobilized enzymes E, which are applied to enzyme carriers ED, consisting of unmodified particles of natural substance of predominantly cellulosic character, such as wood flour, cellulose fibers or cotton fibers.

De volgens de uitvinding toe te passen deeltjes natuurlijke stof hebben als regel een deeltjesgrootte in het traject van 0,01 - 1 mm. In de stand der techniek heeft men voor het fixeren andere wegen ingeslagen.The particles of natural material to be used according to the invention generally have a particle size in the range of 0.01 - 1 mm. In the prior art, other paths have been taken for fixing.

Cellulose en lignine zijn na kostbare modificering bijvoorbeeld door perjodaatoxidatie en reductieve aminering als reactieve enzym-dragers beschreven (vgl. de internationale octrooiaanvrage PCT 81.02.860; Fengxie et al. Biotechnol. Letters Vol. 10, 221 (1988)). Covalente enzymbinding aan cellulose wordt in zeer algemene vorm ook in de Britse octrooiaanvrage 1.407.488 voorgesteld. Aan parels van cellulose covalent gebonden β-maltase wordt b.v. door H. Maeda et al. in Biotechnol. Bioeng. 20, 383 (1978) beschreven.Cellulose and lignin, after costly modification, have been described, for example, by periodate oxidation and reductive amination as reactive enzyme carriers (cf. international patent application PCT 81.02.860; Fengxie et al. Biotechnol. Letters Vol. 10, 221 (1988)). Covalent enzyme binding to cellulose is also presented in very general form in British patent application 1,407,488. For example, β-maltase bonded to cellulose beads is used e.g. by H. Maeda et al. in Biotechnol. Bioeng. 20, 383 (1978).

Bij de enzymdragers ED volgens de uitvinding gaat het in tegenstelling tot de stand der techniek om niet chemisch-gemodificeerde deeltjes natuurlijke stof. De vezels, die de deeltjes natuurlijke stof vormen, zijn derhalve niet chemisch reactief.In contrast to the prior art, the enzyme carriers ED according to the invention are non-chemically modified particles of natural substance. The fibers, which form the particles of natural matter, are therefore not chemically reactive.

De enzymen (zie "de enzymen" in het onderstaande) worden bij voorkeur uit een water bevattend milieu op de enzymdrager ED aangebracht, Bijvoorbeeld bedient men zich daarbij van de uit het DE-A-3.5i5.252 bekende methode, dat wil zeggen de koppeling bij aanwezigheid van een relatief hoge zoutconcentratie, eventueel ook bij licht verhoogde temperaturen. Sulfaten en fosfaten, maar ook andere uitzoutende zouten zijn hiervoor het best geschikt.The enzymes (see "the enzymes" below) are preferably applied from an aqueous medium to the enzyme carrier ED. For example, one uses the method known from DE-A-3.5i5.252, i.e. the coupling in the presence of a relatively high salt concentration, possibly also at slightly elevated temperatures. Sulfates and phosphates, but also other salting salts are best suited for this.

De toepassing van de geïmmobiliseerde enzymen volgens de uitvinding vindt echter bij voorkeur in organisch milieu OM plaats, bij voorkeur bij aanwezigheid van sporen water. Als richtlijn wordt 0,0004 - 1 gew.% water, betrokken op het organische milieu, aangegeven.However, the use of the immobilized enzymes according to the invention preferably takes place in an organic environment OM, preferably in the presence of traces of water. 0.0004-1% by weight of water, based on the organic environment, is given as a guideline.

De enzymen EThe enzymes E

Als te immobiliseren enzymen E zijn op industriële schaal toe te passen enzymen geschikt, in het bijzonder wanneer de toepassing daarvan in organisch milieu praktisch is.Enzymes to be immobilized are suitable for use on an industrial scale, especially when their use in an organic environment is practical.

Genoemd worden in het bijzonder de klassen van de hydrolasen (b.v. E.C.3, in het bijzonder E.C.3.I., E.C.3.2.I.; E.C.3.4.) van de isomerasen (b.v. E.C.5, in het bijzonder E.C.5.3·!)» van de oxido-reductasen (E.C.l, in het bijzonder E.C.1.1; E.C.1.10; E.C.1.11; E.C.l.13) en van de transferasen (E.C.2, in het bijzonder E.C.2.1; E.C.2.4) (Enzyme Nomenclature, Elsevier Scientific Publishing Company 1973» Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd. Ed. Vol. 9, 148 - 240, biz. 175-178 e.v., I98O). Speciaal genoemd worden bijvoor- beeld de esterasen (E.C.3.1.1.), proteasen (E.C.3.4.12; E.C.3.4.21; E.C.3-4.22; E.C.3*4.23; E.C.3.4.24) dehydrogenasen (E.C.1.1.1, 1.1.3). peroxidasen (E.C.1.11.1) glycosyltransferasen (E.C.2.4) en in het bijzonder de lipasen (E.C.3.1.1.3), de fosfolipasen van het type A2 (E.C.3.1.1.4), B (E.C.3.1.1.5), C (E.C.3-1.4.3) en D (E.C.3.1.4.4), het glucoseoxidase (E.C.1.1.3·4), peroxidase (E.C.1.11.1.6), lipoxidase (E.C.I.13.11.12), hexosyltransferasen E.C.2.4.1) en pentoxytransferasen (E.C.2.4.2).Particular mention is made of the classes of the hydrolases (eg EC3, in particular EC3.I., EC3.2.I .; EC3.4.) Of the isomerases (eg EC5, in particular EC5.3 ·!) »Of the oxido reductases (EC1, in particular EC1.1; EC1.10; EC1.11; ECl13) and of the transferases (EC2, in particular EC2.1; EC2.4) (Enzyme Nomenclature, Elsevier Scientific Publishing Company 1973 Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd Ed. Vol. 9, 148-240, pp. 175-178 ff., 98). Specially mentioned are, for example, the esterases (EC3.1.1.), Proteases (EC3.4.12; EC3.4.21; EC3-4.22; EC3 * 4.23; EC3.4.24) dehydrogenases (EC1.1.1, 1.1.3). peroxidases (EC1.11.1) glycosyl transferases (EC2.4) and in particular lipases (EC3.1.1.3), phospholipases of type A2 (EC3.1.1.4), B (EC3.1.1.5), C (EC3 -1.4.3) and D (EC3.1.4.4), the glucose oxidase (EC1.1.3.4), peroxidase (EC1.11.1.6), lip oxidase (ECI13.11.12), hexosyl transferases EC2.4.1) and pentoxy transferases ( EC2.4.2).

Met betrekking tot de enzymen worden in het bijzonder genoemd: A) Lipasen (E.C.3.1.1.3)With regard to the enzymes, the following are specifically mentioned: A) Lipases (E.C.3.1.1.3)

Zoals algemeen gebruikelijk worden als lipasen carboxyl-esterasen aangeduid, die gewoonlijk glycerolesters in waterige emulsie afsplitsen.As commonly used, lipases are referred to as carboxyl esterases, which usually cleave glycerol esters in aqueous emulsion.

Ze onderscheiden zich in zoverre van andere carboxyl-esterasen, die het substraat in een oplossing in water afsplitsen.They differ from other carboxyl esterases in that they split off the substrate in an aqueous solution.

а) Pancreas-lipasenа) Pancreatic lipases

Het pancreatische enzymcomplex bevat naast lipasen meestal esterasen, alsmede proteasen en amylasen als technische belangrijke begeleidende enzymen. De optimale pH (ten opzichte van olijfolie) ligt in het traject 7 “ 8.5. het activiteitstraject ligt bij PH 6,5 - 9,5.In addition to lipases, the pancreatic enzyme complex usually contains esterases, as well as proteases and amylases as technically important accompanying enzymes. The optimal pH (relative to olive oil) is in the range 7 “8.5. the activity trajectory lies at PH 6.5 - 9.5.

Lipasen zijn in het algemeen zeer instabiel, in het bijzonder ten opzichte van proteolytische afbraak door begeleidende proteasen.Lipases are generally very unstable, especially with regard to proteolytic degradation by accompanying proteases.

б) Microbiologische lipasen b.v. uit Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (b.v.б) Microbiological lipases e.g. from Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (e.g.

A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp.A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp.

(b.v. chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp.(e.g., chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp.

(R. nigricans, R. oryzae).(R. nigricans, R. oryzae).

Deze lipasen bezitten als regel ten minste een pH-optimum bij pH >7,0. Lipasen worden, voorzover hun instabiliteit dit toelaat, onder andere toegepast bij de verwijdering van afval, de lederindustrie en in de voedingsbranche.These lipases generally have at least a pH optimum at pH> 7.0. Lipases, insofar as their instability permits, are used, among other things, in waste disposal, the leather industry and in the food industry.

Op gebruikelijke wijze wordt de bepaling van de activiteit van lipasen met olijfolie als substraat uitgevoerd, verder met triacetine en tributyrine. [Vgl. M. Sémériva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971);The determination of the activity of lipases with olive oil as a substrate is carried out in a usual manner, further with triacetin and tributyrine. [Cf. M. Sémériva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971);

Pharmaceutical Enzymes, uitgegeven door R. Ruyssen and A. Lauwers 1978, (FIP)].Pharmaceutical Enzymes, published by R. Ruyssen and A. Lauwers 1978, (FIP)].

Voorzover de vet-afsplitsende activiteit in kilo-lipase-units (eenheid = KLCA) wordt uitgedrukt, wordt onder de standaardomstandigheden: 40°C, pH = 5.5 met tributyrine als substraat gewerkt.Insofar as the fat-splitting activity is expressed in kilo-lipase units (unit = KLCA), the standard conditions are: 40 ° C, pH = 5.5 with tributyrin as substrate.

(Vgl. M. Sémériva, bovengenoemde literatuurplaats).(Cf. M. Sémériva, above literature reference).

B) Katalasen/hydroperoxidasen (E.C.1.11.1.6) a) uit dierlijk weefsel b.v. uit lever β) uit planten b.v. uit mierikswortel ƒ) uit micro-organismen b.v. uit micrococcus lysodeicticus Katalasen worden gewoonlijk gebruikt voor de peroxide-bleking en in de melkindustrie.B) Catalases / hydroperoxidases (E.C.1.11.1.6) a) from animal tissue e.g. from liver β) from plants e.g. from horseradish ƒ) from micro-organisms e.g. from micrococcus lysodeicticus. Catalases are commonly used for peroxide bleaching and in the milk industry.

C) Proteasen (E.C.3.Kirk-Othmer, loc.cit. Vol. % K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industrial Aspects of Biochemistry, Vol. 20 (I), biz. 23-46, North Holland (1974) a) dierlijke herkomst, zoals bijvoorbeeld a) rennine (E.C.3.4.23.4) β) Pancreas-proteasenC) Proteases (EC3.Kirk-Othmer, loc.cit. Vol.% K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industrial Aspects of Biochemistry, Vol. 20 (I), biz. 23-46, North Holland (1974) a) animal origin, such as for example a) rennine (EC3.4.23.4) β) Pancreatic proteases

Pancreatine, in het bijzonder trypsine, chymotrypsine (pH-werkingstraject ongeveer 7 - 10)Pancreatin, especially trypsin, chymotrypsin (pH action range about 7 - 10)

Pepsine (E.C.3.4.23.1) pH-werkingstraject ongeveer 1,5 - 4,0)Pepsin (E.C.3.4.23.1) pH action range about 1.5 - 4.0)

Kathepsine (E.C.3-4.23.5)Kathepsin (E.C.3-4.23.5)

Werkingstraject ongeveer 4,0 - 5.0.Operating range about 4.0 - 5.0.

b) plantaardige herkomst a) Papaine (E.C.3.4.22.1) pH-werkingstraject ongeveer 5.0 - 8,0 β) Ficine (E.C.3.4.22.3) pH-werkingstraject ongeveer 4,0-9.0 ƒ) Bromelaine (E.C.3-4.22.4 en 3.4.22.5) pH-werkingstraject ongeveer 5.0 - 7.0 c) microbiële herkomst (vgl. L. Keay in "Process Biochemistry", 1971. 17 - 21.b) vegetable origin a) Papaine (EC3.4.22.1) pH effect range approximately 5.0 - 8.0 β) Ficin (EC3.4.22.3) pH effect range approximately 4.0-9.0 ƒ) Bromelaine (EC3-4.22.4 and 3.4.22.5) pH action range about 5.0 - 7.0 c) microbial origin (cf. L. Keay in "Process Biochemistry", 1971. 17-21.

α) uit Bacillus-soorten zoals B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus.α) from Bacillus species such as B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus.

B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides.B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides.

β) uit Streptococcus-soorten ƒ) uit Streptomyces-soorten zoals Streptomyces fradiae, S. griseus, S. rectus q) uit Aspergillus-soorten zoals Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usamii e) uit Mucor- en Rhizopus-soorten zoals Mucor pusillus, M. miehei Ύ ) Endothia-soorten r zoals Endothia parasitica μ) uit Trametes-soorten zoals Trametes sanguineaβ) from Streptococcus species ƒ) from Streptomyces species such as Streptomyces fradiae, S. griseus, S. rectus q) from Aspergillus species such as Aspergillus flavus oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usamii e) from Mucor - and Rhizopus species such as Mucor pusillus, M. miehei Ύ) Endothia species r such as Endothia parasitica μ) from Trametes species such as Trametes sanguinea

Naast het onderscheid naar de herkomst vindt ook het onderscheid volgens het aangrijpingspunt (exo-versus endo-enzym) en op grond van de "active site" van de proteasen (serine-proteasen, die door DFP geremd worden, sulfhydryl-enzym) toepassing.In addition to the distinction according to origin, the distinction according to the target point (exo versus endo enzyme) and on the basis of the "active site" of the proteases (serine proteases, which are inhibited by DFP, sulfhydryl enzyme) is also used.

Verder is van aanzienlijk praktisch belang de afhankelijkheid van de pH van de enzymactiviteit. Men onderscheidt daarom op de eerste plaats onder praktische gezichtspunten i) Alkalische proteasen, met een werkingsoptimum ongeveer in het traject van pH 7*5 tot 13, in het bijzonder alkalische bacterie-proteasen (E.C.3.4.21) (die meestal tot het serine-type behoren) en alkalische s chimmelproteasen ii) Neutrale proteasen, met een werkingsoptimum in het traject van pH 6,0 - 9,0 in het bijzonder neutrale bacterie-proteasen (E.C.3.4.24) (die tot de metallo-enzymen behoren) en schimmelproteasen, bijvoorbeeld Bacillus-proteasen, Pseudomonas-proteasen,Furthermore, the dependence of the pH on the enzyme activity is of considerable practical importance. Therefore, one distinguishes primarily among practical viewpoints i) Alkaline proteases, with an action optimum approximately in the range of pH 7 * 5 to 13, in particular alkaline bacterial proteases (EC3.4.21) (which usually belong to the serine type) and alkaline fungal proteases ii) Neutral proteases, with an action optimum in the range of pH 6.0 - 9.0 in particular neutral bacterial proteases (EC3.4.24) (which belong to the metallo enzymes) and fungal proteases, for example Bacillus proteases, Pseudomonas proteases,

Streptomyces-proteasen, Aspergillus-proteasen.Streptomyces proteases, Aspergillus proteases.

iii) Zure proteasen met een werkingsoptimum in het traject van pH 2,0 - 5,0 (E.C.3.4.23) in het bijzonder zure schimmelproteasen, b.v. uit Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp.,iii) Acid proteases with an activity optimum in the range of pH 2.0-5.0 (E.C.3.4.23), especially acidic fungal proteases, e.g. from Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp.,

Mucor spp., en Impex lacteus en Endothitia parasitica.Mucor spp., And Impex lacteus and Endothitia parasitica.

Proteasen worden onder andere bij de lederbereiding, in wasmiddelen en bij de reinging, bij het ontslichten, bij de kaasbereiding, bij vleesopbouw en bij het stabiliseren van bier op industriële schaal toegepast.Proteases are used on an industrial scale, for example in leather preparation, in detergents and in cleaning, in de-lightening, in cheese preparation, in meat building and in beer stabilization.

Genoemd worden als alkalische proteasen in het bijzonder de subtilisinen, alkalische bacterie-proteinasen van het serine-type, die in het pH-traject 9 " 10 stabiel en tegen perboraat enigszins ongevoelig zijn.Particularly mentioned as alkaline proteases are the subtilisins, alkaline bacterial proteinases of the serine type, which are stable in the pH range 9-10 and somewhat insensitive to perborate.

De proteolytische werkzaamheid van enzymen wordt op de gebruikelijke wijze volgens de Anson-Haemoglobine-methode (M.L. Anson J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939) resp. volgens de Löhlein-Volhard-methode (de Löhlein-Volhard'sche methode voor het bepalen van de proteolytische activiteit. Gerbereichem. Taschenbuch, Dresden-Leipzig, 1955) als "LVE" (Löhlein-Volhard-eenheid) bepaald.The proteolytic activity of enzymes is determined in the usual manner by the Anson-Hemoglobin method (ML Anson J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939) or by the Löhlein-Volhard method (the Löhlein-Volhard's method for determination of the proteolytic activity Gerbereichem, Taschenbuch, Dresden-Leipzig, 1955) as "LVE" (Löhlein-Volhard unit).

Onder een Löhlein-Volhard-eenheid moet die hoeveelheid enzym worden verstaan, die onder de specifieke omstandigheden volgens de methode 1,725 mg caseïne verteert. Voorts worden onderstaand voor de bepaling van de activiteit van de in het zure traject werkzame enzymen eenheden toegepast, die uit de Anson-methode zijn afgeleid. Deze worden als "Proteinase-Units (Haemoglobin)” aangeduid. Een UHb komt overeen met de hoeveelheid enzym, welke het vrijmaken van in trichloorazijnzuur oplosbare breukstukken uit haemoglobine equivalent aan 1 pmol tyrosine per minuut bij 37°C (gemeten bij 280 nm) katalyseert.A Löhlein-Volhard unit is understood to mean that amount of enzyme which, under the specific conditions, digests 1.725 mg of casein according to the method. In addition, units derived from the Anson method are used below for determining the activity of the enzymes active in the acid range. These are referred to as "Proteinase Units (Haemoglobin)". A UHb corresponds to the amount of enzyme which catalyzes the release of trichloroacetic acid soluble fractions from hemoglobin equivalent to 1 pmol tyrosine per minute at 37 ° C (measured at 280 nm). .

(1 mUHb = 10”3 UHb).(1 mUHb = 10 ”3 UHb).

D) FosfolipasenD) Phospholipases

Onder fosfolipasen wordt zoals gebruikelijk de groep van hydro-lasen verstaan, die fosfolipiden hydrolytisch splitsen en wel hetzij de carbonzuur-esterbinding (fosfolipasen A en B) hetzij de fosforzuur-esterbinding (Fosfolipasen C en D). Lecithine-afsplitsende fosfolipasen worden ook als lecithinasen aangeduid.Phospholipases are, as usual, understood to mean the group of hydrolases which hydrolytically cleave phospholipids, either the carboxylic acid ester bond (phospholipases A and B) or the phosphoric acid ester bond (Phospholipases C and D). Lecithin-cleaving phospholipases are also referred to as lecithinases.

Het onderscheid wordt algemeen volgens het aangrijpingspunt .genomen. De fosfolipasen A scheiden uit lecithine (resp. kefaline) een vetzuur af, waarbij lysolecithine (resp. lysokefaline) achterblijft. Fosfolipase A^ splitst eindstandige vetzuren af. Fosfolipase A2 (E.0.3.1.1.4) middenstandige, meestal onverzadigde, die in het geval van arachidonzuur tot prostaglandinen gemetaboliseerd kunnen worden.The distinction is generally taken according to the starting point. Phospholipases A secrete a fatty acid from lecithin (or kephalin), leaving behind lysolecithin (or lysokephalin). Phospholipase A ^ splits off terminal fatty acids. Phospholipase A2 (E.0.3.1.1.4) medium, usually unsaturated, which in the case of arachidonic acid can be metabolized to prostaglandins.

Bronnen voor fosfolipase A2 zijn bijvoorbeeld pancreas, insectengiffen en slangengiffen. Het fosfolipase B (Ε.0.3·1·1·5) splitst uit lysolecithine vetzuur af onder vorming van glycerolfosforzuurcholine-ester. Deze komt b.v.in koolhydraten, zoals rijstzemelen, mout, graan, aardappelen, erwten alsmede in schimmelfungi en wespengif voor.Sources for phospholipase A2 are, for example, pancreas, insect poisons and snake poisons. The phospholipase B (Ε.0.3 · 1 · 1 · 5) cleaves from lysolecithin fatty acid to form glycerol phosphoric choline ester. This occurs, for example, in carbohydrates, such as rice bran, malt, grain, potatoes, peas, as well as fungal fungi and wasp poison.

Fosfolipase C (E.C.3.1.4.3·) grijpt lecithine onder vorming van fosforylcholine aan. Deze komt bijvoorbeeld in Bacillus cereus, hersenen en in slangengif voor.Phospholipase C (E.C.3.1.4.3 ·) acts on lecithin to form phosphorylcholine. This occurs, for example, in Bacillus cereus, brains and in snake venom.

Het fosfolipase D (E.C.3-1-4.4.) maakt uit lecithine choline en als verder splitsingsprodukt fosfatidezuur vrij. Het kan b.v. uit Streptomyces chromofuscus gewonnen worden. Verder komen ze voor in bladplanten, zoals kool, spinazie, suikerbietbladeren, Hevea brasiliensis maar ook in rijstkiemlingen, gerstemout enz.Phospholipase D (E.C. 3-1-4.4.) Liberates lecithin choline and as further cleavage product phosphatidic acid. It can e.g. be extracted from Streptomyces chromofuscus. They are also found in foliage plants, such as cabbage, spinach, sugar beet leaves, Hevea brasiliensis, but also in rice sprouts, barley malt, etc.

In het algemeen ligt het pH-optimum bij de typen C en D bij ongeveer 8,0, bij de andere typen hoofdzakelijk bij pH 5 " 6.In general, the pH optimum for types C and D is about 8.0, for the other types mainly for pH 5-6.

(Vgl. E.A. Dennis, in P.D. Boyer (Ed.) The Enzymes, 3rd Ed.(Compare E.A. Dennis, in P.D.Boyer (Ed.) The Enzymes, 3rd Ed.

Vol. 16, pp. 307 - 353 Academic Press 1984;Full. 16, pp. 307 - 353 Academic Press 1984;

Voor de analyse: vgl. Vurioka & Matsuda, Anal. Biochem. 75, 281 (1976).)For the analysis: see Vurioka & Matsuda, Anal. Biochem. 75, 281 (1976).)

De enzymdrager EDThe enzyme carrier ED

De enzymdragers volgens de uitvinding zijn, zoals bovenstaand gedefinieerd - niet gemodificeerde deeltjes natuurlijke stof met hoofdzakelijk een cellulosekarakter. Niet gemodificeerd zijn ze in die zin, dat ze geen chemische omzetting, in het bijzonder geen enkel- soortige activering hebben ondergaan. Bijvoorbeeld worden in het bijzonder genoemd houtmeel, cellulosevezels, katoen-linters en dergelijke. Gewoonlijk zijn de volgens de uitvinding te gebruiken enzymdragers derhalve uit vezels opgebouwd resp. zijn ze vezelvormige deeltjes. Als regel bezitten de volgens de uitvinding te gebuiken deeltjes van natuurlijke stof een deeltjesgrootte van 0,01 - 1 mm (waarbij aan elke ruimte-as te denken is, die door het afzonderlijke deeltje kan worden gelegd).The enzyme carriers of the invention, as defined above, are unmodified particles of natural substance having mainly a cellulosic character. They are unmodified in that they have not undergone any chemical conversion, in particular no single activation. For example, particularly mentioned are wood flour, cellulose fibers, cotton linters and the like. Usually, the enzyme carriers to be used according to the invention are therefore built up from fibers, respectively. they are fibrous particles. As a rule, the particles of natural material to be used according to the invention have a particle size of 0.01 - 1 mm (think of any space axis which can be laid by the separate particle).

Het immobiliseringsprocesThe immobilization process

De enzymen worden bij voorkeur uit een oplossing in water op de enzymdrager ED aangebracht. Als richtsnoer wordt een verhouding enzym/water van ongeveer 1:(10-20) aangegeven. De oplossing in water kan met voordeel nog op zich bekende toevoegsels aan de enzymformuleringen, zoals stabiliseermiddelen, stelmiddelen, zoals b.v. natriumsulfaat, bevatten. Als richtsnoer voor het zoutgehalte wordt ongeveer 1/5 - 1/15 van de hoeveelheid water aangegeven. Het is doelmatig gebleken, eerst het enzym in water op te lossen, dan bijvoorbeeld natriumsulfaat toe te voegen en ten laatste de deeltjes natuurlijke stof, bijvoorbeeld in de vorm van houtmeel. Men laat het enzym gedurende een bepaalde tijdsperiode, gewoonlijk ongeveer 20 uur en onder dooreenmengen bijvoorbeeld door roeren op de enzymdrager optrekken, waarbij het - afhankelijk van de gebruikte enzymen - vaker wordt aanbevolen, boven kamertemperatuur, bijvoorbeeld bij 40°C te werken. Tenslotte wordt afgezogen en wordt de beladen enzymdrager ED gedroogd.The enzymes are preferably applied to the enzyme carrier ED from a solution in water. As a guideline, an enzyme / water ratio of about 1: (10-20) is indicated. The aqueous solution may advantageously contain additives known per se to the enzyme formulations, such as stabilizers, adjusting agents, such as e.g. sodium sulfate. Approximately 1/5 - 1/15 of the amount of water is given as a guideline for salinity. It has proved effective to first dissolve the enzyme in water, then add, for example, sodium sulfate and finally the particles of natural substance, for example in the form of wood flour. The enzyme is allowed to recover for a period of time, usually about 20 hours and with mixing, for example, by stirring on the enzyme carrier, depending on the enzymes used, it is more often recommended to work above room temperature, for example at 40 ° C. Finally, suction is performed and the loaded enzyme carrier ED is dried.

Het organische milieu OMThe organic environment OM

Het organische milieu OM is bij voorkeur aan de werkwijzedoel-einden en -omstandigheden aangepast. Het kan uit alleen de reactie-componenten bestaan, b.v. in het geval van een verestering van vetten uit het vetmengsel zelf. Het substraat kan echter ook met organische oplosmiddelen verdund worden. Goed gebleken zijn koolwaterstoffen, in het bijzonder alifatische of cycloalifatische koolwaterstoffen met 6 - 18 koolstofatomen, zoals b.v. heptaan, isoöctaan, hexadecaan, cyclohexaan, eventueel ook tolueen. Bij toepassing van lipasen komen ook oplosmiddelen van het ether-type, zoals b.v. diethylether of isopropyl-ether, in aanmerking, in het bijzonder bij pancreas-lipasen.The OM organic environment is preferably adapted to the process objectives and conditions. It can consist of only the reaction components, e.g. in the case of an esterification of fats from the fat mixture itself. However, the substrate can also be diluted with organic solvents. Hydrocarbons, in particular aliphatic or cycloaliphatic hydrocarbons with 6-18 carbon atoms, such as e.g. heptane, isooctane, hexadecane, cyclohexane, optionally also toluene. When lipases are used, solvents of the ether type, such as e.g. diethyl ether or isopropyl ether, especially in pancreatic lipases.

Sterk polaire en protonische organische oplosmiddelen zijn daarentegen minder nuttig, hetgeen de van de andere kant waargenomen tendens tot een afnemende enzymactiviteit bij stijgende mengbaarheid met water schijnt te bevestigen.Highly polar and protonic organic solvents, on the other hand, are less useful, which seems to confirm the tendency of decreasing enzyme activity observed from the other side with increasing miscibility with water.

Voordelige werkingenEconomical operations

Volgens de onderhavige ervaringen verkrijgt men een zeer bevredigende belading van de enzymdrager ED met de enzymen. In het geval van de belading met een lipase werden b.v. in het filtraat van het geïmmobiliseerde produkt <1% van de aanvangsactiviteit weer gevonden, d.w.z. vanuit het oogpunt van de praktijk werd de totale toegepaste hoeveelheid enzym gefixeerd.According to the present experiences, a very satisfactory loading of the enzyme carrier ED with the enzymes is obtained. In the case of lipase loading, e.g. <1% of the initial activity was found again in the filtrate of the immobilized product, i.e. from the point of view of practice, the total amount of enzyme used was fixed.

Zoals onmiddellijk is in te zien, zijn de volgens de uitvinding aan de enzymdragers ED gefixeerde enzymen hoofdzakelijk geschikt voor toepassing in het organische milieu OM, met voordeel bij aanwezigheid van geringe hoeveelheden water (ongeveer 0,004 - 1 gew.%). Daardoor kan de desorptie effectief worden vermeden. De enzymdragers volgens de uitvinding zijn als regel primair voor de toepassing in batch-processen geschikt, aangezien het doelmatig pakken van kolommen met de enzymdragers ED moeilijkheden geeft.As can be seen immediately, the enzymes fixed to the enzyme carriers ED according to the invention are mainly suitable for use in the organic environment OM, advantageously in the presence of small amounts of water (about 0.004-1% by weight). Thereby desorption can be effectively avoided. The enzyme carriers according to the invention are generally suitable primarily for use in batch processes, since efficient column packing with the enzyme carriers presents ED difficulties.

De volgens de uitvinding geïmmobiliseerde enzymen zijn volgens de onderhavige ervaringen voor het uitvoeren van enzymatisch gekatalyseerde reacties naar de mate van hun bekende activiteiten volledig geschikt.The enzymes immobilized according to the invention are fully suitable according to the present experiences for carrying out enzymatically catalyzed reactions according to their known activities.

Zo kunnen bijvoorbeeld met geïmmobiliseerde lipasen op op zich bekende wijze heresteringen, veresteringen, alcoholyses, acidolyses en hydrolyses worden uitgevoerd. Van bijzonder belang is onder andere de mogelijkheid voor de selectieve hydrolyse eventueel onder verkrijging resp. produktie van optisch actieve centra.For example, with immobilized lipases, transesterifications, esterifications, alcoholysis, acidolysis and hydrolysis can be carried out in a manner known per se. Of particular interest is, inter alia, the possibility of the selective hydrolysis, optionally under obtaining or production of optically active centers.

VOORBEELDENEXAMPLES

A. Immobilisering van enzymen A. l Immobilisering van lipasen 25Ο g houtmeel (produkt van de firma Rettenmeier) met een deeltjesgrootte van ongeveer 100 pm wordt met 250 g van een lipase uit Pseudomonas (activiteit 20.000 LCA/g, produkt ^DEGOMMA 7101 van de firma Rohm GmbH) in 3·750 g water, dat 588 g natriumsulfaat bevat, gemengd en bij 40°C 20 uur lang geroerd. Bij de bereiding van het mengsel is het doelmatig gebleken, eerst de lipasen in water op te lossen, vervolgens het zout en ten laatste het houtmeel toe te voegen. Aansluitend wordt afgezogen en gedroogd. Activiteit van het geïmmobiliseerde produkt: 6.000 LCA/g droog gewicht. In het filtraat van het geïmmobiliseerde produkt wordt <1# van de activiteit teruggevonden.A. Immobilization of enzymes A. l Immobilization of lipases 25asen g of wood flour (product of the company Rettenmeier) with a particle size of approximately 100 µm is mixed with 250 g of a lipase from Pseudomonas (activity 20,000 LCA / g, product ^ DEGOMMA 7101 of the company Rohm GmbH) in 350 g of water, containing 588 g of sodium sulfate, mixed and stirred at 40 ° C for 20 hours. In the preparation of the mixture, it has proved expedient to first dissolve the lipases in water, then add the salt and finally the wood flour. It is then suction-filtered and dried. Activity of the immobilized product: 6,000 LCA / g dry weight. <1 # of the activity is recovered in the filtrate of the immobilized product.

B. Toepassing van de geïmmobiliseerde enzymen B.1 Heres tering 1 g geïmmobiliseerd lipase (voorbeeld A.l) wordt 2 uur bij 50°C in een mengsel van 0,8 g tristearine in 40 g myristineisopropylester geroerd. Het watergehalte is gering: 8,3# in het geïmmobiliseerde produkt; het substraat werd tevoren gedroogd.B. Application of the Immobilized Enzymes B.1 Resestation 1 g of immobilized lipase (Example A. 1) is stirred at 50 ° C for 2 hours in a mixture of 0.8 g of tristearin in 40 g of myristine isopropyl ester. The water content is low: 8.3 # in the immobilized product; the substrate was previously dried.

Na 2 uur is het gehalte van het tristearine tot 5# van de uitgangswaarde gedaald. Dit komt overeen met een omzetting van 95#· Volgens GC-analyse zijn ongeveer 40# heresteringsprodukten, zoals b.v. trimyristine, 55# hydrolyseprodukten, zoals verschillende mono- en diglyceriden.After 2 hours, the tristearin content has fallen to 5 # from baseline. This corresponds to a conversion of 95 #. According to GC analysis, about 40 # transesterification products, such as e.g. trimyristin, 55 # hydrolysis products, such as various mono- and diglycerides.

B.2 Enantionselectieve heresteringB.2 Enantion selective transesterification

Bij een licht geroerde oplossing van 1,11 g 2-0-benzylglycerol (6,1 mmol) in 20 ml tert-butylmethylether (= 0,3 mol/1) voegt men bij kamertemperatuur 2 ml vinyl acetaat (1,82 g; 18,2 mmol) en 100 mg geïmmobiliseerd lipase (voorbeeld I) toe. Het verloop van de reactie wordt door dunne-1aag-chromatografie (cyclohexaan/ethylacetaat = 1/1 op kiezelgel-platen, r^ (diol) = 0,10; r^ (acetaat) = 0,32) gevolgd. Bij de eerste toepassing van het enzym bereikt men na 6 uur volledige omzetting (bij een achtmalige toepassing stijgt de benodigde reactietijd continu tot ongeveer 12 uur). Na beëindiging van de reactie filtreert men het enzym af, wast dit met tert-butylmethylester en concentreert de verenigde filtraten met behulp van een rotatieverdamper. Men verkrijgt zeer zuiver (S)-l-acetyloxy-2-benzyloxy-propaan-3-ol als olie.In a slightly stirred solution of 1.11 g of 2-0-benzylglycerol (6.1 mmol) in 20 ml of tert-butyl methyl ether (= 0.3 mol / l), 2 ml of vinyl acetate (1.82 g; 18.2 mmol) and 100 mg of immobilized lipase (Example I). The course of the reaction is followed by thin layer chromatography (cyclohexane / ethyl acetate = 1/1 on silica gel plates, r ^ (diol) = 0.10; r ^ (acetate) = 0.32). The first application of the enzyme achieves complete conversion after 6 hours (with an eight-time application the required reaction time increases continuously to about 12 hours). After completion of the reaction, the enzyme is filtered off, washed with tert-butyl methyl ester and the combined filtrates are concentrated using a rotary evaporator. Very pure (S) -1-acetyloxy-2-benzyloxy-propan-3-ol is obtained as an oil.

(S)-l-Acetyloxy-2-benzyloxy-propaan-3-ol ^12^16^4 molecuulgewicht: 224,26 g/mol Rotatiewaarden (c = 2 T = 20°C) CHCI3 Ethanol [a] Ca] 589 nm -17.3° +12,2° 578 nm -18,1° +12,7° 546 nm -20,3° +14,6° 436 nm -34,6° +25,1° 365 nm -54,1“ +39,6°(S) -1-Acetyloxy-2-benzyloxy-propan-3-ol ^ 12 ^ 16 ^ 4 Molecular weight: 224.26 g / mol Rotation values (c = 2 T = 20 ° C) CHCl3 Ethanol [a] Ca] 589 nm -17.3 ° + 12.2 ° 578 nm -18.1 ° + 12.7 ° 546 nm -20.3 ° + 14.6 ° 436 nm -34.6 ° + 25.1 ° 365 nm -54, 1 "+ 39.6 °

Uit de vergelijking met de rotatiewaarden uit de literatuur (Y. Terao, M. Murata, K. Achiwa, T. Nishio, M. Akamtsu, M. Kamimura, Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5173) is het materiaal met een overmaat enantiomeer (ee) van 86# aanwezig.From the comparison with the rotational values of the literature (Y. Terao, M. Murata, K. Achiwa, T. Nishio, M. Akamtsu, M. Kamimura, Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5173), the material with an excess of enantiomer (ee) of 86 # present.

Immomobilisering op houtmeel A.2. Immobilisering van fosfolipase A2 5 g van een fosfolipase A2 (lecitase 10 L van de firma Novo-Nordisk, 10.000 internat, units/ml [1 internat, unit voor fosfolipase A2 is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym, die 1 pmol vrij vétzuur per minuut uit lecithine afsplitst]) wordt in 4.000 ml water opgelost, waaraan naderhand 400 g ammoniumsulfaat werd toegevoegd. In deze oplossing wordt 250 g houtmeel "Lignocel C 120" van de firma Rettermeier met een deeltjesgrootte van ongeveer 100 pm gebracht.Immobilization on wood flour A.2. Immobilization of phospholipase A2 5 g of a phospholipase A2 (lecitase 10 L from Novo-Nordisk, 10,000 internat, units / ml [1 internat, unit for phospholipase A2 is defined as the amount of enzyme, which extracts 1 pmole of free fatty acid per minute lecithin is split off]) is dissolved in 4,000 ml of water, after which 400 g of ammonium sulfate are added. 250 g of wood flour "Lignocel C 120" from Rettermeier with a particle size of approximately 100 µm are introduced into this solution.

De suspensie wordt 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.The suspension is stirred at room temperature for 2 hours.

Aansluitend wordt afgezogen (maar niet nagewassen) en mild gedroogd (bij 40°C in een vacuüm-droogkast gedurende een nacht).Then it is aspirated (but not post-washed) and gently dried (at 40 ° C in a vacuum drying cabinet overnight).

In het filtraat van het geïmmobiliseerde produkt wordt praktisch geen enzymactiviteit teruggevonden. De drager zelf wordt op activiteit volgens de "eigeelmethode" beproefd (eigeel als substraat, 40°C, pH = 8). Deze bezit 212 internat, units/g. hetgeen met een acitiviteits-opbrengst van 30.3 % overeenkomt.Virtually no enzyme activity is found in the filtrate of the immobilized product. The support itself is tested for activity by the "yolk method" (egg yolk as substrate, 40 ° C, pH = 8). It owns 212 internat, units / g. which corresponds to an activity yield of 30.3%.

Dit enzym is b.v. voor de lecithinesplitsing na toevoeging van geringe hoeveelheden water in olie (b.v. ruwe soja-olie) geschikt.This enzyme is e.g. suitable for the lecithin cleavage after addition of small amounts of water in oil (e.g. crude soybean oil).

A.3 Immobilisering van glucoseoxidase (GOD) / katalaseA.3 Immobilization of glucose oxidase (GOD) / catalase

Er wordt zoals in voorbeeld A£ te werk gegaan, slechts wordt als enzym 10 ml glucoseoxidase/katalase uit Aspergillus met een G0D-activiteit van 850 units/ml toegepast (1 GOD-unit/ml is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym, die per minuut 1 pmol gluconzuur vrijmaakt. (37°C, PH = 5.5))·Proceed as in Example A, except that as enzyme 10 ml of glucose oxidase / catalase from Aspergillus with a G0D activity of 850 units / ml is used (1 GOD unit / ml is defined as the amount of enzyme per minute Liberates 1 pmol of gluconic acid. (37 ° C, PH = 5.5))

In het filtraat worden na koppeling van het enzym slechts sporen van het enzym teruggevonden. De activiteit van de drager bedroeg 20 units, hetgeen met een activiteitsopbrengst van 59% overeenkomt.After coupling of the enzyme, only traces of the enzyme are found in the filtrate. The activity of the support was 20 units, which corresponds to an activity yield of 59%.

Door het gehalte ervan aan katalase kan de drager voor het verwijderen van H2O2 in een verdunde desinfectie-oplossing worden toegepast. Daarvoor wordt deze in een gefluïdiseerd bed in een kolom (stromingsrichting van onderen naar boven) toegepast. De vernietiging van H2O2 is aan de vorming van gasbellen (zuurstof) goed te herkennen.Due to its catalase content, the carrier for removing H2O2 in a dilute disinfection solution can be used. For this it is used in a fluidized bed in a column (flow direction from bottom to top). The destruction of H2O2 is easily recognized by the formation of gas bubbles (oxygen).

A.4 Immobilisering van alkalische proteinase op cellulosepoeder.A.4 Immobilization of alkaline proteinase on cellulose powder.

4 g van een alkalisch proteinase van B. licheniformis (Alcalase 2,0 T van Novo Nordisk) wordt in 4 1 1 m fosfaatbuffer met een pH = 8,0 opgelost. Vervolgens wordt 400 g cellulosepoeder fijn met een stortvolume van 3 1/hg (firma Rettenmeier) toegevoegd en 1 uur bij 40°C geroerd. Vervolgens wordt de cellulosepoeder-suspensie zonder te wassen afgezogen en mild gedroogd (40°C, vacuüm-droogkast).4 g of an alkaline proteinase from B. licheniformis (Alcalase 2.0 T from Novo Nordisk) is dissolved in 4 l of 1 m phosphate buffer with a pH = 8.0. 400 g of cellulose powder are then added fine with a bulk volume of 3 l / hg (Rettenmeier) and stirred at 40 ° C for 1 hour. The cellulose powder suspension is then filtered without washing and mildly dried (40 ° C, vacuum drying cabinet).

In het filtraat wordt <7% van de oorspronkelijke enzymactiviteit teruggevonden. De voornaamste hoeveelheid is aan het cellulosepoeder geadsorbeerd (8l% van het toegepaste enzym).<7% of the original enzyme activity is recovered in the filtrate. The main amount is adsorbed on the cellulose powder (8l% of the enzyme used).

Gemeten werd hier in Löhlein-Vollhard-eenheden (LVE)*.Measurements were taken here in Löhlein-Vollhard units (LVE) *.

Alcalase 2,0 T ... 140.000 LVE/g 0,1 procents oplossing ... 140 LVE/gAlcalase 2.0 T ... 140,000 LVE / g 0.1 percent solution ... 140 LVE / g

Filtraat na koppeling ... <10 LVE/g ( = <7% van de uitgangs- activiteit)Filtrate after coupling ... <10 LVE / g (= <7% of the starting activity)

Activiteit aan de drager ... 113 LVE/g ( = Sl% opbrengst van activiteit)Activity to the carrier ... 113 LVE / g (= Sl% yield of activity)

Dit enzym is bijvoorbeeld voor stereo-specifieke estersyntheses in organisch milieu geschikt.This enzyme is suitable, for example, for stereo-specific ester syntheses in the organic environment.

A.5 Immobilisering van het pancreas-enzymcomplexA.5 Immobilization of the pancreatic enzyme complex

Er wordt zoals in voorbeeld A£ te werk gegaan, maar als enzym wordt 10 g pancreas-enzym (Corolase PP Röhm enzymtechnologie, Leid-aktiviteit 220.000 LVE) toegepast.The procedure is as in Example A, but as enzyme 10 g pancreatic enzyme (Corolase PP Röhm enzyme technology, Lead activity 220,000 LVE) is used.

In het filtraat na koppeling van het enzym worden slechts sporen van het enzym teruggevonden. De activiteit van de drager werd met 4.000 LVE gemeten, hetgeen met een acitiviteitsopbrengst van 45# overeenkomt.Only trace amounts of the enzyme are found in the filtrate after coupling of the enzyme. The activity of the support was measured with 4,000 LVE, which corresponds to an activity yield of 45 #.

Door het chymotrypsinegehalte ervan (~10# van de proteïnasen) is dit geïmmobiliseerde enzym voor estersyntheses in het organische milieu goed geschikt.Due to its chymotrypsin content (~ 10 # of the proteinases), this immobilized enzyme is well suited for ester syntheses in the organic environment.

Claims

1. Enzymes immobilized on solid enzyme carriers, characterized. because the enzymes on enzyme carriers ED, consisting of unmodified particles of natural substance with mainly cellulose character, are adsorptively immobilized.

Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 1, characterized in that the enzyme carriers ED are selected from the group consisting of wood flour, cellulose fibers and cotton linters.

Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 2, characterized in that the particles of natural substance have a particle size in the range of 0.01 - 1 mm.

Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claims 1-3, characterized in that the enzymes are selected from the class of the hydrolases, the isomerases, the oxidoreductases and the transferases.

Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 4, characterized in that the enzymes are lipases (E.C.3.1.1.3).

Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 4, characterized in that the enzymes are proteases (E.C.3-4.).

Enzymes immobilized on solid enzyme carriers according to claim 4, characterized in that the enzymes are catalases (E.C.1.11.1.6).

8. Process for the preparation of enzymes which are immobilized adsorptively on solid enzyme carriers ED, characterized in that the enzymes are allowed to be drawn up from an aqueous medium on unmodified particles of natural substance of predominantly cellulosic character.

Process according to claim 8, characterized in that the aqueous medium contains 1/5 to 1/15 of its weight of adjusting salt.

10. Process according to claim 9, characterized in that sodium sulphate is used as the adjusting salt.

Use of the enzymes immobilized on solid enzyme carriers ED adsorptively according to claim 1, characterized in that an organic environment OM is used as the reaction medium.

Use of the enzymes adsorptively immobilized on solid enzyme carriers according to claims 1, 5 and H *, characterized in that an enantio-selective transesterification is carried out.